CN110193097A - 一种三维骨细胞主动接种方法、三维骨细胞主动接种支架及其制备方法 - Google Patents

一种三维骨细胞主动接种方法、三维骨细胞主动接种支架及其制备方法 Download PDF

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Abstract

一种三维骨细胞主动接种方法、三维骨细胞主动接种支架及其制备方法。该制备方法包括：将聚有机硅氧烷与固化剂加入反应瓶中搅拌混匀，真空抽滤得混合物，加入导电填料、成孔剂后充分混合后超声处理，然后浇筑到模具中加热固化，得到复合导电薄层，在其表面浇筑一层混合物形成绝缘层，加热固化后激光切割，得到具有微结构的电极状薄膜，除去电极状薄膜中的成孔剂；将多个去除成孔剂后的电极状薄膜进行粘贴，形成三维骨细胞主动接种支架。该三维骨细胞主动接种方法包括：将该支架置于细胞悬浮液中进行细胞吸附，吸附牢固后转移至细胞培养液中培养一周。本发明具有较高的孔隙率、细胞接种效率高，制备方法简单，成本低廉，具有很大的市场潜力。

Description

一种三维骨细胞主动接种方法、三维骨细胞主动接种支架及 其制备方法
技术领域
本发明涉及组织工程技术领域，且特别涉及一种三维骨细胞主动接种方法、三维骨细胞主动接种支架及其制备方法。
背景技术
细胞三维自动化接种是体外组织构建的关键工序，在组织修复以及人造器官等生物医学应用中具有重要的研究意义。目前由疾病、肿瘤、创伤导致骨缺损的患者相当多见，但是由于自体骨有限及人工骨免疫排斥反应等问题导致治疗情况不佳。随着现代生物医学的不断发展，组织工程骨的研究为患者带来了新的希望。在组织工程骨的构建过程中，需要将体外培养扩增的种子细胞接种在其能够赖以生存和依附的三维生物支架上，经过体外长时间培养，进一步引导其生长成完整的组织构型，再用于修复相应的骨组织缺损。目前大多数对于种子细胞的接种都是采用被动接种的方式，即将带有细胞的溶液流经或者浸润三维生物支架，通过表面蛋白等增强吸附作用使得细胞能够粘附在生物支架上
现有的三维支架被动接种技术，耗时较长，而且接种在支架上的细胞构型是随机分布的，粘附在支架内壁的细胞由于重力作用，会逐渐沉积到支架的底部，这样获得的初始细胞接种密度较低，导致细胞生长繁殖缓慢，难以形成期望的组织构型。
发明内容
本发明的目的在于提供一种三维骨细胞主动接种支架，此三维骨细胞主动接种支架具有较高的孔隙率和较好的细胞相容性。
本发明的另一目的在于提供一种三维骨细胞主动接种支架的制备方法，该方法简单、成本低廉。
本发明的又一目的在于提供一种三维骨细胞主动接种方法，提高了细胞接种效率。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本发明提出一种三维骨细胞主动接种支架的制备方法，包括以下步骤：
S1、将主剂聚有机硅氧烷与固化剂加入反应瓶中搅拌混匀，真空抽滤得混合物，其中，所述聚有机硅氧烷与所述固化剂的质量比为5-12:1；
S2、向所述混合物中加入导电填料、成孔剂后充分混合，得浆状物，将所述浆状物超声处理30-60min，其中，聚有机硅氧烷、导电填料、成孔剂的质量比为3-5:20-30:50-70；
S3、将超声处理后的所述浆状物浇筑到模具中，在50-70℃条件下加热固化30-60min，得到复合导电薄层；
S4、在所述复合导电薄层表面浇筑一层所述混合物形成绝缘层，在50-70℃加热固化30-60min，得双层复合薄膜；
S5、采用激光切割方法加工所述双层复合薄膜，得具有微结构的电极状薄膜，采用粒子沥滤法除去所述电极状薄膜中的成孔剂，其中所述微结构为多个平行排布于所述电极状薄膜表面的凹槽，所述电极状薄膜宽度为9-10mm，所述电极状薄膜上的微结构宽度为300-500μm；
S6、将多个去除成孔剂后的所述电极状薄膜进行粘贴，形成三维骨细胞主动接种支架。
进一步地，在本发明较佳实施例中，所述聚有机硅氧烷为聚二甲基硅氧烷。
进一步地，在本发明较佳实施例中，所述固化剂选自烷氧基硅烷、酰氧基硅烷、酮肟基硅烷中的一种或多种。
进一步地，在本发明较佳实施例中，所述导电填料选自碳纳米管、炭黑、石墨、金属粉中的一种或多种；所述成孔剂选自盐类、糖类中的一种或多种。
进一步地，在本发明较佳实施例中，所述复合导电薄层的浇筑厚度为300-500μm，所述绝缘层的浇筑厚度为50-100μm。
进一步地，在本发明较佳实施例中，在步骤S5中，采用粒子沥滤法除去所述电极状薄膜中的成孔剂包括：
将所述电极状薄膜浸没在去离子水中，每8-12小时更换一次去离子水，2-3天后取出样品。
进一步地，在本发明较佳实施例中，在步骤S6中，将多个所述薄膜微结构粘贴在一起包括以下步骤：
S61、预处理：利用真空氧等离子体处理所述电极状薄膜，处理时间为30-60s；
S62、堆叠：将多个经预处理后的所述薄膜微结构两两正交堆叠使所述绝缘层与所述复合导电薄层相互粘贴，然后转移至60-80℃下保持1-2h，得到三维骨细胞主动接种支架。
本发明还提出一种三维骨细胞主动接种支架，由上述三维骨细胞主动接种支架的制备方法制备得到，所述三维骨细胞主动接种支架孔隙率为20-30％，弹性模量为2-3MPa。
本发明还提出一种三维骨细胞主动接种方法，应用如上所述的三维骨细胞主动接种支架，包括如下步骤：
利用介电泳技术将所述三维骨细胞主动接种支架置于细胞悬浮液中进行细胞吸附，吸附牢固后转移至细胞培养液中培养一周。
本发明实施例的三维骨细胞主动接种方法、三维骨细胞主动接种支架及其制备方法的有益效果是：
(1)本发明的三维骨细胞主动接种支架通过将主剂聚有机硅氧烷与导电填料、成孔剂混合、固化得到了复合导电薄层，进而制备得出的三维骨细胞主动接种支架具有较高的孔隙率和一定的力学性能，且有利于后续接种骨细胞的增殖，该支架同时也具有一定的生物相容性，能为骨组织的修复提供支承作用。
(2)本发明通过电极状薄膜层的堆叠形成三维的导电支架构型，使该三维支架可以利用介电泳技术对细胞进行三维主动接种，在体外得到较完整的三维细胞初始构型。这一方法能够改善现有被动种植细胞效率低耗时长的缺点，且利用少量病体细胞实现体外组织的重构。
(3)本发明的三维骨细胞主动接种支架的制备方法简单、成本低廉、且制备效率高，具有很大的市场应用潜力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1提供的三维骨细胞主动接种支架的制备方法流程图；
图2为本发明实施例5提供的三维骨细胞主动接种方法的接种过程示意图；
图3为本发明实施例5提供的三维骨细胞主动接种方法接种过程的光学显微图片(放大倍数：50X)；
图4为本发明实施例2提供的三维骨细胞主动接种支架接种成骨细胞后的扫描电镜图(放大倍数：200X)；
图5为本发明实施例2提供的三维骨细胞主动接种支架接种成骨细胞后的扫描电镜图(放大倍数：350X)；
图6为本发明实施例5提供的三维骨细胞主动接种支架接种成骨细胞后并培养7天后的扫描电镜图(放大倍数：1000X)；
图7为本发明实施例1和对比例1提供的三维骨细胞主动接种支架的制备方法制备得到的三维骨细胞主动接种支架的对比示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的一种三维骨细胞主动接种方法、三维骨细胞主动接种支架及其制备方法进行具体说明。
参考图1所示，本发明提供了一种三维骨细胞主动接种支架的制备方法，包括以下步骤：
S1、将主剂聚有机硅氧烷与固化剂加入反应瓶中搅拌混匀，真空抽滤得混合物，其中，所述聚有机硅氧烷与所述固化剂的质量比为5-12:1。
进一步的，所述聚有机硅氧烷聚二甲基硅氧烷或其衍生物，包括聚二甲基硅氧烷、环甲基硅氧烷、氨基硅氧烷、聚甲基苯基硅氧烷或聚醚聚硅氧烷共聚物等。聚有机硅氧烷提供了三维结构载体，为细胞提供附着的基础与后续的生长环境，从而建立细胞-细胞之间的联系使其能够分化且产生具有组织特征的结构。进一步的，所述聚有机硅氧烷为聚二甲基硅氧烷，其成本较低，具有优良的耐热、耐寒性、生理惰性和机械性能，对人体组织无毒副作用，有利于细胞在立体空间的生长和分化。
进一步的，所述固化剂选自烷氧基硅烷、酰氧基硅烷、酮肟基硅烷中的一种或多种。优选的，所述固化剂选自烷氧基硅烷，更加优选的，所述有机硅氧烷与所述固化剂的质量比为10:1。
S2、向所述混合物中加入导电填料、成孔剂后充分混合，得浆状物，将所述浆状物超声处理30-60min。其中，聚有机硅氧烷、导电填料、成孔剂的质量比为3-5:20-30:50-70。
进一步的，所述导电填料选自碳纳米管、炭黑、石墨、金属粉中的一种或多种。优选的，所述导电填料选自碳纳米管，加入碳纳米管之前，还包括对其进行表面处理，以增加其在所述混合物中的分散性。优选的，首先将碳纳米管浸没到有机溶剂中除去其表面的杂质，然后添加离子型表面活性剂置于超声波浴中处理10-20min，阴离子表面活性剂可以选用十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵等。
所述成孔剂选自盐类、糖类中的一种或多种。所述成孔剂在水中有良好的溶解性，加入成孔剂制备所得的支架，提高了其孔隙率和吸水膨胀性能，有利于后续骨细胞的增值。其中，所述糖类成孔剂选自淀粉，糖，纤维素等，所述盐类选自无机盐(NaCl、KCl)、表面活性剂等。可选的，所述成孔剂还可以选用石蜡、明胶、聚合物等，本发明不做具体限定。
优选的，所述聚有机硅氧烷、导电填料、成孔剂的质量比为5:25:70。
S3、将超声处理后的所述浆状物浇筑到模具中，在50-70℃条件下加热固化30-60min，得到复合导电薄层。优选的，在70℃条件下加热固化30min，使其完全固化。
S4、在所述复合导电薄层表面浇筑一层所述混合物形成绝缘层，在50-70℃加热固化30-60min，得双层复合薄膜。更为优选的，70℃加热固化30min。
进一步的，所述复合导电薄层的浇筑厚度为300-500μm，所述绝缘层的浇筑厚度为50-100μm。优选的，所述复合导电薄层的浇筑厚度为500μm，所述绝缘层的浇筑厚度为100μm。
S5、采用激光切割方法加工所述双层复合薄膜，得具有微结构的电极状薄膜，采用粒子沥滤法除去所述电极状薄膜中的成孔剂，其中，所述微结构为多个平行排布于所述电极状薄膜表面的凹槽，所述电极状薄膜宽度为9-10mm，所述电极状薄膜上的微结构宽度为300-500μm。
在本发明较佳的实施例中，粒子沥滤法采用相分离的原理将成孔剂从固化后的电极状薄膜中溶出，得到具有一定孔隙率的多孔支架。可选的，所述微结构还可以是球冠形、三角形、圆柱形、十字形等，本发明不做具体限定。优选的，所述电极状薄膜的宽度为10mm，所述电极状薄膜上的微结构宽度为500μm。
进一步的，在步骤S5中，采用粒子沥滤法除去所述电极状薄膜中的成孔剂包括：将所述电极状薄膜浸没在去离子水中，每8-12小时更换一次去离子水，2-3天后取出样品。
S6、将多个去除成孔剂后的所述电极状薄膜进行粘贴，形成三维骨细胞主动接种支架。
进一步的，在步骤S6中，将多个所述薄膜微结构粘贴在一起包括以下步骤：
S61、预处理：利用真空氧等离子体处理所述电极状薄膜，处理时间为30-60s，以增强电极状薄膜之间的粘结力，简单高效。
S62、堆叠：将多个经预处理后的所述薄膜微结构两两正交堆叠使所述绝缘层与所述复合导电薄层相互粘贴，然后转移至60-80℃下保持1-2h，得到三维骨细胞主动接种支架。
更为优选的，将粘贴后的薄膜微结构转移至80℃下保持1h。在本发明中，所述绝缘层与所述复合导电薄层相互粘贴形成多层复合结构，防止了导电层直接电接触。每层电极状薄膜在支架内形成阵列互联的微孔，既可作为细胞粘附的平台，又有利于细胞之间的营养交换。又可作为电场产生的电极。
如图7所示，本发明还提供了一种三维骨细胞主动接种支架，利用如上所述方法制备得到的，所述三维骨细胞主动接种支架孔隙率为20-30％，有利于后续接种骨细胞的增殖。其弹性模量为2-3MPa，具有一定的力学强度，能为骨组织的修复提供支承作用。
如图2、3所示，本发明还提供了一种三维骨细胞主动接种方法，应用如上所述的三维骨细胞主动接种支架，包括如下步骤：
利用介电泳技术将所述三维骨细胞主动接种支架置于细胞悬浮液中进行细胞吸附，利用介电泳对细胞的主动驱动原理，使细胞悬浮液中的细胞主动吸附到支架表面，待吸附牢固后转移至细胞培养液中培养一周。
可选的，将灭菌的三维骨细胞主动接种支架装上无菌电极，浸入成骨细胞的细胞悬浮液中，接通幅值为20-50Vpp的交流电并保持5-10min，然后转移至前成骨细胞的细胞培养液中培养一周，最终得到含有成骨细胞的三维支架。
如图4、5所示，在光学显微镜和电子显微镜下观察细胞在支架上的分化增殖，可以看出，其形成了较为完整的细胞组织构型。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种三维骨细胞主动接种支架的制备方法，包括以下步骤：
S1、将10g聚二甲基硅氧烷与1g正硅酸乙酯加入反应瓶中搅拌混匀，真空抽滤得混合物；
S2、向所述混合物中加入50g碳纳米颗粒、140g糖粉末后充分混合，得浆状物，将所述浆状物超声处理60min；
S3、将超声处理后的所述浆状物浇筑到模具中，在70℃条件下加热固化60min，得到复合导电薄层；
S4、在所述复合导电薄层表面浇筑一层所述混合物形成绝缘层，在70℃加热固化30-60min，得双层复合薄膜；
S5、采用激光切割方法加工所述双层复合薄膜，得宽度为500μm具有微结构的电极状薄膜，将所述电极状薄膜浸没在去离子水中，每12小时更换一次去离子水，3天后取出样品；
S6、利用真空氧等离子体预处理所述电极状薄膜60s，然后两两正交堆叠使所述绝缘层与所述复合导电薄层相互粘贴，转移至80℃下保持1h，形成三维骨细胞主动接种支架。
实施例2
本实施例提供了一种三维骨细胞主动接种支架的制备方法，包括以下步骤：
S1、将10g聚二甲基硅氧烷与1g正硅酸乙酯加入反应瓶中搅拌混匀，真空抽滤得混合物；
S2、向所述混合物中加入50g碳纳米颗粒、100g糖粉末后充分混合，得浆状物，将所述浆状物超声处理60min；
S3、将超声处理后的所述浆状物浇筑到模具中，在70℃条件下加热固化60min，得到复合导电薄层；
S4、在所述复合导电薄层表面浇筑一层所述混合物形成绝缘层，在70℃加热固化30-60min，得双层复合薄膜；
S5、采用激光切割方法加工所述双层复合薄膜，得宽度为500μm具有微结构的电极状薄膜，将所述电极状薄膜浸没在去离子水中，每12小时更换一次去离子水，3天后取出样品；
S6、利用真空氧等离子体预处理所述电极状薄膜60s，然后两两正交堆叠使所述绝缘层与所述复合导电薄层相互粘贴，转移至80℃下保持1h，形成三维骨细胞主动接种支架。
实施例3
本实施例提供了一种三维骨细胞主动接种支架的制备方法，包括以下步骤：
S1、将10g聚二甲基硅氧烷与1g正硅酸乙酯加入反应瓶中搅拌混匀，真空抽滤得混合物；
S2、向所述混合物中加入50g碳纳米颗粒、100g NaCl粉末后充分混合，得浆状物，将所述浆状物超声处理60min；
S3、将超声处理后的所述浆状物浇筑到模具中，在70℃条件下加热固化60min，得到复合导电薄层；
S4、在所述复合导电薄层表面浇筑一层所述混合物形成绝缘层，在70℃加热固化30-60min，得双层复合薄膜；
S5、采用激光切割方法加工所述双层复合薄膜，得宽度为500μm具有微结构的电极状薄膜，将所述电极状薄膜浸没在去离子水中，每12小时更换一次去离子水，3天后取出样品；
S6、利用真空氧等离子体预处理所述电极状薄膜60s，然后两两正交堆叠使所述绝缘层与所述复合导电薄层相互粘贴，转移至80℃下保持1h，形成三维骨细胞主动接种支架。
实施例4
本实施例提供了一种三维骨细胞主动接种支架的制备方法，包括以下步骤：
S1、将10g环甲基硅氧烷与1g正硅酸乙酯加入反应瓶中搅拌混匀，真空抽滤得混合物；
S2、向所述混合物中加入50g碳纳米颗粒、100g糖粉末后充分混合，得浆状物，将所述浆状物超声处理60min；
S3、将超声处理后的所述浆状物浇筑到模具中，在70℃条件下加热固化60min，得到复合导电薄层；
S4、在所述复合导电薄层表面浇筑一层所述混合物形成绝缘层，在70℃加热固化30-60min，得双层复合薄膜；
S5、采用激光切割方法加工所述双层复合薄膜，得宽度为500μm具有微结构的电极状薄膜，将所述电极状薄膜浸没在去离子水中，每12小时更换一次去离子水，3天后取出样品；
S6、利用真空氧等离子体预处理所述电极状薄膜60s，然后两两正交堆叠使所述绝缘层与所述复合导电薄层相互粘贴，转移至80℃下保持1h，形成三维骨细胞主动接种支架。
实施例5
一种三维骨细胞主动接种方法，包括如下步骤：
将实施例1所述三维骨细胞主动接种支架装上无菌电极，置于小鼠的前成骨细胞的细胞悬浮液中，接通幅值为20Vpp的交流电并保持5min，吸附牢固后转移至该前成骨细胞的细胞培养液中培养一周，最终得到含有成骨细胞的三维支架。
如图6所示是本发明实施例5中接种成骨细胞后扫描电镜图，从图中可以看出，在三维支架网络中成功附着成骨细胞，表明该支架具有较好的生物相容性。
对比例1
本对比例提供了一种三维骨细胞主动接种支架的制备方法，包括以下步骤：
S1、将10g聚二甲基硅氧烷与1g正硅酸乙酯加入反应瓶中搅拌混匀，真空抽滤得混合物；
S2、向所述混合物中加入50g碳纳米颗粒后充分混合，得浆状物，将所述浆状物超声处理60min；
S3、将超声处理后的所述浆状物浇筑到模具中，在70℃条件下加热固化60min，得到复合导电薄层；
S4、在所述复合导电薄层表面浇筑一层所述混合物形成绝缘层，在70℃加热固化30-60min，得双层复合薄膜；
S5、采用激光切割方法加工所述双层复合薄膜，得宽度为500μm具有微结构的电极状薄膜，将所述电极状薄膜浸没在去离子水中，每12小时更换一次去离子水，3天后取出样品；
S6、利用真空氧等离子体预处理所述电极状薄膜60s，然后两两正交堆叠使所述绝缘层与所述复合导电薄层相互粘贴，转移至80℃下保持1h，形成三维骨细胞主动接种支架。
试验例1
测定本发明实施例1-4以及对比例1提供的三维骨细胞主动接种支架的制备方法所得三维骨细胞主动接种支架的吸水膨胀率，测试方法如下：
S1、取长宽均为100mm，厚度为500μm的样品分别放入25±2℃的蒸馏水中，水位高出样品顶端30mm，样品之间有一定间隙；
S2、24h后取出样品，将样品表面的水分吸光，测量样品的长度L(或宽度H)，则样品吸水膨胀率由下式得到：
Swelling Ratio(SR)＝Lt/L0×100％ (3-1)
表1吸水膨胀率测定
试验例2
采用德国费希尔微纳米硬度计，利用纳米压痕法测量本发明实施例1-4以及对比例1的弹性模量。测量结果如下表所示：
表2弹性模量测定
试验例3
(1)体积密度测定：
S1、将样品放入80-100℃烘箱中干燥2h后取出，冷却到室温称其质量m0；
S2、将试样放入室温的蒸馏水中浸泡，48h后取出擦去表面水分，称其质量m1，将试样挂在网篮中，称量其在水中的质量m2，则体积密度为：
ρb＝ρw×m0/(m1-m2)
式中，Pw为试验过程中蒸馏水的密度，g/cm3
(2)密度测定
S1、取试样，称量其质量w0，将其放入含蒸馏水的密度瓶内煮沸10-15min，擦干密度瓶并冷却至室温，用蒸馏水加满至标记处，称量其质量w2；
S2、将密度瓶洗干净，用蒸馏水装满至标记处，称其质量w1，则试样的密度为：
ρt＝ρw×w0/(w1+w0-w2)
(3)孔隙率：
式样的孔隙率为：ρa＝(1-ρw/ρt)×100％
表3孔隙率测定
综上所述，本发明实施例1-4提供的三维骨细胞主动接种支架，其孔隙率达到了20％-30％，吸水膨胀率达到了140％-255％，弹性模量为2-3Mpa，相比于未加入成孔剂的对比例1(如图7所示)，其孔隙率仅为1％左右，弹性模量则为20-30Mpa。该支架弹性模量有一定下降，但仍可达到一定的力学强度，能够提供足够的力学支撑作用。成孔剂的加入赋予了三维支架较高的孔隙率和吸水膨胀率，有利于后续接种骨细胞的增殖。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (9)

1.一种三维骨细胞主动接种支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将主剂聚有机硅氧烷与固化剂加入反应瓶中搅拌混匀，真空抽滤得混合物，其中，所述聚有机硅氧烷与所述固化剂的质量比为5-12:1；
S2、向所述混合物中加入导电填料、成孔剂后充分混合，得浆状物，将所述浆状物超声处理30-60min，其中，聚有机硅氧烷、导电填料、成孔剂的质量比为3-5:20-30:50-70；
S3、将超声处理后的所述浆状物浇筑到模具中，在50-70℃条件下加热固化30-60min，得到复合导电薄层；
S4、在所述复合导电薄层表面浇筑一层所述混合物形成绝缘层，在50-70℃加热固化30-60min，得双层复合薄膜；
S5、采用激光切割方法加工所述双层复合薄膜，得具有微结构的电极状薄膜，采用粒子沥滤法除去所述电极状薄膜中的成孔剂，其中，所述微结构为多个平行排布于所述电极状薄膜表面的凹槽，所述电极状薄膜宽度为9-10mm，所述电极状薄膜上的微结构宽度为300-500μm；
S6、将多个去除成孔剂后的所述电极状薄膜进行粘贴，形成三维骨细胞主动接种支架。
2.根据权利要求1所述的三维骨细胞主动接种支架的制备方法，其特征在于，所述聚有机硅氧烷为聚二甲基硅氧烷。
3.根据权利要求1所述的三维骨细胞主动接种支架的制备方法，其特征在于，所述固化剂选自烷氧基硅烷、酰氧基硅烷、酮肟基硅烷中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的三维骨细胞主动接种支架的制备方法，其特征在于，所述导电填料选自碳纳米管、炭黑、石墨、金属粉中的一种或多种；所述成孔剂选自盐类、糖类中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的三维骨细胞主动接种支架的制备方法，其特征在于，所述复合导电薄层的浇筑厚度为300-500μm，所述绝缘层的浇筑厚度为50-100μm。
6.根据权利要求1所述的三维骨细胞主动接种支架的制备方法，其特征在于，在步骤S5中，采用粒子沥滤法除去所述电极状薄膜中的成孔剂包括：
将所述电极状薄膜浸没在去离子水中，每8-12小时更换一次去离子水，2-3天后取出样品。
7.根据权利要求1所述的三维骨细胞主动接种支架的制备方法，其特征在于，在步骤S6中，将多个所述薄膜微结构粘贴在一起包括以下步骤：
S61、预处理：利用真空氧等离子体处理所述电极状薄膜，处理时间为30-60s；
S62、堆叠：将多个经预处理后的所述电极状薄膜两两正交堆叠使相邻电极状薄膜的所述绝缘层与所述复合导电薄层相互粘贴，然后转移至60-80℃下保持1-2h，得到三维骨细胞主动接种支架。
8.一种如权利要求1-7任一项所述方法制备得到的三维骨细胞主动接种支架，其特征在于，所述三维骨细胞主动接种支架孔隙率为20-30％，弹性模量为2-3MPa。
9.一种三维骨细胞主动接种方法，应用如权利要求8所述的三维骨细胞主动接种支架，包括如下步骤：
利用介电泳技术将所述三维骨细胞主动接种支架置于细胞悬浮液中进行细胞吸附，吸附牢固后转移至细胞培养液中培养一周。
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