CN107192757A - 一种质谱两用检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于飞行时间质谱检测蛋白和核酸的通用芯片，其中所述芯片包括：(1)芯片主体：主体表面具有微整列排列的亲水性点样孔和疏水性孔外区；(2)由金属底板构成的芯片适配器，其中该适配器表面分布多个与芯片主体匹配的芯片卡槽，其中，芯片主体选自质地坚韧、平面度佳的单面抛光的金刚石、单晶硅、石英晶体的芯片，所述亲水性点样孔覆盖150‑800nm的亲水性薄膜，疏水性孔外区覆盖150nm‑2μm疏水性薄膜，其表面水滴接触角＞120°；其中预先使用覆盖基质溶液对点样孔进行预处理，所述基质溶液选自用于蛋白质谱的基质溶液，或基质溶液选自用于核酸质谱的基质溶液。

Description

一种质谱两用检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种用于飞行时间质谱检测蛋白和核酸的两用芯片，能质谱检测蛋白和核酸分子，属于质谱检测领域。

背景技术

蛋白质组学(proteomics)是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋白质与蛋白质的相互作用，是功能基因组学时代一门新的科学。包括鉴定蛋白质的表达、修饰形式、结构、功能和相互作用等。根据研究目的，蛋白质组学可以分为表达蛋白质组学、结构蛋白质组学和功能蛋白质组学。表达蛋白质组学用于细胞内蛋白样品表达的定量研究。以绘制出蛋白复合物的结构或存在于一个特殊的细胞器中的蛋白为研究目的的蛋白质组学称为结构蛋白质组学，用于建立细胞内信号转导的网络图谱并解释某些特定蛋白的表达对细胞的作用[2]。功能蛋白质组学以细胞内蛋白质的功能及蛋白质之间的相互作用为研究目的，通过对选定的蛋白质组进行研究和分析，能够提供有关蛋白质的磷酸化、糖基化等重要信息。

蛋白质组学研究的核心就是能够系统的鉴定一个细胞或组织中表达的每一个蛋白质及蛋白质的性能。蛋白质组学的主要相关技术有双向凝胶电泳、双向荧光差异凝胶电泳、质谱分析等[2]。由于蛋白质的高度复杂性和大量低丰度蛋白质的存在，对分析技术提出了巨大挑战，生物质谱技术则是适应这一挑战的必然选择，近期飞速发展的即为MALDI-TOF质谱。

基于MALDI-TOF质谱的蛋白质组学技术用于微生物鉴定和分类与传统的方法以及现在主要在用的自动化仪器相比，具有以下特点：

①操作简单、快速。可将单个微生物菌落或其它生物材料直接加到MALDI样品靶上并使用MALDI-TOF质谱仪进行分析，谱图识别可以在几分钟内完成，且数据评估同测定直接连接。这种简单且唯一的工作流程对于 绝大多数微生物的鉴定是足够的，且不需要进行革兰氏染色、氧化酶测试或PCR引物和条件选择。

②重复性好。在很宽的条件范围内，MALDI方法都被证明是很稳定的。生长培养基的不同组成对峰模式分布影响非常小，如在从4000到12000Da的范围内，几乎没有观察到培养基的影响。同样，细胞的生长状态对峰模式也没有影响，缓慢生长期的细胞与对数生长期、平台期或者死亡期的细胞具有相似的模式。在标准条件下进行样本制备和测量后，在不同的MALDI-TOF仪器上获取的质谱谱图具有很高的可比性，如在3个不同的仪器上，对同一样本靶测量的谱图实际上是一致的。因此，来自于不同MALDI-TOF质谱仪的谱图可以用来建立真实可靠的数据库。这种高重复性是建立在对稳定表达的高丰度的蛋白质测量基础上的，如核糖体蛋白质。在很少出现代谢物的2000到20000Da质量范围内，波谱图可被观察到。与活细胞相比，细菌芽孢可以产生明显不同的峰模式，而且这些“芽孢谱图”也具有重复性。目前，仪器的高灵敏度可以检测到低至100ng或10⁵个细胞。而对于使用CLIN-TOF仪器，25ng的生物材料就能满足需求。

③准确度高。MALDI-TOFMS获得的蛋白指纹图谱用作模式匹配，匹配分值用作鉴定结果的分级和归类。MALDI软件对所得的图谱进行分析统一化，这种校正和统计运算保证了鉴定的精确性，目前可鉴定背离了5000ppm的质谱图。蛋白指纹主要集中在2-20kDa受到微生物生长环境和状态影响很小的持续高表达蛋白。

生物质谱以其无可比拟的优越性成为蛋白质组学研究中必不可少的技术平台。随着质谱的灵敏度、精确度和高通量的不断发展，质谱在蛋白质组学研究中扮演者越来越重要的角色。它在蛋白质鉴定、序列分析、定量、翻译后加工及蛋白质的相互作用等方面已得到了较广泛的应用。同样，MALDI-TOF质谱的高灵敏度、高精确度和高通量在基因组学检测领域优势也尤为突出。

基因组研究应该包括两方面的内容：以全基因组测序为目标的结构基因组学(structural genomics)和以基因功能鉴定为目标的功能基因组学(functionalgenomics)，又被称为后基因组(postgenome)研究，成为系统生物学的重要方法。

基因组DNA测序是人类对自身基因组认识的第一步。随着测序的完成，功能基因组学研究成为研究的主流，它从基因组信息与外界环境相互作用的高度，阐明基因组的功能。功能基因组学的研究内容：人类基因组DNA序列变异性研究、基因组表达调控的研究、模式生物体的研究和生物信息学的研究等。

(1)基因组表达及调控的研究。在全细胞的水平，识别所有基因组表达产物mRNA和蛋白质，以及两者的相互作用，阐明基因组表达在发育过程和不同环境压力下的时、空的整体调控网络。

(2)人类基因信息的识别和鉴定。要提取基因组功能信息，识别和鉴定基因序列是必不可少的基础工作。基因识别需采用生物信息学、计算生物学技术和生物学实验手段，并将理论方法和实验结合起来。基于理论的方法主要从已经掌握的大量核酸序列数据入手，发展序列比较、基因组比较及基因预测理论方法。识别基因的生物学手段主要基于以下的原理和思路：根据可表达序列标签(STS)；对染色体特异性cosmid进行直接的cDNA选择；根据CpG岛；差异显示及相关原理；外显子捕获及相关原理；基因芯片技术；基因组扫描；突变检测体系，等等。

(3)基因功能信息的提取和鉴定。包括：人类基因突变体的系统鉴定；基因表达谱的绘制；“基因改变-功能改变”的鉴定；蛋白质水平、修饰状态和相互作用的检测。

(4)在测序和基因多样性分析。人类基因组计划得到的基因组序列虽然具有代表性，但是每个人的基因组并非完全一样，基因组序列存在着差异。基因组的差异反映在表型上就形成个体的差异，如黑人与白人的差异，高个 与矮个的差异，健康人与遗传病人的差异，等等。出现最多基因多态性就是单核苷酸多态性(SNPs)。

(5)比较基因组学。将人类基因组与模式生物基因组进行比较，这一方面有助于根据同源性方法分析人类基因的功能，另一方面有助于发现人类和其他生物的本质差异，探索遗传语言的奥秘。

MALDI-TOF飞行时间质谱完成的SNP检测准确率可达99.9％，除了准确性高、灵活性强、通量大、检测周期短等优势外，最有吸引力的应该还是它的性价比。MALDI-TOF飞行时间质谱平台是国际通用的基因单核苷酸多态性(SNP)的研究平台，该方法凭借其科学性和准确性已经成为该领域的新标准。

虽然MALDI-TOF飞行时间质谱能够用于检测蛋白或核酸分子，但从应用角度来看，传统的MALDI芯片应用领域单一，如SHIMADZU生产的DE1580TA钢片靶板，只用于蛋白微生物鉴定，适用于SHIMADZU的MALDI-TOF AXIMA；AGENA生产的L24 SpectroCHIP芯片，只用于基因检测，适用于AGENA的MALDI-TOF MASSARRY，目前未见到能同时覆盖基因组学检测或蛋白质组学鉴定两种检测领域的芯片。

从质谱芯片材质与表面特性角度来看，传统的金属芯片，反复使用，有划痕，且表面没有化学改性处理，结晶形态差，质谱检测样本峰的准确度低，信噪比低，基线高。并且对于核酸样品而言，微小核酸残留会影响质谱结果。因此，金属类芯片主要用于蛋白质谱检测，不能跨界检测核酸样品。而核酸芯片主要使用硅片材质，但价格昂贵，并且基质配方被国外垄断，并且采购的进口芯片，表面已经直接覆盖基质，限制了其不能用于蛋白质谱。

因此，目前需要一种能用于飞行时间质谱检测蛋白和核酸的通用芯片，以及芯片表面覆盖的基质配方。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的第一目的是提供一种能用于飞行时间 质谱检测蛋白和核酸的通用芯片，包括：

(1)芯片主体：主体表面具有微整列排列的亲水性点样孔和疏水性孔外区；

(2)由金属底板构成的芯片适配器，其中该适配器表面分布多个与芯片主体匹配的芯片卡槽；

其中，芯片主体选自质地坚韧、平面度佳的金刚石、单晶硅、石英晶体的芯片；

所述亲水性点样孔覆盖150-800nm的亲水性薄膜，疏水性孔外区覆盖150nm-2μm疏水性薄膜，其表面水滴接触角＞120°。

在一个实施方案中，所述亲水性薄膜为二氧化硅氧化物薄膜、氧化锌薄膜、氧化铝薄膜等，疏水性孔外区通过硅烷偶联剂进行处理形成疏水性薄膜。在一个具体实施方案中，所述硅烷偶联剂选自乙烯基硅烷、氨基硅烷或二甲基二氯硅烷。

在另一实施方案中，所述芯片是单面抛光的硅芯片或石英芯片，所示亲水性点样孔层薄膜厚度为500nm，所述孔外区的接触角为＞120°，优选约135°、155°。

在一个实施方案中，所述芯片上的亲水点样孔数量为24、40、70、384等孔，或根据实际临床试验或科研过程中生物样本的检测量设置，亲水性点样孔的形状可以选择圆形，正方形，三角形，多边形等。在一个具体实施方案中，所述亲水性点样孔的孔径范围为0.5-2.8mm，所述芯片尺寸为20×30-83×125mm。在另一具体实施方案中，亲水点样区为圆形，直径为0.7mm，依据圆孔直径选择适当的基质用量，如0.5μl，滴定生物标志物样本， 结晶形态规则，晶向均一为最佳。

在其他实施方案中，所述芯片适配器可以根据芯片尺寸设计不同的卡槽，卡槽尺寸为20×30-83×125mm，以实现一个适配器保证不同规格的芯片进入检测室。

在另一实施方案中，所述适配器上的微阵列芯片卡槽，可以根据需要设计不同的形状，例如正方形，长方形等，每个卡槽尺寸为20×20mm-25×60mm。在一个具体实施方案中，芯片适配器的卡槽为2、4、6、8、12、16或20个。

在另外的实施方案中，所述芯片表面平面度小于10μm。在一个具体实施方案中，所述芯片预先通过化学机械抛光(chemical mechanism polish,CMP)被处理具有单面抛光镜面效应。通过CMP方法，对芯片进行两次抛光，粗抛与细抛。粗抛目的是去除芯片表面残留的机械损伤，一般从表面除去30um范围内的厚度。细抛目的是去除第一次抛光在芯片表面留下的轻微损伤和云雾状缺陷，一般从表面除去2～3um。经过两次抛光的芯片表面具有镜面效应，在质谱检测过程中，通过照明、光路反射及摄像头实时显示，可以直接观测芯片表面样本被轰击的情况，改变激光轰击的位置，得到最佳图谱。在一个更具体实施方案中，所述芯片是单面抛光的硅芯片或石英芯片。

本发明第二目的是提供一种对亲水性点样孔的表面进行覆盖基质预处理的两用芯片，其中在上述方案的基础上，预先使用覆盖基质溶液对点样孔进行预处理。

在一个实施方案中，当基质溶液选自用于蛋白质谱的基质溶液时，该芯片可用于质谱检测蛋白。在另一实施方案中，当基质溶液选自用于核酸质谱的基质溶液时，该芯片可用于质谱检测核酸。

在一个具体实施方案中，用于质谱检测蛋白的基质选自α-氰-4-羟基肉桂酸(CHCA)、3，5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸(SA)，用于质谱检测核酸的基质是3-羟基-2-吡啶甲酸。

本发明第三目的是提供用于制备飞行时间质谱检测蛋白和核酸的两用芯片，包括：

(1)选用质地坚韧、平面度佳的芯片作为基底或芯片主体；

(2)对芯片表面进行亲水处理；

(3)用光刻胶对亲水性点样孔的封闭处理；

(4)用硅烷偶联剂处理芯片；

(5)对光刻胶封闭的点样区进行恢复处理；

(6)将芯片与金属芯片适配器进行匹配安装。

在一个实施方案中，步骤(2)中通过氧气流速60～140ml/min，功率100～300W，处理时间1～10min；再用高纯水对基底表面超声清洗2～3次，每次时间为2～5min，使表面彻底清洁并羟基化。

在另一实施方案中，步骤(3)中采用旋涂的方法将光刻胶旋涂于处理过的基底上，旋涂速度为1000～8000rpm，然后置于光刻掩膜板下，在390nm的紫外光下曝光20s～5min后用相应的显影液洗脱后，从而构筑出有序结构的点样孔区。其中光刻胶使用耐酸性的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚苯乙烯。

在其他实施方案中，步骤(4)中包括：

(i)清洗芯片：将先后浸入丙酮、甲醇水溶液、氯仿，分别清洗后，取出干燥；

(ii)在加热条件下，将浓酸和双氧水缓慢加入含有芯片的水溶液中，进行充分氧化反应后，分别在氯仿、超纯水中进行清洗，该步骤可重复多次；

(iii)将芯片置于干净容器中，加入预先水解的硅烷偶联剂溶液，并加入氨水催化，直至硅烷化反应充分完成；

(iv)取出芯片，分别置于乙醇、超纯水、氯仿中，超声清洗；

(v)将清洗后的芯片，测量并选择接触角＞120°的芯片，作为合格芯片；

在一个实施方案中，步骤(5)中包括：

(i)将硅烷化处理后的芯片，放入去胶液中，浸泡3小时；

(ii)芯片取出，放入丙酮溶液中，超声处理2分钟，

即可去掉光刻胶，恢复点样区亲水表面，形成有亲疏水差异的微阵列芯片表面。

在一个具体实施方案中，去胶液为聚乙二醇单丁醚或聚二甲基硅氧烷溶液。

在另一个实施方案中，步骤(1)所述芯片是质地坚韧、平面度佳的金刚石、单晶硅、石英晶体的芯片。在一个具体实施方案中，所述芯片预先通过化学机械抛光(chemicalmechanism polish,CMP)被处理具有单面抛光镜面效应。通过CMP方法，对芯片进行两次抛光，粗抛与细抛。粗抛目的是去除芯片表面残留的机械损伤，一般从表面除去30um范围内的厚度。细抛目的是去除第一次抛光在芯片表面留下的轻微损伤和云雾状缺陷，一般从表面除去2～3um。经过两次抛光的芯片表面具有镜面效应，在质谱检测过程中，通过照明、光路反射及摄像头实时显示，可以直接观测芯片表面样本被轰击的情况，改变激光轰击的位置，得到最佳图谱。在一个更具体实施方案中，所述芯片是单面抛光的硅芯片或石英芯片。

在另一个实施方案中，步骤(4)所述硅烷偶联剂选自乙烯基硅烷、氨基硅烷、二甲基二氯硅烷。其中，二甲基二氯硅烷生长疏水膜操作简单，接触较大，疏水性佳，疏水层厚度能达到纳米至微米量级，因此硅烷偶联剂优选是二甲基二氯硅烷。在一个具体实施方案中，被所述偶联剂整体硅烷化的疏水表面，其接触角＞120°，在一个优选的实施方案中，所述接触角＞150°，以形成超疏水表面。在其他优选的实施方案中，所述疏水表面的厚度在纳米到微米量级。

在一个实施方案中，所述芯片上的亲水性点样孔数量为24,、40、70、384等孔，或根据实际临床试验或科研过程中生物样本的检测量设置，亲水 性点样孔形状可以选择圆形，正方形，三角形，多边形等。在一个具体实施方案中，所述亲水性点样孔的孔径范围为0.5-2.8mm，所述芯片尺寸为20×30-83×125mm。在另一具体实施方案中，亲水性点样孔为圆形，直径为0.7mm，依据圆孔直径选择适当的基质用量，如0.5μl，滴定生物标志物样本，结晶形态规则，晶向均一为最佳。

在其他实施方案中，所述微阵列芯片卡槽可以根据需要选择正方形，长方形等，每个卡槽范围为20×20mm-25×60mm。在一个具体实施方案中，芯片适配器的卡槽为2、4、6、8、12、16或20个，甚至更多。

本发明第四目的是提供制备飞行时间质谱检测蛋白或核酸的芯片，包括：上述任一方案的步骤，以及，预先使用覆盖基质溶液对点样区进行预处理。在一个实施方案中，当基质溶液选自蛋白质谱的基质溶液时，该芯片可用于质谱检测蛋白。在另一实施方案中，当基质溶液选自核酸质谱的基质溶液时，该芯片可用于质谱检测核酸。

本发明第五目的是提供包括上述芯片的质谱两用检测试剂盒，包括：

真空包装的多个两用芯片以及金属芯片适配器；

核酸和/或蛋白质谱基质溶液；

以及使用说明书。

在一个实施方案中，所述两用芯片已经预先插入金属芯片适配器中。

在另一实施方案中，所述芯片已经预先使用覆盖基质溶液。在一个具体实施方案中，当基质溶液选自蛋白质谱的基质溶液时，该试剂盒可用于质谱检测蛋白。在另一实施方案中，当基质溶液选自核酸质谱的基质溶液时，该试剂盒可用于质谱检测核酸。

在一个实施方案中，所述芯片上的亲水性点样孔数量为24,、40、70、384等孔，或根据实际临床试验或科研过程中生物样本的检测量设置，亲水性点样孔可以选择圆形，正方形，三角形，多边形等。在一个具体实施方案中，所述亲水性点样孔的孔径范围为0.5-2.8mm，所述芯片尺寸为20×30-83×125mm。在另一具体实施方案中，亲水点样区为圆形，直径为 0.7mm，依据圆孔直径选择适当的基质用量，如0.5μl，滴定生物标志物样本，结晶形态规则，晶向均一为最佳。

在其他实施方案中，所述微阵列芯片卡槽可以根据需要选择正方形，长方形等，每个卡槽范围为20×20mm-25×60mm。在一个具体实施方案中，芯片适配器的卡槽为2、4、6、8、12、16或20个，或者更多。

本发明第六个目的是提供上述芯片或试剂盒在用于质谱检测生物分子的用途。

在一个实施方案中，所述生物分子是核酸和/或蛋白分子。

本发明的效果包括：

1、本发明的应用领域覆盖基因组学检测与蛋白质组学鉴定，同一张芯片既可以做基因检测，也可以做蛋白或多肽鉴定，覆盖两种检测领域。

2、芯片表面具有亲水疏水差异设计，能够有效富集样本，晶向均一生长，质谱检测的样本峰准确度高，信噪比高，基线低。

3、在芯片点样区表面通过自动点样覆盖基质，特种的基质配方，使基质与样品在芯片表面共结晶更均匀，检测结果更佳。

4、本发明还提供了包含所述芯片的质谱检测试剂盒，便于客户根据需要随时检测核酸或蛋白样品。

5、本发明还可根据用户需要，提供包含表面覆盖基质的芯片的试剂盒，以满足个性化需要。

6、本发明的试剂盒，芯片主体为一次性材料，使用后即可替换新的芯片与适配器进行配合，避免现有的金属靶板的清洗和样品污染。

7、本发明的芯片适配器，不同的卡槽设计，可放置多张芯片，能实现核酸与蛋白不同样品同时进样检测，节省质谱开门关门时间。

附图说明

图1为微阵列芯片实物图，其中1为亲水性点样孔、2为疏水孔外区。

图2a、2b为微阵列芯片适配器示意图，其中底板为金属板，方形凹槽为微阵列芯片卡槽，内嵌有不同规格的微阵列芯片。

图3为热氧化装置示意图。

图4为浓酸溶液中清洗基片示意图。

图5为微阵列两用芯片与传统芯片结晶对比图。

图6为微阵列芯片点样孔进行表面覆盖基质的点样效果图。

图7为微阵列芯片质谱检测基因样品的谱图结果。

图8为微阵列芯片质谱检测蛋白样品的谱图结果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限值以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。

疏水性(hydrophobicity)：在化学学科里，疏水性指的是一个分子(疏水物)与水互相排斥的物理性质。疏水性分子偏向于非极性，并因此较会溶解在中性和非极性溶液(如有机溶剂)。疏水性分子在水里通常会聚成一团，而水在疏水性溶液的表面时则会形成一个很大的接触角而成水滴状。举例来说，疏水性分子包含有烷烃、油、脂肪和多数含有油脂的物质。

亲水性(hydrophilic property)：指分子带有极性基团的分子，对水有大的亲和能力，可以吸引水分子，或溶解于水。这类分子形成的固体材料的表面，易被水所润湿。具有这种特性都是物质的亲水性。

接触角(contact angle)：是指在气、液、固三相交点处所作的气-液界面的切线穿过液体与固-液交界线之间的夹角θ，是润湿程度的量度。若θ<90°，则固体表面是亲水性的，即液体较易润湿固体，其角越小，表示润湿性越好；若θ>90°，则固体表面是疏水性的，即液体不容易润湿固体，容易在表面上移动。接触角的测定方法很多，有角度测量法(液滴角度测量法)、长度/高度测量法、力测量法等。其中液滴角度测量法是最常用的，即在平整表面滴一小液滴，使用低倍显微镜的量角器即可测量角度大小。

基质，指对特定波长具有较强吸收并易于被激发，并且传递能量和电荷给待测分子发生气化和离子化，从而使得所包含的待测分子一起进入质谱检测通道的特殊溶液。

好的基质要具备下列几种特点：a.基质最重要的功能就是吸收脉冲激光的能量，既可以通过电离吸收紫外区激光的能量，也可以通过分子的化学键振动吸收红外区激光的能量，这由所采用的激光波长来决定。b.基质要能够很好地分散样品分子，防止其聚集，提高电离效率。c.固、液相的基质、样品混合物在解吸时，基质分子不再产生额外的热效应，不会破坏待测分子。d.基质必须能够帮助样品分子很好地电离。如果是液态基质，还必须具有很好的真空稳定性。

在蛋白质组分析中，经常会使用MALDI-TOF基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪来进行蛋白质的鉴定及翻译后的修饰。MALDI的优势在于可 以在短时间内对于多种样品进行处理，MALDI法是将样本添加在一种被称为基质(matrix)的化合物上，制成混合结晶，然后再用激光照射其表面以实现离子化。用作基质的化合物可以是α-氰基-4-羟基肉桂酸、3，5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸、2,5-二羟基苯甲酸。根据样本的不同，可选用不同基质。一般来说，α-氰-4-羟基肉桂酸(CHCA)适用于肽类样品，3，5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸(SA)适用于蛋白质样品，而2，5-二羟基苯甲酸(DHB)则适用于肽、糖类及糖脂类样品。

在基因组学检测中，MALDI方法适用的是3-羟基-2-吡啶甲酸基质，配制好的基质，由BIODOT自动点样，覆盖到微阵列芯片表面的样品孔内，由于表面的亲疏水微阵列结构，使基质结晶生长细致，形态均匀。质谱检测的样本峰准确度高，信噪比高，基线低。

“表面覆盖基质”，指根据待检分子的种类，预先覆盖在点样区的蛋白或核酸基质，并干燥形成结晶。通过将芯片的表面预先覆盖基质，可制备成一次性或直接对样品进行点样和检测的产品或试剂盒。

实施例一、微阵列芯片表面亲水处理

芯片主体特征是质地坚韧、平面度佳；金刚石，单晶硅，石英晶体等；划隔成适合芯片适配器表面单元大小的片状结构，芯片厚度0.5-1.8mm，为保证质量检测精度，芯片表面平面度小于10μm。例如，微阵列芯片基底选择单晶硅片，在硅片片结构表面可以烧制生长二氧化硅氧化物薄膜、氧化锌薄膜、氧化铝薄膜，厚度150-800nm，优选500nm，薄膜特征是具有亲水性，采用热氧化工艺。

如图3所示，使用热氧化装置烧制生长二氧化硅氧化物薄膜的步骤如下：

①将硅片置于用石英玻璃制成的反应管中；

②反应管用电阻丝加热炉加热一定温度，常用的温度为900～1200℃；

③氧气或水汽以1厘米/秒气流速度通过反应管，在硅片表面发生化学反应：

Si(固态)+O₂(气态)→SiO₂(固态)或Si(固态)+2H₂O(汽态)→SiO₂(固态)+2H₂(气态)生成SiO₂层。

硅热氧化工艺，按所用的氧化气氛可分为：干氧氧化、水汽氧化和湿氧氧化。干氧氧化是以干燥纯净的氧气作为氧化气氛，在高温下氧直接与硅反应生成二氧化硅。

水汽氧化是以高纯水蒸汽为氧化气氛，由硅片表面的硅原子和水分子反应生成二氧化硅。水汽氧化的氧化速率比干氧氧化的为大。

湿氧氧化实质上是干氧氧化和水汽氧化的混合，氧化速率介于二者之间。

用高纯氢气和氧气在石英反应管进口处直接合成水蒸汽的方法进行水汽氧化时，通过改变氢气和氧气的比例，可以调节水蒸汽压，减少沾污，有助于提高热生长二氧化硅的质量。

实施例二、微阵列芯片表面疏水处理

1、亲水性点样孔区的封闭处理

清洗芯片表面残留有机物：先通过氧气流速60～140ml/min，功率100～300W，处理时间1～10min；再用高纯水对基底表面超声清洗2～3次，每次时间为2～5min，使表面彻底清洁并羟基化。

光刻胶技术封闭点样孔区：采用旋涂的方法将光刻胶旋涂于处理过的基底上，旋涂速度为1000～8000rpm，然后置于光刻掩膜板下，在390nm的紫外光下曝光20s～5min后用相应的显影液洗脱后，从而构筑出有序结构的点样孔区。其中光刻胶使用耐酸性的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)和/或聚苯乙烯。

2、微阵列芯片孔外区的表面疏水处理

以硅烷偶联剂为主要原料对金属或非金属材料进行表面处理的过程。特征是由化学表面改性的方式制作疏水区域，疏水膜层厚度范围150nm-2μm，疏水区域表面水滴接触角＞120°。

硅烷偶联剂是一类具有特殊结构的有机化合物，含有有机官能团，无机官能团，同时与阴极、非极性物质产生结合力。硅烷偶联剂的化学通式为Y-R-SiX3，式中Y是通过碳原子与硅相连的非水解性有机官能团，可与粘结剂机体中的树脂发生反应从而提高相容性，如氨基、乙烯基、环氧基、巯基、丙烯酰氧丙基等；R为具有饱和和不饱和键的碳链，将Y和Si原子连接起来；X为水解性基团，如卤族、烷氧基、异丙烯氧基等。这些基团水解形成的硅醇能与金属表面的氧化物或烃基反应，从而在金属表面形成Si-O-Si三维网络结构的硅烷膜，防止金属的腐蚀，表面呈现疏水性。

具体步骤如下：

(1)用浓酸溶液清洗芯片:

①将芯片放置在干净的烧杯中，烧杯固定在支架上。

②准备水槽，装满水，放置在烧杯下方，加热；(见图4)

③将浓酸与双氧水按照一定比例(1:5～1:20)缓缓加入装有芯片的烧杯中，待不断出现小气泡，氧化反应开始，反应时间40min。

注意：浓酸很危险，需要在通风橱通风的条件下小心处理。注意个人防护。

④将芯片取出，放在盛有氯仿的烧杯中，超声2min；

⑤将芯片取出，放在盛有超纯水的烧杯中，超声2min。

⑥重复步骤④⑤；

⑦废液处理：浓酸溶液中加入大量水，缓慢稀释，并用NaOH中和。

(2)硅烷化处理

将芯片放置在洁净的烧杯中。

将硅烷偶联剂进行水解，按照配比硅烷偶联剂：水：乙醇＝1:1:8混合，其中硅烷偶联剂为浓度5％～10％的二甲基二氯硅烷溶液，水采用去离子水，乙醇浓度为99％。

将水解后的硅烷化溶液取适量加入含有芯片的烧杯中；

加入一定量的氨水(13％～30％)催化，配比氨水:硅烷化＝1:5，加速反应进行；

放置，溶液表面产生白烟，反应正在进行，时间30分钟(在通风厨中进行)。

(3)硅烷化后清洗

取出芯片，放置到盛有乙醇的新烧杯中，超声，时间10min。

取出芯片，放置在成盛有超纯水水的新烧杯中，超声，时间10min。

取出芯片，放置在成盛有氯仿的新烧杯中，超声，时间10min。

干燥芯片后，在芯片表面滴1μl水滴，使用低倍显微镜的量角器测量水滴接触角大小，分别得到接触角约135°、155°的两种芯片初品。

(4)对封闭的点样孔去胶处理

将硅烷化处理后的芯片，放入去胶液中浸泡3小时，之后取出放入丙酮溶液中超声2分钟，即可去掉光刻胶，恢复点样区亲水表面。形成有亲疏水差异的微阵列芯片表面。去胶液主要成分是聚乙二醇单丁醚或聚二甲基硅氧烷等。

实施例三、微阵列两用芯片与传统芯片结晶对比

选择相同的蛋白或核酸样品，与取适量相应基质溶液分别滴在两用芯片以及传统芯片上，待基质自然晾干后，显微镜下观察结晶形态。

如图5所示，传统生物检测芯片结晶形态(左图)不规则，厚度不均匀，呈咖啡环状态，中间空，周围厚。而本发明提供的微阵列芯片结晶形态(右图)规则，厚度均匀，晶向生长细致。

实施例四、对微阵列芯片点样孔的表面进行覆盖基质预处理

选用3-羟基-2-吡啶甲酸基质溶液，通过BIODOT仪，对亲水性点样孔进行自动点样，以进行表面覆盖基质预处理，待基质自然晾干后，进行观察。

如图6所示，亲水孔覆盖基质后，该靶点结晶均匀，轮廓均匀圆滑，无溶液溢出，具有良好一致性。

实施例五、制备微阵列芯片的两用质谱检测试剂盒

如图2所示，在无菌环境下，将制备的不同数量或规格的微阵列两用芯片，根据需要，对芯片进行真空密封包装。

同时，在试剂盒中分别附有基质溶液，以及使用说明书。

另外，可根据实施例四，将芯片表面用自动点样方法进行表面覆盖基质预处理，再抽真空密封包装，并标注待检样品的分子类型。

试剂盒包装后，于室温避光下保藏。

用户购买时，可以根据需要选择表面覆盖基质预处理的试剂盒或普通试剂盒。

实施例六、微阵列两用芯片试剂盒用于基因检测

使用微量移液器，吸取1ul纯化的耳聋基因标准质粒样品，直接点样到表面覆盖基质预处理的芯片上，并使用北京毅新博创生物科技有限公司生产的Clin-TOF型飞行时间质谱仪对点样后的芯片进行检测和结果判断。

该标准质粒共20个质谱峰，质量范围3000-9000Da，同一质粒样本做5个重复，分析检测结果分型正确率。

参数设置：

Turing mode:linear

Mass Range:3000-9000

Max Laser Rep Rate:10.0

Power:105

Profiles:40

Shots:10

分型结果：

结果如图7所示，检测出核酸样本具有20重质谱峰，基线低，信噪比高，检测范围3000-9000Da,5次重复的质谱曲线峰位置与峰强度一致性好，重复性佳，经北京毅新博创生物科技有限公司BE-SNP软件分析，鉴定结果正确率100％。说明该试剂盒对于核酸样品的质谱检测具有优异的分辨率。

实施例七、微阵列两用芯片试剂盒用于蛋白检测

使用微量移液器将基质CHCA加入芯片的点样孔，然后点样加入1ul纯化的蛋白标准品BPB(分子量3000-40000Da)的标准质粒样品，并使用毅新兴业(北京)科技有限公司生产的Clin-TOF型飞行时间质谱仪对点样后的芯片进行检测和结果判断。

该标准蛋白样品共6个质谱峰，共做20个重复，分析检测结果谱图CV值。

参数设置：

Turing mode:linear

Mass Range:3000-40000

Max Laser Rep Rate:30.0

Power:65

Profiles:100

Shots:5

结果如图8所示，20个重复均只出现20个质谱峰，峰线区分度好，无明显干扰，分布范围3014-38384,所有重复试验的峰线均具有一致对应性，谱图重复性CV＜2.6％，与预设的检测结果分型正确率完全一致，说明该试剂盒对于蛋白样品的质谱检测具有优异的分辨率。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims (6)

1.一种用于飞行时间质谱检测蛋白和核酸的两用芯片，其中所述芯片包括：(1)芯片主体：主体表面具有微整列排列的亲水性点样孔和疏水性孔外区；(2)由金属底板构成的芯片适配器，其中该适配器表面分布多个与芯片主体匹配的芯片卡槽，其中，芯片主体选自质地坚韧、平面度佳的单面抛光的金刚石、单晶硅、石英晶体的芯片，所述亲水性点样孔覆盖150-800nm的亲水性薄膜，疏水性孔外区覆盖150nm-2μm疏水性薄膜，其表面水滴接触角＞120°；

其中预先使用α-氰-4-羟基肉桂酸(CHCA)和/或3，5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸(SA)溶液对点样孔进行预处理，和/或预先使用3-羟基-2-吡啶甲酸溶液对点样孔进行预处理。

2.根据权利要求1所述的两用芯片，其中所述亲水性薄膜为二氧化硅氧化物薄膜、氧化锌薄膜、氧化铝薄膜，疏水性孔外区通过硅烷偶联剂进行处理形成疏水性薄膜。

3.根据权利要求2所述的两用芯片，其中所述硅烷偶联剂选自乙烯基硅烷、氨基硅烷或二甲基二氯硅烷。

4.根据权利要求1或2所述的两用芯片，其中所述芯片是单面抛光的硅芯片或石英芯片，所述亲水性点样孔层薄膜厚度为500nm，所述孔外区的接触角为＞120°，所述芯片上的亲水点样孔数量为24、40、70或384孔，所述亲水性点样孔的孔径范围为0.5-2.8mm，所述芯片尺寸为20×30-83×125mm，优选亲水性点样孔为圆形，直径为0.7mm。

5.根据权利要求1或2所述的两用芯片，其中所述芯片适配器可以根据芯片尺寸设计不同的卡槽，卡槽尺寸为20×30-83×125mm，以实现一个适配器保证不同规格的芯片进入检测室。

6.根据权利要求5所述的两用芯片，所述适配器上的微阵列芯片卡槽尺寸为20×20mm-25×60mm，卡槽为2、4、6、8、12、16或20个。