CN112608848A - 一种太空环境的细胞悬浮培养微流控装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种基于太空环境的细胞悬浮培养单元，所述细胞悬浮培养单元包括培养室和分别与所述培养室连通的且分别独立设置的进液口和出液口，其中，培养单元腔体被胶原蛋白包被成电荷中性，防止细胞贴壁，所述培养室被培养基完全充满以形成全封闭结构，只留进液口和出液口，进液口可以在灌注细胞悬液至培养室后，在上游切换为新鲜培养基进行换液，并且在出液口设计了微柱阵列来阻止换液时细胞漏出，另外在换液后在进液口的上游和出液口的下游通过阀门控制开关，确保换液后培养室的封闭性。

Description

一种太空环境的细胞悬浮培养微流控装置

技术领域

本发明涉及细胞工程技术领域，尤其涉及一种太空环境的细胞悬浮培养微流控装置。

背景技术

动物细胞培养是一种始于20世纪初，目前被生物和医学等领域广泛采用的方法。常用的动物细胞培养分为批次培养、补料批次培养、灌流培养等。其中灌流培养能使培养过程中的培养基不断被更新，及时满足细胞对营养的需求，同时能移除乳酸、铵离子等有害代谢产物。

细胞悬浮培养是一种在液体培养基里，培养单细胞及小细胞团的组织培养系统，是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式。悬浮细胞生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态。悬浮培养一般应用于淋巴细胞或血液系统来源的细胞和部分植物细胞的培养，除此之外，还包括类器官和干细胞(正常干细胞和肿瘤干细胞)的培养，由于干细胞贴壁生长会促使其分化，而悬浮培养可以使得干细胞在特殊的培养基中维持其自我更新的能力。细胞悬浮培养在细胞生物学研究和细胞工业化生产中都是非常重要的。

研究表明空间微重力会对细胞的增殖、分化和基因表达产生影响，如微重力可以加速内皮前体细胞向血管细胞分化，会促使造血干细胞像中性粒细胞分化，也会增强间充质干细胞的增殖与分化。也有研究表明微重力会降低非小细胞肺癌干细胞的干性并促使其凋亡，这对于彻底治愈癌症具有重要的意义，但关于微重力对肿瘤干细胞的研究很少，且已有的研究也仅仅停留在微重力模拟实验，很难严格意义模拟空间的微重力环境。随着微卫星的快速发展，可以为空间生物学研究提供便捷又经济的研究平台，因此设计发明基于微小卫星的细胞悬浮培养装置具有重大的研究意义和商业价值。

中国专利申请CN108715809A公开了一种培养瓶及辅助装置。该培养瓶包括培养瓶体和与其配合的辅助运转装置，细胞培养瓶包括连接培养瓶各环的端盖，端盖上开有通气孔；两侧端盖上设置有螺纹接头，端盖内部含有灌流通道，可将细胞液用注射器通过螺纹接头注入灌流通道，沿瓶体灌流通道经支流通道输送至培养室。细胞培养瓶辅助装置包括机架、机架上的传动固定机构，传动固定结构包括限位支架，限位轮与机架共同限制太空微重力环境细胞培养瓶的位置，并通过计算机与中央控制器对微电机经皮带，驱动转轮进行转速控制驱动细胞培养瓶旋转。

该专利采用瓶体和机架的设计，培养体积大，且主要用于产业化，不适宜在微小卫星上和太空微重力环境下研发工作。空间环境属于低重力或失重的状态，液体不会正常处于培养室的低位，液滴会悬浮在空间中，上述设计也无法确保细胞的正常培养环境。

发明内容

针对现有技术之不足，本发明提供一种细胞悬浮培养单元，具体是一种尤其适用于太空环境的细胞悬浮培养微流控装置，包括培养室和分别与所述培养室连通的且分别独立设置的进液口和出液口。其中，所述培养室被培养基完全充满以形成全封闭结构。

根据一种优选的实施方式，所述出液口设置有细胞截留微柱阵列以阻止所述培养室内的细胞随废液排出。

根据一种优选的实施方式，所述细胞截留微柱阵列的微柱间距为5μm。

根据一种优选的实施方式，所述培养室的内壁被胶原蛋白包被。

根据一种优选的实施方式，被胶原蛋白包被后的所述培养室的内壁呈电荷中性。

根据一种优选的实施方式，胶原蛋白包被后的所述培养室的内壁呈亲水性。

根据一种优选的实施方式，所述培养室由聚二甲基硅氧烷制成。

根据一种优选的实施方式，所述培养基进液口的上游可切换地与细胞悬液、新鲜培养基存储包和添加药物的培养基存储包连通。

根据一种优选的实施方式，进液口设置有过滤膜以缓冲培养基的进液速度从而减小培养液剪切力对细胞的损伤。

根据一种优选的实施方式，所述过滤膜的孔径为0.22μm。

本发明的有益技术效果包括以下一项或多项：

本发明的细胞悬浮培养单元采用全封闭设计，确保细胞培养时培养基充满培养室。空间环境属于低重力或失重的状态，液体不会正常处于培养室的低位，液滴会悬浮在空间。为了确保细胞的正常培养环境，本发明将液体培养单元全封闭设计，并使培养基充满培养室，只留进液口和出液口，进液口可以在灌注细胞悬液至培养室后，在上游切换为新鲜培养基进行换液，并且在出液的管路上设计了微柱阵列，确保换液后培养室的封闭性。

另外，出液口设置了微柱直径为50μm，间距为5μm的细胞截留微柱阵列。细胞截留微柱阵列的5μm间距的设计，主要为了阻止细胞(真核细胞直径一般为10μm左右)随废液排出，造成实验失败。

除此之外，为了确保细胞能在芯片中顺利悬浮培养，本发明对液体培养单元内壁进行胶原蛋白包被。已有的微流控芯片制作的材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料，虽然生物相容性好，但是材料疏水，粘附性强，尤其会造成干细胞的贴壁与分化，不利于干细胞的增殖与干性的维持。所以采用亲水性的胶原蛋白包被培养室的内壁，可以提供中性电荷、亲水性和软性的培养界面，有助于干细胞的生长增殖和干性的维持。

附图说明

图1是本发明的细胞悬浮培养单元的结构示意图；

图2是本发明的一种优选的细胞悬浮培养单元的俯视状态结构示意图；

图3是本发明的另一种优选的细胞悬浮培养单元的俯视状态结构示意图。

附图标记列表

100：细胞悬浮培养单元 101：培养室 102：进液口

103：出液口 104：微柱阵列 105：过滤膜

具体实施方式

下面结合附图1至3进行详细说明。

本发明提供一种细胞悬浮培养单元100，具体是一种尤其适用于太空环境的细胞悬浮培养微流控装置。如图1所示，细胞悬浮培养单元100包括培养室101和分别与培养室101连通的且分别独立设置的进液口102和出液口103。其中，培养室101被培养基完全充满以形成全封闭结构。空间环境属于低重力或失重的状态，液体不会正常处于培养室101的低位，液滴会悬浮在空间。为了确保干细胞的正常培养环境，细胞悬浮培养单元100被设计培养基充满培养室101的全封闭结构，只留进液口102和出液口103。

更优选的，进液口可以在灌注细胞悬液至培养室后，在上游切换为新鲜培养基进行换液，出液的管路设置有细胞截留微柱阵列，以确保换液过程中培养室101的封闭性。

微流控(Microfluidics)指的是使用微管道(尺寸为数十到数百微米)处理或操纵微小流体(体积为纳升到阿升)的系统所涉及的科学和技术，是一门涉及化学、流体物理、微电子、新材料、生物学和生物医学工程的交叉学科。因为具有微型化、集成化等特征，微流控装置通常被称为微流控芯片。微流控的重要特征之一是微尺度环境下具有独特的流体性质，如层流和液滴等。借助这些独特的流体现象，微流控可以实现一系列常规方法所难以完成的微加工和微操作。微流控被认为在生物医学研究中具有巨大的发展潜力和广泛的应用前景。

在太空中的微重力环境下，微流控装置在地球地面环境中的原有的独特的流体性质如层流或液滴等将会发生显著的变化，这些变化对于液体培养基中的细胞、尤其是肿瘤干细胞的生长增殖和干性维持的作用是急需研究的问题。本发明通过设计仅包含进液口102和出液口103，且被培养基完全填充以形成全封闭结构的细胞悬浮培养单元100，能够防止培养室101中的液体培养基在微重力环境下形成悬浮液滴，导致细胞无法正常生长。进液口102上游、出液口103下游分别设置有独立控制的阀门，在换液时，能够通过进液口102、出液口103的阀门的配合和进液流量和出液流量的控制保持培养室101的封闭性。

优选的，本发明的细胞悬浮培养单元100尤其适用于进行肿瘤干细胞的增殖和耐药性实验。肿瘤干细胞是肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞。人体肿瘤干细胞一般具有约10μm的直径。肿瘤干细胞对肿瘤的发生、增殖、转移及复发有着重要作用。从本质上讲，肿瘤干细胞通过自我更新和无限增殖维持着肿瘤细胞群的生命力；肿瘤干细胞的运动和迁徙能力又使肿瘤细胞的转移成为可能；肿瘤干细胞可以长时间处于休眠状态并具有多种耐药分子而对杀伤肿瘤细胞的外界理化因素不敏感。

优选的，根据另一种实施方式，如图3所示，进液口102设置有过滤膜105以缓冲培养基的进液速度从而减小培养液剪切力对细胞的损伤，同时阻止培养室101内的细胞返流回培养基的进液管道。流体剪切力对于细胞的形态和生长具有一定影响。过大的剪切力可能造成细胞的损伤。优选的，进液口102的过滤膜105能够缓冲培养基的进液速度。根据一种优选的实施方式，培养基进液口102设置有孔径在0.1μm至2.0μm范围内的不同孔径的过滤膜105，过滤膜105可进行切换。通过进液速度和过滤膜105孔径的协同调整配合观察形成的不同流体剪切力对培养室101中的肿瘤干细胞的生长增殖的影响。

优选的，过滤膜105的孔径为0.22μm。通过该方式，不仅可以缓冲进液的速度，减少培养液剪切力对细胞的损伤，还可以对培养基起到过滤及除菌的作用，阻止培养单元的细胞返流回进液管道。

根据一种具体的实施方式，过滤膜105设置在多个细胞悬浮培养单元的进液口的上游，即，多个细胞悬浮培养单元共用相同的过滤膜105。根据另一种具体的实施方式，每个细胞悬浮培养单元分别设置单独的过滤膜105。通过这种设置方式，不仅能够减小培养液剪切力对细胞的损伤，同时还嫩巩固阻止培养室101内的细胞返流回培养基的进液管道。

优选的，出液口103设置有细胞截留微柱阵列104以阻止培养室内的细胞随废液排出。优选的，细胞截留微柱阵列104是通过微柱间距控制，保证离开培养室101的细胞随出液通道漏出。根据一种具体的实施方式，细胞截留微柱阵列104的微柱直径为50μm，间距为5μm。

优选的，培养室101由聚二甲基硅氧烷制成。聚二甲基硅氧烷是一种疏水类的有机硅物料。聚二甲基硅氧烷(PDMS)具有较高的光学透明度和较好的生物相容性，无毒，微复制能力强。优选的，被胶原蛋白包被后的培养室101的内壁呈电荷中性。优选的，胶原蛋白包被后的培养室101的内壁呈亲水性。已有的微流控芯片制作的材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料，虽然生物相容性好，但是材料疏水，粘附性强，会造成干细胞的贴壁与分化，不利于干细胞的增殖与干性的维持。所以采用亲水性的胶原蛋白包被培养单元，不仅可以提供中性电荷、亲水性和软性的培养界面，有助于干细胞的生长增殖和干性的维持。

优选的，培养室101的内壁被胶原蛋白包被。优选的，采用重组人IV型胶原蛋白α3或Ⅰ型鼠尾胶原蛋白包被培养室101的内壁。

优选的，培养室101、进液口102和出液口103可以由光刻技术和铸模工艺加工制成。光刻技术是指在光照作用下，借助光致抗蚀剂将掩膜上的图形转移到基片上的技术，可在基片上形成尺度范围从nm到mm级别的微结构。通过光刻技术在基片上加工培养室101、进液口102和出液口103的凸模结构，再通过浇铸PDMS材料即可形成含有培养室101、进液口102和出液口103的PDMS微芯片单元。培养室101包被胶原蛋白后，通过将微芯片单元和玻璃底板键合，即可形成密封的细胞悬浮培养单元100。

优选的，进液口102的上游可切换地与细胞悬液、新鲜培养基存储包和添加药物的培养基存储包连通。

优选地，培养室101由聚二甲基硅氧烷沟道片和玻璃盖片围成。优选的，本发明公开一种细胞悬浮培养单元，所述细胞悬浮培养单元包括由聚二甲基硅氧烷沟道片和玻璃盖片围成的培养室101，使细胞和培养基混合液或者培养基能够在压力、表面张力和毛细力共同作用下以第一速度进入培养室的进液口102，使细胞代谢废物能够在细胞截留微柱阵列的粘性力和表面张力的阻滞作用下通过扩散方式以小于第一速度的第二速度排出培养室101，维持细胞培养过程中培养室内pH处于7.2至7.5范围内并防止培养细胞排出培养室的出液口103。其中，在不存在外加压力和负压吸力的情况下，第一速度大于第二速度，优选的，第一速度是第二速度的两倍以上。优选的，第一速度为0.5μL/min，第二速度小于等于0.3μL/min。优选的，在出液口一侧设置直径50μm，间距5μm的细胞截留微柱阵列，而在进液口102未设置细胞截留微柱阵列。根据另一种实施方式，在进液口102设置一排间距为50～100μm的微柱阵列以减小输入的培养基的剪切力，避免对细胞造成伤害。在进液口和出液口均设置有微柱阵列的情况下，进液口一侧的微柱间距大于出液口一侧的微柱间距。优选的，第二速度能够通过调节细胞截留微柱阵列的直径和间距被相应地调节，并相应地调节细胞代谢废物扩散排出培养室的速度和培养室内所维持的pH值。优选的，细胞培养过程中，培养室内的培养基中的细胞代谢废物乳酸的浓度在0.6至0.8mmol/L的范围内。

优选的，进液口上游设置有第一蠕动泵，出液口的下游设置有第二蠕动泵。第一蠕动泵和第二蠕动泵按照以下方式设置，即第一蠕动泵以第一功率工作，第二蠕动泵以第二功率工作，第一功率小于第二功率，第一功率和第二功率具有功率差以克服细胞截留微柱阵列的粘性力和表面张力的阻滞作用，使得第一速度和第二速度大致相等，并可通过调节第一功率和第二功率的相对大小并与细胞截留微柱阵列的参数，例如直径和间距相配合，调控新鲜培养基的进液速度和细胞培养代谢废物的排出速度，维持培养室内的细胞培养环境稳定，提高空间中三维细胞培养的成功率。

根据一种具体实施方式，第一功率和第二功率固定设置为第一功率是第二功率的50％至70％。根据另一种具体实施方式，第一蠕动泵和第二蠕动泵能够根据地面站的遥控设置第一功率和第二功率，地面站实验人员能够根据实时观测到的细胞生长情况调控第一功率和第二功率。

相比于传统的贴壁培养方法，本发明考虑到空间中的失重或微重力环境，提出了一种适用于微卫星的空间中的全自动的细胞三维培养方法和装置，实现空间中的无需人工操作的细胞的悬浮培养。本发明的细胞悬浮培养单元，将培养液注入、细胞培养和废液排出功能集为一体，实现空间细胞培养的全自动或遥控控制，无需人工操作。利用细胞截留微柱阵列、第一蠕动泵和第二蠕动泵维持培养室内培养环境的稳定，保证新鲜培养基的注入、代谢废物及时排出和培养室内pH值保持在适宜细胞培养的范围内，还利用过滤膜105防止剪切力对细胞的破坏，提高细胞培养的成功率。

需要注意的是，上述具体实施例是示例性的，本领域技术人员可以在本发明公开内容的启发下想出各种解决方案，而这些解决方案也都属于本发明的公开范围并落入本发明的保护范围之内。本领域技术人员应该明白，本发明说明书及其附图均为说明性而并非构成对权利要求的限制。本发明的保护范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种细胞悬浮培养单元(100)，其特征在于，所述细胞悬浮培养单元(100)包括培养室(101)和分别与所述培养室(101)连通的且分别独立设置的细胞进液口(102)和出液口(103)，其中，所述培养室(101)被培养基完全充满以形成全封闭结构。

2.如权利要求1所述的细胞悬浮培养单元(100)，其特征在于，所述出液口(103)设置有细胞截留微柱阵列(104)以阻止所述培养室(101)内的细胞随废液排出。

3.如权利要求2所述的细胞悬浮培养单元(100)，其特征在于，所述细胞截留微柱阵列(104)的微柱直径为50μm，间距为5μm。

4.如权利要求3所述的细胞悬浮培养单元(100)，其特征在于，所述培养室(101)的内壁被胶原蛋白包被。

5.如权利要求4所述的细胞悬浮培养单元(100)，其特征在于，被胶原蛋白包被后的所述培养室(101)的内壁呈电荷中性。

6.如权利要求5所述的细胞悬浮培养单元(100)，其特征在于，胶原蛋白包被后的所述培养室(101)的内壁呈亲水性。

7.如权利要求6所述的细胞悬浮培养单元(100)，其特征在于，所述培养室(101)、进液口(102)和出液口(103)由聚二甲基硅氧烷制成。

8.如权利要求7所述的细胞悬浮培养单元(100)，其特征在于，所述进液口(102)的上游可切换地与细胞悬液、新鲜培养基存储包和添加药物的培养基存储包连通。

9.如权利要求8所述的细胞悬浮培养单元(100)，其特征在于，进液口(102)设置有过滤膜(105)以缓冲培养基的进液速度从而减小培养液剪切力对细胞的损伤。

10.如权利要求9所述的细胞悬浮培养单元(100)，其特征在于，所述过滤膜(105)的孔径为0.22μm。

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