CN113926498A - 一种可促进类脑器官成熟的层流低剪切力微流控芯片的制备方法 - Google Patents

一种可促进类脑器官成熟的层流低剪切力微流控芯片的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可促进类脑器官成熟的层流低剪切力微流控芯片的制备方法，属于微流控芯片领域，包括微流控芯片的制备，包括以下步骤：步骤一：用激光切割亚克力板，将亚克力板分为6个PMMA模块，两两一组分为凹模部分、夹具部分和凸模部分三个部分；步骤二：将凸模部分的其中两块PMMA模块，分别放置在凹模部分的凹槽中，并进行浇注，获得芯片，芯片包括两块不同的PDMS板，分别为芯片上层和芯片下层。步骤三：取一片6孔transwell板的1个小室底部的PET多孔膜，将芯片上层和芯片下层与多孔膜进行接合。即能够形成层流低剪切力力的双层腔室类脑芯片的设计和制作，根据类胚体成熟期的变化，接合流体力学分析所得出的培养基的注射速度。

Description

一种可促进类脑器官成熟的层流低剪切力微流控芯片的制备 方法
技术领域
本发明涉及微流控芯片技术领域，尤其涉及可促进类脑器官成熟的层流低剪切力微流控芯片的制备方法。
背景技术
类器官是近年来干细胞研究领域取得的一个突破性进展，是一种3维培养方式。区别于传统的细胞2维培养，类器官由能够代表某种器官功能的几种细胞组成，与对应的器官拥有类似的空间组织并能够重现对应器官的部分功能，从而提供一个高度生理相关系统。类脑器官即从干细胞诱导分化得到的脑器官部分功能和结构的模拟体。目前，诱导人脑类器官最常用的干细胞为人诱导多能干细胞，即human induced pluripoten stem cell(hipsc)。由人诱导多能干细胞生成类脑器官的过程包括EB formation即形成类胚体(第0-5天)、induction诱导类胚体(第5-7天)、expansion类胚体扩张(第7-10天)、organoidmaturation类脑器官成熟(第10-40天)、类脑器官进一步成熟(40天之后)几个阶段。在目前广泛应用的经典培养方案中，从第10天类器官进入成熟期开始，需将培养类器官的培养皿放置在定轨震荡器上进行振荡培养。
能够在二氧化碳培养箱中长期使用的定轨震荡器需要具有耐高温、耐高湿度、耐高二氧化碳水平等特点，是专业性极高的装置，价格较昂贵，且该装置重量一般在20㎏以上，尺寸一般为35×30×15cm左右，体积大，重量高，放置在培养箱中会占据较大空间，且安装、移动较为复杂。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺陷，而提出的可促进类脑器官成熟的层流低剪切力微流控芯片的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种可促进类脑器官成熟的层流低剪切力微流控芯片的制备方法，包括微流控芯片的制备，包括以下步骤：
步骤一：用激光切割亚克力板，将亚克力板分为6个PMMA模块，两两一组分为凹模部分、夹具部分和凸模部分三个部分；
步骤二：将凸模部分的其中两块PMMA模块，分别放置在凹模部分的凹槽中，并进行浇注，获得芯片，芯片包括两块不同的PDMS板，分别为芯片上层和芯片下层；
步骤三：取一片6孔transwell板的1个小室底部的PET多孔膜，将所述芯片上层和所述芯片下层与多孔膜进行接合，用夹具部分将所述芯片上层和所述芯片下层进行固定，安装不锈钢弯针并连接Tygon管；
步骤四：将芯片进行消毒处理，完成芯片的制备。
进一步地，用于步骤一中，所述凹模部分包括凹槽板、底板和薄板，所述凹槽板和所述薄板的中间位置均开设有正方形凹槽，所述凹槽板和所述底板两块作为浇注芯片的凹模；
所述夹具部分包括上层夹板和下层夹板，所述上层夹板和所述下层夹板两块作为芯片的夹具，所述上层夹板和所述下层夹板内均矩形阵列开设有若干微孔，每条矩形阵列线上分布有三个微孔，所述上层夹板的内部开设有与凸模部分相配合的圆形槽；
所述凸模部分包括凸模一和凸模二，所述凸模一和凸模二均为圆形结构，所述圆形结构的半径与两两所述微孔之间的间距相同，
其中，所述凸模一和凸模二厚度分别为5mm和3mm，且均对称设有与外壁相切的延伸板，所述延伸板的厚度为2mm。
进一步地，用于步骤二中，所述延伸板与所述凸模一配合放入凹模部分凹槽时，所述延伸板的底壁与所述凸模一的底壁位于同一水平线，所述延伸板与所述凸模二配合放入凹模部分凹槽时，所述凸模二被所述延伸板对称分割，且所述延伸板顶壁和底壁与所述凸模二端面的最近距离均为1.5mm。
进一步地，用于步骤二中，所述芯片上层为利用所述凸模一和所述延伸板作为凸模浇注而成的PDMS板，所述芯片下层为利用所述凸模二和所述延伸板作为凸模浇注而成的PDMS板。
进一步地，用于步骤二中，浇注时，将固化剂和PDMS以10:1的比例均匀混合，排气泡后浇注到凹模部分的凹槽中，抽真空排气泡30分钟后80℃烘箱固化1h，待PDMS固化后将制得的PDMS板从模具上剥离，并在延伸板浇注位置上打孔。
进一步地，用于步骤三中，按凸模一成型PDMS板在上凸模二成型PDMS板在下的顺序为将6孔Transwell板的薄膜放置于两个PDMS板之间进行贴合，分别将夹具部分上层夹板在上，下层夹板在下夹持两块贴合的PDMS板。
进一步地，用于步骤四中，将两块贴合的PDMS板放置在紫外下照射30min，通过Tygon管向通道内注入酒精30min对装置进行消毒处理，并放入烘箱1h进行烘干处理。
进一步地，还包括基于微流控芯片的片上培养方法，具体步骤如下：
步骤S1：按照标准培养流程，将在静态条件下培养至第10天的且处于扩张期末的类胚体(EB)放入打开的芯片的多孔膜上，将芯片封接固定，通过管道向上下腔室同时注入成熟培养基；
步骤S2：根据类胚体的发育程度和体积的增加，将微流体的注射速度进行调整。
进一步地，用于上述步骤S2培养期的注射速度中，第10-20天注射速度用24μl/h-30μl/h，第20-30天注射速度用30μl/h-34μl/h，第30-40天注射速度用34μl/h-40μl/h。
相比于现有技术，本发明的有益效果在于：1、可以在类脑器官的成熟期培养过程中避免定轨震荡器的使用，减少了硬件方面的制约；同时微流控芯片的加工成本极低，可以大大节约实验成本；芯片体积小，减少了空间要求。
2、结合了微流控的可控制流体循环和装置特有的层流且具有低剪切力的力学性能，能够加速类脑器官的成熟，缩短实验时间。
3、芯片采用双层结构，由具备良好生物相容性的多孔膜隔开，可以使类器官在成熟期的培养过程中不会沉淀到培养腔室的最底部，而是类似“悬浮”状态，类器官上下都可以充分接触培养基，能够加快实验进程，且使得类器官的神经发育更加快速、完善，使类器官的体积更大。
使得培养类脑器官的腔室中培养基的流动状态为层流且具有低剪切力，可以通过调整进液通道的尺寸、进液速度等，来调整流体的状态，从而使得类脑器官在腔室中的受力状态能够模拟在定轨震荡器上的受力情况，加之微流控装置能够提供新鲜的培养基，从而使得该装置能够在类脑器官的成熟期取代定轨震荡器的使用，并且能够加快类脑器官的成熟。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
图1为本发明提出的可促进类脑器官成熟的层流低剪切力微流控芯片的制备方法的步骤流程图；
图2为本发明提出的可促进类脑器官成熟的层流低剪切力微流控芯片的制备方法的凹模部分的结构示意图；
图3为本发明提出的可促进类脑器官成熟的层流低剪切力微流控芯片的制备方法的夹具部分的结构示意图；
图4为本发明提出的可促进类脑器官成熟的层流低剪切力微流控芯片的制备方法的凸模部分及其所成型通道液体流向的示意图；
图5为本发明提出的可促进类脑器官成熟的层流低剪切力微流控芯片的制备方法的芯片部分的结构示意图；
图6为本发明提出的可促进类脑器官成熟的层流低剪切力微流控芯片的制备方法的夹具部分和芯片示意图。
图中：1、凹模部分；1a、凹槽板；1b、底板；1c、薄板；2、夹具部分；2a、上层夹板；2b、下层夹板；3、凸模部分；3a、凸模一；3b、凸模二；3c、延伸板；4、芯片；4a、芯片上层；4b、芯片下层。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
根据本发明的具体实施例，提供了一种可促进类脑器官成熟的层流低剪切力微流控芯片的制备方法。
如图1所示，一种可促进类脑器官成熟的层流低剪切力微流控芯片的制备方法，包括微流控芯片的制备，包括以下步骤：
步骤S101：用激光切割亚克力板，将亚克力板分为6个PMMA模块，两两一组分为凹模部分1、夹具部分2和凸模部分3三个部分；
步骤S103：将凸模部分3的其中两块PMMA模块，分别放置在凹模部分1的凹槽中，并进行浇注，获得芯片4，芯片4包括两块不同的PDMS板，分别为芯片上层4a和芯片下层4b；
步骤S105：取一片6孔transwell板的1个小室底部的PET多孔膜，将所述芯片上层4a和所述芯片下层4b与多孔膜进行接合，用夹具部分2将所述芯片上层4a和所述芯片下层4b进行固定，安装不锈钢弯针并连接Tygon管；
步骤S107：将芯片4进行消毒处理，完成芯片4的制备。
如图2-6所示，在本申请的具体实施例中，用于步骤S101中，所述凹模部分1包括凹槽板1a、底板1b和薄板1c，所述凹槽板1a和所述薄板1c的中间位置均开设有正方形凹槽，所述凹槽板1a和所述底板1b两块作为浇注芯片4的凹模；
具体的，凹模部分1的长宽比为40X50，凹槽板1a和底板1b的厚度分别为6mm和3mm，薄板的厚度为1mm，凹槽板1a中间的正方形凹槽边长为30mm。
所述夹具部分2包括上层夹板2a和下层夹板2b，所述上层夹板2a和所述下层夹板2b两块作为芯片4的夹具，所述上层夹板2a和所述下层夹板2b内均矩形阵列开设有若干微孔，每条矩形阵列线上分布有三个微孔，所述上层夹板2a的内部开设有与凸模部分3相配合的圆形槽；
具体的，微孔的直径为3mm，同一阵列线上的微孔中心距为12.5mm，上层夹板2a和下层夹板2b的厚度均为3mm。
所述凸模部分3包括凸模一3a和凸模二3b，所述凸模一3a和凸模二3b均为圆形结构，所述圆形结构的半径与两两所述微孔之间的间距相同，其中，所述凸模一3a和凸模二3b厚度分别为5mm和3mm，且均对称设有与外壁相切的延伸板3c，所述延伸板3c的厚度为2mm。
如图4所示，在本申请的具体实施例中，用于步骤二中，所述延伸板3c与所述凸模一3a配合放入凹模部分1凹槽时，所述延伸板3c的底壁与所述凸模一3a的底壁位于同一水平线，所述延伸板3c与所述凸模二3b配合放入凹模部分1凹槽时，所述凸模二3b被所述延伸板3c对称分割，且所述延伸板3c顶壁和底壁与所述凸模二3b端面的最近距离均为1.5mm。
如图5所示，在本申请的具体实施例中，用于步骤S103中，所述芯片上层4a为利用所述凸模一3a和所述延伸板3c作为凸模浇注而成的PDMS板，所述芯片下层4b为利用所述凸模二3b和所述延伸板3c作为凸模浇注而成的PDMS板。
具体的，利用凸模一3a和延伸板3c浇注时，浇注高度与延伸板3c顶壁平齐，利用凸模二3b和延伸板3c浇注时，将薄板1c加在凹槽板1a上，浇注高度与凹槽板1a顶壁平齐。
在本申请的具体实施例中，用于步骤S103中，浇注时，将固化剂和PDMS以10:1的比例均匀混合，排气泡后浇注到凹模部分1的凹槽中，抽真空排气泡30分钟后80℃烘箱固化1h，待PDMS固化后将制得的PDMS板从模具上剥离，并在延伸板3c浇注位置上打孔。
如图6所示，在本申请的具体实施例中，用于步骤S105中，按凸模一3a成型PDMS板在上凸模二3b成型PDMS板在下的顺序为将6孔Transwell板的薄膜放置于两个PDMS板之间进行贴合，分别将夹具部分2上层夹板2a在上，下层夹板2b在下夹持两块贴合的PDMS板。
在本申请的具体实施例中，用于步骤S107中，将两块贴合的PDMS板放置在紫外下照射30min，通过Tygon管向通道内注入酒精30min对装置进行消毒处理，并放入烘箱1h进行烘干处理。
根据本发明的实施例，一种可促进类脑器官成熟的层流低剪切力微流控芯片的制备方法，还包括基于微流控芯片的片上培养方法，具体步骤如下：
步骤S201：按照标准培养流程，将在静态条件下培养至第10天的且处于扩张期末的类胚体EB放入打开的芯片4的多孔膜上，将芯片4封接固定，通过管道向上下腔室同时注入成熟培养基；
步骤S203：根据类胚体的发育程度和体积的增加，将微流体的注射速度进行调整。
在本申请的具体实施例中，用于上述步骤S203培养期的注射速度中，第10-20天注射速度用24μl/h-30μl/h，第20-30天注射速度用30μl/h-34μl/h，第30-40天注射速度用34μl/h-40μl/h。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种可促进类脑器官成熟的层流低剪切力微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括微流控芯片(4)的制备，包括以下步骤：
步骤一：用激光切割亚克力板，将亚克力板分为6个PMMA模块，两两一组分为凹模部分(1)、夹具部分(2)和凸模部分(3)三个部分；
步骤二：将凸模部分(3)的其中两块PMMA模块，分别放置在凹模部分(1)的凹槽中，并进行浇注，获得芯片(4)，芯片(4)包括两块不同的PDMS板，分别为芯片上层(4a)和芯片下层(4b)；
步骤三：取一片6孔transwell板的1个小室底部的PET多孔膜，将所述芯片上层(4a)和所述芯片下层(4b)与多孔膜进行接合，用夹具部分(2)将所述芯片上层(4a)和所述芯片下层(4b)进行固定，安装不锈钢弯针并连接Tygon管；
步骤四：将芯片(4)进行消毒处理，完成芯片(4)的制备。
2.根据权利要求1所述的可促进类脑器官成熟的层流低剪切力微流控芯片的制备方法，其特征在于，用于步骤一中，所述凹模部分(1)包括凹槽板(1a)、底板(1b)和薄板(1c)，所述凹槽板(1a)和所述薄板(1c)的中间位置均开设有正方形凹槽，所述凹槽板(1a)和所述底板(1b)两块作为浇注芯片(4)的凹模；
所述夹具部分(2)包括上层夹板(2a)和下层夹板(2b)，所述上层夹板(2a)和所述下层夹板(2b)两块作为芯片(4)的夹具，所述上层夹板(2a)和所述下层夹板(2b)内均矩形阵列开设有若干微孔，每条矩形阵列线上分布有三个微孔，所述上层夹板(2a)的内部开设有与凸模部分(3)相配合的圆形槽；
所述凸模部分(3)包括凸模一(3a)和凸模二(3b)，所述凸模一(3a)和凸模二(3b)均为圆形结构，所述圆形结构的半径与两两所述微孔之间的间距相同，其中，所述凸模一(3a)和凸模二(3b)厚度分别为5mm和3mm，且均对称设有与外壁相切的延伸板(3c)，所述延伸板(3c)的厚度为2mm。
3.根据权利要求2所述的可促进类脑器官成熟的层流低剪切力微流控芯片的制备方法，其特征在于，用于步骤二中，所述延伸板(3c)与所述凸模一(3a)配合放入凹模部分(1)凹槽时，所述延伸板(3c)的底壁与所述凸模一(3a)的底壁位于同一水平线，所述延伸板(3c)与所述凸模二(3b)配合放入凹模部分(1)凹槽时，所述凸模二(3b)被所述延伸板(3c)对称分割，且所述延伸板(3c)顶壁和底壁与所述凸模二(3b)端面的最近距离均为1.5mm。
4.根据权利要求3所述的可促进类脑器官成熟的层流低剪切力微流控芯片的制备方法，其特征在于，用于步骤二中，所述芯片上层(4a)为利用所述凸模一(3a)和所述延伸板(3c)作为凸模浇注而成的PDMS板，所述芯片下层(4b)为利用所述凸模二(3b)和所述延伸板(3c)作为凸模浇注而成的PDMS板。
5.根据权利要求1所述的可促进类脑器官成熟的层流低剪切力微流控芯片的制备方法，其特征在于，用于步骤二中，浇注时，将固化剂和PDMS以10:1的比例均匀混合，排气泡后浇注到凹模部分(1)的凹槽中，抽真空排气泡30分钟后80℃烘箱固化1h，待PDMS固化后将制得的PDMS板从模具上剥离，并在延伸板(3c)浇注位置上打孔。
6.根据权利要求4所述的可促进类脑器官成熟的层流低剪切力微流控芯片的制备方法，其特征在于，用于步骤三中，按凸模一(3a)成型PDMS板在上凸模二(3b)成型PDMS板在下的顺序为将6孔Transwell板的薄膜放置于两个PDMS板之间进行贴合，分别将夹具部分(2)上层夹板(2a)在上，下层夹板(2b)在下夹持两块贴合的PDMS板。
7.根据权利要求1所述的可促进类脑器官成熟的层流低剪切力微流控芯片的制备方法，其特征在于，用于步骤四中，将两块贴合的PDMS板放置在紫外下照射30min，通过Tygon管向通道内注入酒精30min对装置进行消毒处理，并放入烘箱1h进行烘干处理。
8.根据权利要求6所述的可促进类脑器官成熟的层流低剪切力微流控芯片的制备方法，其特征在于，还包括基于微流控芯片(4)的片上培养方法，具体步骤如下：
步骤S1：按照标准培养流程，将在静态条件下培养至第10天的且处于扩张期末的类胚体(EB)放入打开的芯片(4)的多孔膜上，将芯片(4)封接固定，通过管道向上下腔室同时注入成熟培养基；
步骤S2：根据类胚体的发育程度和体积的增加，将微流体的注射速度进行调整。
9.根据权利要求8所述的可促进类脑器官成熟的层流低剪切力微流控芯片的制备方法，其特征在于，用于上述步骤S2培养期的注射速度中，第10-20天注射速度用24μl/h-30μl/h，第20-30天注射速度用30μl/h-34μl/h，第30-40天注射速度用34μl/h-40μl/h。
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