KR20120114797A

KR20120114797A - 다공성 고분자 지지체, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 유전자 전달 시스템

Info

Publication number: KR20120114797A
Application number: KR1020110032560A
Authority: KR
Inventors: 이진호; 오세행; 김태호; 장성환
Original assignee: 한남대학교 산학협력단
Priority date: 2011-04-08
Filing date: 2011-04-08
Publication date: 2012-10-17

Abstract

본 발명은 다공성 고분자 지지체의 매트릭스에 유전자 전달체를 포함하며, 상기 유전자 전달체는 상기 다공성 고분자 지지체 내에서 서방형 방출 거동을 나타내는 다공성 지지체와 이의 제조방법, 및 이를 이용한 줄기세포의 연골세포로 분화시키기 위한 유전자 전달 시스템에 관한 것이다.
본 발명에 따른 다공성 고분자 지지체에 탑재된 유전자 전달체는 서방형 방출 거동을 나타내어 세포 내로의 높은 이입효율 및 낮은 세포독성을 가져 줄기세포의 분화를 효과적으로 유도할 수 있으며, 상기 구조의 다공성 지지체는 다양한 세포의 우수한 점착성/증식성/분화성을 부여할 수 있는 다공구조를 가지므로, 3D 조직 형성에도 매우 효과적이다.

Description

다공성 고분자 지지체, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 유전자 전달 시스템{Porous polymeric scaffold, method for preparing the same, and gene delivery system using the same}

본 발명은 다공성 고분자 지지체, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 유전자 전달 시스템에 관한 것으로, 상세하게는 줄기세포 (mesenchymal stem cells, MSCs)를 연골세포로 분화시키기 위하여 사용되는 다공성 고분자 지지체와 이의 제조방법, 및 이를 이용한 유전자 전달 시스템에 관한 것이다.

조직 공학에서 3차원적(3D) 다공성 지지체를 이용하는 주된 목적은 세포 점착, 증식, 분화를 위한 적절한 환경을 형성하여, 궁극적으로는 인간을 생물학적으로 대체할 수 있는 체계적인(well-organized) 조직 및/또는 장기(organs)를 제조하기 위한 것이다. 이러한 목적으로 다양한 연구들이 진행되어 왔다.

세포의 증식을 촉진시키거나 세포 분화를 유도할 수 있는 다양한 신호 전달 분자 (성장인자, 사이토카인 등)들은 효과적인 조직/장기의 재생을 위한 매우 중요한 요소로 생각되고 있다. 따라서 이러한 신호 전달 분자를 3D 다공성 지지체 내에 도입시키고, 이들이 서방성 방출을 유도하여 3D 조직/장기를 재생하고자 하는 연구들이 활발히 진행되고 있다. 그러나, 신호 전달 분자를 지지체 내로 탑재하는 과정동안 상기 신호 전달 분자들의 활성화도 감소와 구조적인 불안정성은 여전히 풀어야할 숙제로 남아 있다.

이러한 문제점을 극복하기 위하여, 조직공학 기법과 유전자 치료법이 조합된 전략들이 연구되고 있다.

연골 조직은 연골세포만으로 구성되며 다른 조직에 비해서 혈관이 발달되어 있지 않은 특성을 가지고 있어 연골세포를 배양 시 원래 특성(phenotype)을 잃는 경우가 많기 때문에 연골조직의 체외 재건에 한계가 있다고 알려져 있다. 과거부터 연골치료법으로 사용되었던 자가연골 세포이식술이 현재에도 사용되고 있으나 상기의 문제점으로 인해 사용이 제한적이다.

또한, 연골은 신체에 받는 하중을 견뎌내는 역할을 하는 구조물이다. 팰렛 배양(pellet culture)을 이용한 연골재생은 오직 세포만으로 구성되어 있기 때문에 물성이 떨어져 연골로의 역할을 수행하기에는 한계가 있다. 따라서 우수한 물성을 제공함은 물론 세포의 증식/성장에 좋은 환경을 제공할 수 있는 3D 다공성 지지체를 사용하는 조직공학 기법의 도입은 연골 재건을 위한 필수 요소라 할 수 있다.

최근에는 특정 세포/조직으로의 분화능, 세포 획득 용이성 및 증식 용이성 등의 장점을 가진 줄기세포에 성장인자나 사이토카인과 같은 신호 전달 분자들(signaling molecules)을 도입하여 이들의 연골 조직 재건에 활용하고자 하는 연구가 매우 폭넓게 진행되고 있다. 하지만 대부분의 성장 인자들은 체내/외에 직접 도입 시 고가의 가격에 비해 활성 지속시간이 매우 짧아 경제성 및 효율성 측면에서 상당한 문제점을 안고 있다.

이의 대안으로 특정 유전자를 세포 내로 이입시켜 원하는 신호 전달 분자 (성장인자, 사이토카인 등)를 보다 안정적으로 발현시킬 수 있는 유전자 치료법이 주목을 받고 있으며, 줄기세포의 연골로의 분화에 효과적이라고 알려진 TGF-β, BMP, IGF-1 등의 유전자가 coding된 pDNA를 세포 내로 이입시켜 다양한 줄기세포를 연골로 분화시키려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 하지만 이 역시 유전자가 이입된 세포의 이동, 사멸 등에 의해 원하는 신호 전달 분자의 장기간 방출에는 한계가 있다고 알려져 있다.

이에 본 발명에서는 종래 조직공학 기법을 이용하여 연골을 재생하는 데 있어서 사용되는 지지체의 여러 가지 문제들을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 손쉽고, 안정하게 유전자 전달체를 고분자 지지체에 탑재할 수 있고, 상기 탑재된 유전자 전달체가 상기 고분자 지지체에서 서방형 방출 거동을 나타내어 장기간 지속적으로 세포 내에 이입 및 타겟 신호 전달 분자의 생산을 도모할 수 있는 다공성 고분자 지지체를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기와 같은 특징을 가지는 다공성 고분자 지지체의 제조방법을 제공하는 데도 있다.

또한, 본 발명의 추가의 다른 목적은 상기 다공성 고분자 지지체를 이용하여 줄기세포로부터 연골세포로 분화시키기에 효과적인 유전자 전달 시스템을 제공하는 데도 있다.

이러한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 다공성 고분자 지지체는 유전자 전달체를 매트릭스에 포함하며, 상기 유전자 전달체는 상기 다공성 고분자 지지체 내에서 서방형 방출 거동을 나타내는 것일 수 있다.

상기 다공성 고분자 지지체는 친수성 고분자로 친수화된 생분해성 고분자인 것이 바람직하다.

상기 생분해성 고분자는 중량평균분자량 1,000~1,000,000 g/mol인 락틱산, 글리콜산, 카프로락톤, 다이옥산온, 하이드록시부티릭산, 하이드록시발러릭산, 포스포에스터, 에틸렌 옥사이드의 중합체 및 이들의 공중합체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있다.

상기 친수성 고분자는 중량평균분자량 1,000~1,000,000 g/mol인 에틸렌 옥사이드(ethylene oxide, -CH₂CH₂O) 또는 하이드록시 (hydroxy, -OH) 작용기를 포함하는 것이 바람직하다.

상기 친수성 고분자의 구체 예로는, 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드 공중합체(polyethyleneoxide-polypropyleneoxide copolymer,PEO-PPO), 폴리에틸렌옥사이드-폴리락틱산 공중합체(polyethylene oxide-co-polylactic acid, PEO-PLA), 폴리에틸렌옥사이드-폴리락틱글리콜산 공중합체(polyethylene oxide-poly(lactic-co-glycolic acid) (PEO-PLGA)), 폴리에틸렌옥사이드-폴리카프로락톤 공중합체(polyethylene oxide-polycaprolactone, PEO-PCL), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리비닐알콜(PVA), 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르류(polyoxyethylene alkyl ethers, Brij Series), 폴리옥시에틸렌 케스터 오일 유도체류(polyoxyethylene castor oil derivatives, Cremophores), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 페티 에시드 에스터류(polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, Tween Series), 및 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류 polyoxyethylene stearates)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상인 것이 바람직하다.

상기 친수성 고분자는 생분해성 고분자 1에 대하여 0.001~0.2 중량비로 포함되는 것이 바람직하다.

상기 다공성 지지체는 기공 크기(pore size)가 50~600㎛이고, 다공도(porosity)가 80~98%인 것이 바람직하다.

또한, 상기 다공성 고분자 지지체는 그 표면과 내부의 기공도가 거의 동일한 열린 기공 구조(open pore structure)를 가지는 것이 바람직하다.

상기 유전자 전달체는 상기 다공성 고분자 지지체 내에서 8주 동안 5 ~ 95%의 서방형 방출 거동을 나타내는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 일 실시예에 따른 다공성 고분자 지지체의 제조방법은 유전자 전달체와 고분자 용액을 혼합시키는 단계, 상기 혼합물에 소금 입자를 혼합시키는 단계, 이를 일정한 몰드에 채우는 단계, 침전/염침출시키는 단계, 및 세척/동결건조시키는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 추가의 다른 목적을 달성하기 위하여 유전자 전달체가 서방형 방출 거동을 나타내는 다공성 고분자 지지체를 이용하여 줄기세포의 연골로의 분화 유도 및 연골 조직화와 같은 세포 분화 유도용 유전자 전달 시스템을 제공한다.

본 발명에 따르면, 다공성 고분자 지지체는 유전자 전달체가 안정하게 탑재될 수 있도록 지지체로서의 안정성과 우수한 물성을 가지며, 체내에 이식된 후에도 주위 조직과 염증반응이 없이 우수한 생체적합성을 가진다.

또한, 상기 다공성 고분자 지지체의 매트릭스에 탑재된 유전자 전달체는 서방형 방출 거동을 나타내어 세포 내로의 높은 이입효율 및 낮은 세포독성을 가져 줄기세포의 분화를 효과적으로 유도할 수 있으며, 상기 구조의 다공성 지지체는 다양한 세포의 우수한 점착성/증식성/분화성을 부여할 수 있는 다공 구조를 가지므로, 3D 조직 형성에도 매우 효과적이다.

도 1은 본 발명에 따른 다공성 고분자 지지체를 제조하는 일련의 과정이고,
도 2는 N/P ratio에 따른 pDNA(대조군 1) 및 pDNA/PEI-PEG 전달체의 전기 영동 측정 결과이며,
도 3은 N/P ratio에 따른 pDNA/PEI-PEG 전달체의 입자 크기(A) 및 표면 전하(B) 측정 결과이고,
도 4는 pDNA/PEI-PEG 전달체의 BMMSCs에 4시간 처리 후 이입 효율(A) 및 독성(B) 측정 결과이며,
도 5는 pDNA/PEI-PEG 전달체(N/P ratio=16)가 탑재된 PLGA/Pluronic F127 다공성 고분자 지지체(실시예 1)의 표면 및 단면의 주사전자현미경 사진이고,
도 6은 친수성 첨가제(Pluronic F127)의 함량에 따른 다공성 지지체의 기계적 물성 측정 결과이며,
도 7은 대조군 2(PLGA 지지체 사용, A)와 실시예1(PLGA/Pluronic F127 지지체 사용, B)에 따른 다공성 고분자 지지체로부터 pDNA/PEI-PEG 전달체 (유전자 전달체)의 방출 거동을 나타낸 것이고,
도 8은 대조군 2(PLGA 지지체 사용, A)와 실시예1(PLGA/Pluronic F127 지지체 사용, B)에 따른 다공성 고분자 지지체에서 방출된 pDNA/PEI-PEG 전달체 (유전자 전달체)의 BMMSCs 내로의 이입에 의한 GFP 및 PKH26 발현을 나타낸 것이며,
도 9는 대조군 2(PLGA 지지체 사용, A)와 실시예1(PLGA/Pluronic F127 지지체 사용, B)에 따른 다공성 고분자 지지체에서 순수 pDNA(대조군 1) 및 pDNA/PEI-PEG 전달체에 의한 BMMSCs의 이입 효율을 나타낸 것이고,
도 10은 대조군 2(PLGA 지지체 사용, A)와 실시예1(PLGA/Pluronic F127 지지체 사용, B)에 따른 다공성 고분자 지지체로부터 방출된 순수 pDNA(대조군 1) 및 pDNA/PEI-PEG 전달체에 의한 BMMSCs의 독성을 나타낸 것이다.

이하에서 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명은 줄기세포를 효과적으로 연골세포로 분화시킬 수 있는 다공성 고분자 지지체와 이의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 다공성 고분자 지지체는 매트릭스에 유전자 전달체를 포함하며, 상기 유전자 전달체는 다공성 고분자 지지체 내에서 서방형 방출 특성을 나타낸다.

본 발명에 따른 다공성 고분자 지지체는 기계적 물성이 우수하고, 재현성이 우수하며, 다양하게 응용될 수 있는 합성 고분자가 유리하다. 그러나, 일반적인 합성 고분자들이 갖는 소수성은 다공성 지지체에서 세포를 포함하는 세포액의 다공성 지지체 내로의 침투가 용이치 못하여 나타나는 낮은 초기 세포 파종 밀도; 및 산소와 자양분을 포함하는 세포배양액의 지지체 내로의 원활한 공급이 어려워 나타나는 세포의 괴사 및 느린 성장으로 인해 조직 공학에 응용하는 데 있어 여전히 많은 제한이 따른다.

또한, 본 발명의 다공성 고분자 지지체로 사용되기 위해서는 조직세포가 재료 표면에 점착하여 3차원 구조를 가지는 조직을 형성할 수 있도록 기질 또는 지지체의 역할을 충분히 해내야 하고, 체내에 이식된 후에도 주위 조직과 융화가 잘 되어야 하며 염증반응이 없고 일정 기간이 지난 후 스스로 분해하여 이물질로 남지 않는 우수한 생체적합성을 가져야 한다. 따라서, 이러한 조건에 부합되는 물질이 생분해성 고분자라 할 수 있다.

또한, 유전자 전달 시스템으로 응용하기 위해서 유전자 전달체를 지지체에 안정하게 탑재할 수 있어야 하며, 타겟 조직의 치료/재생 동안 지지체로부터의 서방형 유전자 방출 등의 조건을 충족시켜야 한다. 지지체로부터의 지속적인 방출에 의한 유전자 전달은 특정 조직의 미세환경 내에 존재하는 신호를 조절할 수 있고, 효과적인 수준으로 원하는 단백질의 지속적인 발현을 유도할 수 있는 장점이 있다.

따라서, 본 발명에 따른 다공성 고분자 지지체는 생분해성 고분자가 바람직하며, 상기 생분해성 고분자가 소수성을 띠는 경우, 친수성 고분자로 친수처리된 생분해성 고분자를 사용하는 것이 바람직하다.

상기 친수성 고분자의 구체적인 예를 들면, 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드 공중합체(polyethylene oxidepolypropyleneoxide, PEO-PPO, Pluronic series), 폴리에틸렌옥사이드-폴리락틱산 공중합체(polyethylene oxide-co-polylactic acid, PEO-PLA), 폴리에틸렌옥사이드-폴리락틱글리콜산 공중합체(polyethylene oxide-poly(lactic-co-glycolic acid) (PEO-PLGA)), 폴리에틸렌옥사이드-폴리카프로락톤 공중합체(polyethylene oxide-polycaprolactone, PEO-PCL), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리비닐알콜(PVA), 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르류(polyoxyethylene alkyl ethers, Brij Series), 폴리옥시에틸렌 케스터 오일 유도체류(polyoxyethylene castor oil derivatives, Cremophores), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 페티 에시드 에스터류(polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, Tween Series), 및 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류(polyoxyethylene stearates)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있다.

상기 친수성 고분자는 생분해성 고분자 1에 대하여 0.001~0.2중량비, 보다 바람직하기로는 0.01~0.05중량비로 혼합 사용되는 것이 좋으며, 상기 친수성 고분자가 0.001 중량비 미만으로 사용되면 제조된 다공성 지지체가 친수성을 나타내지 못하는 문제가 있으며, 0.2 중량비를 초과하는 경우에는 물성이 떨어져 다공성 지지체로 사용되는 데 적합하지 못한 문제가 있다.

또한, 상기 다공성 고분자 지지체 제조시 사용되는 용매로는 일정량 이상 사용해도 독성이 없는 것으로서, 예를 들면, 테트라글라이콜(tetraglycol), 다이메틸설폭사이드 (DMSO), 1-메틸-2-피롤리디논(1-methyl-2-Pyrrolidinone (NMP)), 트리아세틴(triacetin) 및 벤질 알콜(benzyl alcohol)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상인 것이 바람직하다.

상기 생분해성 고분자는 유기용매 1에 대하여 0.01~0.5 중량비, 바람직하기로는 0.05~0.3 중량비로 사용하는 것이 좋으며, 상기 사용량이 0.01 중량비 미만이면 고분자의 침전이 형성되지 않거나 물성이 약해지는 문제가 있으며, 0.5 중량비를 초과하는 경우에는 용액의 점도가 높아 용해시키거나 취급이 용이하지 않은 어려움이 있다.

한편, 상기 제조된 다공성 고분자 지지체 상에 탑재되는 유전자 전달체는 음이온성 플라스미드 DNA(pDNA)에 양이온성 고분자를 첨가하여 정전기적 상호작용으로 형성된 complex인 것이 바람직하다. 이는, 음이온을 띄는 pDNA가 차후 세포 내로의 이입되는 효율을 향상시키기 위한 것이다.

상기 양이온성 고분자는 폴리에틸렌이민 (polyethyleneimine), 폴리에틸렌이민-폴리에틸렌옥사이드 공중합체 (polyethyleneimine-co-polyethylene oxide), 키토산 (chitosan), 및 폴리엘라이신 (poly-l-lysine)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 다공성 고분자 지지체는 상기 유전자 전달체를 탑재시켜 제조할 수 있다.

상기 제조된 유전자 전달체를 다공성 고분자 지지체의 매트릭스에 탑재시키는 방법은 상기 유전자 전달체와 고분자 용액을 혼합시키는 단계, 상기 혼합물에 소금 입자를 혼합시키는 단계, 이를 일정한 몰드에 채우는 단계, 침전/염침출 시키는 단계, 및 세척/동결건조시키는 단계를 거쳐 제조할 수 있다.

상기 침전/염침출법 (precipitation/particulate leaching method)을 사용하면 유전자 전달체가 다공성 고분자 지지체 상에 균일하고 안정하게 탑재시킬 수 있다. 이는 다공성 지지체 제조 과정, 특히 소금입자를 포함하고 있는 고분자 용액의 에탄올에서의 침전과정에서 유전자 전달체가 고분자와 동시에 침전되어 유전자 전달체의 손실을 최소화 할 수 있기 때문이다. 이를 통해 줄기세포의 연골로의 분화에 적절한 유전자 전달체를 다공성 고분자 지지체의 매트릭스 내에 효율적으로 탑재시킬 수 있다.

상기와 같은 과정으로 제조된 본 발명에 따른 다공성 고분자 지지체는 매우 높은 다공도, 구체적으로는 약 80~98%, 더 높기로는 93~98%로 나타나는데, 이러한 고 다공성 지지체는 세포의 점착을 위한 매우 큰 표면적을 제공할 수 있어 바람직하고, 세포와 세포 간의 상호작용이 가능하며, 세포 증식과 분화에 매우 효율적인 미세공간(micro-environment)의 제공이 가능하다.

또한, 본 발명에 따른 다공성 고분자 지지체는 그 표면과 단면의 다공 구조가 거의 동일하고, 다공도의 분포가 매우 균일할 뿐만 아니라, 다공질이 서로 열린 계(open cell)로 연속적으로 연결되어 있는 구조를 가진다. 이러한 구조적인 특징은 상기 다공성 고분자 지지체 제조 시, 미세분말의 소금을 사용하여 적절히 조절된 결과라 할 수 있다.

본 발명의 다공성 고분자 지지체의 기공 크기(pore size)는 상기 침전/염침출법에서 사용된 소금 입자의 것과 거의 동일한 약 50~600㎛, 바람직하기로는 약 100~150㎛ 정도이다. 따라서, 침전/염침출법에 의해 유전자 전달체를 탑재시킴에 있어, 첨가되는 소금 입자의 크기를 변화시킴으로써 다공성 지지체 내의 기공 크기를 조절할 수 있게 된다.

상기와 같은 일련의 과정을 거쳐 본 발명에 따른 다공성 고분자 지지체를 제조하는 과정을 다음 도 1에 정리하였다.

이러한 특징을 가지는 본 발명에 따른 다공성 고분자 지지체는 현재까지 개발된 다공성 지지체들이 제조 과정 중 유전자 전달체의 손실로 인해 도입효율이 높지 않거나, 지지체 매트릭스 내에 유전자 전달체를 도입하지 않고 표면에 코팅하는 방법으로 제조함으로 인해 초기에 유전자의 빠른 방출로 인해 지지체 내의 세포에 독성을 나타내는 결과를 초래할 수 있는 문제를 해결할 수 있게 되었다.

따라서, 본 발명에 따른 다공성 고분자 지지체에서, 유전자 전달체는 다공성 고분자 지지체 내에서 8주 동안 5 ~ 95%, 바람직하기로는 8주 동안 90% 이상이 서방형 방출 거동을 나타내는 특성을 가진다.

따라서, 본 발명에 따른 서방형 방출 거동을 나타내는 다공성 고분자 지지체를 이용하여 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도 및 연골 조직화와 같은 세포 분화 유도용 유전자 전달 시스템으로 효과적으로 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하면 다음과 같은 바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

1)유전자 전달체 ( pDNA / PEI - PEG )의 제조

1-1) PEI - PEG 공중합체의 합성

pDNA용 non-viral vector 로 사용하기 위한 PEI-PEG를 합성하기 위하여, PEI(0.25g, 0.01mmol, Mw 25,000)을 PBS(pH 7.4) 10mL에 용해시키고, PEG-NHS(0.04g, 0.02mmol, Mw 2,200)을 첨가한 다음, 상기 용액을 실온(R.T.)에서 24시간 동안 교반시켰다.

반응 종료 후, 미반응된 PEG-NHS를 제거하기 위해 dialysis membrane (molecular weight cut-off, 5000 Da)을 사용하여 과량의 초순수에서 3일 동안 투석하고 동결건조하여 최종의 PEI-PEG 공중합체를 얻었다. 합성된 공중합체의 합성 여부를 FT-IR과 1H-NMR을 이용하여 확인하였다. 추가 실험을 위하여, 65μg/mL의 PEI-PEG 농축액(stock solution)을 제조하였다.

1-2) pDNA / PEI - PEG 전달체의 제조

pDNA 수용액 (0.1μg/ml)에 다양한 농도의 PEI-PEG 수용액을 첨가하고 vortex로 15초간 교반 한 후, 15분간의 상온 방치를 통해 pDNA/PEI-PEG 전달체를 다양한 N/P ratio (1, 2, 4, 8, 16, 32)별로 제조하였다. 이 때, 사용되는 PEI-PEG 수용액의 농도에 의해 N/P charge ratio (PEI-PEG 사슬에 존재하는 질소 (nitrogen)와 pDNA에 존재하는 인 (phosphate)의 비율)가 조절된다.

2) pDNA / PEI - PEG 전달체가 탑재된 다공성 고분자 지지체의 제조

pDNA/PEI-PEG 전달체가 도입된 다양한 Pluronic F127 농도(2~10wt%; PLGA base)를 함유하는 PLGA/F127 지지체를 침전/염침출법을 이용하여 제조하였다. PLGA/F127 혼합 분말을 테트라글리콜에 19 중량%로 용해시켰으며, pDNA/PEI-PEG 전달체를 800 ㎍/mL 농도로 테트라글리콜에 분산시켜주었다. 이 두 용액을 3/1의 부피비로 혼합하여 pDNA/PEI-PEG 전달체 분산되어 있는 혼합 용액을 제조하였다 (최종 농도 PLGA/F127, 15 중량%; pDNA/PEI-PEG 전달체, 200 ㎍/mL).

이 용액을 지지체의 다공질 크기를 조절하기 위한 100~150㎛ 크기의 소금 입자 (NaCl, Ducksan Phamarcy, Korea)와 혼합한 후 (0.5/1, v/w)하고, 이를 직경 7 mm, 두께 2 mm의 실리콘 몰드에 채웠다. 이를 4℃의 에탄올에서 6시간 보관하여 고분자 및 pDNA/PEI-PEG 전달체를 침전시켰으며, 4℃의 70% 에탄올에서 4시간 동안 shaking하여 침전된 고분자 매트릭스로부터 소금입자를 제거하여 pDNA/PEI-PEG 전달체가 균일하고 안정하게 탑재된 다공성 고분자 지지체를 제조하였다 (침전/염침출법).

대조군 1

유전자 전달체를 형성하지 않고, 순수 pDNA를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 과정으로 다공성 고분자 지지체를 제조하였다.

대조군 2

친수성 첨가제인 Pluronic F127로 친수 처리되지 않은 소수성 PLGA를 고분자 지지체로 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 과정으로 다공성 고분자 지지체를 제조하였다.

실험예 1 : 유전자 전달체의 특성 평가

1-1) 유전자 전달체에서 정전기적 상호작용 측정

실시예 1에서 얻어진 각 N/P ratio 별로 혼합되어진 유전자 전달체 용액에서 양이온성 고분자와 음이온성 plasmid DNA (pDNA)의 complex 형성여부를 전기영동법 (electrophoresis)을 이용하여 관찰하였으며, 그 결과를 다음 도 2에 나타내었다. 이를 통하여, 상기 유전자 전달체에서 음이온성 pDNA와 양이온성 고분자 간의 상호작용을 관찰할 수 있다.

pDNA/PEI-PEG 전달체는 N/P ratio 1, 2, 4, 8, 16, 32까지 준비하였다. 실험군들은 loading dye (Sigma)와 혼합하여 사용하였다. 0.1μg/ml의 EtBr이 포함된 1.0% 아가로스겔에 loading dye와 혼합한 실험군들을 처리한 후, 100 V로 40분 동안 전기영동을 걸어 밴드를 시각화함으로서 Luminescent Image Analyzer (LAS-3000, FUJIFILM)를 사용하여 겔의 이미지를 관찰하였다.

전기영동법은 장치 내에서 -극에서 +극으로 흘려보내주는 전류를 따라 음전하를 띠는 pDNA가 그물망 구조인 아가로스겔 내를 통해 +극으로 이동하면서 나타나는 밴드를 통해서 pDNA의 크기를 확인하는 방법이다. 음전하를 띄는 pDNA 전부가 양전하를 띄는 PEI-PEG와 정전기적 인력에 의해 양전하를 띄는 complex를 형성하게 되면 +극 쪽으로 이동하지 않게 되며 밴드가 나타나지 않게 된다. 하지만 PEI-PEG와 complex를 형성하지 못한 pDNA는 음전하를 띄기 때문에 +극 쪽으로 이동하여 아가로스겔 내에서 밴드가 나타나게 된다.

다음 도 2에서와 같이, N/P ratio 4 이상에서는 pDNA가 검출되지 않는, 즉 PEI-PEG와의 완벽한 complex 형성으로 인해 complex를 형성하지 않은 pDNA가 존재하지 않음을 확인할 수 있었다.

1-2) 유전자 전달체의 입자크기 및 표면전하 평가

pDNA/PEI-PEG 전달체의 세포 내로의 이입 및 세포독성에 직접적인 영향을 미치는 pDNA/PEI-PEG 전달체의 입자크기 및 표면전하는 electrophoretic light scattering 8000 (Otsuka Electronics, Japan)를 사용하여 분석하였다. 모든 실험은 3회에 걸쳐 반복실험을 통하여 측정하였으며, 그 결과를 다음 도 3A 및 3B에 나타내었다.

음전하를 띄는 pDNA는 양전하를 띄는 PEI-PEG와 정전기적 인력에 의해 응축되어 complex를 형성하게 된다. N/P ratio가 증가함에 따라 양전하를 띄는 PEI-PEG의 양이 증가하게 되므로 더 큰 정전기적 인력에 의해 pDNA와 PEI-PEG는 표면전하는 높아지고 작은 크기의 complex를 형성하게 된다.

N/P ratio가 4에서 32까지 증가함에 따라, pDNA complex의 입자크기는 210± 17.3nm에서 120.4± 18.2nm 로 감소되고(도 3A), 표면 전하는 0.8± 19mV에서 23.7± 3.4mV로 증가되는 것으로 관찰되었다.(도 3B)

이는 양이온성 고분자인 PEI-PEG의 수소화된 아민과 플라스미드 DNA의 폴리음이온 주쇄 간의 강한 정전기적 상호작용으로 인해 pDNA가 응축(condensation)되어, N/P ratio가 증가함에 따라 표면에 양전하를 띠는 PEI-PEG가 우세하게 형성됨으로 인한 것이다.

1-3) 유전자 전달체의 세포 내 이입효율 및 세포독성 평가

pDNA/PEI-PEG 전달체의 골수줄기세포 (bone marrow mesenchymal stem cell, hBMMSCs)로의 이입 효율을 측정하기 위하여, DMEM/F12 배양액(10% FBS 함유 DMEM/F12, 500 U/mL 페니실린, 및 500mg/mL 스트렙토마이신)에서 37℃, 5% CO₂의 조건의 인큐베이터에서 세포들을 배양시켰다.

상기 세포들을 24-well plate에 5x 10⁴ 개의 세포를 분주하여 24시간 동안 혈청을 포함하는 세포배양액 (DMEM/F-12, 10% FBS, 1% antibiotics)에서 배양하였다. 세포가 80% 정도 confluence된 후, 세포배양액을 제거하고 PBS로 세척한 다음 혈청을 포함하지 않은 세포배양액과 pDNA/PEI-PEG 전달체 (N/P ratio 4, 8, 16, 32)를 혼합한 용액 (0.4ml)을 well에 다시 채워 37℃, 5% CO₂의 조건에서 4시간 동안 배양한 후, 혈청이 포함된 세포배양액으로 교체하여 24시간 동안 배양하였다. 이입 24시간 후, 세포들을 회수하고, 이입 효율을 FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter)를 통해 분석하였으며, 그 결과를 다음 도 4A에 나타내었다.

세포독성은 MTT assay를 이용하여 관찰하였다. pDNA/PEI-PEG 전달체를 골수줄기세포에 처리하여 24시간 동안 배양 후, 5mg/ml의 농도를 갖는 MTT(3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma)용액 (50μl/ml)을 100μl씩 넣고, 4시간 동안 37℃, 5 % CO2 에서 배양시켰다. 보라색 결정이 생성되면 배양액을 제거해주고 dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma) 용액을 1ml씩 넣어 결정이 완전히 녹을 때까지 교반하였다. 96-well plate에 각 실험군을 100μ씩 분주하고 microplate reader(ELISA reader, TECAN, Austria)를 이용하여 590nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과를 다음 도 4B에 나타내었다.

일반적으로, 입자크기가 작고, 유전자 전달체 내에서 양전하가 강할수록, 즉 N/P ratio가 높을수록 더 높은 이입효율을 나타내지만, 강한 양전하를 가지는 유전자 전달체의 경우 독성이 증가되는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서도 다음 도 4A 및 4B에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 실시예 1에 따른 pDNA/PEI-PEG 전달체는 N/P ratio가 증가함에 따라 이입 효율은 증가하고, 세포 독성은 떨어지는 것을 알 수 있다. 이들 중 세포 이입효율 및 세포독성의 고려를 통해 N/P ratio 16을 다공성 고분자 지지체에 도입을 위한 유전자 전달체로 사용하였다.

실험예 2 : 다공성 고분자 지지체의 물성 평가

2-1) Morphology 및 다공도 분석

pDNA/PEI-PEG 전달체(N/P ratio=16)가 탑재된 다공성 고분자 지지체의 표면, 및 단면의 모폴로지를 주사전자현미경(SEM; S-3000N, Hitachi, Japan)을 사용하여 관찰하였으며, 그 결과를 각각 다음 도 5A 와 5B에 나타내었다.

단면 관찰을 위한 샘플은 액체 질소에서 냉동시킨 후 상기 지지체를 잘라 제조하였다. 모폴로지를 측정하기 전에, 상기 지지체 시편을 약 5 x 5 mm의 크기로 잘라 아르곤 분위기에서 platinum으로 진공 증착하여 사용하였다.

또한 지지체의 다공도(porosity)는 Archimedes' principle에 기초한 비중병(Hubbard specific gravity bottle, Hanil, Korea)을 사용하여 측정하였고, 다음 수학식 1에 따라 계산하였다.

( 수학식 1)

Porosity (%) = [(W₂-W₃-W_S)/ρ_e]/[(W₁-W₃)/ρ_e] x 100

상기 식에서, W₁은 에탄올을 가득채운 비중병의 무게, W₂는 지지체와 에탄올이 가득 채워진 비중병의 무게, W₃는 W₂로부터 에탄올이 함유된 지지체를 꺼낸 후 비중병의 무게, W_S는 지지체의 무게, ρ_e는 에탄올의 밀도이다. 따라서, (W₁-W₃)/ρ_e는 기공을 포함하는 지지체의 전체 부피이고, (W₂-W₃-W_S)/ρ_e는 지지체에서 기공의 부피이다.

다음 도 5A와 5B에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 1의 다공성 고분자 지지체는 그 표면과 단면 모두 높은 다공성을 가지며, 표면과 내부의 기공 모양이 거의 동일한 열린 기공 구조(open pore structure)를 가지는 것을 알 수 있다. 이는 세포 점착을 위하여 매우 높은 표면적을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 세포-세포 간의 효율적인 상호작용이 가능하게 한다.

다공성 지지체에 형성된 기공 크기(pore size)는 침전/염침출법에서 첨가된 소금 입자와 동일한 크기(약 100~150㎛)를 가지는 것으로 관찰되었다.

또한, 상기 다공성 고분자 지지체의 다공도는 약 93~95%로 계산되었다. 세포-세포 간 상호작용을 위한 충분한 표면적과 in vitro 세포 배양 중 산소/자양분을 포함한 세포배양액의 세포로의 효율적인 공급 및 extracellular matrix의 재생을 위한 충분한 공간을 제공하기 위해서는 적어도 약 90% 이상의 다공도를 가지는 지지체가 요구되는 것과 비교해 보면, 본 발명에 따른 다공성 지지체는 이러한 모든 조건을 만족하는 우수한 다공성 매트릭스임을 확인할 수 있다.

2-2) 기계적 물성 평가

상기 실시예 1에서 제조된 다공성 고분자 지지체에 포함된 친수성 고분자인 Pluronic F127의 첨가량에 따른 기계적 물성 변화를 비교하였다.

상기 다공성 지지체의 기계적 물성은 본 연구팀에서 직접 고안?제작한 측정 장치를 설치한 UTM 인장기기 (AG-5000G, Shimadzu, Japan)을 이용하여 이축 인장강도 실험 (Bi-axial tensile test)을 시행하였다.

다음 도 6은 상기 기계적 물성 결과를 나타낸 것으로, Pluronic F127의 함량이 증가함에 따라 다공성 지지체의 물성이 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, Pluronic F127의 함량이 5중량% 이하에서는 그 변화가 순수한 PLGA와의 차이가 유의하지 않음도 관찰할 수 있었다.

2-3) 친수성 평가

상기 실시예 1에서 제조된 다공성 고분자 지지체로에 포함된 친수성 고분자인 Pluronic F127의 첨가량에 따른 친수성 정도를 비교하였다.

상기 다공성 지지체의 표면에 물 또는 세포 배양 매질을 떨어뜨렸을 경우, 5중량% 이상의 Pluronic F127을 포함하는 다공성 지지체에서 상기 물 또는 세포 배양액이 지지체 내로 빠르게 흡수되는 것을 관찰할 수 있었다. 이는 지지체의 기공 표면에 노출된 Pluronic F127 내의 친수성 PEG 사슬에 기인된 현상이라 판단된다. 이러한 특성은 세포를 포함한 세포배양액의 지지체내로의 균일한 도입 및 세포 증식/성장에 필수적인 세포배양액이 지지체 내로의 원활한 공급이 가능하므로 조직공학용 다공성 지지체로 유용하게 적용이 가능하리라 판단된다.

그러나, 상기 친수성 고분자인 Pluronic F127를 포함하지 않는 다공성 지지체(대조군 2)에서는 30분 이상의 시간이 지나도 상기 물이나 세포 배양액이 전혀 흡수되지 않는, 즉 PLGA의 소수성에 기인된 특성을 관찰할 수 있었다.

2-4) 유전자 전달체의 방출 거동

실시예 1에서 제조된 다공성 고분자 지지체(직경 7 mm, 두께 2 mm)를 1mL의 PBS (pH 7.4)에 함침시킨 후, 37 ℃, 50 rpm 이상의 속도로 회전하는 항온조에 일정기간 (9주 이상) 동안 보관하였다. 정해진 시간마다 전체 완충용액을 조심스럽게 채취하고 다시 새로운 완충용액을 교환해 주는 방법으로 시료를 채취하였다.

얻어진 완충용액으로부터 용출된 pDNA/PEI-PEG 유전자 전달체의 양을 hoeckst 33342 fluorescence dye (Sigma)를 이용하여 staining 후 fluorescence spectrophotometer (RF-5301 PC, Shimadzu, Japan)를 이용하여 355 nm excitation, 460 nm absorption으로 분석하였으며, 그 결과를 다음 도 7A와 7B에 나타내었다.

다음 도 7A에서와 같이, 소수성 PLGA를 고분자 지지체로 사용한 지지체의 경우, pDNA/PEI-PEG 유전자 전달체는 약 35일까지 방출량이 미미(초기 로딩 양의 10% 미만)하였으며, 이 후 유전자 전달체가 급격히 방출됨을 관찰할 수 있었다. 이러한 방출 거동은 세포 내로의 낮은 초기 이입효율을 유도할 수 있어 바람직하지 못하다.

또한, 양이온성 고분자와 정전기적 상호 작용을 형성한 pDNA/PEI-PEG 전달체에 비해 pDNA만을 사용하는 경우(대조군 1), 지지체로부터 더 빠르게 방출되는 것으로 관찰되었다. 이는 pDNA/PEI-PEG 전달체의 경우 물에 불용성인 데 반해, pDNA는 수용성을 가지기 때문이다.

이에 반해, pDNA/PEI-PEG 전달체를 포함하는 친수성 PLGA/F127를 사용한 본 발명의 다공성 고분자 지지체의 경우, 기간에 상관없이 일정 농도의 pDNA/PEI-PEG 전달체가 지속적으로 방출됨, 즉 유전자 전달체를 효율적으로 세포 내로 이입시킬 수 있음을 관찰할 수 있었다(도 7B).

또한, 본 발명의 실시예 1에 따른 pDNA/PEI-PEG 전달체는 약 8주 동안 일정 농도의 서방형 방출 거동을 나타내는데 (초기 투입량의 약 90%가 방출), 이는 유전자가 세포로 전달되기에 충분하고 안정적인 조건이라고 할 수 있다. 이는 친수화된 PLGA/F127 지지체의 매트릭스 내로 수분 확산 및 고분자 매트릭스의 분해로 설명될 수 있다.

2-5) In vitro 유전자 이입 효율 및 세포독성 평가

PLGA 지지체로부터 pDNA/PEI-PEG 전달체를 지속적으로 방출시켜 BMMSCs의 in vitro 이입 효율과 독성을 관찰하였다. 상기 pDNA/PEI-PEG 전달체는 N/P ratio가 8~32의 범위를 가지는 것과 순수한 pDNA를 대조군으로 하여 N/P ratio 및 지지체의 소수성/친수성에 따라 관찰하였다.

유전자의 세포 내 이입 효율을 측정하기 위하여, 형광 염료인 PKH26(Sigma)가 labeling된 BMMSCs를 상기 다공성 지지체에 도입하고 세포배양용기 (24-well plate)에 위치시켰다.

상기 지지체를 37 ℃, 5% CO₂의 조건에서 2시간 동안 유지시켜 지지체로 세포가 점착되도록 하고, 상기 플레이트에 1mL의 세포 배양액(10% FBS 함유 DMEM/F12, 500 U/mL 페니실린, 및 500mg/mL 스트렙토마이신)을 첨가하였다. 그 다음, 각 지지체 그룹에 있는 세포들을 천천히 교반시키면서(~50 rpm) 2일 동안 37 ℃, 5% CO₂의 조건에서 배양시켰다. 일정시간 (2일) 세포 배양 후, 도입된 세포의 조직학적 평가를 위해 세포가 도입된 지지체를 -20℃에서 동결시키고 각 지지체의 횡방향으로 5㎛ 크기로 절단하였다. 형광현미경 (Olympus, Model BX 51, Japan) 관찰로부터, 지지체 내에 도입된 모든 세포(PKH 26 발현)는 빨간색으로 유전자가 이입된 세포(GFP 발현)는 초록색으로 관찰되며, 유전자 이입 효율은 다음 수학식 2를 통해 계산되었다:

( 수학식 2)

이입 효율(%) = [유전자 이입된 세포 수(초록색)/모든 세포 수(붉은색)] x 100

다음 도 8의 PKH26의 발현으로부터, PLGA 및 PLGA/F127 지지체 내에서 세포들이 모두 균일하게 분포되어 있음을 알 수 있었으며, N/P ratio가 증가함에 따라 pDNA 전달체의 세포 내로의 이입 효율은 지지체의 소수성/친수성에 관계없이 점차적으로 증가함을 관찰할 수 있었다.

그러나, 다음 도 9와 표 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 친수화 처리된 PLGA/F127 지지체는 소수성 PLGA 지지체(대조군 2)에 비해 훨씬 높은 이입 효율을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 이는 친수화 처리된 PLGA/F127 지지체에서 소수성 PLGA 지지체에 비해 보다 많은 양의 pDNA 전달체가 서방형으로 방출되기 때문으로 판단된다.

고분자 지지체	이입 효율(%)
	N/P ratio(8)	N/P ratio(32)
	8	32
PLGA	8.0±1.0	19.0±4.3
PLGA/F127	23.0±1.4	47.0±2.5

또한, 친수화 처리된 PLGA/F127 지지체에서의 유전자 이입 효율이 pDNA 전달체를 세포배양액에 직접 도입한 경우(도 4A 참조)에 비해 약 2배 정도 높은 것을 알 수 있었으며, 이 또한 pDNA 전달체의 서방형 방출과 세포 내로의 지속적인 이입에서 기인된다고 판단된다. 즉, 본 발명에 따른 다공성 지지체로부터 pDNA 전달체의 서방형 방출은 pDNA 전달체를 직접 세포에 이입하는 기존 시스템(도 4A 참조)에 비해 세포 이입효율을 현저하게 개선시킨 것을 알 수 있었다.

서로 다른 N/P ratio를 가지는 pDNA 전달체의 세포 (BMMSCs) 내 이입으로 발생되는 세포 독성을 관찰하기 위하여, 상기 유전자 이입과 동일한 실험이 수행되었으며, 일정시간 배양된 세포의 독성은 MTT assay를 통해 분석되었다. 세포가 배양된 다공성 지지체를 신선한 배양액 1mL을 포함하는 48-well plate에 옮기고, 여기에 MTT (3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma) 용액을 0.1mL씩 넣고, 4시간 동안 37 ℃에서 보관하였다. 배양액을 조심스럽게 제거한 다음, 살아있는 세포들의 미토콘드리아에 의해 형성된 포마잔 침전물에 다이메틸설폭사이드(DMSO, Sigma) 1mL를 첨가하여 완전히 녹을 때까지 교반시켰다. 그 다음, 용액 내의 포마잔의 흡광도(optical density, OD) 값을 precision microplate reader를 이용하여 590 nm에서 흡광도를 측정하였으며, pDNA를 포함하지 않는 지지체에서 배양된 세포들을 대조군 (세포 생존율을 100%로 가정)으로 사용하여 이들의 세포 독성을 평가하였다.

다음 도 10은 지지체로부터 방출된 pDNA 전달체의 이입에 의한 BMMSCs의 독성 결과로서, MTT assay에 의해 측정되었다. 결과에서 확인할 수 있듯이, 다공성 고분자 지지체에서 서방형으로 방출된 pDNA 전달체에서 N/P ratio가 16까지는 세포독성이 거의 없었으며, N/P ratio 32에서 다른 군들에 비해 세포독성이 다소 나타나고 있으나 (세포 생존율: N/P ratio 8, ~ 98 %; N/P ratio 16, ~ 97 %; N/P ratio 32, ~ 80 %), 기존 pDNA 전달체의 세포 내 이입에 의한 세포독성(세포 생존율: N/P ratio 8, ~ 40 %; N/P ratio 16, ~ 20 %; N/P ratio 32, ~ 17 %)에 비해 현저히 낮은 세포독성을 나타냄을 관찰할 수 있었으며, 이는 세포독성을 나타내지 않을 정도의 pDNA 전달체가 지지체로부터 서방형으로 방출되기 때문으로 판단된다. 즉, 본 발명에 따른 다공성 지지체로부터 pDNA 전달체의 서방형 방출은 pDNA 전달체를 직접 세포에 이입하는 기존 시스템(도 4B 참조)에 비해 세포독성을 현저하게 개선시킨 것을 알 수 있었다.

Claims

유전자 전달체를 매트릭스에 포함하는 다공성 고분자 지지체이고,
상기 유전자 전달체는 다공성 고분자 지지체로부터 서방형으로 방출되는 것을 특징으로 하는 다공성 고분자 지지체.
제 1항에 있어서, 상기 다공성 고분자 지지체는 친수성 고분자에 의해 친수화 처리된 생분해성 고분자인 것을 특징으로 하는 다공성 고분자 지지체.
제 2항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 중량평균분자량 1,000~1,000,000 g/mol인 락틱산, 글리콜산, 카프로락톤, 다이옥산온, 하이드록시부티릭산, 하이드록시발러릭산, 포스포에스터, 에틸렌 옥사이드의 중합체 및 이들의 공중합체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 다공성 고분자 지지체.
제 2항에 있어서, 상기 친수성 고분자는 중량평균분자량 1,000~1,000,000 g/mol인 에틸렌 옥사이드(ethylene oxide, -CH₂CH₂O) 또는 하이드록시 (hydroxy, -OH) 작용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 다공성 고분자 지지체.
제 4항에 있어서, 상기 친수성 고분자는 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드 공중합체(polyethyleneoxide-polypropyleneoxide copolymer,PEO-PPO), 폴리에틸렌옥사이드-폴리락틱산 공중합체(polyethylene oxide-co-polylactic acid, PEO-PLA), 폴리에틸렌옥사이드-폴리락틱글리콜산 공중합체(polyethylene oxide-poly(lactic-co-glycolic acid) (PEO-PLGA)), 폴리에틸렌옥사이드-폴리카프로락톤 공중합체(polyethylene oxide-polycaprolactone, PEO-PCL), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리비닐알콜(PVA), 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르류(polyoxyethylene alkyl ethers, Brij Series), 폴리옥시에틸렌 케스터 오일 유도체류(polyoxyethylene castor oil derivatives, Cremophores), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 페티 에시드 에스터류(polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, Tween Series), 및 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류 polyoxyethylene stearates)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 다공성 고분자 지지체.
제 2항에 있어서, 생분해성 고분자 1에 대하여 친수성 고분자가 0.001 ? 0.2 중량비로 포함되는 것을 특징으로 하는 다공성 고분자 지지체.
제 1항에 있어서, 상기 다공성 고분자 지지체는 기공 크기가 50~600㎛이고, 다공도(porosity)가 80~98%인 것을 특징으로 하는 다공성 고분자 지지체.
제 1항에 있어서, 상기 다공성 고분자 지지체는 그 표면과 내부의 기공도가 거의 동일한 열린 기공 구조(open pore structure)를 가지는 것을 특징으로 하는 다공성 고분자 지지체.
제 1항에 있어서, 상기 유전자 전달체는 상기 다공성 고분자 지지체 내에서 8주 동안 5~95%의 서방형 방출 거동을 나타내는 것을 특징으로 하는 다공성 고분자 지지체.
유전자 전달체와 고분자 용액을 혼합시키는 단계,
상기 혼합물에 소금 입자를 혼합시키는 단계,
이를 일정한 몰드에 채우는 단계,
침전/염침출시키는 단계, 및
세척/동결건조시키는 단계를 포함하는 다공성 고분자 지지체의 제조방법.
제1항에 따른 다공성 고분자 지지체를 이용한 세포 분화 유도용 유전자 전달 시스템.