CN108977359A - 一种用于细胞培养及模拟运动后脉动剪切力环境的微流控芯片及检测方法 - Google Patents

Abstract

一种用于细胞培养及模拟运动后脉动剪切力环境的微流控芯片及检测方法，属于细胞生物力学实验装置技术领域。该微流控芯片包括：细胞培养系统，剪切力波形生成系统以及剪切力波形检测系统三部分。细胞培养系统由细胞培养腔室、细胞悬浮液出入口和微通道构成；剪切力波形生成系统由细胞培养腔室、细胞培养液出入口、弹性腔室、阻力通道和微通道构成；通过调节细胞培养液入口的流量输入波形以及改变后阻力通道的尺寸，在细胞培养腔室内实现静息以及运动后剪切力波形的加载；剪切力波形检测系统由细胞培养腔室两侧的压力检测微通道构成，通过显微镜记录压力检测通道内的液柱变化，进而通过细胞培养腔室两侧的压力值计算细胞培养腔室内的剪切力波形。

Description

一种用于细胞培养及模拟运动后脉动剪切力环境的微流控芯 片及检测方法

技术领域

本发明属于细胞生物力学实验装置技术领域，是基于血液动力学原理及微流控芯片技术，用于研究运动诱发的剪切力信号对血管内皮细胞形态和功能的影响及其分子生物学机制的实验装置，具体为一种用于细胞培养及模拟运动后脉动剪切力环境的微流控芯片及检测方法。

背景技术

血管内皮细胞位于血管壁的最内层，内侧与流动的血液直接接触，外侧与平滑肌细胞相邻。血管内皮细胞不仅是血液与血管组织之间的选择性物理屏障，它还能够通过细胞膜表面的感受器及受体，如多糖-蛋白复合物、酪氨酸蛋白激酶、G蛋白耦联受体及离子通道等识别脉动血流所产生的壁面剪切力作用，并通过一系列的信号级联反应将该剪切力信号传递到细胞内部引起细胞形态结构及功能的变化，进而影响血管的紧张性和渗透性，调节凝血系统功能以及介导机体的免疫炎症反应。

合理的运动训练被称为预防和改善心血管系统疾病的“良药”。一系列的在体研究表明，规律且适度的运动训练能够通过增加舒血管因子一氧化氮(NO)、前列环素(PGI₂)等的产生，降低缩血管因子内皮素(ET-1)、血管紧张素II(AngII)以及活性氧类(ROS)等的生成起到抗炎、抗氧化应激以及抗动脉粥样硬化的作用。在上述的在体研究中，研究者们普遍认为运动训练所诱发的前、后向幅值加大以及频率增加的脉动血流剪切力是运动改善血管内皮功能最为重要的介导因素。

离体构建不同频率及幅值的脉动流剪切力生成装置是研究运动引起的血流剪切力对血管内皮功能影响的必要前提。在以往的研究中，主要借助于平行平板流动腔、圆锥板流动腔及其外围装置来模拟血流剪切力环境并进一步研究流体剪切力作用下血管内皮细胞的生物学行为及其机制，但由于其细胞培养腔室或者培养板较大，因此造成细胞及试剂的消耗量大，实验成本高。近些年发展起来的微流控技术，以其微型化，低的样品及试剂消耗量，以及更加接近在体细胞生长环境的优点被广泛应用于细胞力学生物学研究领域。然而，目前利用微流控芯片技术所模拟的运动后剪切力波形主要为定常流剪切力，而大量的离体实验证实血管内皮细胞对于定常流以及脉动流所产生的生物学响应明显不同。因此，需要离体构建一种能够较精确模拟运动后脉动流剪切力环境的微流控芯片。

发明内容

本发明的设计目的在于提供一种用于细胞培养及离体模拟运动后血流剪切力环境的微流控芯片及检测方法，可用于研究运动引起的血流剪切力对血管内皮细胞形态、结构及功能的影响及机制。该发明将血液动力学原理和方法与微流控芯片技术巧妙结合，将细胞悬浮液出入口及通道、细胞培养液出入口及通道、细胞培养腔室、弹性腔室、后阻力通道以及压力检测微通道集成在一块玻璃-PDMS功能芯片上。通过细胞悬液出入口通道结构的优化设计实现细胞培养腔室内细胞的均匀、完全分布，通过设定注射泵的流体输入波形、弹性腔的大小以及后阻力通道的长度来实现细胞培养腔室底部加载运动所引起的前、后向幅值加大以及频率增加的血流剪切力波形。

本发明的技术方案如下：

一种用于细胞培养及模拟运动后脉动剪切力环境的微流控芯片，该微流控芯片包括细胞培养系统A、剪切力波形生成系统B和剪切力波形检测系统C；

细胞培养系统A主要由细胞培养腔室1-3、细胞悬浮液入口1-1、细胞悬浮液出口1-2和微通道构成；从细胞培养腔室1-3的上下两侧均匀引出m个微通道，m≥3，上侧的微通道与下侧的微通道对称布置；上侧的微通道出口汇集并与细胞悬浮液入口1-1相连，下侧的微通道出口汇集并与细胞悬浮液出口1-2相连；

剪切力波形生成系统B主要由细胞培养腔室1-3、细胞培养液入口2-1、第一弹性腔室2-2、第二弹性腔室2-4、第一阻力通道2-5、第二阻力通道2-6、第一细胞培养液出口2-7、第二细胞培养液出口2-8和微通道构成；细胞培养腔室1-3的左侧通过微通道与第一弹性腔室2-2的入口端相连，第一弹性腔室2-2的出口端连接细胞培养液入口2-1；细胞培养腔室1-3的右侧通过微通道与第二弹性腔室2-4的入口端相连，第二弹性腔室2-4的出口端通过微通道依次与第一阻力通道2-5、第二阻力通道2-6相连，第一阻力通道2-5与第二阻力通道2-6之间的微通道上引出第一细胞培养液出口2-7，第二阻力通道2-6与第二细胞培养液出口2-8相通；第二弹性腔室2-4的体积大于第一弹性腔室2-2的体积，故第二弹性腔室2-4的顺应性要大于第一弹性腔室2-2的顺应性；

剪切力波形检测系统C主要由第一压力检测微通道3-1和第二压力检测微通道3-2构成；第一压力检测微通道3-1和第二压力检测微通道3-2的一端分别从紧靠细胞培养腔室1-3左右两端的微通道上引出，另一端封闭，用于检测细胞培养腔室1-3两侧的压力。

所述第一弹性腔室2-2和第二弹性腔室2-4的体积，第一阻力通道2-5和第二阻力通道2-6的长度均根据所需形成的剪切力波形确定。

一种用于细胞培养及模拟运动后脉动剪切力环境的检测方法，步骤如下：

步骤一：打开微流控芯片的所有入口和出口，从细胞培养液入口2-1注入细胞培养液，待整个微流控芯片内充满细胞培养液后，关闭细胞培养液入口2-1、第一细胞培养液出口2-7和第二细胞培养液出口2-8；

步骤二：从细胞悬浮液入口1-1注入细胞悬浮液，确保细胞培养腔室1-3内的细胞均匀、完全分布；当细胞培养腔室1-3底部的细胞达到融合时，关闭细胞悬浮液入口1-1和细胞悬浮液出口1-2；

步骤三：打开细胞培养液入口2-1，并打开第一细胞培养液出口2-7或第二细胞培养液出口2-8，再次从细胞培养液入口2-1注入细胞培养液；

当细胞培养液流入微流控芯片时，一部分流入到第一弹性腔室2-2和第二弹性腔室2-4中，另外的一部分经过细胞培养腔室1-3、第一阻力通道2-5、第一细胞培养液出口2-7流出，或者经过细胞培养腔室1-3、第一阻力通道2-5、第二阻力通道2-6、第二细胞培养液出口2-8流出，此时细胞培养腔室内表现为前向流；

当停止注入时，在一段时间内微流控芯片里的液体会继续保持前向流动，由于第二弹性腔室2-4的顺应性大于第一弹性腔室2-2的顺应性，所以当第二弹性腔室2-4中的空气压力大于通道内的压力时，一部分的液体会由第二弹性腔室2-4流入到第一弹性腔室2-2中，此时在细胞培养腔室内会产生后向流；因此，通过调节细胞培养液注入流量、选择不同的细胞培养液出口或者改变阻力通道的尺寸、以及改变两个弹性腔室的尺寸，来控制细胞培养腔室内产生静息或者不同运动强度所引起的前、后向幅值以及频率改变的脉动血流剪切力；

进一步的，微流控芯片内的各个腔室及通道尺寸设定依据如下：

将微流控芯片内各个腔室及通道等效成电路回路，该回路中的各个参数满足如下的方程：

其中，C₁、C₂分别为第一弹性腔室2-2、第二弹性腔室2-4的顺应性，L为微流控芯片内从第一弹性腔室2-2右侧出口到细胞培养腔室1-3左侧出口之间微通道的流感，R为第一细胞培养液出口2-7打开时第一阻力通道2-5的阻力或者为第二细胞培养液出口2-8打开时第一阻力通道2-5及第二阻力通道2-6的阻力之和，R_f为细胞培养腔室的阻力，q_in为流入微流控芯片的总体积流量率，q_f为通过细胞培养腔室的体积流量率，P_A、P_B分别为细胞培养腔室两侧的压力；

第一弹性腔室2-2及第二弹性腔室2-4的顺应性均通过公式(2)计算：

其中，V为弹性腔室内气体体积，P为弹性腔室内气体压力；A为弹性腔室的内截面积，H为弹性腔室内空气柱的长度，P_a为大气压力，P₀为作用于弹性腔室内空气柱的液压；n为多方指数，此处n＝1；

微流控芯片内微通道的流感L的计算公式如下：

其中，ρ为培养液的密度，l’为从第一弹性腔室2-2右侧出口到细胞培养腔室1-3左侧入口之间微通道的长度，A’为此段微通道的内截面积；

阻力通道为矩形的狭窄微通道，其阻力R的计算公式如下：

其中，η为细胞灌流培养液的粘度，l为阻力通道的长度，b为阻力通道的宽度，h为阻力通道的高度；

步骤四：通过两个压力检测微通道的压力差计算得到模拟运动后脉动的剪切力；

(1)两个压力检测微通道的压力均由式(5)计算获得：

P＝P_g-P_capillary (5)

其中，P为细胞培养腔室左侧的压力P_A或者细胞培养腔室右侧的压力P_B，P_g为压力检测微通道内所压缩空气的压力，P_capillary为压力检测微通道内通过气-液交届面处的压力降；P_g通过恒定温度下的理想气体定律以及微通道内的摩尔质量进行确定，P_capillary通过杨-拉普拉斯定律获得，P_g和P_capillary的计算公式如下：

其中，P_a是大气压力，V₁为压力检测微通道的总体积，V₂为压力检测微通道内压缩空气的体积；σ和θ分别为压力检测微通道内液体的表面张力以及接触角；d和w分别为压力检测微通道的高度和宽度；

将公式(6)和(7)代入公式(5)中，进一步得到两个压力检测微通道的压力为：

由于压力检测微通道的宽度相同，因此，V₁/V₂能用长度L₁/L₂来表示，其中L₁为压力检测微通道的总长度，L₂为压力检测通道内进入液体后空气柱的长度，即L₁减去进入压力检测微通道内液体柱的长度；

(2)由第一压力检测微通道3-1和第二压力检测微通道3-2的压力值P_A和P_B，计算同一时刻下细胞培养腔室两侧的压力差ΔP：

ΔP＝P_A-P_B (9)；

(3)通过公式(10)计算获得细胞培养腔室1-3底部的剪切力：

其中，l_f、w_f、h_f分别为细胞培养腔室的长度、宽度和高度。

本发明的有益效果：本发明可成功实现细胞培养腔室内细胞的均匀、完全分布，可对细胞培养腔室内的细胞施加运动引起的前、后幅值及频率均增大的脉动血流剪切力，并且该剪切力波形可通过微流控芯片内部的压力检测微通道所测量并计算得到。

附图说明

图1是微流控芯片结构图。

图2(a)是具有一个上侧微通道以及一个下侧微通道的细胞培养系统；图2(b)是具有两个上侧微通道以及两个下侧微通道的细胞培养系统；图2(c)是具有三个上侧微通道以及三个下侧微通道的细胞培养系统；图2(d)是具有四个上侧微通道以及四个下侧微通道的细胞培养系统。

图3是图1微流控芯片系统的等效回路。

图4(a)和(b)均为压力检测微通道的检测原理图。

图5是实验系统示意图。

图6(a)是培养液的总体积流量率输入波形；图6(b)是细胞培养腔室底部的剪切力波形图。

图中：A细胞培养系统；B剪切力波形生成系统；C剪切力波形检测系统；1-1细胞悬浮液入口；1-2细胞悬浮液出口；1-3细胞培养腔室；2-1细胞培养液入口；2-2第一弹性腔室；2-4第二弹性腔室；2-5第一阻力通道；2-6第二阻力通道；2-7第一细胞培养液出口；2-8第二细胞培养液出口；3-1第一压力检测微通道；3-2第二压力检测微通道；(i)可编程注射泵流动控制系统；(ii)微流控芯片；(iii)显微镜；(iv)计算机显示系统；(v)废液回收处理系统。

具体实施方式

下面将结合具体实施例和附图对本发明的技术方案进行进一步的说明。

一种用于细胞培养及模拟运动后脉动剪切力环境的微流控芯片及检测方法，如图1所示，该微流控芯片包括细胞培养系统A、剪切力波形生成系统B和剪切力波形检测系统C；

细胞培养系统A主要由细胞培养腔室1-3、细胞悬浮液入口1-1、细胞悬浮液出口1-2和微通道构成；从细胞培养腔室1-3的上下两侧均匀引出m个微通道，m≥3，上侧的微通道与下侧的微通道对称布置；上下侧微通道的出口在细胞培养腔室1-3的上下侧长轴上均匀分布；上侧的微通道出口汇集并与细胞悬浮液入口1-1相连，下侧的微通道出口汇集并与细胞悬浮液出口1-2相连；

剪切力波形生成系统B主要由细胞培养腔室1-3、细胞培养液入口2-1、第一弹性腔室2-2、第二弹性腔室2-4、第一阻力通道2-5、第二阻力通道2-6、第一细胞培养液出口2-7、第二细胞培养液出口2-8和微通道构成；细胞培养腔室1-3的左侧通过微通道与第一弹性腔室2-2的入口端相连，第一弹性腔室2-2的出口端连接细胞培养液入口2-1；细胞培养腔室1-3的右侧通过微通道与第二弹性腔室2-4的入口端相连，第二弹性腔室2-4的出口端通过微通道依次与第一阻力通道2-5、第二阻力通道2-6相连，第一阻力通道2-5与第二阻力通道2-6之间的微通道上引出第一细胞培养液出口2-7，第二阻力通道2-6与第二细胞培养液出口2-8相通；第二弹性腔室2-4的体积大于第一弹性腔室2-2的体积，故第二弹性腔室2-4的顺应性要大于第一弹性腔室2-2的顺应性；

剪切力波形检测系统C主要由第一压力检测微通道3-1和第二压力检测微通道3-2构成；第一压力检测微通道3-1和第二压力检测微通道3-2的一端分别从紧靠细胞培养腔室1-3左右两端的微通道上引出，另一端封闭，用于检测细胞培养腔室1-3两侧的压力。

本发明中芯片所有通道结构均采用标准化的微加工方法，运用PDMS与洁净玻璃片键合而成，形成具有良好生物相容性的玻璃-PDMS芯片。所述细胞悬浮液的灌注通道与剪切力波形生成系统的通道相分离，即将细胞悬浮液的灌注通道与剪切力波形的生成通道设计为分离且正交的两部分，该设计的目的一方面可以更为方便地进行细胞悬浮液注入通道的结构优化；另一方面可以有效地避免剪切力加载通道中细胞的残留，以免影响后续的实验结果，比如在需要收集循环培养液进行活性因子或者炎性因子等的检测时，若连接通道中有灌注时残留且贴壁的细胞则会造成实验结果不够准确。

微流控芯片内细胞培养腔室的长度为0.5厘米，宽度为0.25厘米，高度为0.015厘米，内皮细胞培养于此扁平通道的底部；第一弹性腔室2-2和第二弹性腔室2-4的长度均为0.45厘米，宽度均为0.3厘米，第一弹性腔室2-2的高度为0.26厘米，第二弹性腔室2-4的高度为0.3厘米；第一后阻力通道2-5和第二后阻力通道2-6的长度分别为0.5厘米及0.3厘米，宽度均为0.02厘米，高度均为0.03厘米；剪切力波形检测微通道的宽度为0.02厘米，高度为0.03厘米；其他连接通道以及细胞悬浮液出入口连接通道的高度均为0.03厘米。

本发明中，为了保证细胞悬浮液能够均匀且完全的充满整个细胞培养腔室，首先初步设计了如图2(a)至图2(d)所示的4种细胞培养腔室出入口的通道结构。这四种结构均包含一个细胞悬浮液入口和一个细胞悬浮液出口，差别在于入口到细胞培养腔室以及细胞培养腔室到出口的通道数量。结构a包含一个入口通道和一个出口通道，入口及出口通道均位于培养腔室长轴中点位置；结构b包括左右对称的两个入口通道及左右对称的两个出口通道；结构c包括三个入口通道及三个出口通道，其中左右两个入口及左右两个出口通道分别两两对称，另一个入口及出口通道位于培养腔室长轴中点位置；结构d包含左右两两对称的四个入口通道和左右两两对称的四个出口通道。为了验证上述四种结构的合理性，将这四种结构的CAD模型图导入到COMSOL软件中，进行网格划分后，采用流体流动粒子追踪方法，并设置合适的参数值以及边界条件后进行仿真计算。由图2(a)至图2(d)的粒子仿真结果可得，结构c和d较结构a和b更有利于细胞在培养腔室中的均匀、完全分布。因此，在本发明中采用结构d所设计的出入口通道结构。

本实施例中，该微流控芯片与连有注射器的可编程注射泵、显微镜、计算机构成了完整的剪切力波形生成及检测系统(图5)。装有细胞培养液的注射器i与芯片的细胞培养液入口2-1相连，注射器由可编程注射泵控制。

一种用于细胞培养及模拟运动后脉动剪切力环境的检测方法，步骤如下：

步骤一：打开微流控芯片的所有入口和出口，从细胞培养液入口2-1注入细胞培养液，待整个微流控芯片内充满细胞培养液后，关闭细胞培养液入口2-1、第一细胞培养液出口2-7和第二细胞培养液出口2-8；

步骤二：从细胞悬浮液入口1-1注入密度为1×10⁶的细胞悬浮液，确保细胞培养腔室1-3内的细胞均匀、完全分布；每隔8小时进行一次换液，直至细胞培养腔室内的细胞达到融合；当细胞培养腔室1-3底部的细胞达到融合时，关闭细胞悬浮液入口1-1和细胞悬浮液出口1-2；

步骤三：打开细胞培养液入口2-1，并打开第一细胞培养液出口2-7或第二细胞培养液出口2-8，再次从细胞培养液入口2-1注入细胞培养液；

当细胞培养液流入微流控芯片时，一部分流入到第一弹性腔室2-2和第二弹性腔室2-4中，另外的一部分经过细胞培养腔室1-3、第一阻力通道2-5、第一细胞培养液出口2-7流出，或者经过细胞培养腔室1-3、第一阻力通道2-5、第二阻力通道2-6、第二细胞培养液出口2-8流出，此时细胞培养腔室内表现为前向流；

当停止注入时，在一段时间内微流控芯片里的液体会继续保持前向流动，由于第二弹性腔室2-4的顺应性大于第一弹性腔室2-2的顺应性，所以当第二弹性腔室2-4中的空气压力大于通道内的压力时，一部分的液体会由第二弹性腔室2-4流入到第一弹性腔室2-2中，此时在细胞培养腔室内会产生后向流；因此，通过调节细胞培养液注入流量、选择不同的细胞培养液出口或者改变阻力通道的尺寸、以及改变两个弹性腔室的尺寸，来控制细胞培养腔室内产生静息或者不同运动强度所引起的前、后向幅值以及频率改变的脉动血流剪切力；

微流控芯片内的各个腔室及通道尺寸设定依据如下：

将微流控芯片内各个腔室及通道等效成电路回路，如图3所示，该回路中的各个参数满足如下的方程：

其中，C₁、C₂分别为第一弹性腔室2-2、第二弹性腔室2-4的顺应性，L为微流控芯片内从第一弹性腔室2-2右侧出口到细胞培养腔室1-3左侧入口之间微通道的流感，R为第一细胞培养液出口2-7打开时第一阻力通道2-5的阻力或者为第二细胞培养液出口2-8打开时第一阻力通道2-5及第二阻力通道2-6的阻力之和，R_f为细胞培养腔室的阻力，q_in为流入微流控芯片的总体积流量率，q_f为通过细胞培养腔室的体积流量率，P_A、P_B分别为细胞培养腔室两侧的压力；其他连接微通道包括：第一细胞培养液入口2-1到第一弹性腔室2-2的右端，细胞培养腔室1-3到第二弹性腔室2-4左端，第二弹性腔室2-4右端到第一阻力通道2-5的左端，第一阻力通道2-5的右端到第一细胞培养液出口2-7或者第一阻力通道2-5的右端到第二细胞培养液出口2-8之间微通道所产生的流感对剪切力波形的影响很小，所以在图3所示的等效回路以及上述的公式(1)中未表示；

第一弹性腔室2-2及第二弹性腔室2-4的顺应性均通过公式(2)计算：

其中，V为弹性腔室内气体体积，P为弹性腔室内气体压力；A为弹性腔室的内截面积，H为弹性腔室内空气柱的长度，P_a为大气压力，P₀为作用于弹性腔室内空气柱的液压；n为多方指数，此处n＝1；

微流控芯片内微通道的流感L的计算公式如下：

其中，ρ为培养液的密度，l’为从第一弹性腔室2-2右侧出口到细胞培养腔室1-3左侧入口之间微通道的长度，A’为此段微通道的内截面积；

阻力通道为矩形的狭窄微通道，其阻力R的计算公式如下：

其中，η为细胞灌流培养液的粘度，η的值为0.001Pa·s，l为阻力通道的长度，b为阻力通道的宽度，h为阻力通道的高度；

步骤四：通过两个压力检测微通道的压力差计算得到模拟运动后脉动的剪切力；计算原理如图4(a)和图4(b)所示；

(1)两个压力检测微通道的压力均由式(5)计算获得：

P＝P_g-P_capillary (5)

其中，P为细胞培养腔室左侧的压力P_A或者细胞培养腔室右侧的压力P_B，P_g为压力检测微通道内所压缩空气的压力，P_capillary为压力检测微通道内通过气-液交届面处的压力降；P_g通过恒定温度下的理想气体定律以及微通道内的摩尔质量进行确定，P_capillary通过杨-拉普拉斯定律获得，P_g和P_capillary的计算公式如下：

其中，P_a是大气压力，V₁为压力检测微通道的总体积，V₂为压力检测微通道内压缩空气的体积；σ和θ分别为压力检测微通道内液体的表面张力以及接触角；d和w分别为压力检测微通道的高度和宽度；

将公式(6)和(7)代入公式(5)中，进一步得到两个压力检测微通道的压力为：

由于压力检测微通道的宽度相同，因此，V₁/V₂能用长度L₁/L₂来表示，其中L₁为压力检测微通道的总长度，L₂为压力检测通道内进入液体后空气柱的长度，即L₁减去进入压力检测微通道内液体柱的长度；

(2)由第一压力检测微通道3-1和第二压力检测微通道3-2的压力值P_A和P_B，计算同一时刻下细胞培养腔室两侧的压力差ΔP：

ΔP＝P_A-P_B (9)；

(3)通过公式(10)计算获得细胞培养腔室1-3底部的剪切力：

其中，l_f、w_f、h_f分别为细胞培养腔室的长度、宽度和高度；

通过可编程注射泵控制培养液的总体积流量率，如图6(a)，通过选择不同的细胞培养液出口便可产生如图6(b)所示的静息或者中等强度运动所引起的具有前后向血流的脉动剪切力。由于要产生静息以及运动引起的剪切力波形时所需要的弹性腔室的顺应性以及流感可以相同，而所需要的后阻力不同，因此只需要在产生静息波形时打开第二细胞培养液出口2-8，关闭第一细胞培养液出口2-7；而在产生运动引起的剪切力波形时打开第一细胞培养液出口2-7，并关闭第二细胞培养液出口2-8；在本实施例中，模拟输出如图6(b)所示的静息及运动所引起的脉动剪切力波形所对应的参数R_f，L，C₁，C₂均分别相同，其中，R_f＝7100pa.s.ml^-1，L＝787pa.s².ml^-1，C₁＝3.6×10^-7ml.pa^-1，C₂＝4.1×10^-7ml.pa^-1；另外，模拟两种不同脉动剪切力条件的后阻力分别为R_静息＝1.78×10⁴pa.s.ml^-1，R_运动＝1.10×10⁴pa.sml^-1。

上述的参数可运用MATLAB SIMULINK对电路回路，如图3，进行仿真获得。以所要模拟产生的剪切力波形为目标，对输入的流量率波形以及各个参数值进行调节，直到仿真所得到的波形尽可能地接近于目标波形。在得到各个元件的参数以后，通过公式(2)-(4)便可确定细胞培养腔室，第一弹性腔室，第二弹性腔室以及阻力通道的具体尺寸。

Claims (3)

1.一种用于细胞培养及模拟运动后脉动剪切力环境的微流控芯片，其特征在于，该微流控芯片包括细胞培养系统(A)、剪切力波形生成系统(B)和剪切力波形检测系统(C)；

细胞培养系统(A)主要由细胞培养腔室(1-3)、细胞悬浮液入口(1-1)、细胞悬浮液出口(1-2)和微通道构成；从细胞培养腔室(1-3)的上下两侧均匀引出m个微通道，m≥3，上侧的微通道与下侧的微通道对称布置；上侧的微通道出口汇集并与细胞悬浮液入口(1-1)相连，下侧的微通道出口汇集并与细胞悬浮液出口(1-2)相连；

剪切力波形生成系统(B)主要由细胞培养腔室(1-3)、细胞培养液入口(2-1)、第一弹性腔室(2-2)、第二弹性腔室(2-4)、第一阻力通道(2-5)、第二阻力通道(2-6)、第一细胞培养液出口(2-7)、第二细胞培养液出口(2-8)和微通道构成；细胞培养腔室(1-3)的左侧通过微通道与第一弹性腔室(2-2)的入口端相连，第一弹性腔室(2-2)的出口端连接细胞培养液入口(2-1)；细胞培养腔室(1-3)的右侧通过微通道与第二弹性腔室(2-4)的入口端相连，第二弹性腔室(2-4)的出口端通过微通道依次与第一阻力通道(2-5)、第二阻力通道(2-6)相连，第一阻力通道(2-5)与第二阻力通道(2-6)之间的微通道上引出第一细胞培养液出口(2-7)，第二阻力通道(2-6)与第二细胞培养液出口(2-8)相通；第二弹性腔室(2-4)的体积大于第一弹性腔室(2-2)的体积，故第二弹性腔室(2-4)的顺应性要大于第一弹性腔室(2-2)的顺应性；

剪切力波形检测系统(C)主要由第一压力检测微通道(3-1)和第二压力检测微通道(3-2)构成；第一压力检测微通道(3-1)和第二压力检测微通道(3-2)的一端分别从紧靠细胞培养腔室(1-3)左右两端的微通道上引出，另一端封闭，用于检测细胞培养腔室(1-3)两侧的压力。

2.根据权利要求1所述的一种用于细胞培养及模拟运动后脉动剪切力环境的微流控芯片，其特征在于，所述第一弹性腔室(2-2)和第二弹性腔室(2-4)的体积，第一阻力通道(2-5)和第二阻力通道(2-6)的长度均根据所需形成的剪切力波形确定。

3.采用一种所述的用于细胞培养及模拟运动后脉动剪切力环境的微流控芯片的检测方法，其特征在于，步骤如下：

步骤一：打开微流控芯片的所有入口和出口，从细胞培养液入口(2-1)注入细胞培养液，待整个微流控芯片内充满细胞培养液后，关闭细胞培养液入口(2-1)、第一细胞培养液出口(2-7)和第二细胞培养液出口(2-8)；

步骤二：从细胞悬浮液入口(1-1)注入细胞悬浮液，确保细胞培养腔室(1-3)内的细胞均匀、完全分布；当细胞培养腔室(1-3)底部的细胞达到融合时，关闭细胞悬浮液入口(1-1)和细胞悬浮液出口(1-2)；

步骤三：打开细胞培养液入口(2-1)，并打开第一细胞培养液出口(2-7)或第二细胞培养液出口(2-8)，再次从细胞培养液入口(2-1)注入细胞培养液；

当细胞培养液流入微流控芯片时，一部分流入到第一弹性腔室(2-2)和第二弹性腔室(2-4)中，另外的一部分经过细胞培养腔室(1-3)、第一阻力通道(2-5)、第一细胞培养液出口(2-7)流出，或者经过细胞培养腔室(1-3)、第一阻力通道(2-5)、第二阻力通道(2-6)、第二细胞培养液出口(2-8)流出，此时细胞培养腔室内表现为前向流；

当停止注入时，在一段时间内微流控芯片里的液体会继续保持前向流动，由于第二弹性腔室(2-4)的顺应性大于第一弹性腔室(2-2)的顺应性，所以当第二弹性腔室(2-4)中的空气压力大于通道内的压力时，一部分的液体会由第二弹性腔室(2-4)流入到第一弹性腔室(2-2)中，此时在细胞培养腔室内会产生后向流；因此，通过调节细胞培养液注入流量、选择不同的细胞培养液出口或者改变阻力通道的尺寸、以及改变两个弹性腔室的尺寸，来控制细胞培养腔室内产生静息或者不同运动强度所引起的前、后向幅值以及频率改变的脉动血流剪切力；

微流控芯片内的各个腔室及通道尺寸设定依据如下：

将微流控芯片内各个腔室及通道等效成电路回路，该回路中的各个参数满足如下的方程：

其中，C₁、C₂分别为第一弹性腔室(2-2)、第二弹性腔室(2-4)的顺应性，L为微流控芯片内从第一弹性腔室(2-2)右侧出口到细胞培养腔室(1-3)左侧出口之间微通道的流感，R为第一细胞培养液出口(2-7)打开时第一阻力通道(2-5)的阻力或者为第二细胞培养液出口(2-8)打开时第一阻力通道(2-5)及第二阻力通道(2-6)的阻力之和，R_f为细胞培养腔室的阻力，q_in为流入微流控芯片的总体积流量率，q_f为通过细胞培养腔室的体积流量率，P_A、P_B分别为细胞培养腔室两侧的压力；

第一弹性腔室(2-2)及第二弹性腔室(2-4)的顺应性均通过公式(2)计算：

其中，V为弹性腔室内气体体积，P为弹性腔室内气体压力；A为弹性腔室的内截面积，H为弹性腔室内空气柱的长度，P_a为大气压力，P₀为作用于弹性腔室内空气柱的液压；n为多方指数，此处n＝1；

微流控芯片内微通道的流感L的计算公式如下：

其中，ρ为培养液的密度，l’为从第一弹性腔室(2-2)右侧出口到细胞培养腔室(1-3)左侧入口之间微通道的长度，A’为此段微通道的内截面积；

阻力通道为矩形的狭窄微通道，其阻力R的计算公式如下：

其中，η为细胞灌流培养液的粘度，l为阻力通道的长度，b为阻力通道的宽度，h为阻力通道的高度；

步骤四：通过两个压力检测微通道的压力差计算得到模拟运动后脉动的剪切力；

(1)两个压力检测微通道的压力均由式(5)计算获得：

P＝P_g-P_capillary (5)

其中，P为细胞培养腔室左侧的压力P_A或者细胞培养腔室右侧的压力P_B，P_g为压力检测微通道内所压缩空气的压力，P_capillary为压力检测微通道内通过气-液交届面处的压力降；P_g通过恒定温度下的理想气体定律以及微通道内的摩尔质量进行确定，P_capillary通过杨-拉普拉斯定律获得，P_g和P_capillary的计算公式如下：

其中，P_a是大气压力，V₁为压力检测微通道的总体积，V₂为压力检测微通道内压缩空气的体积；σ和θ分别为压力检测微通道内液体的表面张力以及接触角；d和w分别为压力检测微通道的高度和宽度；

将公式(6)和(7)代入公式(5)中，进一步得到两个压力检测微通道的压力为：

由于压力检测微通道的宽度相同，因此，V₁/V₂能用长度L₁/L₂来表示，其中L₁为压力检测微通道的总长度，L₂为压力检测通道内进入液体后空气柱的长度，即L₁减去进入压力检测微通道内液体柱的长度；

(2)由第一压力检测微通道(3-1)和第二压力检测微通道(3-2)的压力值P_A和P_B，计算同一时刻下细胞培养腔室两侧的压力差ΔP：

ΔP＝P_A-P_B (9)；

(3)通过公式(10)计算获得细胞培养腔室(1-3)底部的剪切力：

其中，l_f、w_f、h_f分别为细胞培养腔室的长度、宽度和高度。