CN112342115A - 捕获和/或计数细胞的微流控芯片及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明适用于生物检测技术领域,提供了一种捕获和/或计数细胞的微流控芯片及其制备方法和应用,该微流控芯片包括:第一基层;抗体修饰的反蛋白石光子晶体结构,设置在第一基层上,其包括抗体修饰层以及掺杂有Yb3+和Er3+的钒酸钇反蛋白石结构层;第二基层,设置在第一基层靠近抗体修饰的反蛋白石光子晶体结构的一侧;微流控腔,设置在第一基层与第二基层之间。本发明通过调控光子晶体最小重复单元尺寸控制光子带隙,制作双层不同孔径、不同带隙的掺杂有Yb3+和Er3+的钒酸钇的反蛋白石结构,可以通过光子晶体的带隙效应,使上转换绿光发射获得明显增强的效果,解决了现有上转换发光过程的低量子效率导致的荧光强度不足的问题。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域,尤其涉及一种捕获和/或计数细胞的微流控芯片及其制备方法和应用。
背景技术
尽管癌症病人早期难以确诊,病情发展速度快,但90%早期癌症是可以治愈的,关键在于早期诊断和早期治疗。微流控技术已经成为癌症的早期检测的热门技术。与传统的磁力富集,尺寸筛选,梯度离心等方法相比微流控技术具有特异性选择,对细胞伤害小和可以实时监控等优势。
循环肿瘤细胞是从原发性肿瘤流入脉管系统或淋巴管的细胞,并随人体的循环系统运动。因此它们可以在循环系统的运输下,在身体的其他重要组织器官生长另外的肿瘤,成为恶性肿瘤转移的诱因。经过这一机制的作用,恶性肿瘤患者的治疗成功几率将会大大减少,事实上,在恶性肿瘤患者的病理过程中,大多数患者是都由于循环肿瘤细胞(CTC)的扩散而死亡。
早期有效地发现肿瘤,对恶性肿瘤的预后具有重要的意义。利用循环肿瘤细胞(CTCs)作为生物标志物进行液体活检显示了一种很有前途的解决方案,因为CTCs在肿瘤通过静脉注射、循环、外渗和继发肿瘤形成的转移过程中发挥了关键作用。然而,解决方案的有效性会受到与CTC相关的稀有性、易感性和脆弱性的影响。在众多分离和富集CTC的新方法中,微流体技术以成本效益和操作友好的方式分离和检测CTC。微流体技术的发展也使得利用微流控系统模拟体内微环境进行体外肿瘤转移建模成为可能,从而对肿瘤转移进行分析和监测。
CTC的敏感检测和筛选引起了人们的极大兴趣,因为它对预后和选择合适的治疗方法有重要意义。到目前为止,已经开发了相当多的CTCs分离方法,采用的策略包括免疫磁珠或微流体装置。前者利用捕获剂涂层磁珠免疫识别血液中的CTC,然后进行磁隔离。微流控方法具有重要的优势,能够高效处理复杂的细胞流体,并且由于剪切力或细胞固定的需要对敏感细胞群造成的损害最小。
然而现存方法对循环肿瘤细胞的捕获效率仍待提高,对于捕获过程的实时监控仍待改进;另外,因为血液中的循环肿瘤细胞数量极少,且血液中的细胞种类繁多,故对于被监控细胞捕获芯片的可视化,随时监测,分辨,计数,提出了更高的要求。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种捕获和/或计数细胞的微流控芯片,旨在解决背景技术中提出的问题。
本发明实施例是这样实现的,一种捕获和/或计数细胞的微流控芯片,其包括:
第一基层;
抗体修饰的反蛋白石光子晶体结构,设置在所述第一基层上,其包括抗体修饰层以及双层掺杂有Yb3+和Er3+的钒酸钇反蛋白石结构层;
第二基层,设置在所述第一基层靠近所述抗体修饰的反蛋白石光子晶体结构的一侧;以及
微流控腔,设置在所述第一基层与所述第二基层之间。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的捕获和/或计数细胞的微流控芯片的制备方法,第一基层与第二基层均为上转换发光材料,在980纳米的近红外光激发下,可以通过上转换激发出Er3+的绿光,作为检测循环肿瘤细胞的光信号,和比率荧光检测信号。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的捕获和/或计数细胞的微流控芯片的制备方法,第一基层与第二基层均为反蛋白石光子晶体结构,并拥有不同的孔径和不同的带隙,通过局域场调控,双带边效应增强了上转换荧光的强度
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的微流控芯片的制备方法,其包括以下步骤:
取一第一基层,并在第一基层上设置双层带隙不同的聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体;
将掺杂有Yb3+和Er3+的钒酸钇前驱体溶液渗入到上述设置有双层带隙不同的聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体的第一基层的光子晶体的缝隙中,并经煅烧处理,消除聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体,以在第一基层上形成双层掺杂有Yb3+和Er3+的钒酸钇反蛋白石结构层;
将双层掺杂有Yb3+和Er3+的钒酸钇反蛋白石结构层依次置于3-巯基丙基三甲氧基硅烷溶液、N-(4-马来酰亚胺丁酰基氧)琥珀酸亚胺溶液、链和亲霉素溶液以及生物素化的抗体溶液中进行修饰处理,形成抗体修饰层,得到设置在第一基层上的抗体修饰的反蛋白石光子晶体结构;
取一第二基层,将设置有抗体修饰的反蛋白石光子晶体结构的第一基层与第二基层进行隔离,以形成微流控腔,然后进行封装处理,得到所述微流控芯片。
作为本发明实施例的一种优选方案,所述步骤,在第一基层上设置双层带隙不同的聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体的方法具体包括:
取两组第一基层,将两组第一基层分别置于两组粒度不同的聚甲基丙烯酸甲酯溶液进行处理后,再经烘干处理,得到两组分别附有不同带隙的聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体的第一基层;
用氯化钠溶液对其中一组附有聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体的第一基层上的聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体进行剥离,然后用另一组附有聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体的第一基层吸附被剥离出的聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体,并经烘干处理,得到设置有双层带隙不同的聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体的第一基层。
作为本发明实施例的另一种优选方案,所述步骤中,掺杂有Yb3+和Er3+的钒酸钇前驱体溶液是由硝酸溶液、去离子水、偏钒酸铵、柠檬酸、硝酸钇、硝酸镱和硝酸铒混合配制而成。
作为本发明实施例的另一种优选方案,所述偏钒酸铵、硝酸钇、硝酸镱和硝酸铒的摩尔比为30:(7~9):(1.5~2.5):(0.05~0.15)。
作为本发明实施例的另一种优选方案,所述步骤中,煅烧处理的温度为500~600℃。
作为本发明实施例的另一种优选方案:
所述3-巯基丙基三甲氧基硅烷溶液为3-巯基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液,其体积浓度为3%~5%;
所述N-(4-马来酰亚胺丁酰基氧)琥珀酸亚胺溶液为N-(4-马来酰亚胺丁酰基氧)琥珀酸亚胺的二甲基亚砜溶液,其摩尔浓度为0.5~1.5μmol/L;
所述链和亲霉素溶液为链和亲霉素溶液的磷酸缓冲盐溶液,其质量浓度为8~12μg/mL;
所述生物素化的抗体溶液为生物素化的抗体的磷酸缓冲盐溶液,其质量浓度为8~12μg/mL。
作为本发明实施例的另一种优选方案,生物素化的抗体为生物素化的EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule,上皮细胞粘附分子)抗体。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述制备方法制得的微流控芯片。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的微流控芯片在用于捕获和/或计数细胞中的应用。
本发明为了解决当前使用微流控芯片在循环肿瘤细胞分选领域应用时,遇到的捕获效率低,工艺繁琐,实时监控难度大等问题,创新性的提出了使用双层钒酸钇三维大孔结构来作为细胞捕获面,稀土离子(Yb和Er)的引入使得芯片捕获面拥有了优异的上转换发光的能力。这赋予了本发明芯片强大的实时监控能力,在荧光场下,检测细胞的同时,通过比率荧光对已捕获细胞进行计数,这大大的推进了微流控芯片内部在捕获细胞时的细胞计数研究,使得在使用微流控芯片处理血液样品时,对于循环肿瘤细胞捕获情况实时监控以及实时计数成为可能。
本发明可使用玻璃基底作为微流控芯片的第一基层和第二基层,价格低廉,易于生产。首先使用牺牲模板法在玻璃基底上制作双层不通孔径的三维大孔反蛋白式结构。这种结构具有大的比表面积,良好的生物相容性,因其高的空隙率和微纳结构级别的粗糙度,易于使循环肿瘤细胞探出的伪足与其发生相互作用。与此同时,本发明还是用了特异性的抗体作为涂覆修饰层,抗体的引入使芯片具有特异性识别循环肿瘤细胞的功能,这无疑大大加强了本发明芯片对于循环肿瘤细胞的识别能力,降低了假阳性的风险。
在微纳捕获面的基础上,本发明还可以引进了磁力牵引体系,先一步使用表面修饰抗体的纳米磁性复合材料与细胞进行特异性结合,在此基础上使用外部定向磁场提供牵引力,与细胞重力相协同,将循环肿瘤细胞与正常血细胞分层,循环肿瘤细胞受磁力指引处于上层,正常血液细胞处于下层。这样本发明在激光,磁场等共同作用下,可以实现新患肿瘤细胞的同步捕获,实时监控,细胞计数等功能。
另外,光子晶体结构具有独特的光子带隙,通过局域场增强作用,带边效应等增强激发场或增强发射场,对于生物组织的活体成像来说,在光穿透组织或组织液后,将会被减弱,局域场增强效应是一种理想的增强荧光成像效果的手段。三维大孔反蛋白石因为其在微观结构的规则重复排列,具有光子晶体的特性。使用双层的反蛋白石引入双带边效应将光的发射场增强增强,使得比率荧光的荧光计数更精确。
本发明实施例提供的一种捕获和/或计数细胞的微流控芯片,通过以含有掺杂有Yb3+和Er3+的钒酸钇的抗体修饰的反蛋白石光子晶体结构作为细胞捕获面,可以使上转换绿光发射获得明显增强的效果,解决了现有上转换发光过程的低量子效率导致的荧光强度不足的问题,从而可以提高对循环肿瘤细胞的捕获效率。
本发明通过以含有掺杂有Yb3+和Er3+的钒酸钇的抗体修饰的反蛋白石光子晶体结构作为细胞捕获面,利用特异性抗体以及大孔结构获得与肿瘤细胞的充分结合,提高对循环肿瘤细胞的捕获效率。捕获细胞之后,细胞检测探针的荧光(红光)以及捕获面的上转换荧光(绿光)会根据捕获细胞的数量而发生荧光分支比变化,进而解析细胞数量,即在捕获循环肿瘤细胞的同时,实现实时监测和细胞计数。
具体的,本发明提供的微流控芯片为半透光类型微流控芯片,在进样口注入细胞悬液时,允许在激光共聚焦显微镜平台上实时监控芯片内部状况。本发明是以抗体修饰的反蛋白石光子晶体结构为捕获面,其所采用的钒酸钇材料是一种水稳定性较强且发光性能较好的稀土掺杂基质。在钒酸钇中掺杂进Yb离子和Er离子可使本发明捕获面得到良好的上转换发光能力,为基于比率荧光的细胞计数提供了前提条件。使用在人体光学窗口波段的近红外光来激发稀土离子,不仅可以增加穿透深度,减少能量损失,并且可以有效的减少背景荧光噪声,使荧光计数能力更加精确。
另外,在荧光计数实验过程中可以使用激光405nm/415nm(染料C6)使在捕获面上的细胞发红光,而同时使用980nm的近红外光激发Yb离子使其向Er离子传递能量,Er离子发出绿光作为比率荧光的背景。随着捕获面上循环肿瘤细胞的增多,某区域内红光强度将会按线性随着区域内细胞数量的增加而上升,而由于上转换稀土离子对(Yb,Er)对于细胞不敏感,故绿光强度在整个过程中不变,红光与绿光两者之间的比值,可以作为细胞数量的定量表示。
附图说明
图1为本发明实施例提供的微流控芯片的结构示意图。
图2为本发明实施例得到的钒酸钇反蛋白石结构在原子力显微镜下的图像。
图3为不同孔径的钒酸钇反蛋白石结构的扫描电子显微镜图像(图中标尺为1μm)。
图4为本发明实施例得到的钒酸钇反蛋白石结构在不同液体环境下的稳定性对比图。
图5为本发明实施例得到的聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体和钒酸钇反蛋白石结构的光子带隙图。
图6为不同结构的发射光强度对比图。
图7为钒酸钇反蛋白石结构的XRD衍射图。
图8为本发明实施例得到的微流控芯片捕获循环肿瘤细胞的共聚焦显微镜成像照片。
图9为实时监控的比率荧光对比图。
图10为激光共聚焦焦平面上的比率荧光与细胞数量的对比图。
图11为细胞在微流控芯片的上表面(捕获表面)、下表面的捕获情况图,其中有无磁场作为变量。
图12为微流控芯片中不同的采样点获得不同数量的细胞的统计图。
图13为微流控芯片下人全血中的肿瘤细胞以及各类细胞图像;其中,(a)明场,(b)磁性复合材料,(c)hoechst 33342 染色,(d)c6 染色,(e)白血细胞,(f)肿瘤细胞,(g)单核细胞,(h)红血细胞。
图14为冲洗前后人全血在捕获表面的捕获情况图;其中,(a)冲洗前图像,(b)Z轴图像,(c)冲洗后图像,(d)Z轴图像。
图中:1-第一基层;2-第二基层;3-抗体修饰的反蛋白石光子晶体结构;4-微流控腔;5-磁铁。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例1
该实施例提供了一种微流控芯片的制备方法,其包括以下步骤:
S1、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)溶液的制备:
(1)准备15mg/mL NaOH溶液,备用。取适量甲基丙烯酸甲酯(MMA)倒入杯中,加入已配制好的NaOH溶液,摇动1.5min,NaOH溶液将MMA中的聚合抑制剂洗去,静置分层,用注射器将下层废液抽提弃掉。重复4次以上,最后一次不要取出。
(2)将适当大小的转子放入三口瓶中,然后将上述清洗的MMA 6mL,水80mL,过硫酸钾38mg放入三口瓶中,连接冷凝管,堵住三口瓶的非冷凝口。将以上全部放入油浴搅拌机中,使三口瓶中的液面低于油面,90℃加热搅拌90分钟左右,即可得到PMMA溶液。在此过程中,由于甲基丙烯酸甲酯在加热过程中发生聚合,使三颈瓶中的液体由无色透明的层状液体变为无层状乳白色液体;当反应完成时,这种液体被称为零涂层PMMA。
(3)若想要得到更大尺寸的PMMA溶液,可以重复以下包覆手段N次:将转子放入三颈瓶中,倒入20mL上述聚合的PMMA溶液,25mL水和3mL偶氮二异丁腈(AIBN)溶液(由0.3mg的AIBN和10mL上述清洗的MMA配制而成),并置于90℃的油浴中加热30分钟,即可获得更大尺寸的PMMA溶液。
S2、选择无划痕、无碎边、清洗过的的玻璃片作为第一基层;将上述得到的未包覆的PMMA溶液置于塑料杯A(因为玻璃烧杯会对后期制作光子晶体模板的实验产生不利影响)中,将上述得到的经过包覆的PMMA溶液置于塑料杯B中;取两个玻璃片分别垂直地插入到塑料杯A和塑料杯B中的溶液中,并置于34℃的烘箱中进行处理24小时;在此过程中,溶液以恒定的速率蒸发,PMMA纳米球由于表面张力而有序地排列在玻璃片上。接着,取下玻璃片,用酒精擦除玻璃片背面(靠近玻璃墙的一侧)不完整的光子晶体。为巩固其机械强度,可将抛光后的玻璃片放入120℃的烘箱中进行烘干处理40min,即可得到两组分别附有不同带隙的聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体的第一基层。
然后,用质量浓度为26.5%的氯化钠溶液对其中一组附有聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体的第一基层上的聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体进行剥离,使得聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体落入到氯化钠溶液的液面上,然后用另一组附有聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体的第一基层吸附被剥离出的聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体,并经自然风干后,再依次置于35℃的烘箱中的保持1.5小时,置于110℃的烘箱中烘干处理50min,即可得到设置有双层带隙(450nm和660nm)不同的聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体的第一基层。
S3、将0.5mL的10%硝酸溶液,10mL的去离子水,30mmol的偏钒酸铵,0.5g的柠檬酸,7.9mmol的硝酸钇,2mmol的硝酸镱,0.1mmol的硝酸铒加入烧杯中,用玻璃棒搅拌80min使其充分反应,得到淡绿色透明的掺杂有Yb3+和Er3+的钒酸钇前驱体溶液。
接着,将上述设置有双层带隙不同的聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体的第一基层的侧面玻璃垫高,将一个滴管的上述钒酸钇前驱体溶液缓慢而均匀地沿玻璃垫高的一侧滴下(原则上,滴管不能触摸玻璃光子晶体的任何一部分),玻璃上的钒酸钇前驱体溶液在重力和表面张力的作用下渗透到光子晶体的缝隙中,得到光子晶体模板。然后,将无水乙醇均匀喷洒在第一基层上,使第一基层迅速竖立,以冲洗掉多余的前驱体溶液,但要注意无水乙醇的用量,否则会冲洗掉大量的前驱体溶液,影响合成的反蛋白石结构的完整性,光子晶体模板晾干即可使用。
S4、将上述光子晶体模板放入陶瓷杯,并置于到马弗炉,以一个摄氏度每分钟的升温速率升温至550℃进行煅烧处理4小时后降回室温,以消除聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体,从而可以在第一基层上形成双层掺杂有Yb3+和Er3+的钒酸钇反蛋白石结构层。
S5、将上述双层掺杂有Yb3+和Er3+的钒酸钇反蛋白石结构层依次置于3-巯基丙基三甲氧基硅烷溶液、N-(4-马来酰亚胺丁酰基氧)琥珀酸亚胺溶液、链和亲霉素溶液以及生物素化的抗体溶液中进行室温修饰处理1h,形成抗体修饰层,即可得到设置在第一基层上的抗体修饰的反蛋白石光子晶体结构。其中,3-巯基丙基三甲氧基硅烷溶液为3-巯基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液,其体积浓度为4%;N-(4-马来酰亚胺丁酰基氧)琥珀酸亚胺溶液为N-(4-马来酰亚胺丁酰基氧)琥珀酸亚胺的二甲基亚砜溶液,其摩尔浓度为1μmol/L;链和亲霉素溶液为链和亲霉素溶液的磷酸缓冲盐溶液(pH=7.3),其质量浓度为10μg/mL;生物素化的抗体溶液为生物素化的EpCAM抗体的磷酸缓冲盐溶液(pH=7.3),其质量浓度为10μg/mL。需要说明的是,在修饰抗体前,还可以在钒酸钇反蛋白石结构表面上包覆一层聚多巴胺膜。
S6、取载玻片作为第二基层,用厚度为140μm的单层的封口膜对上述设置有抗体修饰的反蛋白石光子晶体结构的第一基层与第二基层进行隔离,以形成微流控腔;接着使用丙烯酸酯结构胶(9900 ergo)将第一基层和第二基层的侧边进行封装,风干40min固定后,再取出封口膜;然后,将进样管和出样管分别粘贴在第一基层和第二基层的未封装的短边两侧,并用丙烯酸酯结构胶(9900 ergo)将整个芯片进行封装,即可得到用于捕获和计数循环肿瘤细胞的微流控芯片。
该微流控芯片的结构如附图1所示,其包括:
第一基层1;
抗体修饰的反蛋白石光子晶体结构3,设置在所述第一基层1上,其包括抗体修饰层以及双层掺杂有Yb3+和Er3+的钒酸钇反蛋白石结构层;
第二基层2,设置在所述第一基层1靠近所述抗体修饰的反蛋白石光子晶体结构3的一侧;以及
微流控腔4,设置在所述第一基层1与所述第二基层2之间。
另外,该微流控芯片可配合磁铁5,以用于捕获和计数循环肿瘤细胞;具体的,磁铁可设置在第一基层1远离抗体修饰的反蛋白石光子晶体结构3的一侧上。
实施例2
该实施例提供了一种微流控芯片的制备方法,其包括以下步骤:
S1、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)溶液的制备:
(1)准备15mg/mL NaOH溶液,备用。取适量甲基丙烯酸甲酯(MMA)倒入杯中,加入已配制好的NaOH溶液,摇动1min,NaOH溶液将MMA中的聚合抑制剂洗去,静置分层,用注射器将下层废液抽提弃掉。重复4次以上,最后一次不要取出。
(2)将适当大小的转子放入三口瓶中,然后将上述清洗的MMA 6mL,水80mL,过硫酸钾35mg放入三口瓶中,连接冷凝管,堵住三口瓶的非冷凝口。将以上全部放入油浴搅拌机中,使三口瓶中的液面低于油面,90℃加热搅拌90分钟左右,即可得到PMMA溶液。在此过程中,由于甲基丙烯酸甲酯在加热过程中发生聚合,使三颈瓶中的液体由无色透明的层状液体变为无层状乳白色液体;当反应完成时,这种液体被称为零涂层PMMA。
(3)若想要得到更大尺寸的PMMA溶液,可以重复以下包覆手段N次:将转子放入三颈瓶中,倒入10mL上述聚合的PMMA溶液,20mL水和3mL偶氮二异丁腈(AIBN)溶液(由0.1mg的AIBN和10mL上述清洗的MMA配制而成),并置于90℃的油浴中加热30分钟,即可获得更大尺寸的PMMA溶液。
S2、选择无划痕、无碎边、清洗过的的玻璃片作为第一基层;将上述得到的未包覆的PMMA溶液置于塑料杯A中,将上述得到的经过包覆的PMMA溶液置于塑料杯B中;取两个玻璃片分别垂直地插入到塑料杯A和塑料杯B中的溶液中,并置于30℃的烘箱中进行处理24小时;在此过程中,溶液以恒定的速率蒸发,PMMA纳米球由于表面张力而有序地排列在玻璃片上。接着,取下玻璃片,用酒精擦除玻璃片背面(靠近玻璃墙的一侧)不完整的光子晶体。为巩固其机械强度,可将抛光后的玻璃片放入120℃的烘箱中进行烘干处理30min,即可得到两组分别附有不同带隙的聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体的第一基层。
然后,用质量浓度为26.5%的氯化钠溶液对其中一组附有聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体的第一基层上的聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体进行剥离,使得聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体落入到氯化钠溶液的液面上,然后用另一组附有聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体的第一基层吸附被剥离出的聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体,并经自然风干后,再依次置于30~40℃的烘箱中的保持1~2小时,置于100~120℃的烘箱中烘干处理40min~60min,即可得到设置有双层带隙不同的聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体的第一基层。
S3、将0.5mL的10%硝酸溶液,10mL的去离子水,30mmol的偏钒酸铵,0.5g的柠檬酸,7mmol的硝酸钇,1.5mmol的硝酸镱,0.05mmol的硝酸铒加入烧杯中,用玻璃棒搅拌40min使其充分反应,得到淡绿色透明的掺杂有Yb3+和Er3+的钒酸钇前驱体溶液。
接着,将上述设置有双层带隙不同的聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体的第一基层的侧面玻璃垫高,将一个滴管的上述钒酸钇前驱体溶液缓慢而均匀地沿玻璃垫高的一侧滴下,玻璃上的钒酸钇前驱体溶液在重力和表面张力的作用下渗透到光子晶体的缝隙中,得到光子晶体模板。然后,将无水乙醇均匀喷洒在第一基层上,使第一基层迅速竖立,以冲洗掉多余的前驱体溶液,但要注意无水乙醇的用量,否则会冲洗掉大量的前驱体溶液,影响合成的反蛋白石结构的完整性,光子晶体模板晾干即可使用。
S4、将上述光子晶体模板放入陶瓷杯,并置于到马弗炉,以一个摄氏度每分钟的升温速率升温至500℃进行煅烧处理3小时后降回室温,以消除聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体,从而可以在第一基层上形成双层掺杂有Yb3+和Er3+的钒酸钇反蛋白石结构层。
S5、将上述双层掺杂有Yb3+和Er3+的钒酸钇反蛋白石结构层依次置于3-巯基丙基三甲氧基硅烷溶液、N-(4-马来酰亚胺丁酰基氧)琥珀酸亚胺溶液、链和亲霉素溶液以及生物素化的抗体溶液中进行室温修饰处理1h,形成抗体修饰层,即可得到设置在第一基层上的抗体修饰的反蛋白石光子晶体结构。其中,3-巯基丙基三甲氧基硅烷溶液为3-巯基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液,其体积浓度为3%;N-(4-马来酰亚胺丁酰基氧)琥珀酸亚胺溶液为N-(4-马来酰亚胺丁酰基氧)琥珀酸亚胺的二甲基亚砜溶液,其摩尔浓度为0.5μmol/L;链和亲霉素溶液为链和亲霉素溶液的磷酸缓冲盐溶液(pH=7.2),其质量浓度为8μg/mL;生物素化的抗体溶液为生物素化的EpCAM抗体的磷酸缓冲盐溶液(pH=7.2),其质量浓度为8μg/mL。
S6、取载玻片作为第二基层,用厚度为120μm的单层的封口膜对上述设置有抗体修饰的反蛋白石光子晶体结构的第一基层与第二基层进行隔离,以形成微流控腔;接着使用丙烯酸酯结构胶(9900 ergo)将第一基层和第二基层的侧边进行封装,风干20min固定后,再取出封口膜;然后,将进样管和出样管分别粘贴在第一基层和第二基层的未封装的短边两侧,并用丙烯酸酯结构胶(9900 ergo)将整个芯片进行封装,即可得到用于捕获和计数循环肿瘤细胞的微流控芯片。
实施例3
该实施例提供了一种微流控芯片的制备方法,其包括以下步骤:
S1、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)溶液的制备:
(1)准备15mg/mL NaOH溶液,备用。取适量甲基丙烯酸甲酯(MMA)倒入杯中,加入已配制好的NaOH溶液,摇动2min,NaOH溶液将MMA中的聚合抑制剂洗去,静置分层,用注射器将下层废液抽提弃掉。重复4次以上,最后一次不要取出。
(2)将适当大小的转子放入三口瓶中,然后将上述清洗的MMA 6mL,水80mL,过硫酸钾40mg放入三口瓶中,连接冷凝管,堵住三口瓶的非冷凝口。将以上全部放入油浴搅拌机中,使三口瓶中的液面低于油面,90℃加热搅拌90分钟左右,即可得到PMMA溶液。在此过程中,由于甲基丙烯酸甲酯在加热过程中发生聚合,使三颈瓶中的液体由无色透明的层状液体变为无层状乳白色液体;当反应完成时,这种液体被称为零涂层PMMA。
(3)若想要得到更大尺寸的PMMA溶液,可以重复以下包覆手段4次:将转子放入三颈瓶中,倒入30mL上述聚合的PMMA溶液,30mL水和3mL偶氮二异丁腈(AIBN)溶液(由0.5mg的AIBN和10mL上述清洗的MMA配制而成),并置于90℃的油浴中加热30分钟,即可获得更大尺寸的PMMA溶液。
S2、选择无划痕、无碎边、清洗过的的玻璃片作为第一基层;将上述得到的未包覆的PMMA溶液置于塑料杯A中,将上述得到的经过包覆的PMMA溶液置于塑料杯B中;取两个玻璃片分别垂直地插入到塑料杯A和塑料杯B中的溶液中,并置于36℃的烘箱中进行处理36小时;在此过程中,溶液以恒定的速率蒸发,PMMA纳米球由于表面张力而有序地排列在玻璃片上。接着,取下玻璃片,用酒精擦除玻璃片背面(靠近玻璃墙的一侧)不完整的光子晶体。为巩固其机械强度,可将抛光后的玻璃片放入120℃的烘箱中进行烘干处理60min,即可得到两组分别附有不同带隙的聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体的第一基层。
然后,用质量浓度为26.5%的氯化钠溶液对其中一组附有聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体的第一基层上的聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体进行剥离,使得聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体落入到氯化钠溶液的液面上,然后用另一组附有聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体的第一基层吸附被剥离出的聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体,并经自然风干后,再依次置于40℃的烘箱中的保持2小时,置于120℃的烘箱中烘干处理60min,即可得到设置有双层带隙不同的聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体的第一基层。
S3、将0.5mL的10%硝酸溶液,10mL的去离子水,30mmol的偏钒酸铵,0.5g的柠檬酸,9mmol的硝酸钇,2.5mmol的硝酸镱,0.15mmol的硝酸铒加入烧杯中,用玻璃棒搅拌100min使其充分反应,得到淡绿色透明的掺杂有Yb3+和Er3+的钒酸钇前驱体溶液。
接着,将上述设置有双层带隙不同的聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体的第一基层的侧面玻璃垫高,将一个滴管的上述钒酸钇前驱体溶液缓慢而均匀地沿玻璃垫高的一侧滴下,玻璃上的钒酸钇前驱体溶液在重力和表面张力的作用下渗透到光子晶体的缝隙中,得到光子晶体模板。然后,将无水乙醇均匀喷洒在第一基层上,使第一基层迅速竖立,以冲洗掉多余的前驱体溶液,但要注意无水乙醇的用量,否则会冲洗掉大量的前驱体溶液,影响合成的反蛋白石结构的完整性,光子晶体模板晾干即可使用。
S4、将上述光子晶体模板放入陶瓷杯,并置于到马弗炉,以一个摄氏度每分钟的升温速率升温至600℃进行煅烧处理5小时后降回室温,以消除聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体,从而可以在第一基层上形成双层掺杂有Yb3+和Er3+的钒酸钇反蛋白石结构层。
S5、将上述双层掺杂有Yb3+和Er3+的钒酸钇反蛋白石结构层依次置于3-巯基丙基三甲氧基硅烷溶液、N-(4-马来酰亚胺丁酰基氧)琥珀酸亚胺溶液、链和亲霉素溶液以及生物素化的抗体溶液中进行室温修饰处理1h,形成抗体修饰层,即可得到设置在第一基层上的抗体修饰的反蛋白石光子晶体结构。其中,3-巯基丙基三甲氧基硅烷溶液为3-巯基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液,其体积浓度为5%;N-(4-马来酰亚胺丁酰基氧)琥珀酸亚胺溶液为N-(4-马来酰亚胺丁酰基氧)琥珀酸亚胺的二甲基亚砜溶液,其摩尔浓度为1.5μmol/L;链和亲霉素溶液为链和亲霉素溶液的磷酸缓冲盐溶液(pH=7.4),其质量浓度为12μg/mL;生物素化的抗体溶液为生物素化的EpCAM抗体的磷酸缓冲盐溶液(pH=7.4),其质量浓度为12μg/mL。
S6、取载玻片作为第二基层,用厚度为150μm的单层的封口膜对上述设置有抗体修饰的反蛋白石光子晶体结构的第一基层与第二基层进行隔离,以形成微流控腔;接着使用丙烯酸酯结构胶(9900 ergo)将第一基层和第二基层的侧边进行封装,风干60min固定后,再取出封口膜;然后,将进样管和出样管分别粘贴在第一基层和第二基层的未封装的短边两侧,并用丙烯酸酯结构胶(9900 ergo)将整个芯片进行封装,即可得到用于捕获和计数循环肿瘤细胞的微流控芯片。
实验例:
一、将上述实施例1得到的掺杂有Yb3+和Er3+的钒酸钇反蛋白石结构用原子力显微镜进行观察,其结果如附图2所示,其中插图为大图中白线部分的探针扫描结果。横坐标为距离,纵坐标为高度。如图所示,该钒酸钇反蛋白石结构的三维大孔结构成功地合成,其具有明显的蜂窝状表面,起伏程度达35.9nm,粗糙程度适当,可以与循环肿瘤细胞的伪足进行相互作用。
另外,不同孔径的钒酸钇反蛋白石结构的扫描电子显微镜的照片如附图3所示。从图中可以看出,钒酸钇反蛋白石结构的三维大孔结构在图中显示合成成功,表面六边形网状结构完整,排列整齐,孔隙大小均一,为良好的光子带隙提供了基础条件。另外,钒酸钇反蛋白石结构的三维大孔结构孔隙可调,图3中,从左到右,左图(图中标尺为1μm)为较小孔径的反蛋白石,孔径为198nm;中图(图中标尺为1μm)为中等孔径的反蛋白石,孔径为342nm,图中标尺为1μm;右图(图中标尺为1μm)为较大孔径的反蛋白石,孔径为488nm。
另外,将上述实施例1得到的掺杂有Yb3+和Er3+的钒酸钇反蛋白石结构置于磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)中浸泡并在摇床上摇晃3小时和12小时后的结构图(扫描电子显微镜图像)如附图4所示。图4中,从左到右,左图为钒酸钇反蛋白石结构未浸泡的扫描电子显微镜照片,可以观察到三维大孔结构被大面积,完整度较高的合成出来;中图为钒酸钇反蛋白石结构在摇床上浸泡于磷酸缓冲液(PBS缓冲液中)三小时后的扫描电子显微镜照片,可以观察到但三维大孔结构几乎没有被破坏;右图为钒酸钇反蛋白石结构在摇床上浸泡于磷酸缓冲液(PBS缓冲液中)十二小时后的扫描电子显微镜照片,可以观察到样品依旧大面积的保持着原貌。综上,本发明实施例得到的钒酸钇反蛋白石结构液体稳定性较好,可以胜任捕获面在磷酸盐缓冲液环境下40分钟到1小时的要求。
二、微流控芯片的捕获面(抗体修饰的反蛋白石光子晶体结构)的光学特性及表征
本发明实施例得到的捕获面具有三维大孔反蛋白石形貌设计。蛋白石以及反蛋白石都属于光子晶体范畴。光子晶体是一类在微纳尺寸具有规则形状排布的物质,光子带隙是其特征属性。光子带隙是指某结构本身具有“禁带”,即:在一定范围内的光波不能在其中传播,属于一种广义上的“带阻滤波器”,自然界中的光子晶体大都具有美丽的色彩,而在现代,人工也可以合成出这种具有周期结构的物质,蛋白石结构就是其中之一。而反蛋白石结构,在定义上来说也同样是蛋白石结构大类中的一员,同样也是光子晶体,具有光子带隙。
其中,本发明实施例1制得聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体(蛋白石光子晶体)和钒酸钇反蛋白石结构的光子带隙图如附图5所示。图5中,横坐标为光的波长,纵坐标为透射光强度,从蛋白石光子晶体的透射率曲线(下)可以看出,本发明成功制成了双层的,具有不同结构的蛋白石光子晶体,并且将不同的光子带隙赋予了同一个蛋白石光子晶体模板。钒酸钇反蛋白石结构的透射率图谱(上)说明钒酸钇反蛋白石成功继承了双层蛋白石光子晶体的双层光子带隙,并且经过调控,将两个带隙的上下边带分别重合,得到了在绿光部分的双光子晶体带边效应,这使得反蛋白石光子晶体模板对于发射场的增强有了巨大的提高。
因为折射率的不同,以及在退火过程中的坍缩。反蛋白石光子晶体的光子带隙一般比作为其模板的蛋白石光子晶体带隙位置蓝移,带隙更浅。反蛋白石光子晶体被我们选中的原因之一是因其周期尺寸可控,带隙可调,这为我们利用带边效应进行发射场增强造成了有利的条件。
光子晶体的带边效应是一种局域场增强技术,通过调控微光局域场,使激发光或发射光在物质表面被增强。本发明实施例利用合成手法合成了合适的双层蛋白石模板,并使用牺牲模板法得到了带隙合适的钒酸钇反蛋白石结构。
另外,分别制作无结构的掺杂有Yb3+和Er3+的钒酸钇(glass),掺杂有Yb3+和Er3+的钒酸钇单层反蛋白石结构(inner layer和out layer),并将二者与本发明实施例1制得的双层掺杂有Yb3+和Er3+的钒酸钇反蛋白石结构(double layer)进行发射光强度对比,其结果如图6所示。从图6中可以看出,反蛋白石结构对于Yb离子和Er离子上转换传能的研究,相比于在玻璃片上无结构的钒酸钇材料(glass),不管是内层空隙尺寸(inner layer),还是外层空隙尺寸(out layer)的钒酸钇反蛋白石都对上转换发光具有明显的增强作用,而相对于单层的光子晶体带边作用的增强,双层钒酸钇反蛋白石结构(double layer)的双带边作用增强程度更大,能为激光共聚焦显微系统平台视野提供更好的基底光。因此,单层反蛋白石对于光的发射场增强能力有限,但双层反蛋白石对于光的发射场增强有着十分显著的效果,这证明了我们选择具有三维大孔结构的双层反蛋白石结构达到了在设计时最初的目的,增强了光的强度,使比率荧光具有更高的准确性。
三、本发明实施例1制得的钒酸钇反蛋白石结构的XRD衍射图如附图7所示。图中的每个特征峰对应着晶体的不同镜面,本发明实施例制得的钒酸钇反蛋白石结构的衍射峰与标准卡大致相同,其说明本发明实施例成功合成出了钒酸钇反蛋白石。
四、细胞捕获和计数实验:
(1)合成纳米磁性复合材料:
纳米磁性复合材料的合成方法可参考张勇课题组及崔大祥课题组的工作制备合成,具体如下:首先合成纳米磁性材料Fe3O4,取1.5g FeCl3·6H2O和0.4gFeCl2·4H2O混合在10mL去离子水中,并加入质量分数为28%的氨水调节体系pH=9,在氮气保护下搅拌20min,经过磁铁分离得到纳米磁性材料Fe3O4。0.1 mL CO-520(非离子表面活性剂)、6mL环己烷、4 mL 2mg/mL的Fe3O4的环己烷溶液,搅拌10min,加入0.4mL CO-520、0.08 mL质量分数为30%的氨水,超声30 min,之后加入0.04 mL正硅酸乙酯,充分混合搅拌24 h,加入丙酮得到二氧化硅包覆的Fe3O4。取10 mg二氧化硅包覆的Fe3O4分散在乙醇和去离子水的混合液体中(乙醇15mL,去离子水3 mL),加入300 μL氨水,30μL 2-[甲氧基(聚氧乙烯)丙基]-三甲氧基硅烷,搅拌24 h,通过磁铁吸引,除去上层清液,进一步分散到6 mL二甲基亚砜中,5μL APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)以及1.1 mg NHS(N-羟基丁二酰亚胺)和1.6 mg EDS(碳化二亚胺),混合搅拌12h,经过磁铁分离后用二甲基亚砜和乙醇清洗三次。进一步取5mg经过修饰的 Fe3O4与1mg Ce6在1mL二甲基亚砜中混合,在室温下混合超声30min,并搅拌12h,即可得到纳米磁性复合材料。
(2)细胞捕获实验:
将细胞培养皿中MCF-7细胞(乳腺癌细胞,购自中国科学院上海生物科学研究所)加入0.5mL胰蛋白酶进行消化,再用磷酸缓冲盐溶液稀释成2×104cell/mL的细胞悬浮液,加入上述纳米磁性复合材料共同孵育3h,材料的用量为100μL纳米磁性复合材料加入到1mL细胞悬液中,细胞悬液浓度为2×104。取1mL加入到注射器中,将注射器与上述实施例1得到的微流控芯片的进样管相连,并在微流控芯片的第一基层上表面放置磁铁,通过注射泵,以4mL/h注入到微流控芯片中,另一端通过出样管进行收集。此时,可以在共聚焦显微镜下实时观测并记录细胞捕获情况。实时拍摄的捕获照片如附图8所示。结合附图8可以看到,循环肿瘤细胞(图片中的斑点)随着时间被大量地捕获,Overlay通道可以同时看到发射绿色光绿色的反蛋白石基地和发射红色光红色的循环肿瘤细胞;不同细胞数量的光谱总结,可以看出红光/绿光比率荧光随着细胞数量的上升而线性上升,经统计,可进行细胞计数;其表面本发明实施例得到的微流控芯片具有较高的捕获细胞能力。
另外,使用激光共聚焦平台实时监测微流控芯片捕获细胞。确定微流控芯片的捕获面表面为共聚焦显微镜的焦平面。打开激光器,使用405nm/415nm,980nm激光同时作用于微流控芯片。钒酸钇反蛋白石结构中的Er离子通过敏化剂Yb离子的传能,基态电子被激发到高能级,辐射跃迁后发射绿光。在正确的地方安装好磁体,提供外部磁场以便于牵引循环肿瘤细胞。启动电控微泵,细胞悬液以恒定的流速从进样管流入微流控芯片内部。细胞悬液迅速充满微腔,循环肿瘤细胞在外部磁场的牵引作用和流体的作用下向上和向前做分解运动。当循环肿瘤细胞被捕获面接触,很快与捕获面表面的抗体特异性结合,并且伸出伪足与三维大孔结构产生相互作用。在激光共聚焦显微镜的焦平面上,细胞在激发光的作用下发出红光,如图9~10所示。随着细胞数量的上升,焦平面内红光渐渐增强,而绿光保持基本不变,每一个共聚焦平台视野中的比率荧光代表微流控芯片中在此视野的细胞数量。在循环肿瘤细胞的捕获过程中,随着时间,微电脑注射泵以恒定的速度将细胞悬液从进样口注入到芯片流控微腔内部,因为外磁场的作用,循环肿瘤细胞将向上运动并终将被捕获面捕获。被捕获的细胞在激光共聚焦平台视野中显示红光,而掺杂Yb3+和Er3+的钒酸钇反蛋白石结构在上转换的过程中发出绿光。荧光比率可以表征细胞的数量,从图9可以看出,在细胞增多的过程中,比率荧光大致上线性上升。其中,图10为捕获过程中红光绿光的光谱集合,可以更直观的看出绿光大致不变,而红光强度上升。
(3)微流控芯片捕获率的确定。提前将微流控芯片操作前的细胞悬液通过细胞计数板统计其中的细胞密度,三次取平均值,记录下来。将通过微流控芯片的细胞悬液收集,通过细胞计数板统计其中的细胞密度,三次取平均值,记录下来。捕获率=(之前进入芯片原始数量的循环肿瘤细胞,收集后进入芯片细胞数量)/原循环肿瘤细胞的数*100%。
五、在微流控芯片捕获细胞过程中,控制有无磁场作为变量,将导致的微流控装置置于荧光共聚焦显微成像平台上,当有磁场时,微腔中的被特异性结合的肿瘤细胞受到重力,磁场力,流体的推力共同作用,运动被按照水平和竖直的坐标系分解为向前的运动,向上的运动,其他细胞受到重力,流体的推力共同作用,运动被按照水平和竖直的坐标系分解为向前的运动,向下的运动。当磁场被取消时,微腔中的细胞受到重力,流体的推力共同作用,运动被按照水平和竖直的坐标系分解为向前的运动,向下的运动。因为本装置设置为倒置形式,捕获表面位于微腔上方,所以受到磁场力向上运动的细胞拥有更大的几率与捕获表面接触,并且相互结合,具体如图11所示。
六、在微流控芯片捕获循环肿瘤细胞的过程中,由于磁场力的牵引,被磁珠捕获的循环肿瘤细胞会向上向捕获表面的方向移动,在移动的过程中,由于各细胞自身状况不同,结合的磁珠数量不同,运动轨迹便不同。在微流控芯片中,在不同的采样点获得不同数量的细胞,如图12所示。在进样口到出样口细胞呈递减态势,这决定了微流控装置是否具有足够的长度。
七、在荧光共聚焦显微平台中,循环肿瘤细胞被磁性复合材料结合后受激发出荧光,这与hoechst 33342和c6两种染料对比发现,复合材料存在于细胞质中。如图13的 a,b, c, d所示。在人全血中,可以清晰地分辨出不同的细胞:白血细胞,肿瘤细胞,单核细胞,红血细胞等呈现不同的尺寸和状态。
八、测试细胞在捕获表面上的附着性,在捕获过程实验后,取得捕获表面的图像和z轴扫描图像,如图14的a, b所示。使用10mL/h的PBS缓冲液通入微腔内对捕获表面冲洗,冲洗后,因为捕获面修饰了上表皮黏附因子的抗体,所以没有表达上表皮黏附因子的细胞被冲走,留下与捕获表面特异性结合的循环肿瘤细胞,如图14的c, d所示。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (12)
1.一种捕获和/或计数细胞的微流控芯片,其特征在于,包括:
第一基层;
抗体修饰的反蛋白石光子晶体结构,设置在所述第一基层上,其包括抗体修饰层以及双层掺杂有Yb3+和Er3+的钒酸钇反蛋白石结构层;
第二基层,设置在所述第一基层靠近所述抗体修饰的反蛋白石光子晶体结构的一侧;以及
微流控腔,设置在所述第一基层与所述第二基层之间。
2.一种如权利要求1所述的捕获和/或计数细胞的微流控芯片的制备方法,其特征在于,第一基层与第二基层均为上转换发光材料,在980纳米的近红外光激发下,可以通过上转换激发出Er3+的绿光,作为检测循环肿瘤细胞的光信号,和比率荧光检测信号。
3.一种如权利要求1所述的捕获和/或计数细胞的微流控芯片的制备方法,其特征在于,第一基层与第二基层均为反蛋白石光子晶体结构,并拥有不同的孔径和不同的带隙,通过局域场调控,双带边效应增强了上转换荧光的强度。
4.一种如权利要求1所述的捕获和/或计数细胞的微流控芯片的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
取一第一基层,并在第一基层上设置双层带隙不同的聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体;
将掺杂有Yb3+和Er3+的钒酸钇前驱体溶液渗入到上述设置有双层带隙不同的聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体的第一基层的光子晶体的缝隙中,并经煅烧处理,消除聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体,以在第一基层上形成双层掺杂有Yb3+和Er3+的钒酸钇反蛋白石结构层;
将双层掺杂有Yb3+和Er3+的钒酸钇反蛋白石结构层依次置于3-巯基丙基三甲氧基硅烷溶液、N-(4-马来酰亚胺丁酰基氧)琥珀酸亚胺溶液、链和亲霉素溶液以及生物素化的抗体溶液中进行修饰处理,形成抗体修饰层,得到设置在第一基层上的抗体修饰的反蛋白石光子晶体结构;
取一第二基层,将设置有抗体修饰的反蛋白石光子晶体结构的第一基层与第二基层进行隔离,以形成微流控腔,然后进行封装处理,得到所述微流控芯片。
5.根据权利要求4所述的一种捕获和/或计数细胞的微流控芯片的制备方法,其特征在于,所述步骤,在第一基层上设置双层带隙不同的聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体的方法具体包括:
取两组第一基层,将两组第一基层分别置于两组粒度不同的聚甲基丙烯酸甲酯溶液进行处理后,再经烘干处理,得到两组分别附有不同带隙的聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体的第一基层;
用氯化钠溶液对其中一组附有聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体的第一基层上的聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体进行剥离,然后用另一组附有聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体的第一基层吸附被剥离出的聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体,并经烘干处理,得到设置有双层带隙不同的聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体的第一基层。
6.根据权利要求4所述的一种捕获和/或计数细胞的微流控芯片的制备方法,其特征在于,所述步骤中,掺杂有Yb3+和Er3+的钒酸钇前驱体溶液是由硝酸溶液、去离子水、偏钒酸铵、柠檬酸、硝酸钇、硝酸镱和硝酸铒混合配制而成。
7.根据权利要求6所述的一种捕获和/或计数细胞的微流控芯片的制备方法,其特征在于,所述偏钒酸铵、硝酸钇、硝酸镱和硝酸铒的摩尔比为30:(7~9):(1.5~2.5):(0.05~0.15)。
8.根据权利要求4所述的一种捕获和/或计数细胞的微流控芯片的制备方法,其特征在于,所述步骤中,煅烧处理的温度为500~600℃。
9.根据权利要求4所述的一种捕获和/或计数细胞的微流控芯片的制备方法,其特征在于:
所述3-巯基丙基三甲氧基硅烷溶液为3-巯基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液,其体积浓度为3%~5%;
所述N-(4-马来酰亚胺丁酰基氧)琥珀酸亚胺溶液为N-(4-马来酰亚胺丁酰基氧)琥珀酸亚胺的二甲基亚砜溶液,其摩尔浓度为0.5~1.5μmol/L;
所述链和亲霉素溶液为链和亲霉素溶液的磷酸缓冲盐溶液,其质量浓度为8~12μg/mL;
所述生物素化的抗体溶液为生物素化的抗体的磷酸缓冲盐溶液,其质量浓度为8~12μg/mL。
10.根据权利要求4或9所述的一种捕获和/或计数细胞的微流控芯片的制备方法,其特征在于,生物素化的抗体为生物素化的EpCAM抗体。
11.一种如权利要求4~10中任一项所述制备方法制得的微流控芯片。
12.一种如权利要求1或11所述的微流控芯片在用于捕获和/或基于上转换荧光在计数细胞中的应用。
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