CN103901093A - 制备亲疏水相间的微阵列芯片及其用于质谱成像定量分析的方法 - Google Patents
制备亲疏水相间的微阵列芯片及其用于质谱成像定量分析的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于化学分析技术领域,公开了一种制备亲疏水相间的微阵列芯片及其用于质谱成像定量分析的方法,包括如下步骤:选取疏水性聚合物;采用丝网印刷技术将疏水性聚合物按照设计好的模板刷在导电玻璃上,形成明晰均一的亲水区和疏水区;将待测混合物体系水溶液均匀地铺在亲水区,形成芯片;将芯片烘干固化;在芯片表面均匀铺上使待测混合物体系水溶液离子化的基质溶液;待芯片干燥后形成样品;用质谱成像的方法测量样品的质谱图;将相同面积内样品质谱成像后的图谱用数学方法进行处理,进行定量分析。本发明自动化程度高,操作简单,灵敏度高,对被测物的检测灵敏度达到10-15mol/L,样品用量少,低至微升级。
Description
技术领域
本发明属于化学分析技术领域,特别是一种制备亲疏水相间的微阵列芯片及其用于质谱成像定量分析的方法。
背景技术
微阵列芯片(Microarray)以高密度阵列为特征。其基础研究始于20世纪80年代末,本质上是一种生物技术,主要是在生物遗传学领域发展起来的。微阵列技术就是利用分子杂交原理,使同时被比较的标本与微阵列杂交,通过检测杂交信号强度及数据处理,把他们转化成不同标本中特异基因的丰度,从而全面比较不同标本的基因表达水平的差异。微阵列芯片因其高度均一性,结构稳定性,样品用量少及高通量而成为芯片领域中发展最迅速的一部分。微阵列不仅仅在生物遗传领域有着广泛的用途,在其他定量和相对定量分析方面也有着潜在的用途。
二十世纪发展起来的质谱成像技术(Imaging Mass Spectrometry, IMS),是在专门的质谱成像软件控制下,使用一台通过测定质荷比来分析生物分子的标准分子量的质谱仪来完成的。质谱成像这种最新原位分析技术从其发展起来到现在,主要是利用质谱直接扫描生物样品,分析分子在细胞或组织中的 “结构、空间与时间分布”信息。以质谱为基础的成像方法不局限于特异的一种或者几种待测物,可在样品中找到每一种感兴趣的待测物分子,而事先无需知道所检测物质的信息,不需要对待测物进行标记,分析物可以其最初的形态被检测,同时可对这些分子含量进行相对定量。质谱成像检测到的是每个点的质荷比(m/ z)信息,然后将各个点的分子量信息转化为照片上的像素点。在每个点上,所有质谱数据经平均化处理获得一幅代表该区域内化合物分布情况的完整质谱图。图像中的彩色斑点代表化合物的定位,每个斑点颜色的深浅与激光在每一个点或像素上检测到的信号大小相关。
微阵列芯片因其微孔尺寸相同,微孔与周围亲疏水性质的差别,很好得限制了样品所处的范围,使得所分析的区域保持一致,使定量分析成为可能。质谱成像因为其无需标记,无需分离,通过对图像的分析来进行混合物中组成物质的定量分析,使多组分的同时检测成为可能,因此利用微阵列芯片中质谱成像进行多组分的同时定量分析,是一种具有广泛应用前景的定量分析技术。但是能实现多组分同时定量分析的方法主要是色谱法,因其需要对分离的方法进行探索,检测限也因不同检测方法而有所限制,所以微阵列芯片质谱成像技术对于检测低含量混合物具有很多优良的特色。微阵列芯片中质谱成像在定量分析中的应用很大程度上取决于定量的标准,由于质谱数据采集中的质量歧视,质谱图的峰高或峰面积无法作为样品的定量分析的依据,因此如何获得可靠的,稳定的定量数据就显得尤为重要。
制备微阵列芯片的方法很多,包括旋涂技术(spin-coating), 静电纺丝(electrospinning),丝网印刷(screen printing)等。旋涂技术因其实现的原理不容易获得亲疏水相间的微孔结构,最适合于制作均匀的平面二维结构;静电纺丝技术简单,但是其制备的纳米纤维间存在间隙,无法得到完全亲疏水相间的结构,容易造成待测亲水物质的渗漏。丝网印刷技术因其方法易行,设备简单,能制备均一的亲疏水间隔的微阵列芯片结构而在质谱成像定量分析方面有着潜在的应用。发展方便易得,稳定的制作微阵列芯片的研究并将其应用于实际样品的检测,对于微阵列芯片质谱成像的方法指导及实际应用有着重大意义。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明提供一种制备亲疏水相间的微阵列芯片及其用于质谱成像定量分析的方法,实现质谱成像用于某些生物分子,小分子化合物及高分子聚合物的定量分析。
本发明采取的技术方案是:
一种制备亲疏水相间的微阵列芯片及其用于质谱成像定量分析的方法,其特征在是,包括如下步骤:
a)选取疏水性聚合物,所述疏水性聚合物能够在导电玻璃表面形成亲疏水相间的结构;
b)采用丝网印刷技术将所述疏水性聚合物按照设计好的模板刷在导电玻璃上,形成明晰均一的亲水区和疏水区;
c)将待测混合物体系水溶液均匀地铺在所述亲水区,形成芯片;
d)将所述芯片烘干固化;
e)在芯片表面均匀铺上使所述待测混合物体系水溶液离子化的基质溶液;
f) 待所述芯片干燥后形成样品;
g)用质谱成像的方法测量所述样品的质谱图;
h) 将相同面积内样品质谱成像后的图谱用数学方法进行处理,进行定量分析。
进一步,所述疏水性聚合物为聚二甲基硅氧烷或聚甲基丙烯酸甲酯。
进一步,所述亲水区为半径0.4毫米至1毫米的圆形或方形。
进一步,所述导电玻璃为ITO玻璃或镀金玻璃。
进一步,所述步骤d)中,将所述芯片在烘箱中60摄氏度固化2h。
进一步,在所述的步骤e)中,所述基质溶液通过直接点样、化学打印机打印或喷壶喷洒的方式铺在所述芯片表面。
进一步,在所述的步骤g)中,所述质谱成像的方法包括基质辅助激光解吸飞行时间质谱、表面增强激光解吸电离飞行时间质谱和二次离子质谱中的一种或多种。
进一步,所述质谱成像的方法是对多组分进行同时定量检测的。
进一步,所述步骤h)中包括对相同面积内样品质谱成像后的图谱进行图像识别,图像灰度的计算,图像色彩的计算。
进一步,所述待测混合物体系水溶液为化学样品或生物样品。
本发明的有益效果是:
(1)本发明通过丝网印刷技术将疏水聚合物均匀地铺展在导电玻璃上,形成亲疏水相间的微阵列芯片结构,从而可以严格控制待分析的区域,成为质谱成像定量分析成功的有力外加条件;
(2)本发明通过选择疏水性聚合物材料,使样品能严格地限制在导电玻璃的裸露区域,基质喷涂面积也一致,分析面积严格保持一致;
(3)本发明通过质谱成像的方法,在均一面积的微阵列中对待测物进行分析,可以实现多成分同时的分析,而无需进行繁琐的分离方法的建立,减少了冗长的分离步骤。对不同待测物可以通过选择不同的基质满足不同的需求;
(4)本发明通过对质谱图像的分析,如可以通过灰度的加和与浓度之间的关系,实现待测物的定量分析;
(5)本发明通过质谱成像的方法,可以实现极低浓度的待测物的检测,实现低含量物质的快速检测的应用。
附图说明
附图1是本发明的芯片结构示意图;
附图2是为不同浓度多肽P14R (合成多肽 (M+H)+=1533.8582)的MALDI TOF质谱成像图,其中浓度从左到右从上到下依次为5fmol, 20fmol,50fmol,100fmol,200fmol, 400fmol, 600fmol,800 fmol;
附图3为多肽P14R (合成多肽, (M+H)+=1533.8582)的定量分析关系曲线。
附图中的标号分别为:
1.玻璃; 2.导电层;
3.亲水区; 4.疏水区。
具体实施方式
下面结合附图对本发明制备亲疏水相间的微阵列芯片及其用于质谱成像定量分析的方法的具体实施方式作详细说明。
本发明在于解决质谱成像用于定量分析的需求,提出一种用高分子材料涂覆在导电玻璃上形成均一微阵列芯片结构的方法,实现质谱成像用于某些生物分子,小分子化合物及高分子聚合物的定量分析。所得到的聚合物微阵列芯片结构均一,性能稳定,通过对质谱成像得到图像的分析,能实现待测物浓度和图像灰度之间的定量关系,灵敏度很高,如对2×10-15mol/L 的多肽P14R (合成多肽)能获得稳定的质谱图像。
本发明通过丝网印刷技术,将疏水性的高分子聚合物均匀地涂覆在导电玻璃上,因丝网印刷技术可以使用任意形状的模板,使得微阵列芯片上孔洞的结构可以任意地调节,利用聚合物的疏水性以及导电玻璃表面的亲水性差异,使得待测的亲水性物质均匀铺展在亲水性的导电玻璃表面,从而达到严格控制待测物的铺展面积,也即质谱成像所分析的面积。实验结果表明该方法能获得均一尺寸的微阵列,亲疏水界限明显,对于利用质谱成像来进行定量分析及实际应用有着重要的作用。
本发明的制备亲疏水相间的微阵列芯片及其用于质谱成像定量分析的方法,通过以下步骤实现:
第一步:选取疏水性聚合物,疏水性聚合物能够在导电玻璃表面形成亲疏水相间的结构,疏水性聚合物需疏水性强,易于获得,易于形成任意所需的形状,可选择聚二甲基硅氧烷(PDMS)或聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)。
第二步:采用丝网印刷技术将疏水性聚合物按照设计好的模板刷在导电玻璃上,形成明晰均一的亲水区和疏水区,丝网印刷的模板中分析阵列区域为半径0.4毫米~1毫米的均一形状,如圆形,方形及其他任意形状。导电玻璃可为商业化的ITO玻璃,镀金玻璃,或者自己加工的其他导电玻璃。
第三步:将待测混合物体系水溶液均匀地铺在亲水区,形成芯片,待测混合物水溶液体系包括各种离子化效果好的水溶性化合物混合体系。待测混合物体系水溶液为化学样品或生物样品。
第四步:将芯片烘干固化,通过在烘箱中60摄氏度固化2h。
第五步:在芯片表面均匀铺上使待测混合物体系水溶液离子化的基质溶液,可通过基质喷涂设备将基质均匀地铺在样品表面,其方法可以是直接点样,化学打印机打印,喷壶喷洒。
第六步:待芯片干燥后形成样品。
第七步:用质谱成像的方法测量样品的质谱图,质谱成像的方法包括基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI TOF MS)、表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI TOF MS)和二次离子质谱(SIMS)等等,可以是其中的一种或多种。质谱成像的方法可以是对多组分进行同时定量检测的。
第八步:将相同面积内样品质谱成像后的图谱用数学方法进行处理,进行定量分析。本步骤包括对相同面积内样品质谱成像后的图谱进行图像识别,图像灰度的计算,图像色彩的计算。
下面通过一个具体实施例对本发明作详尽说明。
高分子疏水聚合物有很多种,下面以聚二甲基硅氧烷结合丝网印刷和MALDI TOF质谱成像技术为例,并结合附图对本发明作进一步说明。
(1)亲疏水相间的微阵列芯片的制作。
参见附图1,在玻璃1设置导电层2,形成导电玻璃,这里以ITO玻璃为例。然后制作一块具有半径1mm的圆形微阵列结构的丝网印刷模板。将PDMS 与固化剂按质量比10:1的比例混合均匀,脱除气泡,将混合物利用丝网印刷技术依照模板的结构刷在ITO玻璃上,在ITO玻璃上形成亲水区3和疏水区4,之后放置在烘箱中60摄氏度固化2h,烘干待用。
(2)样品和基质的喷涂。
将2μL多肽混合物(包括Angiotensin II (M+H)+=1046.5423,P14R (合成多肽, (M+H)+=1533.8582) ACTH fragment 18-39 (M+H)+=2465.1989)直接点样在微阵列芯片中的亲水微孔中。 待样品干燥后将2μL的10mg/mL 的α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)用枪头直接点样覆盖在样品表面,干燥待用。
(3)待测物的质谱成像。
将喷涂有待测物的微阵列芯片引入到MALDI TOF质谱仪中,固定每个微孔成像分析时的激光轰击的间隔为100μm,设定成像分析的区域为大约3mm×3 mm,略大于微孔面积。对三组分含量均为5fmol, 20fmol,50fmol,100fmol,200fmol, 400fmol, 600fmol,800 fmol的各个微孔均进行相同的处理,采集质谱图像。
(4)质谱图像的分析
将得到的质谱图像利用BIOMAP软件进行分析,提取每个质量数的成分的质谱成像图,将不同浓度成的图像做相同的处理,得到每种组分的不同浓度的质谱图像组,附图2为P14R (合成多肽, (M+H)+=1533.8582)的不同浓度的质谱图像。另外两个组分得到与图2类似的质谱图像。
(5)待测组分定量曲线的获得
对图像进行分辨收集被测物的像素,对其灰度值进行加和,不同浓度样品的灰度加和值与浓度绘制标准曲线,其在一定浓度范围呈线性关系。如对P14R (合成多肽),在5fmol~800fmol范围内有良好的线性关系,检测限可达2fmol。其结果参见附图3。另外两个组分的线性关系图与图3类似。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种制备亲疏水相间的微阵列芯片及其用于质谱成像定量分析的方法,其特征在于:包括如下步骤:
a)选取疏水性聚合物,所述疏水性聚合物能够在导电玻璃表面形成亲疏水相间的结构;
b)采用丝网印刷技术将所述疏水性聚合物按照设计好的模板刷在导电玻璃上,形成明晰均一的亲水区和疏水区;
c)将待测混合物体系水溶液均匀地铺在所述亲水区,形成芯片;
d)将所述芯片烘干固化;
e)在芯片表面均匀铺上使所述待测混合物体系水溶液离子化的基质溶液;
f) 待所述芯片干燥后形成样品;
g)用质谱成像的方法测量所述样品的质谱图;
h) 将相同面积内样品质谱成像后的图谱用数学方法进行处理,进行定量分析。
2.根据权利要求1所述的制备亲疏水相间的微阵列芯片及其用于质谱成像定量分析的方法,其特征在于:所述疏水性聚合物为聚二甲基硅氧烷或聚甲基丙烯酸甲酯。
3.根据权利要求1所述的制备亲疏水相间的微阵列芯片及其用于质谱成像定量分析的方法,其特征在于:所述亲水区为半径0.4毫米至1毫米的圆形或方形。
4. 根据权利要求1所述的制备亲疏水相间的微阵列芯片及其用于质谱成像定量分析的方法,其特征在于:所述导电玻璃为ITO玻璃或镀金玻璃。
5.根据权利要求1所述的制备亲疏水相间的微阵列芯片及其用于质谱成像定量分析的方法,其特征在于:所述步骤d)中,将所述芯片在烘箱中60摄氏度固化2h。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的制备亲疏水相间的微阵列芯片及其用于质谱成像定量分析的方法,其特征在于:在所述的步骤e)中,所述基质溶液通过直接点样、化学打印机打印或喷壶喷洒的方式铺在所述芯片表面。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的制备亲疏水相间的微阵列芯片及其用于质谱成像定量分析的方法,其特征在于:在所述的步骤g)中,所述质谱成像的方法包括基质辅助激光解吸飞行时间质谱、表面增强激光解吸电离飞行时间质谱和二次离子质谱中的一种或多种。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的制备亲疏水相间的微阵列芯片及其用于质谱成像定量分析的方法,其特征在于:所述质谱成像的方法是对多组分进行同时定量检测的。
9.根据权利要求1至5中任一项所述的制备亲疏水相间的微阵列芯片及其用于质谱成像定量分析的方法,其特征在于:所述步骤h)中包括对相同面积内样品质谱成像后的图谱进行图像识别,图像灰度的计算,图像色彩的计算。
10.根据权利要求1至5中任一项所述的制备亲疏水相间的微阵列芯片及其用于质谱成像定量分析的方法,其特征在于:所述待测混合物体系水溶液为化学样品或生物样品。
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