CN108795759A - 用于剪应力与趋化因子定量调控细胞划痕修复实验的微流控系统及方法 - Google Patents

用于剪应力与趋化因子定量调控细胞划痕修复实验的微流控系统及方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于剪应力与趋化因子定量调控细胞划痕修复实验的微流控系统及方法，属于细胞生物学实验装置技术领域。该系统包括微流控芯片及其外围的加载、检测和控制装置。加载装置结合控制装置，可在细胞培养腔内制造内皮细胞“划痕”并在不同区域产生动态剪切力与趋化因子时空梯度的单独或组合刺激。检测装置可实时观测细胞“划痕”修复过程并将检测数据反馈给控制装置。结合双闭环串级控制技术，进一步调节加载装置，可定量调控内皮细胞“划痕”修复动力学过程。本发明可以用于研究动态剪应力和趋化因子时空浓度单独或协同刺激条件下定量调控细胞“划痕”修复的动力学过程的细胞生物学实验。

Description

用于剪应力与趋化因子定量调控细胞划痕修复实验的微流控 系统及方法
技术领域
本发明属于细胞生物学实验装置技术领域，是基于流体力学、微流控技术与自动控制原理设计的由微流控芯片及外围加载、检测和控制装置构成的用于血管内皮细胞“划痕”修复实验的微流控系统。
背景技术
内皮细胞增殖和迁移是血管内皮损伤修复、血管形成和血管新生的关键细胞生物学行为，受到体内体液流动引起的剪切力与可溶性趋化因子时空信号的动态调控。目前，细胞“划痕”修复实验成为研究血管内皮细胞增殖、迁移的重要手段。然而，常规的培养板、培养皿细胞“划痕”实验仅能静态地模拟细胞微环境及细胞外生化因子浓度，难以重现在体的动态微环境。微流控技术的发展为精确模拟细胞外微环境、观察和检测细胞微环境与细胞的相互作用提供了有效的实验平台。微流控芯片也成为开展细胞“划痕”实验理想的实验工具。然而，多数微流控芯片系统仅能对离体培养细胞加载单一的、静态的剪切力或趋化因子信号刺激。虽然少数微流控芯片系统能加载动态剪切力和趋化因子信号刺激，但这些微流控系统大多采用开环控制技术，难以实现对细胞行为的精准定量调控。另外，与频率相对较高的细胞外微环境剪切力和趋化因子信号相比，细胞内的生物学事件信号频率偏低，两者不在一个时间尺度。因此迫切需要设计和构建可开展血管内皮细胞“划痕”修复实验的微流控系统，引入双闭环串级控制技术，用于研究动态剪切力与趋化因子时空梯度定量调控细胞“划痕”修复动力学过程的细胞生物学实验。
发明内容
本发明的设计目的在于提供一种具有动态剪切力与趋化因子时空梯度、便于制造细胞“划痕”的微流控芯片，可通过外围加载、检测和控制装置对细胞“划痕”修复动力学过程进行定量调控，并形成微流控系统。设计中利用流体力学原理和微流控芯片技术，通过加载装置调控入口溶液及其流量，可以在细胞培养腔内制造宽度可调的细胞“划痕”条带，并可以在不同区域产生单独剪切力、单独趋化因子时空梯度、以及剪切力与趋化因子时空梯度组合刺激。检测装置可实时观察、监测内皮细胞“划痕”修复过程，并将检测和传感数据反馈给控制系统。结合双闭环串级控制技术，可进一步调节加载装置，定量调控在剪切力和趋化因子单独或组合刺激条件下细胞“划痕”修复的动力学过程。
本发明的技术方案：
用于剪应力与趋化因子定量调控细胞划痕修复实验的微流控系统，该系统包括微流控芯片、加载与细胞“划痕”制造装置、细胞“划痕”修复实验检测装置和反馈控制装置，如图1所示；
所述的微流控芯片集成了“圣诞树”型浓度梯度生成器、胰酶细胞消化液入口、第二细胞培养基入口、细胞培养腔、液体内出口和液体外出口，其中“圣诞树”型浓度梯度生成器由趋化因子溶液入口、第一细胞培养基入口和“圣诞树”型微通道构成；“圣诞树”型微通道的一端分别设有趋化因子溶液入口和第一细胞培养基入口，另一端汇集并与细胞培养腔相通；细胞培养腔包括三个入口和上、中、下三个出口，三个入口分别与“圣诞树”型微通道、胰酶细胞消化液入口和第二细胞培养基入口相通，中出口与液体内出口相通，上、下出口分别通过液体输出上通道和液体输出下通道汇合至液体外出口；如图2所示；细胞培养腔由上曲线边界、下曲线边界、上直线边界、下直线边界围成。
所述的加载与细胞“划痕”制造装置由4组可编程注射泵和注射器构成，4个注射器分别与趋化因子溶液入口、第一细胞培养基入口、胰酶细胞消化液入口和第二细胞培养基入口相通，用于注射细胞培养基、趋化因子溶液或胰酶细胞消化液；
所述的细胞“划痕”实验检测装置C包括倒置荧光显微镜、压力传感器和流量传感器，用于实时监测细胞培养腔内微环境的实际状态；
所述的反馈控制装置包括计算机，分别和加载与细胞“划痕”制造装置和细胞“划痕”修复实验检测装置连接；用于接收荧光信号、细胞图像及传感数据，并驱动可编程注射泵对注射流量进行定量控制。
细胞培养腔的高度与其宽度或长度之比小于10-2。
根据流体力学原理，细胞培养腔内液体流动主要受压力梯度和上、下平行平板摩擦力的影响，侧面边界摩擦力的影响可忽略不计。沿培养腔高度取平均后得到的平均流速可用类似于处理平面势流的方法求得。因此可以根据已知复势决定的流线形状确定流动腔的边界，构造出具有流体驻点，即具有无剪切力区域的细胞培养腔。
在Z＝x+iy平面上引进复势
式中和φ(x,y)分别是平均流速的势函数和流函数，在我们熟知的流动复势中，W(Z)＝AZn(其中A是实数，n>1)对应一类重要的平面势流。由于
Z＝x+iy＝reiθ＝r(cosθ+isinθ) (2)
其中r为Z的模，θ为Z的幅角。特别地，取n＝2，所以势函数和流函数φ(x,y)满足
因此，等势线和流线分别为
r2cos(2θ)＝const (4)
与
r2sin(2θ)＝const (5)
图3给出了平面势流W(Z)＝AZ2的流线(实线)和等势线(虚线)，坐标原点处的流速为零，即流体驻点。利用该平面势流的特点，构造如图4所示的细胞培养腔，使上下曲线边界与沿细胞培养腔轴线方向对称的流线重合，满足方程
和
式中
其中L为细胞培养腔的总长度，W为细胞培养腔入口端宽度，θ和r是极坐标系下点的极角和极径，r0是上曲线边界左端点的极径，θ0是上曲线边界左端点极角的补角，θ1是上曲线边界右端点的极角。
直线边界与通过原点的流线重合，满足方程
根据平面势流理论，当液体内出口关闭或内皮细胞阻塞液体内出口时，原点处的平均流速趋近于0，即形成了流体驻点，则驻点附近区域内剪切力也近似等于零，即无剪切力区域。
用于剪应力与趋化因子定量调控细胞划痕修复实验的微流控方法，步骤如下：
步骤一、在内皮细胞融合单层上制造“划痕”条带
当细胞培养腔底部形成内皮细胞融合单层时，打开所有液体出口，控制可编程注射泵向趋化因子溶液入口、第一细胞培养基入口和第二细胞培养基入口中注入细胞培养基，向胰酶细胞消化液入口中注入胰酶细胞消化液，由于层流特性溶液将沿着细胞培养腔轴线方向平行流动，因此在细胞培养腔内产生“培养基-胰酶消化液-培养基”三个流动溶液带；通过控制各个入口溶液之间的输入流量比例，来控制胰酶细胞消化液的溶液宽度和横向位置；利用胰酶细胞消化液降解蛋白、“消化”细胞单层，即在内皮细胞融合单层上制造“划痕”条带；
步骤二、为细胞培养腔内的细胞加载剪切力和生化因子时空梯度刺激，并进行细胞“划痕”修复动力学过程的实时监测；
关闭胰酶细胞消化液入口和液体内出口，向趋化因子溶液入口、第一细胞培养基入口分别通入流量恒定且相等的趋化因子溶液和不含趋化因子的细胞培养基，向第二细胞培养基入口通入流量随时间变化的细胞培养基，则根据流体力学和物质传输原理，在“圣诞树”型浓度梯度生成器与细胞培养腔的连通处产生沿横向方向线性空间分布的趋化因子浓度梯度，而在细胞培养腔底部产生动态变化的剪切力信号；进而根据细胞培养腔中流体的层流特性及存在的流体驻点，在细胞培养腔内形成单独剪切力、单独趋化因子时空梯度、剪切力与趋化因子时空梯度信号组合的区域；以趋化因子溶液与细胞培养基的溶液分界线为界，溶液分界线以下区域内的贴壁细胞受到剪切力单独刺激，溶液分界线以上区域内的贴壁细胞受到趋化因子与剪切力组合刺激，而驻点区域仅受到趋化因子单独刺激(如图5所示)，通过荧光显微镜实时监测记录动态剪切力和趋化因子时空梯度单独或组合刺激条件下的细胞“划痕”修复动力学过程，并将荧光信号、细胞影像以及传感数据反馈给计算机系统；
步骤三、采用双闭环串级控制技术对细胞“划痕”修复动力学过程进行定量调控
如图6所示，双闭环串级控制包括外环控制过程和内环控制过程；内环控制过程负责对微环境关键过程参数进行检测和控制，而外环控制过程则是对细胞迁移与增殖所带来的细胞密度变化进行直接控制。
所述双闭环串级控制的具体过程如下：
(1)外环控制过程
如图6(a)所示，在控制系统中，参考信号为细胞“划痕”的目标修复曲线，首先，细胞密度设定值解算器将此目标修复曲线离散化得到细胞密度的参考值C*，将C*作为直接的控制目标；然后，根据闭环系统的反馈控制原理，获取细胞密度的实际值C并将其与参考值C*做比较，得到当前偏差值ΔC＝C*-C；接下来，依据偏差值ΔC对微环境进行干涉，从而使ΔC减小至0，即驱动细胞密度的实际值C等于其参考值C*；
依据偏差值ΔC对微环境进行干涉的步骤如下：首先，偏差值ΔC经过外环反馈控制器计算，更新微环境参数设定值；然后，内环控制子模块则负责将微环境的实际参数调整到更新后的设计值；进而胞外微环境发生变化后，血管内皮细胞的迁移和增殖必然受其影响，从而改变实际的细胞密度，达到使偏差值ΔC趋向为0的目标；
所述细胞密度的实际值C通过传感器获取的图像数据，并经过机器视觉算法处理分析后间接获得；
(2)内环控制过程
如图6(b)所示，其目标信号是经外环反馈控制器更新的微环境参数设定值，微环境参数包括趋化因子的浓度分布和剪切力的梯度分布；首先，内环的微环境参数参考值由外环自动设定，而其实际值则利用传感器测量技术，并经过图像分析和数据处理后获得，实际值与参考值之差得到微环境参数偏差；然后，微环境参数偏差经过内环反馈控制器映射为控制信号；此控制信号进一步作用于可编程注射泵，从而调整其注射流量，进而影响胞外微环境；与外环控制过程目的相同，内环控制过程目的在于将微环境参数偏差减小到0，即驱动微环境参数实际值到达其设定值；
所述的外环反馈控制器和内环反馈控制器采用PID(Proportional+Integral+Derivative)控制算法、数据驱动(data-driven)无模型控制算法、自适应控制(nonlinearadaptive control)算法或神经网络模糊控制(neuro-fuzzy control)算法。
本发明的有益效果：本发明可方便地开展血管内皮细胞“划痕”修复实验，用于研究动态剪切力与趋化因子时空梯度定量调控细胞“划痕”修复的动力学过程，也可以普遍用于研究动态细胞环境调控离体细胞生物学行为及其机制的细胞生物学研究实验。本发明系统中必然存在一定程度的外在因素干扰，因此采用闭环反馈控制系统来保证目标信号的实际值最终足够趋近到其参考值。
附图说明
图1是用于细胞“划痕”修复实验的微流控芯片系统结构图。
图2是微流控芯片A微通道结构俯视图。
图3是复势W(Z)＝AZ2决定的平面势流流场分布图。
图4是细胞培养腔3示意图。
图5是细胞培养腔3中剪应力和趋化因子时空梯度分布示意图。
图6是血管内皮细胞“划痕”修复实验中双闭环串级控制技术示意图，a为外环控制过程，b为内环控制过程。
图中：A微流控芯片；B加载与细胞“划痕”制造装置；C细胞“划痕”修复实验检测装置；D反馈控制装置；A-1“圣诞树”型浓度梯度生成器；0胰酶细胞消化液入口；1“圣诞树”型微通道；2第二细胞培养基入口；3细胞培养腔；4液体内出口；5液体外出口；1-1趋化因子溶液入口；1-2第一细胞培养基入口；3-1上曲线边界；3-2下曲线边界；3-3上直线边界；3-4下直线边界；5-1液体输出上通道；5-2液体输出下通道。
具体实施方式
图1所示是用于细胞“划痕”修复实验的微流控芯片系统结构图，该系统包括微流控芯片A、加载与细胞“划痕”制造装置B、细胞“划痕”实验检测装置C和反馈控制装置D。
所述的微流控芯片A集成了“圣诞树”型浓度梯度生成器A-1、胰酶细胞消化液入口0、第二细胞培养基入口2、细胞培养腔3、液体内出口4和液体外出口5。其中“圣诞树”型浓度梯度生成器A-1由趋化因子溶液入口1-1、第一细胞培养基入口1-2和“圣诞树”型微通道1构成；“圣诞树”型微通道1的一端分别设有趋化因子溶液入口1-1和第一细胞培养基入口1-2，另一端汇集并与细胞培养腔3相通；细胞培养腔3包括三个入口和上、中、下三个出口，三个入口分别与“圣诞树”型微通道1、胰酶细胞消化液入口0和第二细胞培养基入口2相通，中出口与液体内出口4相通，上、下出口分别通过液体输出上通道5-1和液体输出下通道5-2汇合至液体外出口5；如图2所示；细胞培养腔3由上曲线边界3-1、下曲线边界3-2、上直线边界3-3、下直线边界3-4围成。
微流控芯片A所有通道和腔室结构采用标准化的微加工方法用PDMS制作完成，并与洁净盖玻片永久键合密封，构成透明的生物相容性良好的玻璃-PDMS型芯片。微通道的结构参数如下：细胞培养腔3的总长度L和入口端宽度W分别为2厘米和500微米，直线边界总长度为2厘米，“圣诞树”型微通道宽度为50微米，所有微通道的高度为30微米。
所述的加载与细胞“划痕”制造装置B由4组可编程注射泵和注射器构成，4个注射器分别与趋化因子溶液入口1-1、第一细胞培养基入口1-2、胰酶细胞消化液入口0和第二细胞培养基入口2相通，用于注射细胞培养基、趋化因子溶液或胰酶细胞消化液；
所述的细胞“划痕”实验检测装置C包括倒置荧光显微镜、压力传感器和流量传感器，用于实时监测细胞培养腔3内微环境的实际状态；
所述的反馈控制装置D包括计算机，分别和加载与细胞“划痕”制造装置B和细胞“划痕”实验检测装置C连接；用于接收荧光信号、细胞图像及传感数据，并驱动可编程注射泵对注射流量进行定量控制。
用于剪应力与趋化因子定量调控细胞划痕修复实验的微流控方法，步骤如下：
步骤一、在内皮细胞融合单层上制造“划痕”条带
当细胞培养腔3底部形成内皮细胞融合单层时，打开所有液体出口，控制可编程注射泵向趋化因子溶液入口1-1、第一细胞培养基入口1-2和第二细胞培养基入口2中注入细胞培养基，向胰酶细胞消化液入口0中注入胰酶细胞消化液，由于层流特性溶液将沿着细胞培养腔3轴线方向平行流动，因此在细胞培养腔3内产生“培养基-胰酶消化液-培养基”三个流动溶液带；通过控制各个入口溶液之间的输入流量比例，来控制胰酶细胞消化液的溶液宽度和横向位置；利用胰酶细胞消化液降解蛋白、“消化”细胞单层，即在内皮细胞融合单层上制造“划痕”条带；
步骤二、为细胞培养腔3内的细胞加载剪切力和生化因子时空梯度刺激，并进行细胞“划痕”修复动力学过程的实时监测；
关闭胰酶细胞消化液入口0和液体内出口4，向趋化因子溶液入口1-1、第一细胞培养基入口1-2分别通入流量恒定且相等的趋化因子溶液和不含趋化因子的细胞培养基，向第二细胞培养基入口2通入流量随时间变化的细胞培养基，则根据流体力学和物质传输原理，在“圣诞树”型浓度梯度生成器1与细胞培养腔3的连通处产生沿横向方向线性空间分布的趋化因子浓度梯度，而在细胞培养腔3底部产生动态变化的剪切力信号；进而根据细胞培养腔3中流体的层流特性及存在的流体驻点，在细胞培养腔内形成单独剪切力、单独趋化因子时空梯度、剪切力与趋化因子时空梯度信号组合的区域；以趋化因子溶液与细胞培养基的溶液分界线为界，溶液分界线以下区域内的贴壁细胞受到剪切力单独刺激，溶液分界线以上区域内的贴壁细胞受到趋化因子与剪切力组合刺激，而驻点区域仅受到趋化因子单独刺激(如图5所示)，通过荧光显微镜实时监测记录动态剪切力和趋化因子时空梯度单独或组合刺激条件下的细胞“划痕”修复动力学过程，并将荧光信号、细胞影像以及传感数据反馈给计算机系统；
步骤三、采用双闭环串级控制技术对细胞“划痕”修复动力学过程进行定量调控
如图6所示，双闭环串级控制包括外环控制过程和内环控制过程；内环控制过程负责对微环境关键过程参数进行检测和控制，而外环控制过程则是对细胞迁移与增殖所带来的细胞密度变化进行直接控制，具体过程如下：
(1)外环控制过程
如图6(a)所示，在控制系统中，参考信号为细胞“划痕”的目标修复曲线，首先，细胞密度设定值解算器将此目标修复曲线离散化得到细胞密度的参考值C*，将C*作为直接的控制目标；然后，根据闭环系统的反馈控制原理，获取细胞密度的实际值C并将其与参考值C*做比较，得到当前偏差值ΔC＝C*-C；接下来，依据偏差值ΔC对微环境进行干涉，从而使ΔC减小至0，即驱动细胞密度的实际值C等于其参考值C*；
依据偏差值ΔC对微环境进行干涉的步骤如下：首先，偏差值ΔC经过外环反馈控制器计算，更新微环境参数设定值；然后，内环控制子模块则负责将微环境的实际参数调整到更新后的设计值；进而胞外微环境发生变化后，血管内皮细胞的迁移和增殖必然受其影响，从而改变实际的细胞密度，达到使偏差值ΔC趋向为0的目标；
所述细胞密度的实际值C通过CCD高速相机等传感器获取的图像数据，并经过机器视觉算法处理分析后间接获得；
(2)内环控制过程
如图6(b)所示，其目标信号是经外环反馈控制器更新的微环境参数设定值，微环境参数包括趋化因子的浓度分布和剪切力的梯度分布；首先，内环的微环境参数参考值由外环自动设定，而其实际值则利用荧光成像等传感器测量技术，并经过图像分析和数据处理后获得，实际值与参考值之差得到微环境参数偏差；然后，微环境参数偏差经过内环反馈控制器映射为控制信号；此控制信号进一步作用于可编程注射泵，从而调整其注射流量，进而影响胞外微环境；与外环控制过程目的相同，内环控制过程目的在于将微环境参数偏差减小到0，即驱动微环境参数实际值到达其设定值；
所述的外环反馈控制器和内环反馈控制器采用PID(Proportional+Integral+Derivative)控制算法、数据驱动(data-driven)无模型控制算法、自适应控制(nonlinearadaptive control)算法或神经网络模糊控制(neuro-fuzzy control)算法。

Claims (5)

1.一种用于剪应力与趋化因子定量调控细胞划痕修复实验的微流控系统，其特征在于，该系统包括微流控芯片(A)、加载与细胞“划痕”制造装置(B)、细胞“划痕”修复实验检测装置(C)和反馈控制装置(D)；
所述的微流控芯片(A)集成了“圣诞树”型浓度梯度生成器(A-1)、胰酶细胞消化液入口(0)、第二细胞培养基入口(2)、细胞培养腔(3)、液体内出口(4)和液体外出口(5)，其中“圣诞树”型浓度梯度生成器(A-1)由趋化因子溶液入口(1-1)、第一细胞培养基入口(1-2)和“圣诞树”型微通道(1)构成；“圣诞树”型微通道(1)的一端分别设有趋化因子溶液入口(1-1)和第一细胞培养基入口(1-2)，另一端汇集并与细胞培养腔(3)相通；细胞培养腔(3)包括三个入口和上、中、下三个出口，三个入口分别与“圣诞树”型微通道(1)、胰酶细胞消化液入口(0)和第二细胞培养基入口(2)相通，中出口与液体内出口(4)相通，上、下出口分别通过液体输出上通道(5-1)和液体输出下通道(5-2)汇合至液体外出口(5)；细胞培养腔(3)由上曲线边界(3-1)、下曲线边界(3-2)、上直线边界(3-3)、下直线边界(3-4)围成；
所述的加载与细胞“划痕”制造装置(B)由4组可编程注射泵和注射器构成，4个注射器分别与趋化因子溶液入口(1-1)、第一细胞培养基入口(1-2)、胰酶细胞消化液入口(0)和第二细胞培养基入口(2)相通，用于注射细胞培养基、趋化因子溶液或胰酶细胞消化液；
所述的细胞“划痕”修复实验检测装置(C)包括倒置荧光显微镜、压力传感器和流量传感器，用于实时监测细胞培养腔(3)内微环境的实际状态；
所述的反馈控制装置(D)包括计算机，分别和加载与细胞“划痕”制造装置(B)和细胞“划痕”修复实验检测装置(C)连接；用于接收荧光信号、细胞图像及传感数据，并驱动可编程注射泵对注射流量进行定量控制。
2.根据权利要求1所述的微流控系统，其特征在于，所述的细胞培养腔(3)的高度与其宽度或长度之比小于10-2。
3.根据权利要求1或2所述的微流控系统，其特征在于，所述上曲线边界(3-1)和下曲线边界(3-2)由公式
和
确定，式中
其中，L为细胞培养腔的总长度，W为细胞培养腔入口端宽度，r和θ是极坐标系下点的极角和极径，r0是上曲线边界左端点的极径，θ0是上曲线边界左端点极角的补角，θ1是上曲线边界右端点的极角；
上直线边界(3-3)和下直线边界(3-4)满足方程
4.采用权利要求1-3任一所述微流控系统的微流控方法，其特征在于，步骤如下：
步骤一、在内皮细胞融合单层上制造“划痕”条带；
当细胞培养腔(3)底部形成内皮细胞融合单层时，打开所有液体出口，控制可编程注射泵向趋化因子溶液入口(1-1)、第一细胞培养基入口(1-2)和第二细胞培养基入口(2)中注入细胞培养基，向胰酶细胞消化液入口(0)中注入胰酶细胞消化液，由于层流特性溶液将沿着细胞培养腔(3)轴线方向平行流动，因此在细胞培养腔(3)内产生“培养基-胰酶消化液-培养基”三个流动溶液带；通过控制各个入口溶液之间的输入流量比例，来控制胰酶细胞消化液的溶液宽度和横向位置；利用胰酶细胞消化液降解蛋白、“消化”细胞单层，即在内皮细胞融合单层上制造“划痕”条带；
步骤二、为细胞培养腔(3)内的细胞加载剪切力和生化因子时空梯度刺激，并进行细胞“划痕”修复动力学过程的实时监测；
关闭胰酶细胞消化液入口(0)和液体内出口(4)，向趋化因子溶液入口(1-1)、第一细胞培养基入口(1-2)分别通入流量恒定且相等的趋化因子溶液和不含趋化因子的细胞培养基，向第二细胞培养基入口(2)通入流量随时间变化的细胞培养基，则根据流体力学和物质传输原理，在“圣诞树”型浓度梯度生成器(1)与细胞培养腔(3)的连通处产生沿横向方向线性空间分布的趋化因子浓度梯度，而在细胞培养腔(3)底部产生动态变化的剪切力信号；进而根据细胞培养腔(3)中流体的层流特性及存在的流体驻点，在细胞培养腔内形成单独剪切力、单独趋化因子时空梯度、剪切力与趋化因子时空梯度信号组合的区域；以趋化因子溶液与细胞培养基的溶液分界线为界，溶液分界线以下区域内的贴壁细胞受到剪切力单独刺激，溶液分界线以上区域内的贴壁细胞受到趋化因子与剪切力组合刺激，而驻点区域仅受到趋化因子单独刺激，通过荧光显微镜实时监测记录动态剪切力和趋化因子时空梯度单独或组合刺激条件下的细胞“划痕”修复动力学过程，并将荧光信号、细胞影像以及传感数据反馈给计算机系统；
步骤三、采用双闭环串级控制技术对细胞“划痕”修复动力学过程进行定量调控；
双闭环串级控制包括外环控制过程和内环控制过程；内环控制过程负责对微环境关键过程参数进行检测和控制，而外环控制过程则是对细胞迁移与增殖所带来的细胞密度变化进行直接控制。
5.根据权利要求4所述的微流控方法，其特征在于，所述双闭环串级控制的具体过程如下：
(1)外环控制过程
在控制系统中，参考信号为细胞“划痕”的目标修复曲线，首先，细胞密度设定值解算器将此目标修复曲线离散化得到细胞密度的参考值C*，将C*作为直接的控制目标；然后，根据闭环系统的反馈控制原理，获取细胞密度的实际值C并将其与参考值C*做比较，得到当前偏差值ΔC＝C*-C；接下来，依据偏差值ΔC对微环境进行干涉，从而使ΔC减小至0，即驱动细胞密度的实际值C等于其参考值C*；
依据偏差值ΔC对微环境进行干涉的步骤如下：首先，偏差值ΔC经过外环反馈控制器计算，更新微环境参数设定值；然后，内环控制子模块则负责将微环境的实际参数调整到更新后的设计值；进而胞外微环境发生变化后，血管内皮细胞的迁移和增殖必然受其影响，从而改变实际的细胞密度，达到使偏差值ΔC趋向为0的目标；
所述细胞密度的实际值C通过传感器获取的图像数据，并经过机器视觉算法处理分析后间接获得；
(2)内环控制过程
其目标信号是经外环反馈控制器更新的微环境参数设定值，微环境参数包括趋化因子的浓度分布和剪切力的梯度分布；首先，内环的微环境参数参考值由外环自动设定，而其实际值则利用传感器测量技术，并经过图像分析和数据处理后获得，实际值与参考值之差得到微环境参数偏差；然后，微环境参数偏差经过内环反馈控制器映射为控制信号；此控制信号进一步作用于可编程注射泵，从而调整其注射流量，进而影响胞外微环境；与外环控制过程目的相同，内环控制过程目的在于将微环境参数偏差减小到0，即驱动微环境参数实际值到达其设定值；
所述的外环反馈控制器和内环反馈控制器采用PID控制算法、数据驱动无模型控制算法、自适应控制算法或神经网络模糊控制算法。
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