CN110596375A - 微孔板、基于微孔板的高灵敏度免疫荧光检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及材料化学、生物分子检测技术领域，具体涉及一种微孔板、基于微孔板的高灵敏度免疫荧光检测方法。一种微孔板，用于酶联免疫分析，包括一平面材料，所述平面材料的平面上加工有微米级尺寸的微腔阵列。本发明中，由于微孔板上的微孔体积微小，单次样本检测只需加入极少量的底物，且酶作用底物产生的荧光分子被很好的聚集在微孔中，可在荧光分子数量很少的情况下仍然被荧光显微镜检测到，从而提升方法的检测灵敏度。

Description

微孔板、基于微孔板的高灵敏度免疫荧光检测方法

技术领域

本发明涉及材料化学、生物分子检测技术领域，具体涉及一种微孔板以及以微孔板作为聚集荧光分子，提升检测灵敏度的免疫荧光检测方法。

背景技术

在生命科学研究和临床应用中，生物分子的检测是多种疾病诊断和治疗的基础。作为最常用的生物分子检测方法，酶联免疫分析方法即ELISA，应用酶对检测抗体进行标记，在进行抗原抗体的特异性免疫反应后，酶催化底物发生显色反应，用以定量检测抗原。该方法结合了免疫结合技术和酶的高效催化作用，在快速、低成本、易操作等方面尽显检测优势。相比于免疫荧光法，化学发光法和电化学发光法等，ELISA仍然是多种临床免疫指标检测的不可替代的主导技术。

ELISA既可以用来检测抗原，也可以检测抗体，主要类型包括双抗体夹心法，间接法，竞争法，双位点一步法，捕获法测IgM抗体，应用亲和素和生物素的ELISA。其中，临床检测抗原中最常用的检测方法是双抗体夹心法。该方法目前已经商用制备成为试剂盒。将可与检测抗原特异性配对的捕获抗体作为探针包被到固相载体上并洗去多余未结合的抗体后，加入待检样本适温孵育，在样本中的抗原和固相载体上的抗体通过免疫反应结合后，洗去未结合物质并加入酶标记的抗体孵育，形成抗体-抗原-抗体-酶复合物，再次洗涤去除未结合的酶标抗体，加入底物显色。针对用户不同样本的检测需求，选用与检测抗原特异性配对的捕获抗体包被在96孔板制备特种检测样本的试剂盒。目前已商业化的ELISA试剂盒，操作简单方便，对于检测人员要求不高，检测范围和检测限根据不同的抗原抗体种类不同，大概在纳克至微克级别。

由于96孔板的每个孔具有平方厘米级的底面积，通常需要添加百微升体积的液体覆盖整个孔板底面进行反应，因而当检测样本浓度较低导致酶的量少时，产生的少量荧光分子在百微升的体系里很难被探测到信号，即难以对低浓度的样品进行检测。相较于液相生物芯片，电化学方法等生物分子检测方法，该方法虽然成熟稳定，可操作性强，但在检测灵敏度方面的表现不尽人意。在未来的科学研究和临床应用中，如何发展一种高灵敏、简单、廉价的检测技术用于生物分子分析，尤其是特定疾病的生物标志物的定量检测，仍是亟待解决的问题。

发明内容

为解决上述背景技术中存在的问题，本发明提出一种微孔板以及基于微孔板的高灵敏度免疫荧光检测方法，该方法具有简单、廉价，易于操作的优点。

一种微孔板，用于酶联免疫分析，其特殊之处在于：

包括一平面材料，所述平面材料的平面上加工有微米级尺寸的微腔阵列。

优选地，上述平面材料可以为PC、PS、PMMA等塑料材料，也可以为石英、硅片等硬质材料。

优选地，平面上加工微米级尺寸的微腔阵列可以采用湿法刻蚀、干法刻蚀、纳米压印、激光加工等方法。

本发明解决上述问题的技术方案是：一种基于微孔板的高灵敏度免疫荧光检测方法，其特殊之处在于，包括以下步骤：

1)双抗夹心法反应

在96孔板进行检测抗原的捕获和酶标检测抗体的结合；

2)应用微孔板聚集荧光分子

将底物滴在上述微孔板加工有微米级尺寸的微腔阵列的平面上，然后将微孔板的平面向下压实在96孔板底面进行反应；

或者，将少量底物加入步骤1)中96孔板的反应孔中，然后立即将上述微孔板的微腔阵列的平面压实在反应孔底面上，进行反应；

3)荧光显微镜检测

将反应完成后的微孔板通过荧光显微镜成像，然后用图像分析软件对其进行荧光强度计算用以定量检测样本。

优选地，上述荧光显微镜成像可以采用荧光显微镜、共焦荧光显微镜或者荧光扫描显微成像等仪器或技术。

本发明的优点：

1)本发明在现有ELISA的基础上，结合使用微孔板，可以解决传统ELISA灵敏度不够高的问题，且该方法简单、廉价，易于操作；

2)本发明中，由于微孔板上的微孔体积微小，单次样本检测只需加入极少量的底物，且酶作用底物产生的荧光分子被很好的聚集在微孔中，可在荧光分子数量很少的情况下仍然被荧光显微镜检测到，从而提升方法的检测灵敏度。

附图说明

图1是本发明一种基于微孔板的荧光免疫检测方法相对传统ELISA提升灵敏度的原理示意图；

图2是本发明一种基于微孔板的荧光免疫检测方法的检测步骤示意图；

图3是本发明中微纳加工得到的微孔板的明场显微镜图；

图4是本发明应用微孔板聚集荧光分子的不同浓度老鼠肉双抗夹心实验荧光显微图；其中，a-d实验组的检测浓度分别为200U/mL、10U/mL、0.2U/mL、0.002U/mL；e为空白对照组，选用10mM的PBS溶液代替检测样本；

图5是本发明中应用微孔板聚集荧光分子的不同浓度老鼠肉双抗夹心实验浓度响应曲线。

具体实施方式

为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

实施例一

一种微孔板，平面材料是聚碳酸酯板，即PC板。本实施例中的微腔采用纳米压印的方式制备，明场显微镜图如图3所示，微腔分布均匀，单个微腔大小为4.5微米×4.5微米×3微米。微孔板的制备过程与现有微纳加工工艺兼容，便于大规模生产从而降低成本，制备所用材料安全无毒，易于保存和运输，而且应用微孔板在整个流程中，并不会过度增加检测方法的复杂性。微孔板在实际制作中，厚度不限，优选为几百微米至几毫米；边长不限，优选为几毫米。

实施例二

如图2所示，一种基于微孔板的高灵敏度免疫荧光检测方法，包括以下步骤：

1)双抗夹心法反应

在96孔板进行老鼠肉双抗夹心法反应，包括检测抗原的捕获和酶标检测抗体的结合。在已包被了捕获抗体的96孔板中，每个反应孔加入不同浓度的50μL老鼠肉试剂盒标准品，分别为200U/mL、10U/mL、0.2U/mL、0.002U/mL，并用10mM的PBS溶液作为空白对照组，室温下摇晃反应2小时，然后每孔用300μL,10mM的PBS溶液清洗3次。之后加入50μL HRP标记的检测抗体，在37℃摇晃1小时，重复洗涤四次。

2)应用微孔板聚集荧光分子

每次取3μL，7mM的10-乙酰基-3，7-二羟基吩嗪(ADHP)过氧化氢溶液(0.3％)作为底物滴在一个微孔板的微腔刻蚀面，然后将微孔板的微腔刻蚀面向下压实在96孔板底面。96孔板底面的酶HRP作用底物ADHP产生荧光分子，20分钟后对各个微孔板进行荧光显微镜成像。

3)荧光显微镜检测

反应完成后的微孔板通过荧光显微镜成像，激发波长546nm，然后用Image J对其进行荧光强度计算用以定量检测样本。对四组梯度和一组空白样品进行荧光显微镜成像的结果如图4所示。随着检测样本的浓度降低，微孔板内液体的荧光强度逐渐下降，空白对照组几乎探测不到荧光强度。该实验的浓度响应曲线如图5所示，在我们的检测范围内，荧光强度和检测样本浓度大致呈现线性关系。

本发明的一种基于微孔板的荧光免疫检测方法，是在传统ELISA的基础上，结合使用微孔板来聚集荧光分子，提升检测灵敏度。该方法相较于传统ELISA方法可以提升检测灵敏度，原理如图1所示。对于传统ELISA，由于96孔板的每个反应孔具有0.32平方厘米的底面积，通常需要添加大概百微升体积的液体覆盖整个孔板底面进行反应，因而当检测样本浓度较低导致酶的数量较少时，酶作用底物产生的荧光分子数量也就很少，少量荧光分子分散在百微升的液体体系里难以被探测到信号，即无法对低浓度的样品进行检测。

而本发明实施例中，应用PC板表面微纳加工了只有几个微米边长的微孔作为酶作用底物的微反应腔室，单个微孔大概只有几十飞升的体积。通过使用微孔板减小酶和底物的反应空间，将酶作用底物产生的荧光分子聚集在微孔中，使得只有少量的荧光分子也可以被荧光显微镜探测到信号，从而完成对低浓度目标分析物的检测，提升方法的检测灵敏度。

以上所述仅为本发明的实施例，并非以此限制本发明的保护范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的系统领域，均同理包括在本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一种微孔板，用于酶联免疫分析，其特征在于：

包括一平面材料，所述平面材料的平面上加工有微米级尺寸的微腔阵列。

2.根据权利要求1所述的一种微孔板，其特征在于：所述平面材料可以为PC、PS、PMMA、石英或硅片材料。

3.根据权利要求1或2所述的一种微孔板，其特征在于：所述平面上加工微米级尺寸的微腔阵列可以采用湿法刻蚀、干法刻蚀、纳米压印或激光加工方法进行加工。

4.一种基于微孔板的高灵敏度免疫荧光检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)双抗夹心法反应

在96孔板进行检测抗原的捕获和酶标检测抗体的结合；

2)应用微孔板聚集荧光分子

将底物滴在如权利要求1-3任一所述的微孔板加工有微米级尺寸的微腔阵列的平面上，然后将微孔板的平面向下压实在所述96孔板底面进行反应；

或者，将少量底物加入步骤1)中所述96孔板的反应孔中，然后立即将如权利要求1-3任一所述的微孔板的微腔阵列的平面压实在反应孔底面上，进行反应；

3)荧光显微镜检测

将反应完成后的微孔板通过荧光显微镜成像，然后用图像分析软件对其进行荧光强度计算用以定量检测样本。

5.根据权利要求4所述的一种基于微孔板的高灵敏度免疫荧光检测方法，其特征在于：

步骤3)中，荧光显微镜成像可以采用荧光显微镜、共焦荧光显微镜、荧光扫描显微成像仪器或技术。