JP2014145771A - 装置及び方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】基板に設けられたチャネルと、プラズモン共鳴が可能であり、金属部分によって生じた電磁界が前記チャネルを通過する分子と相互作用するのに適した位置で前記チャネルと結合している金属部分42と、前記チャネルを通過するように分子を誘導する手段と、前記金属部分において表面プラズモン共鳴を誘導する手段と、前記金属部分によって生じた電磁界と前記チャネルを通過する分子との間の相互作用を検出する手段とを備える。
【選択図】図7
Description
方法に関する。装置及び方法は、これらの分子の迅速かつ詳細な分析の課題へのナノスケ
ールの技術の適用に関する。一態様において、本発明は、核酸を配列決定する装置及び方
法に関する。
多くのゲノム(ヒトを含む)の全配列は現在では既知であり、更に多くのものが利用でき
るようになっているが、多くの理由で配列データを得る必要性が残っている。現在の配列
決定技術は、主に、サンガー(「ジデオキシ」)技術を基にしており、根気のいるもので
あり、かつ遅い。ポリメラーゼによる単一のヌクレオチドの挿入の検出を伴う方法は、ポ
リメラーゼが相補DNA鎖を合成することができる比較的低速なものに本質的に限られてい
る。現在、単一の配列決定装置における最大の配列決定の速度は、約1塩基/秒であり、
従来のサンガー配列決定技術を超える改善がなされているが、これは、まだ非常に遅いも
のである。
する方法が提案されている。そのような方法は、検出の理論上の最大速度が高いものであ
るが、今まで、比較的低い検出速度が達成されており、導電性の標識の全体の設計又は使
用の大幅な改良がなければ、検出の限界が低いままである。
新規なアプローチ及び材料をもたらす領域である。ナノテク技術者は、現在、サブナノメ
ートルのスケールまでの材料を製造し、かつ操作することが可能である。これは、新規か
つ以前に考慮されていない可能性を有する装置又は技術の開発の可能性をもたらすもので
ある。しかしながら、ナノテクノロジーが、たとえば電子産業における有用性を見出した
ものではあるものの、まだ、生物学の分野において幅広く利用されていない。
る現象である。プラズモン共鳴は、Biacore(登録商標)などの多くの従来の分析機器に
おいて使用されている。平面上のプラズモンが励起される場合には、表面プラズモン共鳴
(surface plasmon resonance, SPR)という用語が用いられ、ナノメートルサイズの粒子
が励起される場合には、局在表面プラズモン共鳴(localised surface plasmon resonanc
e, LSPR)という用語が現象のこの態様を区別するためによく用いられる。小さい金属粒
子が光で照射された際に、振動電界が粒子の電子をコヒーレントに振動させる。これらの
電子の集団振動は、双極子プラズモン共鳴と呼ばれている。電子雲における集団振動は、
強力な、極めて局在した電磁界(electromagnetic field, EMF)を生じる。これらの集団
振動を生じるためには、正確な励起波長を用いなければならない。この波長は、励起され
る金属粒子又はナノ構造体の大きさ及び形状の両方に依存する。
、生体分子の構造をナノメートルスケールで調査することができることを見出した。
−基板に設けられた少なくとも1つのチャネルであって、分子が通過するのに適している
チャネルと、
−プラズモン共鳴が可能な少なくとも1つの金属部分であって、該金属部分によって生じ
た電磁界が前記チャネルを通過する分子と相互作用するのに適した位置で前記チャネルと
結合している金属部分と、
−前記チャネルを通過するように分子を誘導する手段と、
−前記金属部分において表面プラズモン共鳴を誘導する手段と、
−前記金属部分によって生じた電磁界と前記チャネルを通過する分子との間の相互作用を
検出する手段とを備える、
分子を調査するための装置が提供される。
に適した第1のリザーバと、分子がチャネルを通過次第、分子が移行するのに適した第2
のリザーバとを備える。適切には、2つのリザーバは基板によって互いに区切られており
、分子は、少なくとも1つのチャネルを通過して、第1のリザーバから第2のリザーバへ
移行しなければならない。従って、基板は、2つのリザーバを分ける膜又は隔壁とみなす
ことができる。
べきであり、従って、分子は金属部分の近くで通過することを強いられ、それ故に分子と
金属部分によって生じた局在EMFとの間の相互作用が生じる。また、チャネルは、概して
、1つの分子のみが同時にチャネルを通過することができるような適した寸法を有するべ
きである。
のチャネルの他の形態も適しており、可能である。
して想定される。
下、特に30nm又はそれ以下の直径を有してもよい。直径という用語を用いるが、当然
のことながら、厳密な幾何学的感覚を意図するものではなく、たとえば、非円形の開口又
はチャネルの最も小さい寸法に適用してもよい。
体にわたって用いられ、適宜解釈されるべきものである。
ある。二重鎖の核酸は、約2nm又はそれ以上の開口を通過する(Heng J. Bら, Biophys
ical Journal (2006),90,1098-1106参照)。
1nm〜30nm、特に1nm〜10nm、とりわけ1nm〜5nmである。二重鎖の核
酸においては、開口は、直径2nm〜100nm、好ましくは2nm〜30nm、特に2
nm〜4nmである。
もよい。
ポア、たとえばα−ヘモリシンなどのポアを有するタンパク質又はミトコンドリアの外膜
で見られる有機のポアから形成されてもよい。
作に従来用いられているゲルで提供することができる。
ィルムなどの基板において設計することができる。たとえば、窒化ケイ素からナノメート
ルの直径のポアを形成する方法について論じるHo C. ら, PNAS(2005), 102(30) 10445-10
450を参照されたい。
のナノ多孔質材料から形成することもできる。Nettiらは、金のナノキャビティの形成及
びその表面プラズモンを形成する能力について説明している(Netti M.C. ら, Advanced
Materials (2001), 13(18), 1368-1370参照)。Aizpurua O.らは、金のナノリングの形成
について説明している(Aizpuruaら, Physical Review Letters (2003), 90(5), 057401-
1-057401-4参照)。Lesuffleurらは、プラズモン共鳴が増大した金のナノポアのアレイに
ついて論じている(Lesuffleur A. ら, Applied Physics Letter (2007), 90, 243110参
照)。開口自体がLSPRを示すことが可能な金属物質から形成されている場合、別個の金属
部分が必要ではないことは明らかであろう。
、急速に発展している技術分野である。そのようなものとして、本発明で必要とされてい
る基板にてチャネルを形成するのに適した新規の技術及び材料が将来開発されることが期
待され、そのような技術は本発明の範囲内である。
置を調整する場合、アレイで配置することができ、これは、ナノ工学を用いて基板に開口
を形成する場合に特に好都合である。別の方法として、開口を、その位置の調整なしで基
板にわたって散らすことができる。
辺に形成することができなければならない。この機能を達成するのに適しているいずれの
材料も金属部分において使用するのに適している。金、銀、銅及びアルミニウムの金属が
、プラズモンの形成及び伝搬の点からみて望ましい特性を有するとみられ、それ故に、概
して、金属部分が、主として又は完全に、1種又は複数のこれらの金属から形成されてい
るのが好ましい。
る。形状は、粒子によって生じたEMFにかなりの影響を与えることができる(Mock J.J.ら
, Journal of Chemical Physics, 116(15), 6755-6759参照)。
故に、金属部分の適した実施態様を形成する。50nm〜150nmの直径を有する球状
の金属粒子が、高レベルの蛍光増感のために、特に適していることが見出されている(Na
kamura及びHayashi, Japanese Journal of Applied Physics, 44(9A), 6833-6837参照)
。
定の利益を有し、環内のEMFが強く、かつ環によって定められる内側の領域にわたって比
較的一定であることが示されている(Aizpuruaらの前記の論文参照)。金属部分が環であ
る場合、環自体が、分子が通過する開口を形成することができることは明らかである。そ
のようなナノの環を製造する方法は、Aizpuruaらの論文に示されている。
以上の種類の金属を用いてもよいことを指摘する。実際には、各部分の区別可能なEMFの
組み合わせの結果として最大のEMFの領域が生じるように、2又は3以上の金属材料を用
いることが望ましい。これによって、極めて局在した領域において非常に高いEMFの値が
生じる。
ら十分に間隔を空けられていて、分子から放射されたシグナルのクエンチングを防ぐか、
又は緩和することが重要である。これは多くの方法で達成できる。分子が通過するように
チャネルを成形し、かつその大きさを調整し、金属部分から近くなりすぎないか(それ故
にクエンチングを避ける)、又は遠くなりすぎない(それ故に相互作用を確実にする)よ
うな位置に制限し、これは、ポア自体がクエンチングの活性を有さない場合に特に適して
いる。別の方法として、制御手段を用いて、金属部分に近くなりすぎないように分子を導
いてもよい。
好ましくは30nm又はそれ以下、特に10nm又はそれ以下の位置に配置されているべ
きである。
数の手段、マイクロ流体工学装置又はレーザートラッピング装置であってもよい。しかし
ながら、チャネルへ及び/又はチャネルを通って移動するように分子を誘導するのに適し
たいずれの他の手段も適している。
段を備えてもよい。制御手段は、速度、方向、位置又は分子の構造の1又は複数を制御す
るように適合されていてもよい。
る。核酸の配列決定が必要とされる場合、直線状の核酸分子のチャネルの通過速度を制御
することが重要である。配列決定において、核酸分子を直線状の構造に保持することも望
ましい。
孔性のマトリックスは、チャネルへの入り口に直接隣接して位置する。多孔性のマトリッ
クスを用いる場合、電気泳動によってマトリックスを通過するように分子を誘導すること
が好都合である。電気泳動の条件と組み合わせての多孔性マトリックスの特性によって、
マトリックスを通しての及びチャネルへの分子(たとえば核酸)の移動の良好な制御が可
能になる。ゲルを通しての核酸の移動の速度の正確な制御を達成できる。多孔性マトリッ
クスによる電気泳動の更なる利益は、直線状の分子の構造を、配列決定に特に適している
引き伸ばされた直線状の形態に引き伸ばすことである。適した多孔性のマトリックスを、
ポリアクリルアミド又はアガロースなどの核酸及びタンパク質を操作するのに使用されて
いる従来の材料から形成してもよい。別の方法として、他のナノ多孔性材料も適している
。
るレベルの制御を必要とするか、又は制御の程度がより高いか、もしくはより低い。
もよいことに留意すべきである。たとえば、液体媒体単独における電気泳動は、構造及び
速度の正確な制御を必要としない場合に分子を制御するのに適している。別の方法として
、レーザートラッピングを用いて、チャネルの方への及びチャネル内への分子の移動を正
確に制御してもよい。
在EMFと該部分にかなり近接している分子との間の相互作用を検出することができるいず
れの適した装置であってもよい。適した手段としては、蛍光を検出する手段又はラマン散
乱を検出する手段が挙げられる。
出された光子を検出するのに十分な感度を有するいずれの装置も挙げられる。適した装置
としては、光電子増倍管又はアバランシェ・フォトダイオードが挙げられる。蛍光は、本
質的に蛍光を発する分子又はフルオロフォアで標識された分子を検出するのに適している
。
る。ラマン散乱を用いて、非標識及び非蛍光性の分子を検出してもよい。ラマン散乱を検
出する技術は本技術分野において周知である。本発明におけるラマン散乱を用いる検出は
、表面増強ラマン分光の現象に基づく(背景について、Jeanmaire, David L.: Richard P
. van Duyne (1977). “Surface Raman Electrochemistry Part I.Heterocyclic, Aromat
ic and Aliphatic Amines Absorbed on the Anodized Silver Electrode”. Journal of
Electroanalytical Chemistry 84: 1-20参照)
によって、調査するサンプルの準備が簡素化され、また、チャネルを通しての分子の通過
を妨げる可能性のある標識の存在が必要でない。
−調査する分子を含む液体のサンプルを準備するステップと、
−基板に設けられたチャネルであって、プラズモン共鳴を有するように誘導される結合し
た金属部分を有するチャネルを通過するように前記分子を誘導するステップと、
−前記金属部分によって生じた電磁界とチャネルを通過する分子との間の相互作用を検出
するステップとを含む、
分子を調査する方法を提供する。
は直線状のタンパク質/ペプチドなどの直線状の分子が、本方法を用いる調査に特に適し
ている。一本鎖の核酸が本方法を用いる調査に特に適している。
要はない。サンプル中の個々の分子の計数及び直線状の分子上のマーカーのマッピングの
ために前記方法を使用することが、他の可能性のある用途の中でも想定される。
、前記方法は、更に、前記金属部分と相互作用する標識で分子を標識するステップを含ん
でもよい。
の生体分子の蛍光標識に関連する分野において周知である。本発明において、フルオロフ
ォアが、標識した分子のチャネルの通過を阻害しないほどに十分に小さいことが重要であ
る。典型的には、フルオロフォアは、2nm又はそれ以下の有効なサイズを有し、好まし
くは、色素分子はどの寸法においても1nm以下である。
フルオル488 C5−マレイミド(Alexa Fluor 488 C5-maleimide)、アレクサ・フル
オル532 C2−マレイミド(Alexa Fluor 532 C2-maleimide)及びローダミン・レッ
ドC2−マレイミド(Rhodamine Red C2-maleimide)及びローダミン・グリーンが挙げら
れる。これらのフルオロフォアは、それぞれ、本技術分野において既知の技術を用いて核
酸の塩基を標識するのに用いることができる。
好ましい実施態様において、分子中の1種もしくは複数種の塩基の大部分又はすべてが標
識されており、各種類の塩基は、個々に識別可能な発光スペクトルを持つ標識を有する。
特に好ましい実施態様において、すべての又はほぼすべての塩基が標識されており、各種
類の塩基は、個々に識別可能な発光スペクトルを持つ標識を有する。核酸の高濃度の標識
は、Tasaraら, Nucleic acids Research, 2003, 31(10), 2636-2646に記載されている。
ことが可能であることが重要である。特定の特性の金属部分にフルオロフォアを適合させ
るのは日常的な事項である。概して、金属部分とフルオロフォアとの間の良好な相互作用
について、フルオロフォアが、金属部分の局在表面プラズモン共鳴のピークよりわずかに
低いエネルギーでの発光ピークを有する、すなわち、フルオロフォアの発光ピークがLSPR
のピークからわずかに赤方偏移されていることが好ましい。約20〜150meVの赤方
偏移が適しており、好ましくは約40〜120meVである(Chenら, Nano Letters(200
7), 7(3), 690-696参照)。
−基板に設けられた少なくとも1つのチャネルであって、分子が通過するのに適している
チャネルと、
−プラズモン共鳴を誘導するのに適した少なくとも1つの金属部分であって、該金属部分
によって生じた電磁界が前記チャネルを通過する分子と相互作用することができるような
位置で前記チャネルと結合している少なくとも1つの金属部分とを備える、
分子を調査する装置への使用に適した基板を提供する。
実施例に制限されるものではない。
小さい球状の金属粒子に光を照射した際、振動する電界が粒子の電子をコヒーレントに
振動させる。これらの電子の集団振動は、双極子プラズモン共鳴と呼ばれている。電子に
おける集団振動によって、強力な、極めて局在した電磁界(EMF)が生じる。これらの集
団振動を引き起こすために、正確な励起波長を用いなければならない。このような波長は
、励起される金属粒子の大きさ及び形状に依存する。特定の粒子についての正確な波長は
、容易に実験で決定でき、また、特定の形状についてのものは、既知のモデリング技法を
用いて予測することが可能である。
る中でもCy5及びローズ・ベンガルなどの一般に使用されている蛍光標識を励起するのに
用いることができることが[1]に示されている。これらの実験は、金又は銀のナノ粒子を
表面上に置き、増強したEMFから恩恵を受けるようにフルオロフォアを位置づけることを
伴う。これによって、いわゆる金属増強蛍光(metal enhanced fluorescence, MEF)がも
たらされる。
は、局在EMFと蛍光の寿命が減少するあまり解明されていない現象との両方から恩恵を受
ける。同様の現象は、分子のラマン散乱を調べる際に生じる。局在表面プラズモン共鳴を
示す金属粒子に分子がかなり近い場合、ラマン散乱のレベルの劇的な増加がみられる。
と、より短い蛍光の寿命によって、より高い光子の放出がもたらされる。90%の量子収
量及び2.5nsの蛍光寿命を有するフルオロフォアは、最大3億6千万の光子/sを放
出することができる。実際には、蛍光色素は、劣化する前に数百万の光子を放出すること
ができる。
キャビティ[4]、金属ナノリング[5]及び多孔性の薄い金属フィルム[6]を用いて実証さ
れるものなどの極めて局在した増強EMFを誘導し、該EMFから恩恵を受けるようにフルオロ
フォアを位置づけることによって、MEFを誘導することができ、フルオロフォアを検出す
ることができるか、又はその代わりにラマン散乱を検出することができる。
である空間の領域があるように装置を作製した場合、そのフルオロフォアの位置を知るこ
とができる。開口(ポア)の周囲に又は近くにプラズモン構造体(たとえば金属部分)を
配置することによって、蛍光粒子を、最大の蛍光の増強(maximum fluorescent enhancem
ent, MaxFE)の領域を通過するように方向づけることができる。適したポアとしては、ゲ
ル(ポリヌクレオチドを閉じ込めるために一般に使用される)、α-ヘモリシンなどの有
機ポア、窒化ケイ素で作製することができるものなどの固体の状態のポア、多孔性の金、
コロイド結晶、コロイドキャビティ、金属トロイドなどのナノ多孔性材料、又は直径10
nm以下、好ましくは直径5nm以下、特に1.5〜2.5nmのいずれの他のポアが挙
げられる。
−2つのプラズモン共鳴する表面の間のEMFが、それら表面の間の距離が減少する際に増
大すること、
−プラズモン共鳴する表面への接近も、フルオロフォアの蛍光寿命を減少させること、
−これらの表面の間の距離を5nm以下とすることができること、並びに
−コロイド、多孔性の薄いフィルム、2Dの結晶アレイ、及び他のナノ構造体を、2nm
以下の大きさにすることができること
を考えると、最大の光子の放出を極めて小さい領域において発生するようにすることがで
きることを予想することは理にかなっている。
て特定することができる。これは、特定のフルオロフォアの位置の特定と同様に、識別可
能なラマンスペクトルを有する特定の特徴をもつものの位置を、そのプラズモン構造体へ
の接近によって特定することができる。
る場合、単一のイオン−フルオロフォアの抱合体を検出するか、又は特定のラマンスペク
トルを有する領域を検出することができるように、該イオンがこのMaxFEの領域を通過す
るようにすることができる。
た荷電イオンを誘導してナノポアを通過させることによって、イオンの定量化が以下に記
載するように可能である。すなわち、
−2つの同一の蛍光粒子/イオン抱合体を考えると、第1のものがポアを通過し、限定し
たEMFに入ると、フルオロフォアが光子を放出し始める。フルオロフォアがMaxFEの領域に
さらに近付くように移動するにつれて、フルオロフォアの数が増加して放出される。MaxF
Eの領域への距離が減少するにつれて指数関数的に次々に増加しているEMFの強度と光子の
放出が直接関連しているとき、光子の放出も指数関数的に増加し、MaxFEの領域において
光子の放出ピークを生じさせ、抱合体がMaxFEの領域から離れるにつれて減少する。第2
の同一の蛍光粒子は、同様のパターンの光子放出を生じる。ピークの光子の放出が、2つ
のフルオロフォア/イオン抱合体の間の距離より少ない厚さを有する別個の領域にて発生
する限り、これら2つのフルオロフォアによって生じた蛍光は識別することができる。
−2つの抱合体が非常に密接に共にあるような間隔(0.5nm以下)で置かれている場
合、個々の検出は困難であり、MaxFEの領域における2つ以上のフルオロフォアの存在は
、光子の放出によって決定することができる。同等のEMFの強さに曝された2つの同一の
フルオロフォアは、単一のフルオロフォアの約2倍の光子/sを放出すべきである。MaxF
Eの領域が2、3又は4以上の抱合体を含むことができると考えると、それら抱合体がEMF
を通る速度が知られている場合、EMFを通過する抱合体の数の定量化を達成することがで
きる。
られた2つのチャンバーを作製することによって、MaxFEの領域が2、3又は4以上の抱
合体を含むことができるかどうかにかかわらず、数が決定されるかぎり、移動するように
誘導することができるイオンを定量化することができる。
蛍光標識は、通常、一本鎖(single stranded, ss)及び二本鎖(double stranded, ds
)の両方のポリヌクレオチドDNA及びRNAに組み込まれる。DNAポリメラーゼと蛍光修飾さ
れるヌクレオチドの両方の慎重な選択によって、蛍光標識をDNAに組み込む多くのよく確
立された方法があり、4種の塩基(CGTA)の1種又は複数種のすべてを蛍光標識すること
ができることが[7]に示されている。dsDNA及びdsRNAにおけるヌクレオチドの間の距離は
、0.34nmであることが知られており、一方で、ssDNA及びssRNAにおいて、ポリマー
が直線状の構造であることができ、それによって最大の空間的隔離がより大きくなるよう
にすることが可能であるが、正確な距離は、強制された伸縮力に応じて0.5nm〜1n
mの間で変動する[8]。
一本鎖DNAがα−ヘモリシンなどの有機ポア[10]又は窒化ケイ素における固体状態のポ
アを通過する速度の正確な制御が達成できることが知られている[8,9]。ポリヌクレオチ
ドの塩基の1種又は複数種のすべてが蛍光標識されるようにポリヌクレオチドを標識し、
ヌクレオチドが少なくとも1つの蛍光標識ヌクレオチドを含むことができるMaxFEの領域
を通過するように、マイクロ流体工学、電気泳動または既知の速度でEMFを通過させるい
くつかの他の手段によってポリヌクレオチドを誘導することによって、DNA断片に沿う標
識したヌクレオチドの位置を決定できる。
クレオチド塩基のすべてがそれぞれにおいて蛍光標識されている4つのPCR反応を行うこ
とができる。次に、鎖を変性し、ssDNA又はssRNAを形成する。次いで、既知の速度でナノ
ポアを通過し、かつ既知の数のヌクレオチドを含むことができるMaxFEの領域を通過する
ように各鎖を誘導する。標識したヌクレオチドがEMFを通過した際に、その位置を他の標
識したヌクレオチドと比較して決定することができ、4つの同一であるが異なる標識がな
されたポリヌクレオチドのそれぞれについての距離のマップが得られる。次に、これらの
4つの距離のマップを容易に組み合わせて完全なポリヌクレオチドの配列を構築すること
ができる。
本方法を用いてゲノムを配列決定するためには、全ゲノムの増幅に利用可能なものなど
の蛍光標識したランダムプライマーを用いることができる。これらのプライマーの配列は
既知であり、蛍光標識は、ポアを通過するDNA断片の5‘又は3’の方向を示す機能を果
たすことができる。また、標識したプライマーは、標識したヌクレオチドの距離マップを
関係づけることができる最初の基準点として機能を果たすこともできる。優先的には、4
種の塩基の2種以上のすべてを蛍光標識し、異なる放出スペクトルを有する蛍光標識を用
いて、これらの塩基を区別する。また、標識が別個の最大の放出スペクトルを有する場合
には、2つ以上の蛍光標識スペクトルを用いて、1種の塩基のすべてを標識することもで
きる。
ように誘導することができる。Cy5の色素を用いて、3億〜9億光子/sのMEFにおける光
子の放出速度が得られる[1]。これによって、DNAが1億ヌクレオチド塩基/秒/ナノ構
造体よりわずかに低い速度で通過可能となる。ナノ構造体のアレイは、この速度をアレイ
の大きさによって増加させることを可能にする。これらのプライマーがランダムであり、
ゲノム内のDNA断片における距離マップの位置が知られていない場合、完全なショットガ
ン配列決定に用いられるものなどの全ゲノム構築ソフトウェアが正確なアライメント及び
構築に必要とされる。
本発明は、他のDNA配列決定方法のみならず、他の単一の分子の検出方法を超える様々
な利点をもたらす:
・本発明は、機能強化された単一の分子の検出を可能にする。
・本発明を用いて、単一の分子の位置及び速度を決定することができる。
・PCRを用いて単一の分子を蛍光標識することができるが、本装置及び方法は、化学的な
又は酵素の反応に依存しない。
・何十、何百、何千又は何百万のこれらのナノ構造体を一度に作動した状態にすることが
できるように本装置を配列することができる。
・上記で概略を説明した本方法を用いるDNAの配列決定は非常に速い。本方法を用いる配
列決定のコストは、蛍光標識、ヌクレオチド、ポリメラーゼ及び他の比較的重要でない消
耗品などの4つしかないPCRの試薬のコストに限られている。
本発明の中心は、制御された様式で極めて局在したEMFを通過するように単一の分子を
誘導し、分子とEMFとの間の相互作用を検出することにある。ゲル、有機ポア、固体状態
のポア、ビーズへの結合及び表面上への固定化を含めたタンパク質及びポリヌクレオチド
の両方を制御する多くのよく研究されている方法がある。これによって、極めて局在した
EMFを通過させることができるようにタンパク質又はDNA断片などの単一の分子を制御でき
る幅広い範囲の装置を構成できるようになる。
おけるMEFまたはSERSを誘導するかぎり、いずれの表面も用いることを可能にし、単一の
分子を、MaxFEの領域を通過するように誘導することができる。
領域を通過するように単一の分子を誘導するいずれの手段も可能にする。
鳴の周波数で蛍光を発するいずれの蛍光標識も使用することを可能にする。理想としては
、蛍光標識は、高い量子収量、低い蛍光寿命、低い分子量を有し、かつ容易にポリメラー
ゼで組み込まれる。好ましくは、ヌクレオチド自体が本質的に蛍光を発するものである。
有のラマンスペクトルを知るべきである。
、各方法は、異なる利点を有する:
−単一の分子を制御するのに「有機」ポアを使用することは、金のナノ粒子をポア自体又
は周囲の脂質に共有結合させることを可能にする。もう一つの方法として、窒化ケイ素で
作製できるものなどのより大きな固体状態のナノポアの内側に有機ポアを設置することが
でき、プラズモン構造体(たとえば金属部分)を、有機ポア内の分子又は分子の一部にME
F又はSERSを最適化するように位置づけることができる。別の方法として、光子のナノキ
ャビティなどのプラズモン構造体の内側に有機ポアを設置することができる(図5及び6
参照)。この方法の利点としては、そのようなポアを通過するように誘導された単一の分
子のよく特徴づけられた性質、有機ポアが可能にする小さくかつ極めて再生可能なポアの
直径、並びにそのような有機ポアを製造する低いコストが挙げられる。
−固体状態のナノポアを使用することによって、ポアの直径にわたる制御及びMEF又はSER
Sが最適化されるようにプラズモン構造体をナノで位置づけすることが可能となる。理想
としては、光子の放出を、導波管を用いてさらに制御することができる。これによって、
より効率的な光子の検出及びより高い検出速度が可能になる。
−第3の一般的な構成方法は、多孔性の表面上のいずれの任意の点での電界強度が知られ
ていないような極めて局在したEMFのランダムな分布を可能にし、単一の分子が、制御さ
れた速度で、制御されていない位置でこの表面を通過できるようにするものである(図7
)。これは、EMF又は単一の分子の位置も分布も正確に制御されていないという点で他の
2つの方法を超える多大な利点を有し、そのような装置が構成できる容易さは相応してよ
り卓越したものである。20nmのポアと、ランダムに分布したEMFを含む表面との交差
位置での単一の分子の速度を制御する方法は、以下に記載する。この方法は、本質的に多
重化されているという利点を有する。EMFを通過する単一の分子によって生じた蛍光が、
秒当たり1つのみの分子を検出できるようなものであっても、数百又は数千又は数百万の
ポアが一度に作動した状態であるように装置を多重化できる。
本発明に従う装置は、以下のものを備える:
−数μlの溶液を入れることができ、底面の表面に埋め込まれた電極26を含む第1のリ
ザーバ19;
直径が20nmであり、表面にエッチングされて1μm離れて間隔を空けられているナノ
ポア10のアレイを有するシリコン(基板)の層11。電極12が、各々20nmの直径
のポア10が電極12を含むようにシリコンの層11に埋め込まれており、各電極12は
、高いスキューレートを有する電圧源に接続されている(図示せず);
−金のナノ粒子14の規則的なアレイが堆積されている多孔性の膜22がシリコンの層に
結合している。金のナノ粒子14は、既知の大きさ及び幾何学的性質を有するものであり
、適切な周波数で励起させた際、EMFを生じる;
−アガロース又はポリアクリルアミドなどのゲル24が、ssDNA20が誘導されてゲル2
2を通って移動する際にほぼ直線状の構造を取るような平均孔径を有する膜22に貼り付
けられている。これは、本発明の実施態様における制御手段を形成するものである;
−第2のリザーバ21が、分子がポアを通った後に通過する基板22の反対側に設けられ
ている;
−高いスキューレートを有する電圧モジュレータのアレイ(図示せず)がアバランシェ・
フォトダイオードなどの高感度の光子検出器(図示せず)に接続されている;
−アバランシェ・フォトダイオードなどの光子検出器(図示せず)が設けられている;
−光子検出器(図示せず)からの入力に基づく電圧源のアレイを制御する手段が設けられ
ている;
−既知の大きさ及び幾何学的性質の金属コロイドにおいてプラズモン共鳴を誘導すること
が可能な周波数のレーザー(図示せず)が設けられている。
与えられたssDNAの鎖における2種の塩基(C及びA又はG及びT)のすべてを、使用した
金属コロイド14のプラズモン共鳴の周波数に近いが、好ましくは該周波数に対してわず
かに赤方偏移した最大の放出を有する蛍光標識を用いて蛍光標識するように、DNAを前述
のPCRによって標識する。
れており、かつ金のナノ粒子14のほぼ均一な分布を、該ナノ粒子間の間隔が1nm〜1
00nmの間でランダムに変動するように含む膜22を第1のリザーバ19上へ設置する
。次いで、シリコンの層11を膜22上に設置し、すべてのアセンブリーを導電溶液中に
浸すことができる。次に、第2のリザーバ21を通ってゲル24へ移動し、直線状の構造
でゲル24を通過し、プラズモン共鳴によって生じたEMFを通過する際に光子を放出する
金のナノ粒子14のアレイを通るようにssDNA20を誘導するように、20nmのポア1
0の内側の電極12に正電荷を与える。蛍光標識したランダムプライマーをPCR反応に使
用した際、第1の光子の放出が、5’又は3’のプライマーのいずれかによって生じる。
プライマーから得られた光子の放出は、ssDNA20の断片がEMFを通って移動するように誘
導でき、かつ明確なシグナルがまだ得られる速度を直ちに示す。金の球体14に対するss
DNA20の位置づけが、ssDNA断片20ごとの20nmのポア10のそれぞれの内側で異な
る場合、最適な電圧を常に各ポア10に加えることができる。上記の概略のように、互い
に対しての及び既知のプライマーに対しての距離を含む距離マップを光子放出のデータか
ら作成できる。次に、このデータを組み合わせて全ゲノム配列を構築することができる。
ナノテクノロジーの技術を用いて適した基板を製造できる多くの方法がある。以下に、
2つの可能な方法及び配列決定のプロトコールを行う様態を説明する。
1)光子のナノキャビティ30などのプラズモン構造体のアレイを、[4]に記載されて
いる適した材料32から作り、該ナノキャビティは、図5にあるような内径8〜10nm
を有するか、又は図6にあるような内径4〜5nmを有する。
2)次に、α−ヘモリシンなどの有機ポア34を、該有機ポア34が約1μm離れて間隔
を空けられているように、[13]に示唆されている手段によってこれらのプラズモン構造
体の内側に位置づける。
3)次いで、これらのナノキャビティ30のプラズモン共鳴の波長を正確に決定し、レー
ザー及び蛍光色素スペクトルを、定められたプラズモン共鳴と一致するように選択する。
蛍光色素スペクトルを、プラズモン共鳴のピークからわずかに赤方偏移すべきである(2
0〜150meV)。
4)有機ナノポア34を介した電解輸送を[10]に記載されているように実施する。
5)蛍光標識からの光子の放出を、本技術分野において周知のアバランシェ・フォトダイ
オード検出システムを用いて検出する。
6)選択した遺伝子源からDNAを抽出した後、ssDNAを、PCR及び全ゲノム増幅に用いられ
ているものなどのランダムプライマーを用いて蛍光標識する。PCR反応において存在する
4種のヌクレオチドのうち、1種が染色で修飾された形態でのみ存在し、これによって、
選択したヌクレオチドの高密度の蛍光標識が確実にもたらされる。長い解読の長さでの高
密度の標識を確実にするために、いくつかの蛍光色素を、[7]に記載されている種々の
ポリメラーゼを用いて試験する必要がある。
7)続いて、このようなPCR反応を、残りの3種のヌクレオチドについて行い、従って、
4種のPCR反応を実施し、その結果として、それぞれC、T、G及びAのヌクレオチドのすべ
てにおいて蛍光標識したDNAを含有する4種のサンプルがもたらされる。
8)DNAが配列決定装置を通過する直前に、PCR反応物を本技術分野で周知のように変性し
て、標識したssDNAがナノポア34を通過できるようにする。
9)1種の同時に変性したPCR反応物をナノポア34に通過できるようにする。
10)色素分子からの光子の放出が、1秒の100万分の1の精度のAPDによって得られ
る。光子の放出のこれらの突発のタイミングを、ssDNAのポアを通しての転位置に関して
、既知のものを用いて標準化し、同一のヌクレオチド間の間隔を明らかにする数千又は数
百万の距離マップを作製する。
11)次に、これらの距離マップを、最初に、同一のヌクレオチドの4種の完全に再構築
した配列に再構築し、全ゲノム配列に合成する。
1)30nm又はそれ以下の先端における内側半径を有する円錐状のナノポアのアレイを
、半導体の窒化ケイ素又は導体の金属の膜40に、本技術分野において周知の電子ビーム
・リソグラフィを用いてエッチングする。これらのナノポアは、1μm離れて間隔を空け
られている。エッチングしたシリコン膜を、[11]に記載されているステージ上に取り付
け、電気メッキ槽として働く小さいテフロン(登録商標)チューブ(直径2mm)内の電
気メッキ液に入れる。1.17%(w/w)KAu(CN)2を含むTEMPEREX 8400(田中貴金属
)を、室温での電気メッキ液として用いる。金のワイヤー(直径0.5mm)をカウンタ
ー電極として溶液に浸漬する。続いて、1.4〜1.5Vのバイアス電圧を、システムに
おけるカウンター電極に対する最初の電極に印加する。これに続いて、最初の電極の表面
上へ金が電着する。典型的には、0.2mAの起誘導電流によって、室温での1A°/秒
の電気メッキ速度が可能になる。
2)次に、金42の層を、[11]記載の電着を用いて堆積させて、直径1.5〜2.5n
mのポアを製造する。適切な波長の入射波によって励起した際、この構造体は、円錐状の
ポアの先端に集中した極めて局在したEMFを生じる[12]。
3)電気泳動によって、ポア44を通して移動するように標識したssDNAを誘導した際、
個々の標識は、ポア44のエッジ43と接触する。ポア44のエッジの周囲にEMFが極め
て局在しているとき、蛍光標識が領域を通過する際、光子の放出が期待される。しかしな
がら、ポア44の先端における金の表面と蛍光標識したssDNAとの間の接触によって、蛍
光のクエンチングが誘導される。標識したssDNAがポアの先端を過ぎてチャネルへ移動し
続ける際、チャネルが膨張する。この膨張によって、プラズモン構造体の表面との接触及
び結果として起こる蛍光のクエンチングがなくなる。
4)続いて、これらの電気メッキした円錐状のポア44のプラズモン共鳴の波長を正確に
決定し、レーザー及び蛍光色素スペクトルを、定められたプラズモン共鳴と一致するよう
に選択する。蛍光色素スペクトルをプラズモン共鳴のピークからわずかに赤方偏移すべき
である(20〜150meV)。
5)円錐状のナノポア44を介した電解輸送を、[8,9]に記載されているように実施す
る。
6)蛍光標識からの光子の放出を、本技術分野において周知のアバランシェ・フォトダイ
オード検出システムを用いて検出する。
7)選択した遺伝子源からDNAを抽出した後、ssDNAを、PCR及び全ゲノム増幅に用いられ
ているものなどのランダムプライマーを用いて蛍光標識する。PCR反応において存在する
4種のヌクレオチドのうち、1種が染色で修飾された形態でのみ存在し、これによって、
選択したヌクレオチドの高密度の蛍光標識が確実にもたらされる。長い解読の長さでの高
密度の標識を確実にするために、いくつかの蛍光色素を、[7]に記載されている種々の
ポリメラーゼを用いて試験する必要がある。
8)続いて、このようなPCR反応を、残りの3種のヌクレオチドについて行い、従って、
4種のPCR反応を実施し、その結果として、それぞれC、T、G及びAのヌクレオチドのすべ
てにおいて蛍光標識したDNAを含有する4種のサンプルがもたらされる。
9)DNAが配列決定装置を通過する直前に、PCR反応物を本技術分野で周知であるもののよ
うに変性して、標識したssDNAがナノポア44を通過できるようにする。
10)1種の同時に変性したPCR反応物がナノポア44を通過できるようにする。
11)色素分子からの光子の放出が、1秒の100万分の1の精度のAPDによって得られ
る。光子の放出のこれらの突発のタイミングを、ssDNAのポア44を通しての転位置に関
して、既知のものを用いて標準化し、同一のヌクレオチド間の間隔を明らかにする数千又
は数百万の距離マップを作製する。
12)次に、これらの距離マップを、最初に、同一のヌクレオチドの4種の完全に再構築
した配列に再構築し、全ゲノム配列に合成する。
[1] Fu, Yi, Lakowicz; Joseph R., "Single molecule studies of enhanced fluorescen
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11 シリコン(基板)の層
12 電極
14 金のナノ粒子
19 リザーバ
20 ssDNA
21 リザーバ
22 膜
24 ゲル
26 電極
30 ナノキャビティ
32 材料
34 有機ポア
40 膜
42 金
43 エッジ
44 ポア
Claims (33)
- 基板に設けられた少なくとも1つのチャネルであって、分子が通過するのに適している
チャネルと、
プラズモン共鳴が可能な少なくとも1つの金属部分であって、該金属部分によって生じ
た電磁界が前記チャネルを通過する分子と相互作用するのに適した位置で前記チャネルと
結合している少なくとも1つの金属部分と、
前記チャネルを通過するように分子を誘導する手段と、
前記金属部分において表面プラズモン共鳴を誘導する手段と、
前記金属部分によって生じた電磁界と前記チャネルを通過する分子との間の相互作用を
検出する手段とを備える、
分子を調査するための装置。 - 基板によって互いに区切られている2つのリザーバを備え、第1のリザーバは、調査す
る分子を含むサンプルを入れるのに適しており、第2のリザーバは、分子がチャネルを通
過次第、該分子が移行するのに適している請求項1記載の装置。 - 前記チャネルが開口である請求項1又は2記載の装置。
- 前記開口が約0.5nm〜100nmの直径を有する請求項1〜3のいずれか1項に記
載の装置。 - 前記開口が約1nm〜50nmの直径を有する請求項1〜4のいずれか1項に記載の装
置。 - 前記開口が約1nm〜30nmの直径を有する請求項1〜5のいずれか1項に記載の装
置。 - 前記開口が約1nm〜5nmの直径を有する請求項1〜6のいずれか1項に記載の装置
。 - 前記開口が有機ポアを含む請求項1〜7のいずれか1項に記載の装置。
- 前記開口がゲルによって設けられている請求項1〜7のいずれか1項に記載の装置。
- 前記開口がフィルムなどの基板において設けられている請求項1〜7のいずれか1項に
記載の装置。 - 前記開口が、多孔質の金、コロイド結晶、コロイドのキャビティ及び金属トロイドから
なる群より選択されたナノ多孔質材料から形成されている請求項1〜7のいずれか1項に
記載の装置。 - 基板を通る複数の開口を備える請求項1〜11のいずれか1項に記載の装置。
- 前記開口がアレイで配置されている請求項12記載の装置。
- 前記金属部分が金、銀、銅又はアルミニウムを含む請求項1〜13のいずれか1項に記
載の装置。 - 前記金属部分が実質的に球状である請求項1〜14のいずれか1項に記載の装置。
- 前記金属部分が実質的に環状である請求項1〜14のいずれか1項に記載の装置。
- 前記金属部分が多角形の角柱である請求項1〜14のいずれか1項に記載の装置。
- 前記金属部分が50nm〜150nmの直径を有する請求項1〜17のいずれか1項に
記載の装置。 - 前記金属部分が、チャネルを通過する分子から50nm又はそれ以下の位置にあるよう
に配置されている請求項1〜18のいずれか1項に記載の装置。 - チャネルを通過するように分子を誘導する手段は、電気泳動を誘導する1つもしくは複
数の手段、マイクロ流体工学装置又はレーザートラッピング装置を含む請求項1〜19の
いずれか1項に記載の装置。 - 開口の方へ、開口内へ及び/又は開口を通しての分子の通過を制御する制御手段を備え
る請求項1〜20のいずれか1項に記載の装置。 - 前記制御手段が、分子が通過する多孔性のマトリックスを備え、該多孔性のマトリック
スが、チャネルへの入り口に直接隣接して位置する請求項21記載の装置。 - 金属部分と分子との相互作用を検出する手段が、蛍光を検出する手段又はラマン散乱を
検出する手段を含む請求項1〜22のいずれか1項に記載の装置。 - 蛍光を検出する手段が、光電子増倍管又はアバランシェ・フォトダイオードを含む請求
項23記載の装置。 - ラマン散乱を検出する手段が、ラマン・スペクトロメータを含む請求項23記載の装置
。 - 調査する分子を含む液体のサンプルを準備するステップと、
基板に設けられたチャネルであって、プラズモン共鳴を有するように誘導される結合し
た金属部分を有するチャネルを通過するように前記分子を誘導するステップと、
前記金属部分によって生じた電磁界とチャネルを通過する分子との間の相互作用を検出
するステップとを含む、
分子を調査する方法。 - 前記分子が生体分子である請求項26記載の方法。
- 前記分子が核酸である請求項26記載の方法。
- 前記分子が、金属部分と相互作用する標識を含む請求項26〜28のいずれか1項に記
載の方法。 - 前記標識がフルオロフォアである請求項29記載の方法。
- 前記標識が、ローズ・ベンガル(Rose Bengal)、C5−マレイミド、C2−マレイミ
ド、ローダミン・レッド、C2−マレイミド及びローダミン・グリーンのうちの1種であ
る請求項30記載の方法。 - 前記標識が、前記金属部分の局在表面プラズモン共鳴のピークよりわずかに低いエネル
ギーでの放出ピークを有する請求項31記載の方法。 - 基板に設けられた少なくとも1つのチャネルであって、分子が通過するのに適している
チャネルと、
プラズモン共鳴を誘導することが可能な少なくとも1つの金属部分であって、該金属部
分によって生じた電磁界が前記チャネルを通過する分子と相互作用することができるよう
な位置で前記チャネルと結合している少なくとも1つの金属部分とを備える、
分子を調査する装置への使用に適した基板。
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