CN113388517A - 一种适用微重力回转仪装配的生物培养微流控芯片及其细胞培养方法 - Google Patents

一种适用微重力回转仪装配的生物培养微流控芯片及其细胞培养方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113388517A
CN113388517A CN202110649283.2A CN202110649283A CN113388517A CN 113388517 A CN113388517 A CN 113388517A CN 202110649283 A CN202110649283 A CN 202110649283A CN 113388517 A CN113388517 A CN 113388517A
Authority
CN
China
Prior art keywords
culture
chip
chamber
biological
layer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110649283.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113388517B (zh
Inventor
马宏
陈钰
邓玉林
吴语非
麻陈灿
王舒钥
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Institute of Technology BIT
Original Assignee
Beijing Institute of Technology BIT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Institute of Technology BIT filed Critical Beijing Institute of Technology BIT
Priority to CN202110649283.2A priority Critical patent/CN113388517B/zh
Publication of CN113388517A publication Critical patent/CN113388517A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113388517B publication Critical patent/CN113388517B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/08—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing artificial tissue or for ex-vivo cultivation of tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/033—Rearing or breeding invertebrates; New breeds of invertebrates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/16—Microfluidic devices; Capillary tubes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/20—Material Coatings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/04—Filters; Permeable or porous membranes or plates, e.g. dialysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/10—Perfusion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/04—Mechanical means, e.g. sonic waves, stretching forces, pressure or shear stimuli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M37/00—Means for sterilizing, maintaining sterile conditions or avoiding chemical or biological contamination
    • C12M37/04—Seals
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/12—Specific details about manufacturing devices
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0887—Laminated structure

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本发明提供了一种适用微重力回转仪装配的生物培养微流控芯片及其细胞培养方法，芯片软膜完全覆盖在培养芯片本体上，通过可拆卸的固定装置将生物培养微流控芯片侧面固定，在软膜与培养芯片接口层间形成密封，生物培养微流控芯片固定在微重力回转仪的固定位上。该芯片大大降低了培养腔室的深宽比，减少培养基用量，能够满足平行培养需求，同时有效减少流体剪应力对培养目标物的损伤。

Description

一种适用微重力回转仪装配的生物培养微流控芯片及其细胞 培养方法
技术领域
本发明属于空间医学工程以及生物技术研究领域，具体涉及一种适应于微重力回转仪(Random Position Machine,RPM)装配的生物培养微流控芯片，以及使用该微流控芯片的细胞培养方法。
背景技术
太空环境的重力一般在零到千分之几G，即微重力环境。在轨工作的航天员往往出现多种生物损伤效应，涉及心血管系统、肌肉运动系统、神经系统和免疫系统等。为探究生物损伤效应机制，保护在轨工作的航天员，相关研究是必要的。然而，航天员的样本极其珍贵，在轨开展生物实验的机会也极其有限，因此目前空间生物学研究的主要手段是地面模拟微重力。其中，对于体外培养的细胞样本，最常见的实验方法是使用三维回转仪和二维回转仪模拟微重力。
细胞生物学中，哺乳动物细胞培养的传统方法是将单层贴壁细胞培养于器皿的底部，并在其上覆盖一层约1mm的培养基，使细胞全时在培养基的覆盖中，以保证细胞不会由于干燥或缺乏营养而死亡。然而，在微重力回转仪的作用下，细胞培养的器皿是不断运动的，单层培养基无法实现全时、全面地覆盖培养的细胞，同时，培养器皿的不断运动也会使培养基产生巨大的剪应力，损伤培养的细胞。因此对于细胞、微生物等样本，一般会先将培养瓶灌满培养基，再封口后装配至微重力回转仪上，开始随机旋转，模拟微重力环境。这样的方法会导致对细胞培养基的极度浪费。对于底面积为12.5cm2的培养瓶仅需2mL培养基即满足48h的细胞培养需求，而现有技术中在微重力回转仪上使用底面积为12.5cm2的培养瓶，则需要灌满整个培养瓶至少需要37mL培养基，极大提高相关实验的成本。更重要的是，在传统细胞培养方法中，常用多孔板增加实验的生物学重复，然而由于无法将多孔板填满培养基，因此多孔板无法使用在微重力回转仪上。
发明内容
为了解决现有的模拟微重力环境下细胞培养技术的缺陷，本发明结合微流控细胞培养技术与模拟微重力技术，提供一种适用微重力回转仪装配的生物培养微流控芯片及其细胞培养方法，该芯片大大降低了培养腔室的深宽比，减少培养基用量，既能够满足平行培养需求，又可效减少流体剪应力对培养目标物的损伤。
本发明提供以下技术方案：
一种适用微重力回转仪装配的生物培养微流控芯片，由下至上包括下固定板、培养芯片本体、软膜、上固定板，其特征在于，所述软膜完全覆盖在所述培养芯片本体上，通过可拆卸的固定装置将所述生物培养微流控芯片侧面固定，在软膜与培养芯片接口层间形成密封，所述生物培养微流控芯片固定在微重力回转仪的固定位上。
进一步的，所述软膜为聚二甲基硅氧烷PDMS、聚乙烯PE、聚氯乙烯PVC、聚偏二氯乙烯PVDC。
进一步的，所述培养芯片本体包括接口层、培养层和基底层，所述培养层的培养腔室深宽比为0.003～1，完全交汇时细胞数：所需的培养基＝1.4x106：0.625～1.4x106：6.25；所述接口层设有若干通孔，通孔位置与培养腔室对应。
进一步的，所述培养芯片本体包括接口层、培养层和基底层，所述培养层设有若干培养腔室，每一培养腔室均设有进液通道和出液通道，培养腔室的深宽比为0.003～1，完全交汇时贴壁细胞数量：所需的培养基＝1.4x106：0.625～1.4x106：6.25。所述接口层设有若干通孔，通孔位置与培养腔室的进液通道和出液通道对应。
进一步的，所述培养芯片本体从下往上依次包括基底层、培养层和接口层，所述培养层水平方向依次设有储液腔室、培养腔室以及废液腔室，在储液腔室、培养腔室之间设有第一多孔膜，在培养腔室、废液腔室之间设有第二多孔膜，在所述第二多孔膜下游设有片上单向阀，在废液腔室与储液腔室之间设有通道，通道进口及出口处分别设有多孔疏水膜，所述接口层设有若干通孔，通孔位置分别对应储液腔室、培养腔室、废液腔室以及片上单向阀内。
进一步的，所述第一多孔膜、第二多孔膜为亲/疏水复合膜，在聚对苯二甲酸乙二醇酯PET膜的一面进行亲水性表面改性处理。
进一步的，基底层为玻璃、聚苯乙烯PS、聚碳酸酯或聚对苯二甲酸乙二醇酯PET。
进一步的，接口层、培养层材质为聚二甲基硅氧烷PDMS。
进一步的，接口层、培养层材质为聚甲基丙烯酸甲酯PMMA。
一种利用生物培养微流控芯片进行细胞培养的方法，包括以下步骤：
步骤1，将微流控芯片本体和软膜消毒；
步骤2，将非贴壁细胞离心，并用培养基进行细胞重悬，制备种子液；
步骤3，通过微流控芯片本体接口层的通孔向培养腔室细胞接种，培养腔室加满种子液；
步骤4，将生物培养微流控芯片的下固定板、培养芯片本体、软膜、上固定板由下至上依次装配，侧面固定；
步骤5，将生物培养微流控芯片固定在微重力回转仪的固定位上。
进一步的，步骤2中将贴壁细胞用胰蛋白酶消化成细胞悬液后离心，制备为种子液；
步骤4和步骤5之间还需要细胞静置培养、贴壁的步骤。
一种利用生物培养微流控芯片进行细胞培养的方法，包括以下步骤：
步骤1，将微流控芯片本体和软膜消毒；
步骤2，将非贴壁细胞离心，向培养基中加入HEPES作为pH缓冲剂，并用培养基进行细胞重悬，制备种子液；
步骤3，通过微流控芯片本体接口层的通孔向培养腔室细胞接种，培养腔室加满种子液；
步骤4，将生物培养微流控芯片的下固定板、培养芯片本体、软膜、上固定板由下至上依次装配，侧面固定；
步骤5，将生物培养微流控芯片固定在微重力回转仪的固定位上。
采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：
1、降低了培养腔室的深宽比，在收获等量细胞样本的前提下，可有效减少培养基等相关试剂的使用量，
2、能够满足平行培养需求，提高实验的拷贝数(生物重复数)，因此可有效地降低实验成本，
3、同时有效减少微重力回转仪运行过程中，培养腔室内的流体剪应力，减少流体剪应力对培养目标物的损伤，
4、可实现模拟微重力环境下细胞灌流培养，有助于延长模拟微重力环境下生物培养的时间，灌流培养技术也可实现细胞培养基的不断更换，因此可使细胞所处的微环境更稳定。
附图说明
图1是本发明实施例中微流控芯片的结构示意图；
图2是本发明实施例中另一微流控芯片的结构示意图；
图3是本发明实施例中另一微流控芯片的结构示意图；
图4是本发明实施例中另一微流控芯片的俯视图；
图5利用本发明的培养芯片培养的人单核细胞白血病细胞THP-1经CCK8实验测定的细胞生长曲线的结果示意图；
图6是采用本发明培养芯片培养的人神经胶质瘤U-87MG细胞形态图；
图7是培养的人神经胶质瘤U-87MG细胞经CCK8实验测定的细胞生长曲线结果示意图；
图8是测试流体线速度最大值的实验结果图；
图9是流体线速度仿真结果示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的结构图及具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本发明提供了一种适用微重力回转仪装配的生物培养微流控芯片，如图1所示，由下至上包括下固定板1、培养芯片本体3、软膜2、上固定板4，软膜完全覆盖在培养芯片本体上，通过可拆卸的固定装置将生物培养微流控芯片侧面固定，生物培养微流控芯片固定在微重力回转仪的固定位上。
软膜为聚二甲基硅氧烷PDMS、聚乙烯PE、聚氯乙烯PVC、聚偏二氯乙烯PVDC。培养的生物目标物可以是细胞、微生物、组织、卵、幼虫等。为了对培养芯片本体继续进行实验，固定装置的固定方法采用所有已知的可拆卸固定方法，如采用夹具夹持固定，螺栓连接固定。螺栓通过固定板对芯片本体和软膜产生压力，使软膜产生形变，填充接口层的通孔，以封闭芯片腔室，可防止培养液泄漏，能够适应模拟微重力环境。
实施例2
如图2所示，培养芯片本体包括接口层5、培养层6和基底层7，培养层的培养腔室深宽比为0.003～1，接口层设有若干通孔8，通孔位置与培养腔室对应。优选地，加样时，培养基应没过培养腔室的通孔，确保添加的培养基充满整个培养腔室，不产生气泡。
灌满标准T12.5培养瓶需要37mL培养基，完全交汇时贴壁细胞数量(细胞)：所需的培养基(mL)＝1.4x106：37，与其相比，利用图2所示的培养芯片开展实验，培养腔室底面设置为12.5cm2时，灌满培养腔室则只需要2.5mL培养基，完全交汇时贴壁细胞数量(细胞)：所需的培养基(mL)＝1.4x106：2.5，可大大减少培养基的使用量。
使用长满细胞时(细胞完全交汇)的细胞数量与培养基体积的比例来体现本发明的优势。接种数量是可变的，但是基底面积固定的前提下，长满细胞后，细胞数量是相对固定的。因此，该比值能够反应在模拟微重力环境下收获等量细胞时，需要耗费的培养基体积，该比值越大，说明收获等量细胞时耗费的培养基量越少。在空间生命科学与医学研究中，许多实验需要收集大量细胞，如多种微量生物大分子的提取(蛋白、RNA等)、培养基中外泌体的提取等，对于此类实验，本发明提供的微流控芯片和培养方法可有效提高该比值，避免传统方法使用培养瓶等工具会耗费过多培养基的劣势，减少培养基消耗量。
优选地，基底层可以为玻璃、聚苯乙烯PS或聚对苯二甲酸乙二醇酯PET。
接口层、培养层材质为聚二甲基硅氧烷PDMS，该材质能够允许气体通过，不允许液体通过，可无需添加额外缓冲剂即满足培养腔室内的pH稳定的需求。
或者，接口层、培养层材质为聚甲基丙烯酸甲酯PMMA，该材质无法透气，需要在培养基中额外添加缓冲剂，但其加工方法无需依赖模具，可满足芯片大规模生产的需求。
接口层、培养层和基底层之间的固定可由环氧树脂灌封胶或聚甲基丙烯酸甲酯PMMA双面胶相互粘合，或者由热压键合封合。
实施例3
如图3所示，本专利的培养芯片本体包括接口层5、培养层6和基底层7，培养层设有若干培养腔室9，每一培养腔室均设有进液通道10和出液通道11，培养腔室的深宽比为0.003～1，接口层设有若干通孔8，通孔位置与培养腔室的进液通道和出液通道对应。传统细胞培养多孔板常用于体外细胞研究领域需要样本量少，生物重复数多的实验中，然而传统细胞培养多孔板无法应用于模拟微重力环境中，只能使用培养瓶进行多次重复实验。
如检测细胞存活率或检测细胞凋亡试验中采用培养瓶连接微重力回转仪需要6个培养瓶中，3个实验组，3个对照组。采用本专利的生物培养微流控芯片，只需在培养芯片本体上设置3个培养腔室，采用两个培养芯片进行微重力实验和对照实验即可。
此外，腔室体积减小可降低贴壁细胞在三维微重力回转仪RPM中受到的流体剪应力。在三维回转仪模拟微重力的过程中，使用器皿的容积越小，腔室内的样品受到的流体剪应力越小。使用COMSOL软件计算微重力回转仪运行过程中不同培养容器内流体的最大线速度。对微流控芯片建模后，设置培养腔室为流域，流体设为水，设定温度为310.15K，压力为标准大气压，流体属性为层流，以恒定速度随机方向旋转流体子域，待流体线速度最大值稳定后，输出流体子域内流体的最大线速度，其流体力学仿真结果见图8、图9。
结果表明在模拟微重力过程中，T12.5培养瓶的流体线速度仍远大于本发明实施例2、3微流控芯片的流体线速度，而流体线速度越大，流体剪应力越大，故本发明提供的微流控芯片流体剪应力远小于传统培养工具。因此，本发明微流控芯片的小腔室设计可有效降低剪应力对细胞的影响，使装置可更精确地模拟微重力环境对细胞的生物学效应。
实施例4
如图4所示，培养芯片本体从下往上依次包括基底层、培养层和接口层，培养层水平方向依次设有储液腔室12、培养腔室9以及废液腔室13，在储液腔室、培养腔室之间设有第一多孔膜14，在培养腔室、废液腔室之间设有第二多孔膜15，在第二多孔膜下游设有片上单向阀16，在废液腔室与储液腔室之间设有通道，通道进口及出口处分别设有多孔疏水膜，接口层设有若干通孔，通孔位置分别对应储液腔室、培养腔室、废液腔室以及片上单向阀内。
第一多孔膜、第二多孔膜为亲/疏水复合膜，在疏水聚对苯二甲酸乙二醇酯PET多孔膜的一面进行亲水性表面改性处理，制备得到亲/疏水复合多孔膜，第一多孔膜的亲水侧朝向储液腔室，第二多孔膜的亲水侧朝向培养腔室。开展实验时，将上述培养芯片使用上固定板、软膜和下固定板固定，再装配至三维微重力回转仪，使用随机转速模拟微重力。
三维微重力回转仪在运行过程中，固定培养芯片和培养瓶的固定架以随机转速沿两条轴旋转，因此培养腔室的方位是随机的，当培养芯片处于从上至下“储液腔室-培养腔室-废液腔室”时，储液腔室内的液体在重力的作用下透过第一多孔膜进入培养腔室，同时，培养腔室内的液体在重力的作用下透过第二多孔膜，经过片上单向阀，进入废液腔室；当培养芯片处于从上至下“废液腔室-培养腔室-储液腔室”时，废液腔室内的液体无法通过片上单向阀回流至培养腔室中，因此在上述两种状态不断循环的过程中，储液腔室内的液体可不断灌流至培养腔室中，实现培养腔室内培养基的更换。同时在废液腔室和储液腔室间设有通道，用于气体的回流，防止第一多孔膜和第二多孔膜间液体的阻塞，同时为了防止废液腔室内的废液回流至储液腔室，在上述通道内设置了疏水膜，可不妨碍气体回流，同时阻止液体从废液腔室回流至储液腔室。
同理，上述培养芯片装配在二维微重力回转仪时，原理与三维回转仪类似，储液腔室内的液体在重力作用下从储液腔室流经培养腔室和片上单向阀，进入废液腔室。
实施例5
本发明提供了一种利用任意项所述的生物培养微流控芯片进行细胞培养的方法，包括以下步骤：
步骤1，将微流控芯片本体和软膜消毒；
步骤2，将非贴壁细胞离心，并用培养基进行细胞重悬，制备种子液；
步骤3，通过微流控芯片本体接口层的通孔向培养腔室细胞接种，培养腔室加满种子液；
步骤4，将生物培养微流控芯片的下固定板、培养芯片本体、软膜、上固定板由下至上依次装配，侧面固定；
步骤5，将生物培养微流控芯片固定在微重力回转仪的固定位上。该方法中接口层、培养层材质选用聚二甲基硅氧烷PDMS。
为了满足贴壁细胞的培养需求，本发明还提供了优选方法，在步骤2中将贴壁细胞用胰蛋白酶消化成细胞悬液后离心，制备为种子液；
步骤4和步骤5之间还需要细胞静置培养、贴壁的步骤。
本发明还提供了一种利用生物培养微流控芯片进行细胞培养的方法，包括以下步骤：
步骤1，将微流控芯片本体和软膜消毒；
步骤2，将非贴壁细胞离心，向培养基中加入HEPES作为pH缓冲剂，并用培养基进行细胞重悬，制备种子液；
步骤3，通过微流控芯片本体接口层的通孔向培养腔室细胞接种，培养腔室加满种子液；
步骤4，将生物培养微流控芯片的下固定板、培养芯片本体、软膜、上固定板由下至上依次装配，侧面固定；
步骤5，将生物培养微流控芯片固定在微重力回转仪的固定位上。该方法中接口层、培养层材质选用聚甲基丙烯酸甲酯PMMA。
图5是利用本发明的培养芯片培养的人单核细胞白血病细胞THP-1经CCK8实验测定的细胞生长曲线的结果示意图。步骤方法如下：
生物培养微流控芯片固定在微重力回转仪的固定位上，以随机转速旋转。芯片内细胞培养至图中所示指定时间后，使用CCK8法测定细胞存活率，具体方法如下：混匀细胞后，从芯片腔室内吸出细胞，将100μL的细胞悬液与10μL的CCK8溶液混合，加入96孔板内，在37℃孵育60min，最后使用酶标仪测定450nm处的吸光值。对照组芯片实验步骤基本与上述步骤一致，但培养时不装配至微重力回转仪。
从结果可以看出，在模拟微重力环境下，THP-1细胞的增殖受到抑制，抑制在48～72h最明显，这与模拟微重力对哺乳动物增殖影响的传统认知一致，说明本发明的培养芯片与三维回转仪结合可应用于模拟微重力研究。
图6是采用本发明培养芯片培养的人神经胶质瘤U-87MG细胞形态图，实验方法如下：生物培养微流控芯片固定在微重力回转仪的固定位上，以随机转速旋转，在倒置荧光显微镜下进行拍照。
图7是培养的人神经胶质瘤U-87MG细胞经CCK8实验测定的细胞生长曲线结果示意图。将上述培养腔室中的培养基移除，再加入含有10μL CCK8的190μL DMEM(无酚红)，反应60min，最后将溶液吸出，混匀后，转移100μL至96孔板，使用酶标仪测定450nm处的吸光值。结果中可以看出，人神经胶质瘤U-87MG细胞增殖受到抑制，抑制在72h最明显，这与模拟微重力对哺乳动物增殖影响的传统认知一致，说明本发明的培养芯片与三维回转仪结合可应用于模拟微重力研究。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (12)

1.一种适用微重力回转仪装配的生物培养微流控芯片，由下至上包括下固定板、培养芯片本体、软膜、上固定板，其特征在于，所述软膜完全覆盖在所述培养芯片本体上，通过可拆卸的固定装置将所述生物培养微流控芯片侧面固定，在软膜与培养芯片接口层间形成密封，所述生物培养微流控芯片固定在微重力回转仪的固定位上。
2.根据权利要求1所述的生物培养微流控芯片，其特征在于，所述软膜为聚二甲基硅氧烷PDMS、聚乙烯PE、聚氯乙烯PVC、聚偏二氯乙烯PVDC。
3.根据权利要求1所述的生物培养微流控芯片，其特征在于，所述培养芯片本体包括接口层、培养层和基底层，所述培养层的培养腔室深宽比为0.003～1，完全交汇时细胞数：所需的培养基＝1.4x106：0.625～1.4x106：6.25；所述接口层设有若干通孔，通孔位置与培养腔室对应。
4.根据权利要求1所述的生物培养微流控芯片，其特征在于，所述培养芯片本体包括接口层、培养层和基底层，所述培养层设有若干培养腔室，每一培养腔室均设有进液通道和出液通道，培养腔室的深宽比为0.003～1，完全交汇时贴壁细胞数量：所需的培养基＝1.4x106：0.625～1.4x106：6.25。所述接口层设有若干通孔，通孔位置与培养腔室的进液通道和出液通道对应。
5.根据权利要求1所述的生物培养微流控芯片，其特征在于，所述培养芯片本体从下往上依次包括基底层、培养层和接口层，所述培养层水平方向依次设有储液腔室、培养腔室以及废液腔室，在储液腔室、培养腔室之间设有第一多孔膜，在培养腔室、废液腔室之间设有第二多孔膜，在所述第二多孔膜下游设有片上单向阀，在废液腔室与储液腔室之间设有通道，通道进口及出口处分别设有多孔疏水膜，所述接口层设有若干通孔，通孔位置分别对应储液腔室、培养腔室、废液腔室以及片上单向阀内。
6.根据权利要求5所述的生物培养微流控芯片，其特征在于，所述第一多孔膜、第二多孔膜为亲/疏水复合膜，在聚对苯二甲酸乙二醇酯PET膜的一面进行亲水性表面改性处理。
7.根据权利要求3-5任一项所述的生物培养微流控芯片，其特征在于，基底层为玻璃、聚苯乙烯PS、聚碳酸酯或聚对苯二甲酸乙二醇酯PET。
8.根据权利要求3-5任一项所述的生物培养微流控芯片，其特征在于，接口层、培养层材质为聚二甲基硅氧烷PDMS。
9.根据权利要求3-5任一项所述的生物培养微流控芯片，其特征在于，接口层、培养层材质为聚甲基丙烯酸甲酯PMMA。
10.一种利用根据权利要求8中任意项所述的生物培养微流控芯片进行细胞培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，将微流控芯片本体和软膜消毒；
步骤2，将非贴壁细胞离心，并用培养基进行细胞重悬，制备种子液；
步骤3，通过微流控芯片本体接口层的通孔向培养腔室细胞接种，培养腔室加满种子液；
步骤4，将生物培养微流控芯片的下固定板、培养芯片本体、软膜、上固定板由下至上依次装配，侧面固定；
步骤5，将生物培养微流控芯片固定在微重力回转仪的固定位上。
11.根据权利要求10所述的细胞培养的方法，其特征在于，步骤2中将贴壁细胞用胰蛋白酶消化成细胞悬液后离心，制备为种子液；
步骤4和步骤5之间还需要细胞静置培养、贴壁的步骤。
12.一种利用根据权利要求9中任意项所述的生物培养微流控芯片进行细胞培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，将微流控芯片本体和软膜消毒；
步骤2，将非贴壁细胞离心，向培养基中加入HEPES作为pH缓冲剂，并用培养基进行细胞重悬，制备种子液；
步骤3，通过微流控芯片本体接口层的通孔向培养腔室细胞接种，培养腔室加满种子液；
步骤4，将生物培养微流控芯片的下固定板、培养芯片本体、软膜、上固定板由下至上依次装配，侧面固定；
步骤5，将生物培养微流控芯片固定在微重力回转仪的固定位上。
CN202110649283.2A 2021-06-08 2021-06-08 一种适用微重力回转仪装配的生物培养微流控芯片及其细胞培养方法 Active CN113388517B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110649283.2A CN113388517B (zh) 2021-06-08 2021-06-08 一种适用微重力回转仪装配的生物培养微流控芯片及其细胞培养方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110649283.2A CN113388517B (zh) 2021-06-08 2021-06-08 一种适用微重力回转仪装配的生物培养微流控芯片及其细胞培养方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113388517A true CN113388517A (zh) 2021-09-14
CN113388517B CN113388517B (zh) 2022-10-25

Family

ID=77620317

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110649283.2A Active CN113388517B (zh) 2021-06-08 2021-06-08 一种适用微重力回转仪装配的生物培养微流控芯片及其细胞培养方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113388517B (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112608848A (zh) * 2020-12-17 2021-04-06 清华大学 一种太空环境的细胞悬浮培养微流控装置
CN113926498A (zh) * 2021-11-04 2022-01-14 田甜 一种可促进类脑器官成熟的层流低剪切力微流控芯片的制备方法
CN115267880A (zh) * 2022-06-14 2022-11-01 大连海事大学 一种用于道尔期线虫空间辐射暴露的样品盒
CN115430472A (zh) * 2022-10-10 2022-12-06 中国科学院力学研究所 模拟微重力平台的微流控芯片及其批量法生产大分子药物结晶的方法
CN116064236A (zh) * 2023-04-06 2023-05-05 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种多通道微流控芯片及应用

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN201793576U (zh) * 2010-08-19 2011-04-13 西北工业大学 一种新型细胞培养装置
CN102329729A (zh) * 2011-10-08 2012-01-25 中国科学院力学研究所 一种用于悬浮细胞微重力效应模拟的培养系统
CN103667054A (zh) * 2013-09-18 2014-03-26 中国航天员科研训练中心 一种集成化微流控细胞培养芯片及其制备方法
CN103667057A (zh) * 2013-12-30 2014-03-26 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 基于微流控芯片的细胞受创后细胞迁移生物学行为的监控方法
CN105754855A (zh) * 2016-04-12 2016-07-13 中国航天员科研训练中心 一种流加式两层细胞共培养器官芯片
CN106544270A (zh) * 2016-12-06 2017-03-29 北京理工大学 一种用于细胞共培养的微流控芯片及其细胞培养方法
CN107702967A (zh) * 2017-10-17 2018-02-16 西北工业大学 一种基于微流控芯片的空间站用细胞样本自动预处理装置
US20200215538A1 (en) * 2019-01-04 2020-07-09 National Tsing Hua University Self-driven microfluidic chip for rapid influenza a detection
CN112457985A (zh) * 2020-12-16 2021-03-09 北京理工亘舒科技有限公司 一种灌流培养芯片及灌流系统
CN112481077A (zh) * 2020-12-01 2021-03-12 北京理工大学 一种微流控灌流培养装置及其灌流方法

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN201793576U (zh) * 2010-08-19 2011-04-13 西北工业大学 一种新型细胞培养装置
CN102329729A (zh) * 2011-10-08 2012-01-25 中国科学院力学研究所 一种用于悬浮细胞微重力效应模拟的培养系统
CN103667054A (zh) * 2013-09-18 2014-03-26 中国航天员科研训练中心 一种集成化微流控细胞培养芯片及其制备方法
CN103667057A (zh) * 2013-12-30 2014-03-26 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 基于微流控芯片的细胞受创后细胞迁移生物学行为的监控方法
CN105754855A (zh) * 2016-04-12 2016-07-13 中国航天员科研训练中心 一种流加式两层细胞共培养器官芯片
CN106544270A (zh) * 2016-12-06 2017-03-29 北京理工大学 一种用于细胞共培养的微流控芯片及其细胞培养方法
CN107702967A (zh) * 2017-10-17 2018-02-16 西北工业大学 一种基于微流控芯片的空间站用细胞样本自动预处理装置
US20200215538A1 (en) * 2019-01-04 2020-07-09 National Tsing Hua University Self-driven microfluidic chip for rapid influenza a detection
TW202026432A (zh) * 2019-01-04 2020-07-16 國立清華大學 用於a型流感快篩之自驅動微流體晶片
CN112481077A (zh) * 2020-12-01 2021-03-12 北京理工大学 一种微流控灌流培养装置及其灌流方法
CN112457985A (zh) * 2020-12-16 2021-03-09 北京理工亘舒科技有限公司 一种灌流培养芯片及灌流系统

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YU CHEN等: "Design and surface modification of a microfluidic chip for intercellular interactions research during space flight", 《ACTA ASTRONAUTICA》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112608848A (zh) * 2020-12-17 2021-04-06 清华大学 一种太空环境的细胞悬浮培养微流控装置
CN112608848B (zh) * 2020-12-17 2022-09-09 清华大学 一种适用于太空环境的细胞悬浮培养单元
CN113926498A (zh) * 2021-11-04 2022-01-14 田甜 一种可促进类脑器官成熟的层流低剪切力微流控芯片的制备方法
CN113926498B (zh) * 2021-11-04 2022-11-29 田甜 一种可促进类脑器官成熟的层流低剪切力微流控芯片的制备方法
CN115267880A (zh) * 2022-06-14 2022-11-01 大连海事大学 一种用于道尔期线虫空间辐射暴露的样品盒
CN115430472A (zh) * 2022-10-10 2022-12-06 中国科学院力学研究所 模拟微重力平台的微流控芯片及其批量法生产大分子药物结晶的方法
CN116064236A (zh) * 2023-04-06 2023-05-05 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种多通道微流控芯片及应用
CN116064236B (zh) * 2023-04-06 2023-06-20 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种多通道微流控芯片及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113388517B (zh) 2022-10-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113388517B (zh) 一种适用微重力回转仪装配的生物培养微流控芯片及其细胞培养方法
CN103805511B (zh) 可在高倍物镜下直接观测的动脉血管模拟微流控装置
CN112481077B (zh) 一种微流控灌流培养装置及其灌流方法
RU2612904C1 (ru) Способ и микрофлюидный чип для культивирования клеток или клеточной модели
US20070036690A1 (en) Inlet channel volume in a reactor
CN108277198A (zh) 一种实现二维、三维交叉共培养的肝脏微流控芯片及其应用
CN112608841A (zh) 一种肿瘤类器官培养和药物实验的微流控系统及使用方法
CN109456890A (zh) 一种分层带状共培养4种肝细胞的微流控芯片及其应用
CN107904168B (zh) 一种研究细胞趋化的微流控芯片和方法
CN103146574A (zh) 一种高通量微流控生物力学长期刺激系统及其应用
CN108641931A (zh) 一种数字化微阵列器官芯片及其应用
CN106929417A (zh) 一种基于叶脉网眼结构仿生的多层细胞培养微器件
CN114231414A (zh) 一种基于微流控技术构建的骨组织仿生芯片及其应用
CN103146573B (zh) 一种动脉血管模拟微流控装置及其应用
CN201321462Y (zh) 新型超滤膜细胞培养器
CN101586077A (zh) 新型超滤膜细胞培养器及其制造方法
CN113862151B (zh) 一种用于细胞共培养的微流控芯片装置及一种细胞共培养方法
Weyand et al. Fluid dynamics in bioreactor design: considerations for the theoretical and practical approach
CN212077076U (zh) 一种微流控实验板
US20230183625A1 (en) Apparatus and method for cell cultivation
CN114849801A (zh) 通量化体外细胞、组织、器官培养和分析的微流控装置
CN103992948B (zh) 一种用于细胞迁移研究的微纳流控器件
CN113528334A (zh) 一种微流控实验板及细胞培养方法
CN219861382U (zh) 一种自重力高通量膜式芯片
CN115287189B (zh) 一种用于细胞球快速制备的微流控芯片及细胞球制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant