CN105689028A - 用于免疫微球单一分布的微流体芯片、方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于免疫微球单一分布的微流体芯片、方法及其应用，其特征在于所述的微流芯片是由平行排列的样品池组成，每个样品池是由20000个直径10μm的微孔组成，每个微孔分布一个免疫微球，每个样品池相互独立，互不影响；样品池的数量根据实际需求改变而改变。本发明微阵列芯片主要用于微球免疫检测，检测离体肿瘤标志物的免疫检测灵敏度也高，同时较常规ELISA方式不仅灵敏度大大提高，而且准确性控制在20％以内，满足临床的需求。

Description

用于免疫微球单一分布的微流体芯片、方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种用于免疫微球单一分布的微流体芯片、方法及其应用，更确切地说是一种可以将免疫磁珠单一分布及将免疫反应、清洗及检测于一体的检测系统，包括微流体芯片领域和微球免疫检测方法。
背景技术
以微球或磁性微球作为生化反应的固相支持物对生物检测方法具有重要意义。微球具有的高体表比，使其表面能结合大量的抗体及其他生物分子探针，伴随着轻微震荡，微球能够悬浮在液相体系中，微球表面充分和溶液接触，表面溶液时刻更新，传质影响较小，表面修饰的生物分子与溶液中的目标分子相互作用的几率增大，彼此结合的动力学和热力学性质都得到改善，从而明显缩短了分析时间。微球可以通过不同颜色的荧光物质标记，同样作为一种高通量分析载体得到了广泛的应用。
在常规的反应试管或微孔板里，微球虽然可以较好地悬浮在液相体系里，但是由于微球表面的电荷特性、微球表面一些基团的交联作用以及缓冲溶液中离子浓度的变化等原因会导致微球聚集成簇，严重影响微球表面的生物分子反应效率；另外，对于检测荧光信号的反应体系来说，聚集成簇的微球容易造成荧光信号的干扰。因此，需要一种可将微球能单一、均匀分布的系统。
另外，在对于大部分免疫反应及生化反应来说，反应结束后都需要用洗液清洗未参与反应的多余的生物分子及信号探针，以降低非特异信号的干扰，获得较高的信噪比。而如果利用微球作为固相支持物，这个清洗过程就会变得非常为复杂，目前常用的方法就是离心，而离心过程不仅比较费时，还会导致磁珠进一步聚集，影响后续信号的检测。微流体芯片技术的发展可以为解决这个问题提供技术支持。微流体分析芯片是以微机电加工为手段，把样品预处理、反应、分离、检测等基本操作单元集成在一块几厘米大小的芯片上。利用微流体芯片不仅可以缩小分析仪器体积，还可以减小试剂消耗，加快反应速度，成本低甚至一次性使用，还具有易操控、易集成、通量大等优势。因此，利用微流体芯片技术，在玻璃或PDMS(聚二甲基硅氧烷)等基片上，刻蚀微管道、微孔或微反应腔，从而构建将磁珠单一分布、免疫反应、清洗及检测为一体的检测体系。
专利文献1(CN1635146A)公开了一种一维微珠芯片用于基因及蛋白的表达分析。该芯片是在微流控芯片微分离通道上设置多个小室，不同的小室利用显微操作技术放置表面修饰了不同生物分子的微颗粒；在进行基因分析或蛋白分析时，微颗粒特异性地识别和捕获多种目标分子，然后引入荧光实际，微颗粒表面最终特异性结合上荧光标记物，再用荧光成像检测。该方法设计虽然具有微流控技术和阵列分析的优点，但所述的方法需要压力驱动或者电驱动，微珠分散技术比较繁琐。分析微珠的尺寸比较大，数量低，准确度低，重复性差。且该芯片只有一个单元，难以实现高通量分析。
文献2(Henley；2012.Fabricationofmicrofluidicdevicescontainingpatternedmicrowellarrays.Anal.Chem.84(3),1776-1780)报道了一种基于微孔阵列的微流体装置，在压力驱动下，将大量的微珠引入微流体装置。此芯片只有一个单元，微珠的填充率低。在流体驱动下，造成大量微珠流失。文献3(Filipponi,L.,2009.Microbeadsonmicroposts:aninvertedarchitectureforbeadmicroarrays.Biosens.Bioelectron.24(7),1850-1857)报道了一种微珠固定在微孔中的方式，在加热PDMS之前，微珠被均匀分散在硅片阳模上，然后利用PDMS复制阳模上的结构，标有抗体的微珠被固定在了PDMS上。但此方法易造成蛋白的变性，高温下，抗原抗体等生物分子容易失活。
因此，目前面临的技术性难题在于研发一款在结构和微珠操控方式上比较简单的芯片，不仅实现微珠的均匀分布，而且可以达到高通量，高灵敏度的要求。从而引导出本发明的构思。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可将微球单一分布的多通道微流体芯片、制备方法及其在离体的肿瘤标志物检测方面的应用；
首先，本发明提供了一种多通道微流体芯片。该芯片是由平行排列的样品池组成，每个样品池是由20000个直径10μm的微孔组成，每个微孔可以分布一个免疫微球，每个样品池相互独立，互不影响。样品池的数量可以根据实际需求改变而改变，不只局限于16个。16个只是为叙述方便和经常使用的样品池数目。
本发明提供了一种所述的微流体芯片的制备方法：利用硅片作衬底，在第一层掩模板的保护下，利用SU-83050光刻胶，经过甩胶，前烘，曝光，后烘，显影后做出阳模的第一层，厚度大概是200μm左右。这个高度即是后续样片池的高度，可以容纳多达10μl的液体。然后在第一层的基础上进行第二层掩模板的套刻。在第二层微柱层掩模板的保护下，利用PI(聚酰亚胺)光刻胶制备出所要的微柱结构层，8-10μm左右。这个高度略大于单个聚苯乙烯微珠的直径，刚好容纳一个微珠。两层结构做好后，在170～200℃的热板上硬烘30～60min，这样防止模具因多次使用而造成光刻胶的脱落。完成整个模具结构的制作后，在硅片上复制出的阴模结构即为所要的微流体芯片结构。
本发明还提供了一种所述的微流体芯片应用于肿瘤标志物的离体的免疫检测：首先用NHS(N-Hydroxysuccinimide，N-羟基硫代硫代琥珀酰亚胺)/EDC(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimidehydrochloride，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)活化微球的方式分别标记三种肿瘤标志物的捕获抗体。然后是将一定量的微球(20000～30000个/反应)，一定浓度的混合好的待检测标准品：CYFRA21-1(fragmentsofcytokeratin19，细胞角蛋白片段19)抗原、CEA(carcinoembryonicantigen，癌胚抗原)抗原、NSE(neuron-specificenolase，神经烯醇化酶)抗原、空白对照及待测样本(各10μl)和不同发射波长的量子点标记的检测抗体(QD-625：1.5～2nM；QD-525及QD-585:20～25nM)滴加到微阵列芯片中间区域37℃孵育30～60min；红色量子点QD-625识别CYFRA21-1抗原，黄色量子点QD-585识别CEA抗原，绿色量子点QD-525识别NSE抗原；孵育结束后，可直接将整块微流体芯片放在自动摇床上以2000～3000转速清洗5分钟，这样可以保证16个反应单元清洗步骤的同步性，减小操作误差。最后用荧光显微镜观察并拍照，并用现有的图像分析软件对图形信号进行分析(具体方法见专利CN201510329958X)。
在本发明提供的微阵列芯片检测肿瘤标志物方法中，所述的微球是聚苯乙烯微球，直径为6.5μm，本身的背景荧光值低，对于后续的分析不会造成干扰。
本发明所提供的微阵列芯片检测肿瘤标志物的方法中，所述的量子点为CdSe/ZnS(硒化镉/硫化锌)氨基量子点。其水溶性好，量子产率高，抗光漂白性强。
综上所述，本发明提供的微流体芯片，集成了16个带有微孔的结构单元，因此可以在一块芯片上实现对多个样品进行同时检测；且每个单元相互独立，避免了液体回流混合造成的试剂的交叉污染。所用的免疫微球可以单一地沉积在检测区域的每个微孔里，提高了微球的分散性，不仅提高了反应的效率，而且避免了微球堆积造成的微球信号之间的干扰。本发明所提供的微流体芯片，清洗方便，操作简单，大大提高了反应的效率，检测灵敏度比较也高，本发明的检测限为(CEA:0.19ng/ml；CYFRA21-1:0.97ng/ml；NSE:0.37ng/ml；S/N＝3)，而常规ELISA的检测限最低只能做到10ng/ml的数量级。相比于常规的ELISA方式，由此可见本发明提供的芯片和检测方法，不仅灵敏度大大提高，而且在检测准确性方面，利用本发明的检测芯片检测了合成血清质控品(CEA、CYFRA21-1、NSE抗原的浓度已知)进行验证，相对偏差(相对偏差＝检测值与实际值的差值÷实际值×100％)均控制在20％以内，准确性比较高，可满足临床的需求。
总之，本发明微阵列芯片主要用于微球免疫检测，将大量标记抗体的微球，带检测抗原以及标记了检测抗体的量子点探针混合溶液滴加在每个样品池里，在液体蒸发力和表面张力的作用下，微球被均一分散在微孔中，避免了微球与微球之间信号的干扰；同时，利用微球高的表面积体积比，加快了反应的速率；在一块芯片上集成多个样品池，可一次进行多个样品的同时检测。本发明的微流体芯片操作简单，节省时间，耗费试剂少且高效准确。
附图说明
图1为本发明提供的微流体芯片的掩模板结构图。
图2为本发明提供的微流体芯片三维立体示意图，其中(a)为排布有16个芯片反应池的微流体芯片示意图；(b)为微流体芯片上的其中一个芯片反应池。
图3为用于三种离体肿瘤标志物检测的结果图。(A)不同浓度的抗原反应后荧光照片；(B)不同抗原的荧光强度与抗原浓度关系曲线；(C)荧光强度与抗原浓度直线的线性关系。
具体实施方式
实施例1多通道微流体芯片的结构
微流体芯片的掩模板结构图如图1所示，图中A代表第一层掩模板的整体结构，包含16个平行排列的相同单元。B代表第二层掩模板的结构图，包含16个相同的点阵，每个单元点阵由20000个直径10μm，间隔10μm的小圆组成。和第一层对准后，这16个密集的点阵恰好位于16个平行排列的单元腔体内。C代表这些小圆放大后的图。
实施例2本发明提供的微流体芯片三维立体示意图
如图2所示，微球最后都沉积在检测区域的微孔中。其中左图为排布有16个芯片反应池的微流体芯片示意图；右图为微流体芯片上的其中一个芯片反应池，由20000个直径10μm的微孔组成。
实施例3基于量子点标记的微阵列芯片检测三种离体肿瘤标志物
1、聚苯乙烯微球的生物功能化修饰及标记
1)利用PBS(磷酸缓冲盐溶液，phosphatebuffersaline)将微珠重新混合均匀后，吸取5.0X106的微球入离心管中，磁分离器上放置30-60s后吸去上清液，吸取100μlH2O重悬清洗，涡旋并超声20s；
2)磁分离器上放置30-60s后吸去上清液，吸取80μl100mM磷酸二氢钠溶液(PH6.2)重悬，涡旋并超声约20s，加10μl50mg/mlSμlfo-NHS，EDC(indH2O),轻柔涡旋震荡，室温下孵育20min，每10min轻柔涡旋震荡，重新混合；
3)磁分离器上放置30-60s后吸去上清液，吸取250μl50mMPH5.0的MES(4-MorpholineEthaneSμlfonicAcid，2—(N—吗啉代)乙磺酸)重悬，涡旋并超声约20s；(100mMMESPH6.0，或PH7.4的PBS也可，依蛋白质对PH值要求而定，重复上述清洗步骤；
4)吸取100μl50mMMES(PH5.0)重悬，涡旋并超声约20s，加1-125ug蛋白质入体系中，用50mMMES(PH5.0)补齐体积到500μl，涡旋混合体系，使之反应，室温下孵育2h，用涡旋器轻柔震荡；
5)磁分离器上放置30-60s后吸去上清液，吸取500μlPBS-TBN重悬，涡旋并超声约20s(PBS-TBN:0.1％BSA,0.02％Tween-20,0.05％Adize,PH7.4PBS-TB:0.1％BSA,0.05％Adize,PH7.4都可用作储存缓冲液)混合着(byrotation)在室温下孵育30分钟；磁分离器上放置30-60s后吸去上清液，吸取1mLPBS-TBN重悬，涡旋并超声约20s(PBS-TBN,PBS,0.05％Tween-20均可作为washingbuffer)，重复上述清洗步骤，加250-1000μlPBS-TBN定容，用细胞计数器数数，2-8℃避光保存。
2、芯片的制备过程
1)利用计算机辅助设计软件CAD(ComputerAidedDesign，计算机辅助设计)作图，设计出芯片结构图，其中比较窄的管道的宽度为750μm,中间检测区域矩形的长，宽分别是8743μm，2084μm。小微柱的直径为10μm，间距为10μm，深度也在10μm左右。
2)利用硅片作衬底，利用SU-8(环氧基紫外负性光刻胶)胶和第一层掩模板，经过甩胶，前烘，曝光，后烘，显影后做出阳模的第一层，厚度大概是200μm左右，然后利用PI(polyimide，聚酰亚胺)光刻胶和微柱层掩模板，在第一层的基础上进行第二层的套刻，制备出所要的微柱结构层，8-10μm左右。两层结构做好后，在200℃的热板上硬烘30min，完成整个模具结构的制作。
3)将PDMS和固化剂以质量比为10：1的比例混合，抽气半小时后，浇注在制备出的功能层模具上，90℃加热固化，制备出含有微孔的结构。为了防止硅片阳模在多次使用过程中碎裂，接下来利用先前浇出的PDMS倒在3寸干净的培养皿里，图案面朝上，真空抽气1小时。然后将配置好的环氧胶(环氧胶的配方为：A胶：B胶＝4：1)倒在抽完气的PDMS上，静置3～4天左右，这样就制备出了和硅片上图案一致的阳模。最后再利用环氧胶为阳模，按照前面所述方式配置好PDMS并抽气，并把配置好的PDMS浇注在环氧胶上，65℃加热4小时，然后接下PDMS阴模，150℃加热2小时以增加PDMS的疏水性，防止水溶性的量子点的吸附，造成最后分析背景大的问题。
3、芯片用于肿瘤标志物离体检测的性能
1)将标记好抗体的微球用2％BSA(牛血清白蛋白)封闭20min；
2)将三种微球(CYFRA21-1，NSE，CEA)均匀混合，每一个反应取20000个微球；三种待检测抗原CYFRA21-1，NSE，CEA)按1：1：1的比例混合，抗原最终浓度为1000、330、110、36.7、12.2、4.06、1.35、0.45、0ng/mL；三种量子点荧光探针最终浓度分别为：2nMQD-625、25nMQD-525及25nMQD-585；将上述微球、不同浓度抗原及量子点荧光探针混合均匀后，滴加到微阵列芯片中间区域37℃孵育1小时；
3)孵育结束后，吸走上清，并滴加PBS清洗掉未结合的量子点溶液，这个过程可以用枪反复抽打的方式进行。最后用荧光显微镜观察并拍照，并用现有的图像分析软件对图形信号进行分析。
不同浓度混合抗原的检测反应。红色代表检测CYFRA21-1抗原，黄色代表检测CEA抗原，绿色代表检测NSE抗原。A)不同浓度的抗原反应后荧光拍照图；B)软件分析后的荧光强度与抗原浓度的关系及校正曲线；C)软件分析后的荧光强度与抗原浓度直线的线性关系。线性范围为：CEA和CYFRA21-1为1.03–111ng/mL；NSE,9.26–1000ng/ml。
表1为准确性检测结果：选择含三种已知浓度CEA、CYFRA21-1、NSE抗原的合成血清质控品，用本发明芯片检测，评估其相对偏差(相对偏差＝检测值与实际值的差值÷实际值×100％)，相对偏差均控制在20％以内，满足临床需要。
表1.CEA、CYFRA21-1、NSE三种蛋白准确性检测结果

Claims (10)

1.一种用于免疫微球单一分布的微流体芯片，其特征在于所述的芯片由平行排列的样品池组成，每个样品池是由20000个直径10μm的微孔组成，每个微孔分布一个免疫微球，每个样品池相互独立，互不影响。
2.按权利要求1所述的微流体芯片，其特征在于：
①所述的免疫微球单一地沉积在检测区域的每个微孔中；
②所述的微球为聚苯乙烯微球，直径为6.5μm。
3.按权利要求1所述的微流体芯片，其特征在于样品池的数量根据实际需求改变而改变。
4.按权利要求1所述的微流体芯片，其特征在于样品池的数目为16个。
5.制作如权利要求1-4所述的任一个微流体芯片的方法，其特征在于具体制作步骤是：
①利用硅片作衬底，在第一层掩模板的保护下，利用SU-83050光刻胶，经过甩胶，前烘，曝光，后烘，显影后做出阳模的第一层；
②然后在第一层的基础上进行第二层掩模板的套刻；在第二层微柱层掩模板的保护下，利用聚酰亚胺光刻胶制备出所要的微柱结构层；
③两层结构做好后，在170～200℃的热板上硬烘30～60min，以防止模具因多次使用而造成光刻胶的脱落；
④完成整个模具结构的制作后，在硅片上复制出的阴模结构即为所要的微流体芯片结构。
6.按权利要求5所述的方法，其特征在于：
①第一层厚度为200μm，容纳多达10μl的液体；
②第二层厚度为8-10μm，略大于单个聚苯乙烯微球直径，正好容纳一个微球。
7.应用权利要求1所述的微流体芯片检测离体肿瘤标志物的检测方法，其特征在于具体步骤为：
首先用NHS/EDC活化微球的方式分别标记三种离体肿瘤标志物的捕获抗体；然后是将20000～30000个/反应的微球，一定浓度的混合好的待检测标准品：CYFRA21-1抗原、CEA抗原、NSE抗原、空白对照及待测样本各10μl和不同发射波长的量子点标记的检测抗体滴加到微阵列芯片中间区域37℃孵育30～60min；红色量子点QD-625识别CYFRA21-1抗原，黄色量子点QD-585识别CEA抗原，绿色量子点QD-525识别NSE抗原；孵育结束后，直接将整块微流体芯片放在自动摇床上以2000～3000转速清洗5分钟，保证16个反应单元清洗步骤的同步性，减小操作误差；最后用荧光显微镜观察并拍照，并用现有的图像分析软件对图形信号进行分析。
8.按权利要求7所述的方法，其特征在于具体分三大步骤，它们是：
(一)聚苯乙烯微球的生物功能化修饰及标记
1)利用PBS将微珠重新混合均匀后，吸取5.0X106的微球入离心管中，磁分离器上放置30-60s后吸去上清液，吸取100μlH2O重悬清洗，涡旋并超声20s；
2)在磁分离器上放置30-60s后吸去上清液，吸取80μl100mMPH为6.2磷酸二氢钠溶液重悬，涡旋并超声20s，加10μl50mg/mlSμlfo-NHS，EDC,轻柔涡旋震荡，室温下孵育20min，每10min轻柔涡旋震荡，重新混合；
3)再在磁分离器上放置30-60s后吸去上清液，吸取250μl50mMPH5.0的MES重悬，涡旋并超声20s；
4)吸取100μl50mMMESPH5.0重悬，涡旋并超声20s，加1-125ug蛋白质入体系中，用PH5.050mMMES补齐体积到500μl，涡旋混合体系，使之反应，室温下孵育2h，用涡旋器轻柔震荡；
5)磁分离器上放置30-60s后吸去上清液，吸取500μlPBS-TBN重悬，涡旋并超声20s混合并在室温下孵育30分钟；磁分离器上放置30-60s后吸去上清液，吸取1mLPBS-TBN重悬，涡旋并超声20s，重复上述清洗步骤，加250-1000μlPBS-TBN定容，用细胞计数器数数，2-8℃避光保存；
(二)芯片的制备
1)利用计算机辅助设计软件CAD计算机辅助作图，设计出芯片结构图，其中比较窄的管道的宽度为750μm,中间检测区域矩形的长，宽分别是8743μm，2084μm。小微柱的直径为10μm，间距为10μm，深度也在10μm；
2)利用硅片作衬底，利用SU-8胶和第一层掩模板，经过甩胶，前烘，曝光，后烘，显影后做出阳模的第一层，然后利用聚酰亚胺PI光刻胶和微柱层掩模板，在第一层的基础上进行第二层的套刻，制备出所要的微柱结构层，两层结构做好后，在200℃的热板上硬烘30min，完成整个模具结构的制作；
3)将PDMS和固化剂以质量比为10：1的比例混合，抽气半小时后，浇注在制备出的功能层模具上，90℃加热固化，制备出含有微孔的结构；为了防止硅片阳模在多次使用过程中碎裂，接下来利用先前浇出的PDMS倒在3寸干净的培养皿里，图案面朝上，真空抽气1小时；然后将配置好的环氧胶，环氧胶的配方为：A胶：B胶＝4：1倒在抽完气的PDMS上，静置3～4天左右，制备出和硅片上图案一致的阳模；最后再利用环氧胶为阳模，按照前面所述方式配置好PDMS并抽气，并把配置好的PDMS浇注在环氧胶上，65℃加热4小时，然后接下PDMS阴模，150℃加热2小时以增加PDMS的疏水性，防止水溶性的量子点的吸附；
(三)芯片用于肿瘤标志物离体检测
1)将标记好抗体的微球用2％BSA封闭20min；
2)将CYFRA21-1，NSE和CEA三种微球均匀混合，每一个反应取20000个微球；三种CYFRA21-1，NSE和CEA待检测抗原按1：1：1的比例混合，抗原最终浓度为1000、330、110、36.7、12.2、4.06、1.35、0.45、0ng/mL；三种量子点荧光探针最终浓度分别为：2nMQD-625、25nMQD-525及25nMQD-585；将上述微球、不同浓度抗原及量子点荧光探针混合均匀后，滴加到微阵列芯片中间区域37℃孵育1小时；
3)孵育结束后，吸走上清，并滴加PBS清洗掉未结合的量子点溶液，这个过程可以用枪反复抽打的方式进行；最后用荧光显微镜观察并拍照，并用现有的图像分析软件对图形信号进行分析。
9.按权利要求7所述的方法，其特征在于所述的量子点为CdSe/ZnS氨基量子点。
10.按权利要求8所述的方法，其特征在于：
a)步骤一中3)或使用100mMPH6.0或PH7.4的PBS，具体依蛋白质对PH值要求而定；
b)步骤二中1)所述的芯片结构是窄的管道宽度为750μm，中间检测区的矩形长、宽分别为8743μm，间距为10μm，深度为10μm；
c)检测限为CEA：0.19ng/ml，CYFRA21-1：0.97ng/ml，NSE：0.37ng/ml，相对偏差在20％以内，满足临床检测要求。
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