CN105158485A - 人绒毛膜促性腺激素肿瘤标志物过糖基化修饰的检测试剂盒 - Google Patents

人绒毛膜促性腺激素肿瘤标志物过糖基化修饰的检测试剂盒 Download PDF

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CN105158485A CN201510507018.5A CN201510507018A CN105158485A CN 105158485 A CN105158485 A CN 105158485A CN 201510507018 A CN201510507018 A CN 201510507018A CN 105158485 A CN105158485 A CN 105158485A
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Abstract

本发明涉及一种人绒毛膜促性腺激素(hCG)肿瘤标志物过糖基化修饰(hCG-H)的检测试剂盒。它利用磁珠结合一种亲和力受糖基化变化影响最小的抗体(MCA-A)作为捕获抗体对待检样品中总hCG进行捕获，利用一种受糖基化变化影响最显著的抗体(MCA-B)和另一种受糖基化影响较小的抗体(MCA-C)同时对样品中hCG的蛋白总量和N-糖基化修饰程度进行检测，从而实现对肿瘤生物标志物的鉴定。本发明大大提高了免疫诊断方法的准确性，灵敏度和特异性，对于实际样品中肿瘤标志物过糖基化修饰的检测具有极大的实用价值。

Description

人绒毛膜促性腺激素肿瘤标志物过糖基化修饰的检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种人绒毛膜促性腺激素(hCG)肿瘤标志物过糖基化修饰(hCG-H)的检测试剂盒，特别涉及一种联合不同抗体同时对病料中hCG和hCG-H进行检测的试剂盒，属于肿瘤免疫诊断技术领域。
背景技术
肿瘤和癌症是严重威胁人类健康的主要疾病之一，早期的发现和诊断以及正确治疗手段的选用是防治肿瘤癌症疾病的关键。很多癌症患者体内某些生物分子的水平和结构会发生变化，这类分子往往可以作为发现癌症的生物标志物。这些生物标志物中相当大一部分是糖蛋白。很多疾病尤其是肿瘤的糖蛋白会发生糖链变长、分支增多、结构更加复杂等糖基化异常现象，即过糖基化。通过测定病料里的生物标志物水平可对这些疾病进行早期诊断，同时可以在治疗过程中监控生物标志物的水平来判断治疗效果，从而及时选择最有效的治疗方法。多种癌症病人，如：绒毛膜癌、侵袭性葡萄胎等，在疾病的发生过程中其hCG的含量和糖基化均会发生异常。监测hCG含量及糖链结构的变化对多种疾病的预防及早期诊断具有非常重要的意义。体外免疫诊断方法可以通过抗体特异结合的方式测定病人样本里的生物标志物水平从而早期发现和诊断肿瘤癌症疾病，现已有多种针对hCG的免疫诊断产品上市，但这些诊断产品忽略了过糖基化对诊断结果的影响，在实际应用中可能会存在以下问题：
(1)现有的免疫诊断试剂是基于标志物与抗体的结合能力不受糖基化影响的假设之上，未考虑病人hCG糖基化的个体差异。而糖基化可能会改变蛋白的结构，从而影响抗原与抗体的亲和力，最终导致测量结果发生偏差。
(2)现有的免疫诊断试剂产品只能对生物标志物hCG的蛋白总量进行定量分析，而无法从结构上区分糖基化异常的hCG-H和普通的hCG。
如果在hCG检测中能够区别正常糖基化与过糖基化的hCG，将会大大增强疾病诊断结果的准确性、灵敏度和特异性。筛选出能够识别糖基化发生变化的抗体是检测hCG过糖基化的关键，将会引导新一代的癌症诊断试剂的研究开发。
现在虽然有报道能够特异性识别hCGCore2O-糖基化异常的抗体，但是能够直接识别癌症病人hCG中N-糖基化修饰异常的抗体还未能找到，主要是由于N-糖基化修饰的微不均一性和弱免疫原性造成的。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种检测hCG过糖基化程度的检测试剂盒，本试剂盒采用亲和力受hCG的N-糖基化修饰变化影响显著和基本不受影响的抗体联用的方式同时更客观的检测hCG的蛋白总量和N-糖基化修饰程度。
发明概述
本发明通过免疫亲和纯化等手段从生殖细胞肿瘤患者的样本中分离纯化过糖基化hCG-H并用质谱技术分析其N-糖链结构。筛选亲和力受糖基化变化影响最显著的抗hCG抗体和亲和力受糖基化变化影响最小的抗体。利用筛选出的抗体通过磁微粒技术和发光标记技术制备具有商业化前景的新一代肿瘤免疫诊断试剂盒。
发明详述
一种人绒毛膜促性腺激素肿瘤标志物过糖基化修饰的检测试剂盒，包括：
包被有捕获抗体的磁珠，
所述捕获抗体为具有与抗原hCG结合受糖基化影响最小的特性的捕获抗体；
与抗原hCG结合的偶联碱性磷酸酶标记的检测抗体B，
所述与抗原hCG结合的偶联碱性磷酸酶标记的检测抗体B是具有与抗原hCG结合受糖基化影响最小的特性的检测抗体B；
与抗原hCG结合的偶联碱性磷酸酶标记的检测抗体C，
所述与抗原hCG结合的偶联碱性磷酸酶标记的检测抗体C是具有与抗原hCG结合受糖基化影响最大的特性的检测抗体C；
以及抗体稀释液、样品稀释液、洗涤液、底物液和终止液。
根据本发明优选的，所述的捕获抗体与抗原结合的抗原表位为未被糖链覆盖的区域。
根据本发明优选的，所述的与抗原结合的偶联碱性磷酸酶标记的检测抗体B与抗原结合的抗原表位为未被糖链覆盖，但不同于捕获抗体的抗原表位。
根据本发明优选的，所述的与抗原结合的偶联碱性磷酸酶标记的检测抗体C与抗原结合的抗原表位包含有能够全部或部分被糖链覆盖的区域。
本发明的另一个目的是提供上述检测人绒毛膜促性腺激素肿瘤标志物过糖基化修饰试剂盒的制备方法。
上述检测人绒毛膜促性腺激素肿瘤标志物过糖基化修饰的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)包被有捕获抗体的磁珠的制备方法，步骤如下：
将2mg磁珠置于离心管中，加入pH5.0，10mM的MEST溶液500μL涡旋混匀，磁性分离，弃去上清，重复上述步骤；
用500μLMEST溶液重悬，加入2.5mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，涡旋混匀，于室温下活化30min，弃上清，用MEST洗涤，然后用pH8.0的50mM磷酸盐缓冲溶液洗涤磁珠；
取150μg抗体MCA-A，用pH8.0的50mM磷酸盐缓冲溶液配置成0.3mg/mL的溶液加入到磁珠中，室温反应3h，然后经磁性分离，弃上清；
再加入1wt％牛血清白蛋白溶液500μL室温下封闭30min，磁性分离，弃上清，用pH8.0的50mM磷酸盐缓冲溶液洗涤并重悬至lμg/mL，制得包被有捕获抗体的磁珠；
(2)与hCG结合的偶联碱性磷酸酶标记的检测抗体B的制备方法，步骤如下：
分别取1mg抗体MCA-B，加入10mg/mL的偶联剂2-亚氨基硫烷盐酸盐溶液(购自Sigma公司)，室温静置20min，加入0.1mol/L甘氨酸溶液10μL，室温静置5min，除盐后，收集活化的抗体；
取1.5mg碱性磷酸酶，加入5mg/mL的交联剂琥珀酰亚胺-4-环已烷-1-碳酸酯溶液，室温静置30min，除盐，收集活化的碱性磷酸酶；
将活化的抗体和活化的碱性磷酸酶混合，4℃静置过夜，用Supperdex-200凝胶纯化柱纯化得到碱性磷酸酶标记的抗体溶液，用磷酸盐缓冲液重悬至lμg/mL，制得与hCG结合的偶联碱性磷酸酶标记的检测抗体B；
(3)与hCG结合的偶联碱性磷酸酶标记的检测抗体C的制备方法，步骤如下：
分别取1mg抗体MCA-C，加入10mg/mL的偶联剂2-亚氨基硫烷盐酸盐溶液(购自Sigma公司)，室温静置20min，加入0.1mol/L甘氨酸溶液10μL，室温静置5min，除盐后，收集活化的抗体；
取1.5mg碱性磷酸酶，加入5mg/mL的交联剂琥珀酰亚胺-4-环已烷-1-碳酸酯溶液，室温静置30min，除盐，收集活化的碱性磷酸酶；
将活化的抗体和活化的碱性磷酸酶混合，4℃静置过夜，用Supperdex-200凝胶纯化柱纯化得到碱性磷酸酶标记的抗体溶液，用磷酸盐缓冲液重悬至lμg/mL，制得与hCG结合的偶联碱性磷酸酶标记的检测抗体C；
(4)按现有技术配制稀释液、洗涤液、底物溶液和终止液，然后包装后，即得检测人绒毛膜促性腺激素肿瘤标志物过糖基化修饰的检测试剂盒。
所述步骤(1)、(2)和(3)中捕获抗体和检测抗体采用如下方法筛选：
A、制备抗原并鉴定：收集病料(病人尿液)利用免疫亲和层析技术从该样品溶液中分离纯化过糖基化hCG-H作为抗原；用N-glycanase(PNGaseF)对抗原进行去糖基化处理，用PGC小柱收集酶切下来的糖链，采用液质联用方法对N-糖链进行分析；同时对hCG进行同步处理作为正常糖基化的对照；
B、筛选不同用途的抗体并验证：通过生物膜光干涉技术(BLI)从十几种商品化的单克隆抗体中筛选出3种抗体，其中抗体A(MCA-A)和抗体B(MCA-B)的亲和力基本不受hCG的N-糖基化影响，抗体C(MCA-C)与hCG-H的结合力相比hCG明显降低；因此以抗体A作为捕获抗体，抗体B和抗体C作为检测抗体。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中抗体稀释液每升组分如下：
NaCl8.00g、KH2PO40.20g、Na2HPO4·12H2O2.90g、KCl0.20g，少量超纯水溶解，定容至1000mL。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中样品稀释液每升组分如下：
NaCl8.00g、KH2PO40.20g、Na2HPO4·12H2O2.90g、KCl0.20g，少量超纯水溶解，定容至1000mL。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中洗涤液每升组分如下：
NaCl8.00g、KH2PO40.20g、Na2HPO4·12H2O2.90g、KCl0.20g，超纯水溶解，加入Tween-200.50mL，定容至1000mL，摇匀。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中底物溶液组分如下：
1mol/L二乙醇胺、0.5mmol/L氯化镁，调节pH值到9.8，加入pNPP，使其终浓度为1mg/mL。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中终止液组分如下：
浓度为3mol/L的NaOH溶液。
有益效果
本发明制备了一种精确测定样品中hCG的浓度并判断其是否发生过糖基化的试剂盒，不仅可以检测hCG的浓度，而且还能区分hCG-H与正常hCG，大大提高了免疫诊断方法的灵敏度、特异性和准确率，对于实际样品中过糖基化hCG的检测具有极大的实用价值。
附图说明
图1hCG和hCG-H的SDS-PAGE电泳图；
图2hCG和hCG-H的N-糖链分析结果；
图3不同抗体的氢氘交换比率以及抗原表位示意图；
图4hCG和hCG-H针对不同捕获抗体的标准曲线；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
试剂来源
CNBr活化的琼脂糖珠4B购自GEHealthcare；PNGaseF购自prozyme；MCA-A、MCA-B以及MCA-C三种单克隆抗体购自AbDSerotec；hCG购自Sigma-Aldrich；Pepsin购自Promega；D2O购自青岛腾龙；TCEP购自Sigma-Aldrich；
实施例1
一种从病料(尿液)中提取hCG的方法，步骤如下：
1.1收集病料，向其中加入3wt％的叠氮钠溶液，混匀，用滤纸过滤，收集滤液过0.22的滤膜，之后用10KD的超滤管过滤浓缩得到含有目的蛋白的样品溶液。
1.2用30KD的超滤管将抗体的溶剂置换成偶联缓冲液(0.1MNaHCO3溶液，pH8.3，含0.5MNaCl)。
1.3取CNBr活化的琼脂糖珠4B0.22g加入10mL1mM的HCl，涡旋15min(<500rpm)，静置，弃上清。再加入13mL1mM的HCl涡旋2min，静置3min，弃上清，重复3次。弃净上清后用偶联缓冲液洗两次。
1.4将1.2中得到的抗体加入到1.3中得到的琼脂糖珠里，室温300rpm孵育2h。
1.5将偶联后的琼脂糖珠装柱，用偶联缓冲液洗涤5个柱体积。
1.6用1个柱体积封闭液(0.1M的Tris-HCl溶液，pH8.0)洗柱子，弃掉液体，再加入1个柱体积的封闭液室温封闭2h，期间每20min用枪头轻柔吹打一次。
1.7将封闭液放掉，用洗涤液A和B交替洗4轮，每次每种5个柱体积(洗涤液A：0.1MCH3COONa溶液含有0.5MNaCl，pH4.0；洗涤液B：0.1MTris-HCl溶液含有0.5MNaCl，pH8.0)。
1.8用10倍柱体积的pH7.4PBS以1mL/min的流速平衡柱子。
1.9将1.1中得到的样品溶液每4.5mL上样一次，室温孵育1h，期间每20min用枪头轻柔吹打一次。
1.10用10倍柱体积的pH7.4PBS，以1.5mL/min流速洗脱杂质。
1.11用10倍柱体积的10mMpH4.5乙酸铵以1.5mL/min流速洗脱未结合的杂蛋白。
1.12用10倍柱体积的3M乙酸以0.5～0.7mL/min的流速洗脱蛋白，收集洗脱液，每500μL洗脱液中加入300μL5M的NH4OH进行中和。
1.13用10KD的超滤管将洗脱下来的蛋白溶剂置换为PBS并浓缩，取2μg用于SDS-PAGE鉴定，其余蛋白于-80℃冻存。
1.14SDS-PAGE初步进行蛋白鉴定，结果见附图1。
实施例2
一种糖蛋白hCGN-糖链分析的方法，步骤如下：
2.1取5μg/μL的hCG20μL加入5μL纯水和2.5μL变性缓冲液，涡旋混匀后于100℃沸水作用10min，加入2.5μLdetergent，涡旋混匀，加入2μLN-glycanase(PNGaseF)，混匀后于37℃酶切3d。
2.2将PGC小柱用含0.1％三氟乙酸(TFA)的80％乙腈(ACN)溶液500μL洗涤三次，之后用纯水500μL洗涤三次，将步骤2.1中酶切后的溶液上样至小柱中，用500μL纯水洗涤小柱三次，最后用含0.05％TFA的80％ACN溶液500μL洗脱N-糖链，收集洗脱液并冻干。
2.3将步骤2.2中冻干的糖链溶液复溶，用液质联用方法对N-糖链进行分析。用安捷伦1100液相系统对糖链进行分离，所用色谱柱为HypersilHyperCarbKappPGCcolumn(0.32mm×100mm，5μm)，柱温为35℃。流动相A为10mM碳酸氢铵溶于2％乙腈水溶液，流动相B为10mM碳酸氢铵溶于85％乙腈水溶液，流速6μL/min，洗脱梯度为：0～60min，100～40％流动相A，0～60％流动相B；60～75min，40％流动相A，60％流动相B；75～90min，40～0％流动相A，60～100％流动相B；90～105min，0％流动相A，100％流动相B。ThermoLTQOrbitrapVelosPro质谱仪在正离子模式下进行检测，得到高分辨质谱图；设定参数为：同位素分辨率：60000；扫描质量范围：500～2000；鞘气流速：15；辅助气流速：5；喷雾电压：4.5kV；离子传输毛细管温度：275℃；S-lenslevel：69％。糖链分析结果见附图2。
实施例3
一种筛选对hCG与hCG-H具有不同特异性的抗体的方法，步骤如下：
3.1向1mL浓度为1mg/mL的单克隆抗体(包括MCA-A、MCA-B和MCA-C)中加入6.67μL浓度为1mM的生物素溶液，迅速混匀，室温下孵育30min，反应完毕后用PD-10柱纯化得到生物素化的单克隆抗体。
3.2通过Octet-RED96系统检测MCA-A、MCA-B以及MCA-C三种抗体分别对hCG和hCG-H的亲和解离动力学常数(KD值)。实验中使用SA传感器，结合生物素化抗体的时间设定为300s，用生物素和BSA先后封闭结合后的传感器60s，检测基线之后让其与分别与不同浓度(分别为7.8nM、15.6nM、31.3nM、62.5nM、125nM、250nM和500nM)的hCG和hCG-H结合60～300s，然后解离300s。
3.3利用Octet-RED数据分析软件(Version3.1)进行抗体亲和解离常数的拟合。结果见表1。
表1
实施例4
一种氢氘交换结合液质联用分析抗原表位的方法，步骤如下：
4.1将hCGβ亚基溶于50mM磷酸盐缓冲液中作为母液，终浓度为40μM。同时制备hCGβ亚基分别与MCA-B和MCA-C的混合溶液，各物质的终浓度均为40μM，室温孵育2h。
4.2取5μL母液加入45μL用D2O配制的50mM磷酸盐缓冲液(pH7.8)，于20℃交换10min。交换完毕后立即加入25μL用1％FA配制的200mMTCEP水溶液以终止交换反应。以同样步骤对孵育后的抗原抗体混合溶液进行氢氘交换实验。
4.3向步骤4.2得到的溶液中加入25μL用1％FA配制的Pepsin溶液(1mg/mL)，于20℃酶解5min。
4.4用岛津LC-20A液相系统联合ThermoLTQOrbitrapVelosPro质谱仪对步骤4.3中酶解后的样品立即进行液质联用分析。所用色谱柱为HypersilODS2-C18column(4.6mm×20mm，5μm)。流动相A为含有1％甲酸的2％乙腈水溶液，流动相B为含有1％甲酸的98％乙腈水溶液，流速0.6mL/min，洗脱梯度为：0～1.5min，95％流动相A，5％流动相B；1.5～8min，95～55％流动相A，5～45％流动相B；8～8.5min，55～15％流动相A，45～85％流动相B；8.5～10min，15％流动相A，85％流动相B。使用柱后分流装置使液相系统中1/6流出液体进入ThermoLTQOrbitrapVelosPro质谱仪，质谱仪在正离子模式下进行检测，得到高分辨质谱图；设定参数为：同位素分辨率：100000；扫描质量范围：350～1500；鞘气流速：12；辅助气流速：3；喷雾电压：4.5kV；离子传输毛细管温度：275℃；S-lenslevel：69.8％。抗原表位分析结果见附图3。
实施例5
检测人绒毛膜促性腺激素肿瘤标志物过糖基化修饰的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)包被有捕获抗体的磁珠的制备方法，步骤如下：
取150μg抗体MCA-A，用pH8.0的50mM磷酸盐缓冲溶液配置成0.3mg/mL的溶液。
将2mg磁珠置于离心管中，加入pH5.0，10mM的MEST溶液500μL涡旋混匀。将离心管放置于磁分离架上直到磁珠完全被吸附，弃去上清。重复两次。用500μLMEST溶液重悬，加入2.5mg的EDC和NHS，涡旋混匀，于室温下活化30min，弃上清。用MEST洗涤三次。
用pH8.0的50mM磷酸盐缓冲溶液洗涤步骤5.2中得到的磁珠两次，弃上清，迅速将步骤5.1中得到的抗体溶液加入到磁珠中，室温反应3h。完毕后将离心管置于磁分离架上磁性分离，弃上清。
加入1％BSA溶液500μL室温下封闭30min，完毕后将离心管置于磁分离架上磁性分离，弃上清。用pH8.0的50mM磷酸盐缓冲溶液洗涤三次并重悬至lμg/mL，并于4℃保存。
(2)与hCG结合的偶联碱性磷酸酶标记的检测抗体B的制备方法，步骤如下：
分别取1mg抗体MCA-B，加入10mg/mL的偶联剂2-IT溶液，室温静置20min，加入0.1mol/L甘氨酸溶液10μL，室温静置5min，除盐后，收集活化的抗体，于4℃保存。
取1.5mgALP，加入5mg/mL的交联剂SMCC溶液，室温静置30min，除盐，收集活化的ALP，4℃保存。
将上述活化的抗体和活化的ALP混合，4℃静置过夜，用Supperdex-200凝胶纯化柱纯化得到ALP标记的抗体溶液，用PBS重悬至lμg/mL，于4℃保存备用。
(3)与hCG结合的偶联碱性磷酸酶标记的检测抗体C的制备方法，步骤如下：
分别取1mg抗体MCA-C，加入10mg/mL的偶联剂2-IT溶液，室温静置20min，加入0.1mol/L甘氨酸溶液10μL，室温静置5min，除盐后，收集活化的抗体，于4℃保存。
取1.5mgALP，加入5mg/mL的交联剂SMCC溶液，室温静置30min，除盐，收集活化的ALP，4℃保存。
将上述活化的抗体和活化的ALP混合，4℃静置过夜，用Supperdex-200凝胶纯化柱纯化得到ALP标记的抗体溶液，用PBS重悬至lμg/mL，于4℃保存备用。
(4)配制稀释液、洗涤液、底物溶液和终止液：
抗体稀释液每升组分如下：
NaCl8.00g、KH2PO40.20g、Na2HPO4·12H2O2.90g、KCl0.20g，少量超纯水溶解，定容至1000mL。
样品稀释液每升组分如下：
NaCl8.00g、KH2PO40.20g、Na2HPO4·12H2O2.90g、KCl0.20g，少量超纯水溶解，定容至1000mL。
洗涤液每升组分如下：
NaCl8.00g、KH2PO40.20g、Na2HPO4·12H2O2.90g、KCl0.20g，超纯水溶解，加入Tween-200.50mL，定容至1000mL，摇匀。
底物溶液组分如下：
1mol/L二乙醇胺、0.5mmol/L氯化镁，调节pH值到9.8，加入pNPP，使其终浓度为1mg/mL。
终止液组分如下：
浓度为3mol/L的NaOH溶液。
通过以上步骤制得的人绒毛膜促性腺激素肿瘤标志物过糖基化修饰的检测试剂盒，包括：
包被有捕获抗体的磁珠，
所述捕获抗体为具有与抗原hCG结合受糖基化影响最小的特性的捕获抗体；且捕获抗体与抗原结合的抗原表位为未被糖链覆盖的区域。
与抗原hCG结合的偶联碱性磷酸酶标记的检测抗体B，
所述与抗原hCG结合的偶联碱性磷酸酶标记的检测抗体B是具有与抗原hCG结合受糖基化影响最小的特性的检测抗体B；且与抗原结合的偶联碱性磷酸酶标记的检测抗体B与抗原结合的抗原表位为未被糖链覆盖，但不同于捕获抗体的抗原表位。
与抗原hCG结合的偶联碱性磷酸酶标记的检测抗体C，
所述与抗原hCG结合的偶联碱性磷酸酶标记的检测抗体C是具有与抗原hCG结合受糖基化影响最大的特性的检测抗体C；且与抗原结合的偶联碱性磷酸酶标记的检测抗体C与抗原结合的抗原表位包含有能够全部或部分被糖链覆盖的区域。
以及抗体稀释液、样品稀释液、洗涤液、底物液和终止液。
实施例6
一种利用上述人绒毛膜促性腺激素肿瘤标志物过糖基化修饰的检测试剂盒检测hCG并判断其是否发生过糖基化的诊断方法，步骤如下：
6.1将hCG和hCG-H分别用PBS倍比稀释成系列浓度：0ng/mL，20ng/mL，40ng/mL，80ng/mL，160ng/mL，320ng/mL。分别取100μL加入步骤5.4得到的免疫磁珠20μL，平行做两组试验，37℃孵育30min，洗涤3次。
6.2向两组磁珠中分别加入100μLALP标记的MCA-B和MCA-C，37℃孵育30min，用洗涤液洗涤3次。
6.3向两组磁珠中加入100μLpNPP显色底物(pH9.8，1mol/L二乙醇胺，0.5mmol/L氯化镁，pNPP终浓度为1mg/mL)，于室温避光孵育15min，结束后加入50μL终止液终止反应。
6.4将EP管置于磁性分离架上，用移液器将上清转入酶标板中，100μL/孔，用酶标仪读取OD450值，并绘制标准曲线，见附图4。
6.5为判断该检测方法是否可行，分别取100ng/mL的hCG和hCG-H混和制备成总hCG/hCG-H浓度100ng/mL的待检样品，按照步骤6.2-6.4所述进行操作，进行OD405的测定。将抗体B测得的OD405值带入标准曲线计算总hCG浓度，将该浓度值带入hCGvs抗体C标准曲线计算得到总hCG理论OD405值，将抗体C测得的OD405值与计算所得理论值进行比对以判定N-糖基化修饰程度。经计算hCG总浓度为102ng/mL，理论OD405值应为0.214，实测值为0.131，该检测方法可行。

Claims (6)

1.一种检测人绒毛膜促性腺激素肿瘤标志物过糖基化修饰的试剂盒，其特征在于，包括：
包被有捕获抗体的磁珠，
所述捕获抗体为具有与抗原hCG结合受糖基化影响最小的特性的捕获抗体；
与抗原hCG结合的偶联碱性磷酸酶标记的检测抗体B，
所述与抗原hCG结合的偶联碱性磷酸酶标记的检测抗体B是具有与抗原hCG结合受糖基化影响最小的特性的检测抗体B；
与抗原hCG结合的偶联碱性磷酸酶标记的检测抗体C，
所述与抗原hCG结合的偶联碱性磷酸酶标记的检测抗体C是具有与抗原hCG结合受糖基化影响最大的特性的检测抗体C；
以及抗体稀释液、样品稀释液、洗涤液、底物液和终止液。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的捕获抗体与抗原结合的抗原表位为未被糖链覆盖的区域。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的与抗原结合的偶联碱性磷酸酶标记的检测抗体B与抗原结合的抗原表位为未被糖链覆盖，但不同于捕获抗体的抗原表位。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的与抗原结合的偶联碱性磷酸酶标记的检测抗体C与抗原结合的抗原表位包含有能够全部或部分被糖链覆盖的区域。
5.权利要求1所述检测人绒毛膜促性腺激素肿瘤标志物过糖基化修饰的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)包被有捕获抗体的磁珠的制备方法，步骤如下：
将2mg磁珠置于离心管中，加入pH5.0，10mM的MEST溶液500μL涡旋混匀。将离心管放置于磁分离架上直到磁珠完全被吸附，弃去上清。重复两次。用500μLMEST溶液重悬，加入2.5mg的EDC和NHS，涡旋混匀，于室温下活化30min，弃上清。用MEST洗涤三次。用pH8.0的50mM磷酸盐缓冲溶液洗涤磁珠两次。取150μg抗体MCA-A，用pH8.0的50mM磷酸盐缓冲溶液配置成0.3mg/mL的溶液加入到磁珠中，室温反应3h。完毕后将离心管置于磁分离架上磁性分离，弃上清。加入1％BSA溶液500μL室温下封闭30min，完毕后将离心管置于磁分离架上磁性分离，弃上清。用pH8.0的50mM磷酸盐缓冲溶液洗涤三次并重悬至lμg/mL，并于4℃保存备用。
(2)与hCG结合的偶联碱性磷酸酶标记的检测抗体的制备方法，步骤如下：
分别取1mg抗体MCA-B和抗体MCA-C，加入10mg/mL的偶联剂2-IT溶液，室温静置20min，加入0.1mol/L甘氨酸溶液10μL，室温静置5min，除盐后，收集活化的抗体。取1.5mgALP，加入5mg/mL的交联剂SMCC溶液，室温静置30min，除盐，收集活化的ALP。将活化的抗体和活化的ALP混合，4℃静置过夜，用Supperdex-200凝胶纯化柱纯化得到ALP标记的抗体溶液，用PBS重悬至lμg/mL，于4℃保存备用。
(3)按现有技术配制抗体稀释液、样品稀释液、洗涤液、底物溶液和终止液，然后包装后，即得检测人绒毛膜促性腺激素肿瘤标志物过糖基化修饰的检测试剂盒。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)和(2)中捕获抗体和检测抗体采用如下方法筛选：
A、制备抗原并鉴定：收集病料(病人尿液)利用免疫亲和层析技术从该样品溶液中分离纯化过糖基化hCG-H作为抗原。用N-glycanase(PNGaseF)对抗原进行去糖基化处理，用PGC小柱收集酶切下来的糖链，采用液质联用方法对N-糖链进行分析。同时对hCG进行同步处理作为正常糖基化的对照。
B、筛选不同用途的抗体并验证：通过生物膜光干涉技术(BLI)从十几种商品化的单克隆抗体中筛选出3种抗体，其中抗体A(MCA-A)和抗体B(MCA-B)的亲和力基本不受hCG的N-糖基化影响，抗体C(MCA-C)与hCG-H的结合力相比hCG明显降低。因此以抗体A作为捕获抗体，抗体B和抗体C作为检测抗体。
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