CN112481123B - 一种研究剪切力和生化因子梯度调控细胞划痕修复的微流控系统及方法 - Google Patents

一种研究剪切力和生化因子梯度调控细胞划痕修复的微流控系统及方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种研究剪切力和生化因子梯度调控细胞划痕修复的微流控系统及方法，属于细胞生物学实验装置技术领域。利用流体力学的虹吸原理和微流控芯片技术设计恒流泵、生化因子浓度梯度生成器和细胞培养室。恒流泵用于调控入口溶液及其流量，可以在细胞培养腔内制造尺寸可控的细胞“划痕”条带，特殊的微流控芯片结构设计可在细胞培养腔内产生剪切力与生化因子空间梯度组合刺激。微型细胞培养箱可通过温度及气体传感器实时监测箱内温度和气体浓度等信息，并将检测和传感数据反馈给控制系统，为微流控芯片上的细胞提供最适宜的细胞生存环境。结合荧光显微成像系统实时监测剪切力和生化因子组合刺激条件下细胞“划痕”修复的动力学过程。

Description

一种研究剪切力和生化因子梯度调控细胞划痕修复的微流控 系统及方法
技术领域
本发明属于细胞生物学实验装置技术领域，是基于流体力学原理和微流控芯片技术，由可生成生化因子浓度空间梯度的微流控芯片、可自主灌注产生定常流剪切力的恒流微泵、以及微型细胞培养箱等构成的用于研究剪切力和生化因子梯度调控细胞“划痕”修复的微流控系统及方法。
背景技术
细胞划痕试验是体外评价细胞增殖和迁移能力的重要方法。一般在常规的培养皿或培养板上体外培养细胞，当细胞生长至融合单层状态时，在融合的单层细胞上用机械方法人为制造一个空白区域，称为“划痕”，划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”修复，用显微镜实时观测细胞迁移期间动态图像，后期分析处理动态图像数据，得到细胞迁移速率等评估细胞增殖和迁移能力的指标。
细胞划痕修复受所处的微环境调控。细胞微环境的参数可以分为生物化学因素和生物物理因素两大类。生物化学因素主要包括各种生化因子的浓度及浓度梯度分布变化，生物物理因素主要包括机械力的作用如流体剪切力等。传统的培养皿或培养板体系只能提供静态的生化因子作用环境，无法产生流体剪切力的作用；此外，采用机械方法制造细胞划痕的方法不可避免地对细胞造成机械损伤，影响划痕边缘部位的细胞功能。
随着微纳制造和微流控技术的快速发展，使用微流控芯片技术制造细胞划痕、精确模拟剪切力和生化因子梯度微环境开展各种细胞划痕试验越来越普遍。这些装置和系统通常需要将微流控芯片连接有源压力泵及外部控制系统实现压力和流量的精确控制，从而实现细胞划痕宽度、剪切力和生化因子空间梯度的精准模拟。然而，这些装置和系统具有庞大的压力泵及其外围控制装置，不便整体放置于培养箱中进行长时间的细胞培养和观察。因此，迫切需要设计和构建一种具有无源自主灌注恒流微泵、微流控芯片以及微型细胞培养箱组成的微流控系统及方法，用于研究剪切力与生化因子浓度空间梯度调控细胞“划痕”修复动力学过程。
发明内容
本发明的目的在于设计和构建一种无源自主灌注恒流微泵、微流控芯片以及微型细胞培养箱组成的微流控系统及方法，用于研究剪切力与生化因子浓度空间梯度调控细胞“划痕”修复动力学过程。利用流体力学的虹吸原理和微流控芯片技术设计恒流微泵、生化因子浓度梯度生成器和细胞培养室。恒流微泵用于调控入口溶液及其流量，可以在细胞培养腔内制造尺寸可控的细胞“划痕”条带，特殊的微流控芯片结构设计可在细胞培养腔内产生剪切力与生化因子空间梯度组合刺激。微型细胞培养箱可通过温度及气体传感器实时监测箱内温度和气体浓度等信息，并将检测和传感数据反馈给控制系统，为微流控芯片上的细胞提供最适宜的细胞生存环境。进一步结合细胞“划痕”试验检测装置实时监测剪切力和生化因子组合刺激条件下细胞“划痕”修复的动力学过程。
本发明的技术方案如下：
一种研究剪切力和生化因子梯度调控细胞划痕修复的微流控系统，包括恒流微泵A、微型细胞培养箱B、微流控芯片C和细胞“划痕”试验检测装置D；
所述的恒流微泵A包括恒流发生器A-1和弹性阻尼器A-2；恒流发生器A-1的个数根据实际需要进行调整；恒流发生器A-1包括离心管和两端开口的软管；弹性阻尼器A-2为圆柱形透明管，其顶部连接有一个可开关的接头，用于控制是否与大气相通；弹性阻尼器A-2一端通过软管与恒流发生器A-1相连，另一端和微流控芯片C中“圣诞树”型微通道“树顶”端的四个入口相通，用于灌注细胞培养基、生化因子溶液或胰蛋白酶溶液；
所述的微型细胞培养箱B包括外围温度控制及反馈装置、气体数字混合器及气体传感器反馈控制装置；用于实时监测、反馈和控制微型细胞培养箱B内温度和气体浓度，为微流控芯片C上的细胞培养提供良好的环境；
所述微流控芯片C包括“圣诞树”型浓度梯度生成器C-1、细胞培养基入口2、细胞培养腔C-2、溶液出口3；其中“圣诞树”型浓度梯度生成器C-1包括第一入口1-1、第二入口1-2、第三入口1-3、第四入口1-4和“圣诞树”型微通道；第一入口1-1、第二入口1-2、第三入口1-3、第四入口1-4分别设置于“圣诞树”型微通道的“树顶”端，“圣诞树”型微通道的“树根”端汇集并与细胞培养腔C-2相通；细胞培养腔C-2包括三个入口和一个出口，其中一个入口与“圣诞树”型微通道相通，另外两个入口分布于“圣诞树”型微通道两侧，并汇集成一个细胞培养基入口2。溶液出口3位于细胞培养腔C-2的尾端。
所述的细胞“划痕”试验检测装置D包括倒置荧光显微镜成像系统，用于实时监测细胞培养腔C-2内划痕修复进程的实际状态。
所述的恒流发生器A-1中两端开口的软管下端开口处的压强始终保持与外界大气压相同；往离心管加入液体，液体上方封闭一段空气柱，满足气体状态方程:
P1V1＝C1 (1)
其中，P1为气体压强，V1为气体体积，C1是常数。设a点为恒流发生器内液面所处位置；b点为两端开口软管下端所处位置；c点为恒流发生器液体流出位置；若液面高度高于软管下端开口处，则由于重力作用液体从c点流出，离心管中的水面下降，水面上方密闭的气体体积增大，气体压强减少，液体下流的速度就会减慢，导致容器内b点的水平面压力小于外界大气压，外界气体会在大气压的作用下通过软管下端的b口补气。
设c点的高度为Hc＝0，b点的高度为Hb，a和b两点之间的距离为△H，液体从c点流出的速度大小根据伯努利方程进行求解：
Figure BDA0002780073760000041
其中，C2为常数，V2为流体中某点的流速，H2为流体中该点的高度，P2为该点的压强，ρ为流体密度，g为重力加速度；
设c点的压强为Pc，c点流速为Vc，b点的压强为Pb，b点流速为Vb,则根据用伯努利方程(2)得：
Figure BDA0002780073760000042
其中b点处与c点处均与大气接触，所以Pb＝Pc＝Patm。Patm为大气压强。由于整个容器的横截面面积远大于c点的面积，根据连续性方程，Vb＜＜Vc，故认为Vb＝0。将前述条件代入公式(3)，即求得c点处液体流动速度为：
Figure BDA0002780073760000043
由公式(4)得：当ΔH>0时，Hb是恒定的，此时溶液从c孔流出的速度是恒定的，其大小取决于Hb的大小。
当液体由恒流发生器A-1流出经过弹性阻尼器A-2时，由于弹性阻尼器A-2顶部的接头被关闭，因此封闭在弹性阻尼器A-2内的空气由于其弹性作用，可将恒流发生器A-1因加气循环所产生的波动流转变为定常流，起到类似滤波的作用，如需要调节弹性阻尼器A-2内空气柱的高度，则可通过打开接头进行调节。弹性阻尼器A-2弹性腔的顺应性可以通过如下的公式进行计算：
Figure BDA0002780073760000044
其中，VA-2是弹性腔内空气柱的体积，PA-2是弹性腔内空气柱的压力，n是一个多方指数，n≥1，由于顺应性的调节过程中温度保持不变，所以n＝1。A是弹性腔的内截面积，h是弹性腔内空气柱的长度，Patm和P0分别为大气压以及液体作用于空气柱的压力。因此，如果给定了弹性腔顺应性C3的具体数值，那么在硅胶管内截面积已知的情况下，通过上述的公式(5)便可得到弹性腔内所需空气柱的高度h。
“圣诞树”型浓度梯度生成器C-1具有以下特点：第一，“圣诞树”型微通道的第一级混合通道的个数总是比入口个数多一个；第二，每一级的混合通道数量有序增加，即下一级混合通道的个数总是比这一级混合通道的个数多一个；第三，结构内所有混合通道的结构完全相同，从而具有相同的流阻。
设i表示“圣诞树”型微通道“树顶”端的入口编号，则Ci＝0，表示入口i的初始质量浓度为零，即不含生化因子的培养基被送入入口i；同理，Ci＝1表示入口i通入含有生化因子且初始浓度为1的溶液。因此4个入口共有24-2种混合含有/不含有生化因子培养基的方法。
流体力学中的流量，流阻和压力可以分别与电路当中的电流，电阻和电压相类比。如图4所示的两级三通道为例来具体阐述。由于上下级通道之间的水平通道阻值远小于混合通道的阻值，其阻值可以忽略不计，根据流体力学基本原理可以得出各混合通道内的流量均分入口处总流量。在如图4所示的集总参数模型中，根据基尔霍夫定律，可以得到：i1＝i2＝i3＝1/3(I1+I2+I3+I4)。其中i1、i2、i3分别为三条混合通道的电流大小，I1、I2、I3、I4分别为“圣诞树”型微通道“树顶”端的入口的电流大小。设i表示“圣诞树”型微通道“树顶”端的入口编号，参数ki表示入口i的流量Qi与“圣诞树”型浓度梯度生成器C-1内总流量Qc-1的比值，因此ki＝Qi/Qc-1。可见细胞培养腔内的浓度梯度分布主要取决于参数ki和每个入口处的初始浓度Ci。
细胞培养腔C-2由上直线边界、下直线边界围成。制造细胞划痕时，通过控制三入口的流量比即可控制划痕尺寸，具体为：
设细胞培养基和胰蛋白酶溶液均为牛顿流体且忽略混合微通道内出入口边界效应的影响，在微通道内流体具有很低的雷诺数Re＜＜1，因此认为微通道内液体流动为充分发展的层流，高度方向即y方向的变化可以忽略不计。基于定常流和准定常假设，溶液在微通道当中的流速根据泊肃叶定律近似表达为：
Figure BDA0002780073760000061
其中p为压强，μ为溶液粘度系数，H为微通道的高度。进而得到单位宽度的流量：
Figure BDA0002780073760000062
上式中，Q为流体的流量，W为微通道的宽度。在细胞培养基和胰蛋白酶两种溶液粘度系数近似相等的情况下，可以得到流体的宽度比等于流量比，即：
W1/W2/W3＝Q1/Q2/Q3 (8)
基于此原理，改变三入口处的流量分布即可实现细胞划痕尺寸的定量控制。
一种研究剪切力和生化因子梯度调控细胞划痕修复的微流控方法，步骤如下：
步骤一、在细胞融合单层上制造“划痕”条带
当细胞培养腔C-2底部形成细胞融合单层时，打开溶液出口3，控制恒流微泵A向第一入口1-1、第二入口1-2、第三入口1-3、第四入口1-4中注入胰蛋白酶溶液，细胞培养基入口2中注入细胞培养基，由于层流特性溶液将沿着细胞培养腔C-2轴线方向平行流动，因此在细胞培养腔C-2内产生“培养基-胰蛋白酶溶液-培养基”三个流动溶液带；通过控制各个入口溶液之间的输入流量比例，来控制胰酶细胞消化液的溶液宽度和横向位置；利用胰酶细胞消化液降解蛋白、“消化”细胞单层，即在细胞融合单层上制造“划痕”条带。
步骤二、为细胞培养腔内的细胞加载剪切力和生化因子浓度梯度刺激；
向第一入口1-1、第二入口1-2、第三入口1-3、第四入口1-4按照不同的浓度和流量比组合通入含有或不含有生化因子的溶液、细胞培养基入口2通入流量恒定且不含生化因子的细胞培养基，且保证细胞培养基入口2和“树顶”端的4个入口流量总和之比要与生成细胞划痕时相同。则根据流体力学和物质传输原理，在细胞培养腔C-2内细胞划痕处产生沿芯片宽度方向不同且复杂空间分布的生化因子浓度梯度，而在细胞培养腔C-2底部产生定常的剪切力信号。
步骤三、组合微型细胞培养箱实现划痕修复动力学的实时监测
将恒流微泵A放置于微型细胞培养箱B内，开启气体数字混合器、控制及反馈装置，并用计算机读取实时的温度及气体浓度信息，微流控芯片放置于荧光显微镜上。将微型细胞培养箱B内的温度及气体浓度信息设定完成，而其实际值则利用传感器测量技术，并经过图像分析和数据处理后获得，实际值与参考值之差得到微型细胞培养箱B内设定温度及气体浓度参数偏差；然后，参数偏差经过反馈控制装置映射为控制信号；此控制信号进一步作用于气体数值混合器及温度及反馈装置，从而调整恒流微泵A所处环境的温度和气体浓度，进而为微流控芯片上的细胞提供适宜的微环境。反馈控制装置采用PID控制算法。通过荧光显微镜实时监测记录剪切力和生化因子空间梯度组合刺激条件下的细胞“划痕”修复动力学过程，并将荧光信号、细胞影像以及传感数据反馈给计算机系统。
本发明的有益效果：本发明可方便地开展细胞“划痕”修复试验，用于研究剪切力与生化因子浓度梯度协同调控细胞“划痕”修复的动力学过程，结合自制恒流微泵与微型细胞培养箱可无需外接昂贵复杂的注射泵，结合荧光显微镜成像系统可实现细胞划痕修复过程的实时监测。本发明微型细胞培养箱中必然存在一定程度的外在因素干扰，因此采用闭环反馈控制系统来保证箱内温度及气体浓度等条件的稳定。
附图说明
图1是用于细胞“划痕”修复试验的微流控芯片装置及系统。
图2是自制恒流微泵结构示意图。
图3是微流控芯片微通道结构图。
图4是两级三通道“圣诞树”结构的集总参数模型。
图5是细胞划痕宽度随时间变化示意图。其中，(a)为0h时示意图，(b)为12h时的示意图。
图中：A恒流微泵；B微型细胞培养箱；C微流控芯片；D细胞“划痕”试验检测装置；A-1恒流发生器；A-2弹性阻尼器；a恒流发生器内液面所处位置；b两端开口软管下端所处位置；c恒流发生器液体流出位置；C-1“圣诞树”型浓度梯度生成器；C-2细胞培养腔；1-1第一入口；1-2第二入口；1-3第三入口；1-4第四入口；2细胞培养基入口；3溶液出口。
具体实施方式
现针对可施加剪切力及生化因子的恒流微泵及体外细胞划痕修复实验装置系统，阐述具体实施方式：
如图1本实例用到的装置包括：用于加载与细胞划痕制造的恒流微泵A、微型细胞培养箱B、微流控芯片C、细胞“划痕”试验检测装置D。利用该装置进行细胞划痕修复实验包括以下环节：
(一)首先设计并制作微流控芯片C及恒流微泵A步骤如下：
步骤一：微流控芯片C所有通道和腔室结构采用标准化的微加工方法用PDMS制作完成，并与洁净盖玻片永久键合密封，构成透明的生物相容性良好的玻璃-PDMS型芯片。微通道的结构参数如下：其“圣诞树”型浓度梯度生成器C-1长10.4mm，共有7级宽为0.1mm的蛇形通道；细胞培养腔C-2的长度为L＝10mm，宽度为W＝1.2mm；芯片高度为H＝60μm。
步骤二：恒流微泵A由恒流发生器A-1和弹性阻尼器A-2组成，其中恒流发生器A-1是将开离心管盖打孔并插入两端开口的软管后使用热熔胶密封制成。弹性阻尼器A-2为圆柱形透明管，透明管顶端有一个可开关用于控制是否与大气相通的接头。弹性阻尼器A-2一端通过软管与恒流发生器A-1相连，另一端和微流控芯片C的各个入口相连，用于灌注细胞培养基、生化因子溶液或胰蛋白酶溶液。
(二)在微流控芯片细胞培养腔C-2内生成细胞划痕的实验步骤如下：
步骤一、向微流控芯片C内灌注细胞悬浮液；
步骤二、当细胞培养腔C-2底部形成细胞融合单层时，打开液体出口3，控制恒流微泵A向第一入口1-1、第二入口1-2、第三入口1-3、第四入口1-4中注入胰蛋白酶溶液，细胞培养基入口2中注入细胞培养基，由于层流特性溶液将沿着细胞培养腔C-2轴线方向平行流动，因此在细胞培养腔C-2内产生“培养基-胰蛋白酶溶液-培养基”三个流动溶液带；通过控制各个入口溶液之间的输入流量比例，来控制胰酶细胞消化液的溶液宽度和横向位置；利用胰蛋白酶“消化”细胞单层，即在细胞融合单层上制造“划痕”条带
(三)为细胞培养腔C-2内的细胞加载剪切力和生化因子空间梯度刺激；
首先确定在细胞培养腔C-2内目标剪切力τ，根据公式(9)计算需要的流量率Q:
Figure BDA0002780073760000091
若微通道内的细胞划痕宽度为细胞培养腔C-2总宽度的1/3，则入口2流量
Figure BDA0002780073760000092
圣诞树入口流量
Figure BDA0002780073760000093
Figure BDA0002780073760000094
设细胞培养腔C-2的流动阻力为Rc；L、W、H分别为细胞培养腔C-2的长、宽和高均为已知；Rc计算公式为：
Figure BDA0002780073760000095
μ细胞培养液的粘度通常为0.001Pa·s。
其余微流通道(除细胞培养腔C-2以外)的长度为Lf、宽度为Wf、高度为Hf。微通道的流动阻力Rf的计算公式为：
Figure BDA0002780073760000101
α为长宽比且满足：
C(α)＝96(1-1.3553α+1.9467α2-1.7012α3+0.9564α4+0.2537α5) (12)
微流控芯片出口3认为P3＝0；因此在Q、Rc、Rf已知的情况下，根据公式(13)可计算得到不同入口的压力值：
Figure BDA0002780073760000102
恒流微泵A的静水压力取决于Hb的大小，已知P的条件下根据公式(14)可求得不同压力下所需的Hb：
P＝ρgHb (14)
由此，可通过调整恒流微泵Hb的大小来调整不同入口所需的流量率的大小。接下来向“圣诞树”型浓度梯度生成器C-1的第一入口1-1、第二入口1-2、第三入口1-3、第四入口1-4按照不同的浓度和流量比组合通入含有或不含有生化因子的溶液；细胞培养基入口2通入流量恒定且不含生化因子的细胞培养基，且保证入口2和第一入口1-1、第二入口1-2、第三入口1-3、第四入口1-4的流量总和之比要与生成细胞划痕时相同。则根据流体力学和物质传输原理，在细胞培养腔C-2内细胞划痕处产生沿芯片宽度方向不同且复杂空间分布的生化因子浓度梯度，而在细胞培养腔C-2底部产生定常的剪切力信号；
(四)组合微型细胞培养箱B实现划痕修复动力学的实时监测
上述恒流微泵A放置于微型细胞培养箱B内，开启气体数字混合器以及温度控制器，并用计算机读取实时的温度及气体浓度信息，微流控芯片C放置于细胞“划痕”试验检测装置D上。将微型细胞培养箱B内的温度及气体浓度信息设定完成，而其实际值则利用传感器测量技术，并经过图像分析和数据处理后获得，实际值与参考值之差得到微型细胞培养箱内设定温度及气体浓度参数偏差；然后，参数偏差经过反馈控制器映射为控制信号；此控制信号进一步作用于气体数值混合器及温度控制器，从而调整恒流微泵A所处环境的温度和气体浓度，进而为微流控芯片C上的细胞提供适宜的微环境。上述反馈控制器采用PID(Proportional+Integral+Derivative)控制算法。
通过细胞“划痕”试验检测装置D实时监测记录剪切力和生化因子浓度梯度组合刺激条件下的细胞“划痕”修复过程，将细胞影像用IMAGE J等软件处理得到划痕宽度随时间的变化用来表征划痕修复速率及情况(如图5)。

Claims (7)

1.一种研究剪切力和生化因子梯度调控细胞划痕修复的微流控系统，其特征在于，包括恒流微泵（A）、微型细胞培养箱（B）、微流控芯片（C）和细胞“划痕”试验检测装置（D）；
所述的恒流微泵（A）包括恒流发生器（A-1）和弹性阻尼器（A-2）；恒流发生器（A-1）包括离心管和两端开口的软管；弹性阻尼器（A-2）为圆柱形透明管，其顶部连接有一个可开关的接头，用于控制是否与大气相通；弹性阻尼器（A-2）一端通过软管与恒流发生器（A-1）相连，另一端和微流控芯片（C）中“圣诞树”型微通道“树顶”端的四个入口相通，用于灌注细胞培养基、生化因子溶液或胰蛋白酶溶液；
所述的微型细胞培养箱（B）包括外围温度控制及反馈装置、气体数字混合器及气体传感器反馈控制装置；用于实时监测、反馈和控制微型细胞培养箱（B）内温度和气体浓度，为微流控芯片（C）上的细胞培养提供良好的环境；
所述微流控芯片（C）包括“圣诞树”型浓度梯度生成器（C-1）、细胞培养基入口（2）、细胞培养腔（C-2）、溶液出口（3）；其中“圣诞树”型浓度梯度生成器（C-1）包括第一入口（1-1）、第二入口（1-2）、第三入口（1-3）、第四入口（1-4）和“圣诞树”型微通道；第一入口（1-1）、第二入口（1-2）、第三入口（1-3）、第四入口（1-4）分别设置于“圣诞树”型微通道的“树顶”端，“圣诞树”型微通道的“树根”端汇集并与细胞培养腔（C-2）相通；细胞培养腔（C-2）包括三个入口和一个出口，其中一个入口与“圣诞树”型微通道相通，另外两个入口分布于“圣诞树”型微通道两侧，并汇集成一个细胞培养基入口（2）；溶液出口（3）位于细胞培养腔（C-2）的尾端；
所述的细胞“划痕”试验检测装置（D）包括倒置荧光显微镜成像系统，用于实时监测细胞培养腔（C-2）内划痕修复进程的实际状态。
2.根据权利要求1所述的一种研究剪切力和生化因子梯度调控细胞划痕修复的微流控系统，其特征在于，所述的恒流发生器（A-1）中两端开口的软管下端开口处的压强始终保持与外界大气压相同；往离心管加入液体，液体上方封闭一段空气柱，满足气体状态方程:
P 1 V 1 =C 1 (1)
其中，P 1 为气体压强，V 1 为气体体积，C 1 是常数；设a点为恒流发生器内液面所处位置；b点为两端开口软管下端所处位置；c点为恒流发生器液体流出位置；若液面高度高于软管下端开口处，则由于重力作用液体从c点流出，离心管中的水面下降，水面上方密闭的气体体积增大，气体压强减少，液体下流的速度就会减慢，导致容器内b点的水平面压力小于外界大气压，外界气体会在大气压的作用下通过软管下端的b口补气；
设c点的高度为H c =0，b点的高度为H b ，a和b两点之间的距离为△H，液体从c点流出的速度大小根据伯努利方程进行求解：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
(2)
其中，
Figure 460430DEST_PATH_IMAGE002
为常数，
Figure DEST_PATH_IMAGE003
为流体中某点的流速，
Figure 705467DEST_PATH_IMAGE004
为流体中该点的高度，
Figure DEST_PATH_IMAGE005
为该点的压强，
Figure 796789DEST_PATH_IMAGE006
为流体密度，
Figure DEST_PATH_IMAGE007
为重力加速度；
设c点的压强为
Figure 519894DEST_PATH_IMAGE008
，c点流速为
Figure DEST_PATH_IMAGE009
，b点的压强为
Figure 524146DEST_PATH_IMAGE010
，b点流速为V b ,则根据用伯努利方程（2）得：
Figure DEST_PATH_IMAGE011
(3)
其中b点处与c点处均与大气接触，所以P b =P c =P atm ；P atm 为大气压强；由于整个容器的横截面面积远大于c点的面积，根据连续性方程，
Figure 674505DEST_PATH_IMAGE012
，故认为V b =0；将前述条件代入公式（3），即求得c点处液体流动速度为：
Figure DEST_PATH_IMAGE013
(4)
由公式（4）得：当
Figure 754588DEST_PATH_IMAGE014
时，
Figure DEST_PATH_IMAGE015
是恒定的，此时溶液从c孔流出的速度是恒定的，其大小取决于H b 的大小。
3.根据权利要求1或2所述的一种研究剪切力和生化因子梯度调控细胞划痕修复的微流控系统，其特征在于，当液体由恒流发生器（A-1）流出经过弹性阻尼器（A-2）时，由于弹性阻尼器（A-2）顶部的接头被关闭，因此封闭在弹性阻尼器（A-2）内的空气由于其弹性作用，可将恒流发生器（A-1）因加气循环所产生的波动流转变为定常流，起到类似滤波的作用，如需要调节弹性阻尼器（A-2）内空气柱的高度，则可通过打开接头进行调节；弹性阻尼器（A-2）弹性腔的顺应性可以通过如下的公式进行计算：
Figure 530652DEST_PATH_IMAGE016
(5)
其中，
Figure DEST_PATH_IMAGE017
是弹性腔内空气柱的体积，
Figure 527426DEST_PATH_IMAGE018
是弹性腔内空气柱的压力，n是一个多方指数，
Figure DEST_PATH_IMAGE019
，由于顺应性的调节过程中温度保持不变，所以
Figure 599419DEST_PATH_IMAGE020
；A是弹性腔的内截面积，h是弹性腔内空气柱的长度，
Figure DEST_PATH_IMAGE021
和
Figure 416065DEST_PATH_IMAGE022
分别为大气压以及液体作用于空气柱的压力；因此，如果给定了弹性腔顺应性
Figure DEST_PATH_IMAGE023
的具体数值，那么在硅胶管内截面积已知的情况下，通过上述的公式（5）便可得到弹性腔内所需空气柱的高度h。
4.根据权利要求1或2所述的一种研究剪切力和生化因子梯度调控细胞划痕修复的微流控系统，其特征在于，“圣诞树”型浓度梯度生成器（C-1）具有以下特点：第一，“圣诞树”型微通道的第一级混合通道的个数总是比入口个数多一个；第二，每一级的混合通道数量有序增加，即下一级混合通道的个数总是比这一级混合通道的个数多一个；第三，结构内所有混合通道的结构完全相同，从而具有相同的流阻；
设i表示“圣诞树”型微通道“树顶”端的入口编号，则C i =0，表示入口i的初始质量浓度为零，即不含生化因子的培养基被送入入口i；同理，C i =1表示入口i通入含有生化因子且初始浓度为1的溶液；因此4个入口共有24−2种混合含有/不含有生化因子培养基的方法；
由于上下级通道之间的水平通道阻值远小于混合通道的阻值，其阻值可以忽略不计，根据流体力学基本原理可以得出各混合通道内的流量均分入口处总流量；根据基尔霍夫定律，可以得到：i 1 =i 2 =i 3 =1/3（I 1 +I 2 +I 3 +I 4 ）；其中i 1 、i 2 、i 3 分别为三条混合通道的电流大小，I 1 、I 2 、I 3 、I 4 分别为“圣诞树”型微通道“树顶”端的入口的电流大小；设i表示“圣诞树”型微通道“树顶”端的入口编号，参数k i 表示入口i的流量Q i 与“圣诞树”型浓度梯度生成器（C-1）内总流量Q c-1 的比值，因此k i = Q i / Q c-1 ；细胞培养腔内的浓度梯度分布主要取决于参数k i 和每个入口处的初始浓度C i 。
5.根据权利要求3所述的一种研究剪切力和生化因子梯度调控细胞划痕修复的微流控系统，其特征在于，”圣诞树”型浓度梯度生成器（C-1）具有以下特点：第一，“圣诞树”型微通道的第一级混合通道的个数总是比入口个数多一个；第二，每一级的混合通道数量有序增加，即下一级混合通道的个数总是比这一级混合通道的个数多一个；第三，结构内所有混合通道的结构完全相同，从而具有相同的流阻；
设i表示“圣诞树”型微通道“树顶”端的入口编号，则C i =0，表示入口i的初始质量浓度为零，即不含生化因子的培养基被送入入口i；同理，C i =1表示入口i通入含有生化因子且初始浓度为1的溶液；因此4个入口共有24−2种混合含有/不含有生化因子培养基的方法；
由于上下级通道之间的水平通道阻值远小于混合通道的阻值，其阻值可以忽略不计，根据流体力学基本原理可以得出各混合通道内的流量均分入口处总流量；根据基尔霍夫定律，可以得到：i 1 =i 2 =i 3 =1/3（I 1 +I 2 +I 3 +I 4 ）；其中i 1 、i 2 、i 3 分别为三条混合通道的电流大小，I 1 、I 2 、I 3 、I 4 分别为“圣诞树”型微通道“树顶”端的入口的电流大小；设i表示“圣诞树”型微通道“树顶”端的入口编号，参数k i 表示入口i的流量Q i 与“圣诞树”型浓度梯度生成器（C-1）内总流量Q c-1 的比值，因此k i = Q i / Q c-1 ；细胞培养腔内的浓度梯度分布主要取决于参数k i 和每个入口处的初始浓度C i 。
6.根据权利要求1、2或5所述的一种研究剪切力和生化因子梯度调控细胞划痕修复的微流控系统，其特征在于，细胞培养腔（C-2）由上直线边界、下直线边界围成；制造细胞划痕时，通过控制三入口的流量比即可控制划痕尺寸，具体为：
设细胞培养基和胰蛋白酶溶液均为牛顿流体且忽略混合微通道内出入口边界效应的影响，在微通道内流体具有很低的雷诺数，因此认为微通道内液体流动为充分发展的层流，高度方向即
Figure 733170DEST_PATH_IMAGE024
方向的变化可以忽略不计；基于定常流和准定常假设，溶液在微通道当中的流速根据泊肃叶定律表达为：
Figure DEST_PATH_IMAGE025
(6)
其中p为压强，
Figure 335184DEST_PATH_IMAGE026
为溶液粘度系数，
Figure DEST_PATH_IMAGE027
为微通道的高度；进而得到单位宽度的流量：
Figure 827345DEST_PATH_IMAGE028
(7)
上式中，Q为流体的流量，W为微通道的宽度；在细胞培养基和胰蛋白酶两种溶液粘度系数近似相等的情况下，可以得到流体的宽度比等于流量比，即：
Figure DEST_PATH_IMAGE029
(8)
基于此原理，改变三入口处的流量分布即可实现细胞划痕尺寸的定量控制。
7.采用权利要求1-6任一所述系统的一种研究剪切力和生化因子梯度调控细胞划痕修复的微流控方法，其特征在于，步骤如下：
步骤一、在细胞融合单层上制造“划痕”条带
当细胞培养腔（C-2）底部形成细胞融合单层时，打开溶液出口（3），控制恒流微泵（A）向第一入口（1-1）、第二入口（1-2）、第三入口（1-3）、第四入口（1-4）中注入胰蛋白酶溶液，细胞培养基入口（2）中注入细胞培养基，由于层流特性溶液将沿着细胞培养腔（C-2）轴线方向平行流动，因此在细胞培养腔（C-2）内产生“培养基-胰蛋白酶溶液-培养基”三个流动溶液带；通过控制各个入口溶液之间的输入流量比例，来控制胰酶细胞消化液的溶液宽度和横向位置；利用胰酶细胞消化液降解蛋白、“消化”细胞单层，即在细胞融合单层上制造“划痕”条带；
步骤二、为细胞培养腔内的细胞加载剪切力和生化因子浓度梯度刺激；
向第一入口（1-1）、第二入口（1-2）、第三入口（1-3）、第四入口（1-4）按照不同的浓度和流量比组合通入含有或不含有生化因子的溶液、细胞培养基入口（2）通入流量恒定且不含生化因子的细胞培养基，且保证细胞培养基入口（2）和“树顶”端的4个入口流量总和之比要与生成细胞划痕时相同；则根据流体力学和物质传输原理，在细胞培养腔（C-2）内细胞划痕处产生沿芯片宽度方向不同且复杂空间分布的生化因子浓度梯度，而在细胞培养腔（C-2）底部产生定常的剪切力信号；
步骤三、组合微型细胞培养箱实现划痕修复动力学的实时监测
将恒流微泵（A）放置于微型细胞培养箱（B）内，开启气体数字混合器、控制及反馈装置，并用计算机读取实时的温度及气体浓度信息，微流控芯片放置于荧光显微镜上；将微型细胞培养箱（B）内的温度及气体浓度信息设定完成，而其实际值则利用传感器测量技术，并经过图像分析和数据处理后获得，实际值与参考值之差得到微型细胞培养箱（B）内设定温度及气体浓度参数偏差；然后，参数偏差经过反馈控制装置映射为控制信号；此控制信号进一步作用于气体数值混合器及温度及反馈装置，从而调整恒流微泵（A）所处环境的温度和气体浓度，进而为微流控芯片上的细胞提供适宜的微环境；反馈控制装置采用比例+积分+微分控制算法；通过荧光显微镜实时监测记录剪切力和生化因子空间梯度组合刺激条件下的细胞“划痕”修复动力学过程，并将荧光信号、细胞影像以及传感数据反馈给计算机系统。
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