CN108602064A - 用于控制活体几何形状的微米流体装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于控制、选择、处理或培养活体的微米流体装置，包括第一隔室、第二隔室和引导轨道的网络，其中：所述引导轨道的网络包括至少一个第一引导轨道和至少一个第二引导轨道，所述至少一个第一引导轨道连接所述第一隔室和所述第二隔室，所述至少一个第二引导轨道将所述至少一个第一引导轨道与至少两个互相连接点连接；并且所述至少一个第二引导轨道包括弯曲部分；所述弯曲部分呈现为内凹部，其面向第二隔室或网络的连接至第二隔室的部分。

Description

用于控制活体几何形状的微米流体装置

技术领域

本发明涉及用于培养细胞或活体的微米流体装置和方法，特别是神经元细胞。在一些实施方案中，其涉及用于控制活体的形状或活体之间的连接性的微米流体装置。

背景技术

能够在体外培养各种类型的活体，特别是培养生物神经元和任何可以产生形成受控阵列的神经元的细胞类型将在许多科学领域中开启开创性应用的大门。在基础科学中，这可以用于研究大脑的信号处理或大脑的发育。在医学上，葡萄糖供能的神经植入物可以修复大脑功能。体外试验还可以促进制药行业的药物发现和药物筛选。例如，细胞培养物可以作为模型应用于了解神经退行性疾病(阿尔茨海默病、亨廷顿、克雅氏病等)或脑损伤后的细胞和分子机制，并基于这些机制来研究分子或药物的影响。最终，生物信息处理器可能会导致新的人工智能。

各种实验模型被用于上述应用。在动物整体模型中第一类模型使用电子记录或成像。解剖结构完好无损，但细胞水平的实验受到严重限制。第二类模型使用脑切片，或更广泛的组织切片。在这种情况下，高分辨率成像和机械或化学处理与动物整体更容易，但是这种培养物的寿命很短，并且在密集的三维阵列中很难对单个神经元的物理连接性进行了解。此外，为了进行高分辨率成像，并正确馈入与其天然血管系统分离的活组织，必须制作非常薄的切片，因此真正的三维结构受到强烈干扰，并且许多神经元连接丢失。最后，广泛使用了培养皿或微量滴定板孔中的分离培养物。它们具有上述许多优点：神经元可以培养至少几周；可以使用高分辨率成像和最新的生物染色方法。此外，原则上至少在低密度下，可以追踪个别神经突。然而，在这些系统中，细胞发育和连接在空间上是随机的，使得这些系统在细胞-细胞交换和功能方面与真正的系统非常不同。

为了克服上述限制已经进行了多次尝试。例如，在WO 200434016或WO 2006037033和US 7 419822中，Jeon等人受到Campenot的著作的启发[R·B·Campenot，通过神经生长因子局部控制神经突发育，美国科学学院学报，1977，74(10)，4516-4519]([Campenot,R.B.Local control of neurite development by nerve growthFactor.Proc.Natl.Acad.Sci.The USA.1977,74(10),4516-4519])，提出了允许从它们的轴突的神经元隔离体细胞的微米流体装置。这包括：第一隔室，在第一隔室中接种神经元；多个微通道，神经突而不是细胞体可以进入微米通道中；以及第二隔室，所述第二隔室与所述第一隔室通过所述微通道流体连接。

该装置是体外控制体外中枢神经系统(CNS)轴突的神经元培养的第一步。在微米通道中的扩散时间很长，这使得可以以不同的方式处理所述第一室和第二室的内容物。但是，该装置仍然存在很多限制。首先，它可以分隔开细胞区室，但是，如果两个群体接种在第一隔室和第二隔室中，则不能控制轴突连接的方向，因此使得连接不是生理的。

在WO 2010/040920中，Peyrin等人提出了解决第一个问题的方案，这归功于培养装置，特别是神经细胞的装置，包括：支撑物，其限定旨在通过第一细胞培养接种的第一隔间微米流体和至少第二隔间微米流体；流体互相连接系统(3)，其连接第一隔间和第二隔间并允许细胞(特别是轴突)从一个隔间向另一个隔间延伸。在所述装置中，执行互相连接系统以相比于至少第二类细胞伸展而使至少第一类细胞进行伸展，前述的伸展第一类和第二类细胞伸展由于所他们来自的微米流体隔间或者由于所伸展的细胞类型而不同。然而，这种效果需要制造狭窄通道，这有两个缺点。首先，制造精细，并导致一些不可重现性。其次，所述狭窄通道很容易被轴突自身所堵塞，导致细胞培养期间流体连接的不可重现性和变化。最后，选择性不是100％，例如在Peyrin等人的[实验室芯片：2011年11月7日；11(21)：3663-73，doi：10.1039/c1lc20014c]中所示的。

在实验室芯片：2013；13(4)：589-598，doi：10.1039/c2lc41000a中，Honegger等人描述了基于交流电动力约束的神经元的三维拓扑网络。所述限制增加了神经元阵列设计的灵活性，但它需要具有集成电极的复杂芯片以及复杂的控制电子设备。

因此迫切需要改进的(或者更广泛的)人造系统和方法来引导神经突以控制细胞形状和突起。

发明内容

本发明涉及一种用于控制、选择、处理或培养活体的微米流体装置，包括第一隔室、第二隔室和引导轨道的网络，其中：

-所述引导轨道的网络包括至少一个第一引导轨道和至少一个第二引导轨道，所述至少一个第一引导轨道连接所述第一隔室和所述第二隔室，所述至少一个第二引导轨道将所述至少一个第一引导轨道与至少两个互相连接点连接；并且

-所述至少一个第二引导轨道包括弯曲部分；所述弯曲部分呈现面向第二隔室或网络的连接至第二隔室的部分的内凹部。

根据一个实施方案，所述引导轨道的网络包括至少两个第一引导轨道，所述至少两个第一引导轨道连接第一隔室和第二隔室，并且其中每个第一引导轨道包括与至少一个与至少一个第二引导轨道的互相连接点。

根据一个实施方案，每个第一引导轨道包括与至少一个第二引导轨道的至少两个互相连接点。

根据一个实施方案，所述引导轨道的网络包括至少两个第二引导轨道，其中每个第二引导轨道将至少一个第一引导轨道与至少两个互相连接点连接。

根据一个实施方案，每个第一引导轨道连接到至少两个第二引导轨道。

根据一个实施方案，每个互相连接点是三通互相连接点。

根据一个实施方案，在至少一个第一引导轨道与至少一个第二引导轨道之间面向第二隔室或面向网络的连接至所述第二隔室的部分的内角范围为从90°到180°、从100°到180°、从120°到180°、从150°到180°、从160°到180°或从170°到180°。

根据一个实施方案，在至少一个第一引导轨道与至少一个第二引导轨道之间面向第一隔室或面向网络的连接至所述第一隔室的部分的内角小于150°、140°、130°、120°、110°、100°或90°。

根据一个实施方案，沿着一个第一引导轨道的两个相邻的互相连接点之间的空间范围为20μm至5mm。

根据一个实施方案，本发明的装置上的区域或体积不是任何引导轨道或任何隔室的一部分，而是排斥区域或排斥体积；所述排斥区域或排斥体积呈现出的支持活体生长或粘附的能力低于引导轨道或隔室的支持细胞生长或粘附的能力。

本发明还涉及一种微米流体装置，包括至少一个第一隔室和通过至少一个第一引导轨道连接的至少一个第二隔室，其中所述至少一个第一隔室和所述至少一个第二隔室均包括底部，并且其中：

-至少一个第一引导轨道在至少一个第一隔室的底部的水平上连接至所述至少一个第一隔室；以及

-至少一个第一引导轨道在比至少一个第二隔室底部的水平高的水平上连接至所述至少一个第二隔室，从而设计所述至少一个第二隔室的底部与所述至少一个第一引导轨道之间的高度差。

根据一个实施方案，根据本发明的微米流体装置进一步包括至少一个第三隔室，所述至少一个第三隔室通过至少一个第二引导轨道连接至所述至少一个第二隔室。

根据一个实施方案，引导轨道在其表面的至少一个上包括一个或多个微切口。

根据一个实施方案，所述至少一个第三隔室包括底部，并且其中：

-至少一个第二引导轨道在至少一个第二隔室的底部的水平处连接至所述至少一个第二隔室；以及

-至少一个第二引导轨道在比至少一个第三隔室底部的水平高的水平处连接至所述至少一个第三隔室，从而设计所述至少一个第三隔室的底部与所述至少一个第二引导轨道之间的高度差。

根据一个实施方案，至少一个第二隔室的底部不与至少一个第一隔室的底部平行。

本发明还涉及一种用于控制、选择、处理或培养活体的方法，包括以下步骤：

-提供根据本发明的微米流体装置；

-在至少一个第一隔室中培养至少一个活体并且在至少一个第二隔室中培养至少一个活体；

-将至少一个活体从所述至少一个第二隔室引导至所述至少一个第一隔室，而不将所述至少一个活体从所述至少一个第一隔室引导至所述至少一个第二隔室。

本发明还涉及一种用于控制、选择、处理或培养活体的方法，包括以下步骤：

-提供根据本发明的微米流体装置；

-在至少一个第一隔室中培养至少一个活体并且在至少一个第二隔室中培养至少一个活体；

-将至少一个活体从所述至少一个第二隔室引导至所述至少一个第一隔室，并且同时避免所述至少一个第二隔室中的所述至少一个活体到达所述至少一个第一隔室。

根据一个实施方案，活体为细胞、神经突、轴突、树突、侵入性伪足、丝状伪足、细胞膜、细胞突起、鞭毛、微触须、生长锥、神经胶质细胞、真菌、植物细胞、丝状真菌、整个生物体、蠕虫、酵母菌、粘菌、动物细胞、多细胞球体、类器官或胚胎。

定义

在本发明中，以下术语具有以下含义：

-“通道”是指任何长形的空间、管状物、管、管道、导管，流体物质可以沿其传输。更具体地，如果它们是微米级(即，如果它们的部段中的至少一个尺寸被包括在1μm至1毫米之间)，则指定通道为微米通道，如果它们是毫米级(即，如果它们的部段中的至少一个尺寸被包括在1mm至1cm之间)，指定为毫米通道，或者如果它们是纳米级(即，如果它们的部段的至少一个尺寸包括在1nm至1μm之间)，则指定为纳米通道。

-“微通道”，在许多优选实施方案中，本发明对于微米通道特别关注。然而，为了简洁和完整，在下文中，将设计为微通道，通道包括沿着它们的长度为毫米、微米或纳米的至少一部分。

-“微流体芯片”，或更简洁地“芯片”或“微流体部件”或“微流体装置”，将其指定为包括至少一个通道或者通道的至少一个组合、至少部分嵌入矩阵中的所述通道或通道的组合的对象。优选地，所述通道是微通道。然而，为了简单起见，除非另有说明，在下文中，我们还将包括在定名为“微流体”的对象中，其为微米流体(即，包含至少一个微米通道)、毫米流体(即，包含至少一个毫米通道)或纳米流体(即，包含至少一个纳米通道)，或者包含毫米通道、纳米通道或微米通道的任何组合的芯片。

-“隔室”，在一些实施方案中指定通道或通道的一部分具有一个尺寸(明显小于两个其它尺寸)，称为“厚度”。如果其它尺寸中的至少一个尺寸分别是毫米级、微米级或纳米级，则这些隔室可以是毫米隔室、微米隔室或纳米隔室。毫米隔室、微米隔室和纳米隔室包含在“微隔室”的通用名称中。典型地，本发明中的隔室旨在能够以单位长度容纳比通道更大的流体体积，隔室用所述通道流体连接。因此，在一些实施方案中，隔室也可以作为在装置内限定的体积或装置顶部的凹部并且具有大于通道的最小侧向尺寸的至少一个侧向尺寸，隔室流体连接至所述通道。在一些优选实施方案中，隔室的所述一个侧向尺寸小于所述通道的所有侧向尺寸。

-“器械”，指定为一个集成装置，该装置至少可以执行一项功能，而无需附加除操作环境中可用部件之外的额外部件，例如能源或消耗品。在我们的描述中，器械因此是集成装置的子类别。

-“装置”，指定为芯片、部件、器械或系统中的任何一个。

-“系统”，指定为执行一项或多项任务的相关器械的组合。

-“微流体装置”(分别为微米流体、毫米流体、纳米流体)，指定为包含至少一个微通道(分别为微米通道、毫米通道、纳米通道)的装置，但装置可选地包含其它部件，所述其它部件在其性质或功能上不必是流体或微流体。本发明的微流体装置可以涉及不同水平的集成。例如，它们可以限制成集成一个或多个功能的单个微流体芯片或部件。本发明的微流体装置还可以包括所有其它种类的元件和部件，其中一些在此明确描述为例如泵、阀、传感器、致动器、检测器以及本领域已知的许多其它元件和部件，这些元件和部件包含在本发明的范围内。特别地，本发明的微流体装置也可以是完整的器械，并且例如集成任何的保持器、壳体、电源、控制软件和硬件、通信装置、存储装置、操纵装置、人机界面。

-术语“集成装置”，指定为包含本发明的微流体芯片或部件和至少一个附加部件的装置。

-“附加部件”，指定为不是本发明的微流体芯片或微流体装置的组成部分的部件，但是对于操作本发明或者为了发挥本发明的某些优点可能是必需的或有利的。所述部件可以包括例如机械操纵器或保持器、流体容器、管道或流通装置、电子部件或光学部件或信息处理部件、用户接口、外壳等。作为共同的特征，本发明的附加部件通过某些手段例如机械、电、电磁、光学、流体等与本发明的微流体装置或微流体通道连接或相关联，并且该附加部件涉及本发明的装置的操作的至少一个潜在方式。

-“活体”，指定为活体生物体、生物体的活体部分、活细胞或活细胞组合(livingcellular assemblies)。这包括例如器官、器官的一部分、细胞、细胞组合，来自包括人在内的各种生物体，特别是生物神经元和任何可产生神经元的细胞类型。

-“引导轨道”，指定为在微流体装置内的特定区域，相比于所述装置的不属于引导轨道的部分，关注的活体优选它们在该区域内或在该区域上定位或生长。所述引导轨道可以是化学的，例如由表面上或大部分液体中或凝胶中的一些特定化学物质限定或者一些特定化学性质如电荷、pH值、疏水性、化学组成而限定；它也可以是生物或生物化学的，例如由一些特定的生物或化学种类如蛋白质、抗体、适体、亲和体、细胞等来限定。所述引导轨道也可以是物理的，即它可以包含在包括拓扑结构或被拓扑结构包围的区域内，例如微米结构、纳米柱、微米柱、纳米柱、壁。在这种情况下，他们因此可以是通道、沟道、楔道、腔道；引导轨道还可以涉及其它类型的引导线索，例如与装置的其余部分具有不同的温度或辐射或光照的区域。这里限定的引导轨道有两个末端。优选地，所述末端是与另一引导轨道或隔室中的至少一个的互相连接点。然而，与另一引导轨道的互相连接不可能发生在除末端以外的沿引导轨道的其他地方，这是因为在这种情况下，交叉点将引导轨道分成彼此交叉并且与所述另一个引导轨道交叉的两个不同的引导轨道。为了清楚起见，并且作为示例，图4a涉及8个引导轨道(以及由虚线切割的引导轨道的在顶部和底部的两个半部)。图4i涉及5个引导轨道，图4j涉及9个引导轨道。本发明中的引导轨道可以是任何尺寸，纳米级、微米级、毫米级。优选地，本发明中的至少一些引导轨道是长形的。

-“横穿引导轨道”，指定为连接两条相邻引导轨道的引导轨道；所述相邻的引导轨道将第一隔室连接至第二隔室。所述横穿引导轨道包括呈现内凹部的弯曲部分，其中所述弯曲部分的所述内凹部面向作为接收隔室的第一隔室。

-相反地，在本发明装置上的不属于任何引导轨道或隔室的一部分的区域被命名为“排斥区域”。这应该是广义的意思，即不仅包括被处理过以排斥细胞的表面，而且还包括具有支持细胞或细胞突起生长或粘附的能力低于引导轨道的能力的任何区域。例如，“排斥区域”可以是没有表面处理的区域，或者具有亲水性、优选不带电的、天然的区域，或者升高的形貌结构，或者细胞不能穿透构造该装置的材料的体积中的区域等等……。

而且，本发明的装置通常以三维形式延伸，典型地因为细胞或更广泛地活体是立体的并且因此需要一定的厚度来生长。因此，本发明中的“排斥区域”的概念是相对于平面而定义的，尽管事实上该平面可能仅仅是穿过排斥区域的切口，该排斥区域确实是立体体积。因此，在说明书中将等同地使用“排斥区域”和“排斥体积”。例如，取决于实施方案，在“尖角”或弯曲区域等以及表征本发明的更广泛的结构中的不对称性可以涉及沿不同类型平面的不同类型的切口)。

例如，许多实施方案沿平面设计组织形成，并且尖角或其它结构也沿着所述平面组织形成。这例如是图3中描述的实施方案中的情况。一些其它实施方案可以利用第三维来实施本发明。这例如是图8中呈现的实施方案的情况。在那种情况下，“排斥区域”或“尖角”的概念将被认为沿着与该装置的主平面不同的平面，例如在图8的情况是沿着BB’平面的竖直切割线。

-如本文所用，“互相连接的通道”或“互相连接的引导轨道”是指在结构内在至少一个末端处接触的两个或更多个通道或轨道。

-两条引导轨道彼此相遇的地方称为“互相连接点”。互相连接点可以涉及不同数量的引导渠道或通道。例如，图4a示出了涉及4条引导轨道的互相连接点或“四通式互相连接点”；图4d示出了涉及3个引导轨道或“三通式互相连接点”的互相连接点5。

-如果互相连接的网络包括至少两个不同的互相连接点，或者至少有一个涉及至少4个引导轨道的互相连接点，则称互相连接的网络包含“多个互相连接点”。

-通道或多个未连接的或互相连接的通道或引导轨道，在设备中限定一个或多个“流动路径”或引导路径(即流体在外力作用下或者在扩散的作用下可以遵循的路径，或者分别是多个细胞或一个细胞的路径)。

-指定通道或引导轨道的整体为通道或引导轨道的“网络”，通道或引导轨道中的每个至少包括与所述网络中的第二通道或引导轨道的流体连接或与所述网络中的另一引导轨道的接触。如果可以在所述网络中的任何两个通道或任何两个引导轨道之间发现流体流动路径或沿着引导轨道的连续性，则所述网络被称为“互相连接的网络”。

-“尖锐角”或“尖角”，参考引导轨道的边界或参考引导轨道，其指定为所述边界或所述轨道突然改变方向的位置。突然地应该参考用于制造该装置的微制造方法的可能性以及参考存在于所述引导轨道上的活体的特性来理解。例如，许多制造技术具有有限的分辨率，因此不能制造具有小于所述分辨率的回转半径的角度或小于所述分辨率乘以一些数字因子的角度。因此，具有由制造分辨率限制的一些圆的角度在本发明内仍被认为是尖锐的。另外，关于活体，如果角度的回转半径(可能乘以因子)小于所述活体能够没有损坏地转弯的转角，则角度将被视为“尖锐”的。

-相反地，将沿着引导轨道的区域定义为引导轨道的“弯曲”部分，并且引导轨道的主轴线沿着该区域具有逐渐变化的方向。同样，如果所述边界的方向逐渐变化，则将引导轨道或排斥区域的边界定义为“弯曲”。在一些实施方案中，如果在所述位置处所述边界的回转半径小于2倍的(优选地小于5倍或10倍)所述位置的任一侧上的所述边界的回转半径，则引导轨道的边界上的位置将被定义为“尖角”。

另外在一些实施方案中，如果所述引导轨道的主轴线的回转半径有限但大于2倍的(优选地大于5倍或10倍)所述引导轨道的宽度，则引导轨道的一部分将被限定为弯曲的。

在一些实施方案中，如果在所述位置处所述边界的回转半径小于2倍(优选地小于5倍或10倍)的所述位置的任一侧上的所述边界的回转半径，则引导轨道的边界上的位置将被定义为“尖角”；等同地，在一些实施方案中，可以将“尖角”定义为这样的位置，在该位置上结构边界的回转半径的倒数具有峰值，所述峰值是高于位于所述峰值的每侧上的所述倒数的值得至少2倍，优选5倍、10倍或20倍。

在一些实施方案中，所述尖角还可以参考所引导的细胞或细胞突起的特性来限定。例如，如果所述位置处的所述边界的回转半径小于引导的细胞结构的持续长度或典型曲率，优选地小于2倍、5倍、10倍、20倍或50倍的所述持续长度或典型曲率，则沿着细胞引导结构的边界的地方将构成“尖角”。在一些实施方案中，所述细胞结构是细胞突起。

相反地，如果沿着引导轨道的区域的主轴线不是线性的并且其回转半径大于引导的细胞结构的持续长度或典型曲率，优选地大于2倍、5倍、10倍、20倍或50倍的所述持久长度或典型曲率，则沿着引导轨道的区域将定义为“弯曲”。

-所述“细胞突起”可以是从胞体突出的细胞的任何部分，例如神经突、或轴突、或树突、或侵入性伪足、或丝状伪足、或细胞膜、或细胞突起、或鞭毛、或微触须、或生长锥。

例如，在神经元的情况下，为了解决思路，如果沿边界的地方回转半径小于2微米，或者小于5微米、8微米、10微米或20微米，则所述沿边界的地方将被视为尖角。

还重要的是，尖角限定了在所述尖角的一侧上的边界的方向与所述尖角的另一侧上的边界的方向之间的方向变化的角度。

附图说明

图1示出了可用于创建引导图案的不同类型的引导提示。

图2显示了现有技术的不同类型的引导图案。

图3表示遇到尖角的轴突的特性的研究(图3A)，以及本发明的装置的示例(图3B)，具有允许从左到右的神经元连接。

图4表示本发明的可能实施方案的非限制性系列示例。

图4a表示第一种可能设计，其包括称为发射隔室的第一隔室1、称为接收隔室的第二隔室2和由引导轨道4分隔开的排斥区域3，排斥区域以两行和两列组织而成(附加行未示出，可能会超出虚线)。引导轨道5之间的互相连接点在这里是四通互相连接点。在这种设计中，排斥区域的右列在面向接收隔室的一侧具有两个尖角，而在面向发射隔室的一侧没有尖角。左列在两侧都具有两个尖角，但面向接收隔室的尖角比面向发射隔室的尖角尖锐。引导轨道的网络是一个完全互相连接的网络。

图4b表示第二种设计，其具有三列排斥区域。右列和左列与图4a中的列相同，中间列在面向接收隔室的一侧具有两个尖锐的尖角，并且在面向发射隔室的一侧没有尖角。

图4c表示另一种可能的设计，其中排斥区域的中间列在面向接收隔室的一侧具有一个尖角，而在面向发射隔室的一侧没有尖角。在所述排斥区域左侧的引导轨道是圆形的并且其凹部面向接收隔室。

图4d表示另一种设计，其中排斥区域没有按常规列进行组织。在那种情况下，互相连接点5是三通互相连接点。

图4e表示又一种设计，其具有与漏斗形的引导轨道4结合的根据本发明的三列排斥区域。

图4f表示另一种设计，示出了一个优选实施方案，其中排斥区域和隔室之间的边界不是直的。

图4g表示又一个实施方案，其中排斥区域的尺寸沿一个方向是不均匀的。

图4h表示另一个实施方案，其中排斥区域的尺寸沿着两个方向是不均匀的。

图4i表示另一个实施方案，其中引导轨道的网络没有完全互相连接。该实施方案包括所述网络与发射隔室的至少一个连接以及与接收隔室的一个连接。它还包括两个排斥区域3，其具有一个面向接收隔室的尖角，并且没有面向发射隔室的尖角。它还包括5个引导轨道4和所述引导轨道5之间的两个四通互相连接点。当然，这种设计可以根据需要横向地(以便产生在发射隔室和接收隔室之间的相互连接点的若干独立的行)或纵向地重复任意次数，如图4j所示，以形成引导轨道和排斥区域的若干列。后一种设计的意义在于例如增加设计的选择性。

图4j表示另一个实施方案，其中引导轨道的网络对应于图4i的重复设计的示例。

图5表示作为另一个示例，用于准备根据本发明的排斥区域的组合设计的装置的具体实现的凸模的一部分以及具有漏斗形状的一些微米通道的放大图(仅中间列被完全示出)，其中引导轨道由微米通道或沟槽构成。

图6举例说明了本发明的用途，以促进轴突从发射隔室到接收隔室的生长(图6A和图6B)，并防止轴突从接收隔室到发射隔室的生长(图6C和图6D)。

图7表示实验和理论模型之间的比较，用于本发明的操作，以及不同设计的选择性的评估。

图7A示出了有效概率分布。

图7B示出了类似于4a的本发明设计的实验结果(顶部)和模拟结果(底部)之间的比较。

图7C呈现了几种不同设计的理论选择性(从发射隔室到接收隔室穿过引导图案的轴突的数量至沿相反方向穿过引导图案的轴突的数量)。设计1、设计2和设计3具有类似于4f的引导图案，其分别具有2列、5列和10列排斥区域。设计4具有类似于4e的引导图案，具有5列排斥区域。

图8表示本发明的实施方案，其中表征特征在第三维中展开。

图8A表示现有技术的装置，在竖直平面B B'中没有尖角。

图8B表示本发明的装置，其包括在接收隔室2的侧部上的微米通道3的末端处的位于BB'平面中的尖角4，并且在发射隔室1的侧部上的所述通道的末端处没有这种尖角。

图8C表示本发明的另一装置，其包括在接收隔室2的侧部上的微米通道3的末端处的位于BB'平面中的两个尖角4，并且在发射隔室1的侧部上的所述通道的末端处没有这种尖角。

图8D表示本发明的另一装置，其包括在接收隔室6和2的侧部上的微米通道3的末端处的位于BB'平面中的两个尖角4。

图8E表示本发明的装置，其包括在接收隔室2的侧部上的微米通道3的末端处的位于BB'平面中的尖角4，并且在发射隔室1的侧部上的所述通道的末端处没有这种尖角，接收隔室高于发射隔室2。

图9表示根据本发明的一个实施方案的一个引导轨道(4)，其中引导轨道(4)包括用于导引活体的一个或多个微切口。

附图标记

1-发射隔室；

2-接收隔室；

3-排斥区域或物体；

4-引导轨道；

5-引导轨道之间的互相连接点；

6-第三隔室。

具体实施方式

本发明涉及微流体的领域，特别是微米流体和纳米流体。

更具体地说，它提出了控制、生长、选择、处理或培养活体的微流体装置。

在一些具体实施方式中，本发明提出了新的方法以控制生物体、细胞、细胞集合体、细胞突起、细胞器、细胞突起、细胞边界、神经突、神经元、树突、胞突、板状伪足、侵入性伪足、细胞伸展等等的引导、连接或定位，所述方法比现有技术更加有效或更为方便。

在第一方面，本发明涉及一种用于控制、生长、选择、处理或培养活体的微流体装置，其至少包括称为“发射隔室”的第一隔室、称为“接收隔室”的第二隔室以及具有至少两个互相连接点的引导轨道的网络，所述网络在其元件中的至少一些元件之间限定由周边包围的排斥区域，其中所述排斥区域中的至少一些在其与发射隔室或者具有从发射隔室产生的引导轨道接触的一侧(而不是在与接收隔室接触或从接收隔室产生的引导轨道接触的一侧)呈现多个尖角或具有更小角度的尖角或者它们的组合。

作为本发明的另一方面，其提出了用于控制、生长、选择、处理或培养活体的微流体装置，其至少包括称为“发射隔室”的第一隔室、称为“接收隔室”的第二隔室以及具有至少两个互相连接点的引导轨道的网络，所述网络在其元件之间限定排斥区域或排斥体积，所述排斥区域由周边限定，或者所述排斥体积由表面限定，其中所述排斥区域中的至少一些关于沿其周边或表面的两侧的弯曲部分或尖角呈现不对称性，所述两侧分别与发射隔室(或从发射隔室产生的引导轨道)接触并和接收隔室(或从接收隔室产生的引导轨道)接触。

作为本发明的另一方面，其提出了用于控制、生长、选择、处理或培养活体的微流体装置，其至少包括称为“发射隔室”的第一隔室、称为“接收隔室”的第二隔室以及具有至少两个互相连接点的引导轨道的网络，所述网络至少包括至少横穿引导轨道，所述横穿引导轨道包括至少一些弯曲部分，其中所述弯曲部分的内凹部优选地面向接收隔室或者网络的连接至接收隔室的部分，并且所述弯曲部分的外凸部优选地面向发射隔室或者网络的连接至发射隔室的部分。

根据优选实施方案，所述互相连接点为三通互相连接点。在另一个实施方案中，所述互相连接点为四通互相连接点。

根据一个实施方案，所述引导轨道的网络包括沿着每个引导轨道的至少3个、4个、5个或6个互相连接点。

根据一个实施方案，至少一个横穿引导轨道的弯曲部分的回转半径小于20μm。在另一个实施方案中，至少一个横穿引导轨道的弯曲部分的回转半径小于10μm、8μm、5μm或小于2μm。该回转半径允许活体改变方向并离开连接两个隔室的引导轨道。

作为本发明的另一方面，其提出了用于控制、生长、选择、处理或培养活体的微流体装置，其至少包括称为“发射隔室”的第一隔室、称为“接收隔室”的第二隔室、以及引导轨道的网络，所述引导轨道在其面向接收隔室的一侧或在其与网络的连接至接收隔室的部分接触的一侧比在其面向发射隔室的一侧或在其与网络的连接至发射隔室的部分(该部分包括至少一些弯曲部分)接触的一侧呈现更多的尖角或更尖的尖角，其中所述弯曲部分的内凹部优选地面向接收隔室或者网络的连接至接收隔室的部分，并且所述弯曲部分的外凸部优选地面向发射隔室或者网络的连接至发射隔室的部分。

在一些优选的实施方案中，例如在图8b和图8c中举例说明的，至少一些引导轨道具有微米通道的形式，并且所述微米通道与接收隔室的连接产生在所述隔室的在远离所述隔室的底部的位置处的侧壁上，而所述微米通道与发射隔室的连接产生在所述隔室的在与所述隔室的底部同水平的位置处的侧壁上。

在一些优选实施方案中，有利地与上述结合，所述隔室的底部对于活体是粘附性的，而所述隔室的侧壁对于活体是非粘附性的或是较少粘附性。

“优选地”，在上面和下面的描述中，我们的意思是，从全面的或统计的角度来看，具有第一特性的引导轨道比具有第二特性的更多，或者给定的引导轨道沿其长度具有带有所述第一特性的部段比带有所述第二特性的部段更多，或者具有所述第一特性的引导轨道的数量与具有所述第一特性的所述引导轨道的长度的第一组合高于关于第二特性建立的第二组合。例如，并且这里正好给出的为非排他性的方式来修正想法，所述第一组合可以是具有弯曲部分(其具有面向接收隔室的内凹部)的引导轨道的所有长度的总和，并且所述第二组合可以是具有弯曲部分(其具有面向发射隔室的内凹部)的引导轨道的所有长度的总和。

在一些优选实施方案中，所述网络存在多个互相连接点。

在一些优选实施方案中，所述多个互相连接点存在至少四通式的互相连接点。

在一些优选实施方案中，所述互相连接点分布为一维阵列，或者为二维阵列，或者为三维阵列。例如，图4a至图4h示出了以二维阵列分布的互相连接点，其中排斥区域和连接轨道以多个列和行来组织形成，而图4i至图4j示出了以一维阵列分布的互相连接点，作为基本设计的连接的行。通过将如图4a至图4h中的多层设计关联，可以获得三维阵列。通过将如图4i至图4j中的设计关联为多个层，或者将相同层的平行的行关联起来，可以获得二维阵列。在该图的特定表示中，使用惯例将列设计为沿自下而上方向的多个元件，将行设计为沿左右方向的多个元件，以及在垂直于纸的平面上设计层。但是，这个惯例只是一种表示的工具。

利用这样的设计，例如在示例2或示例4中所展示的，从发射隔室增殖的细胞突起倾向于跟随引导结构的圆形侧部，并因此返回到接收隔室。相反，对于来自另一侧的突起，它们似乎不能跟随所述侧部，并因此继续朝向接收隔室。这种效果取决于通道、引导结构和排斥区域的形状，还取决于活体和突起的性质。因此，本发明提出了不同的方法来制备装置，其可能对不同类型的活体和/或不同类型的细胞突起更加有用。

在一些优选实施方案中，所述网络是连接的网络。

在一些优选的实施方案中，所述网络或所述引导轨道中的至少一些在其表面的至少一部分上具有有利于细胞粘附或细胞生长的特性，或者更广泛地具有用于活体的亲和性。

在一些其它优选的实施方案中，本发明的隔室或通道在限定它们的表面的至少一个元件上对于活体呈现粘附性并在限定它们的表面的至少另一个元件上对于活体(特别是包含在所述隔室或通道中的活体，或者引入或培养在所述隔室或通道中的活体)呈现非粘附性或较少粘附性。

许多有利于细胞粘附的方法是本领域技术人员已知的。这可以例如包括在具有全体正电荷的表面中的例如但不限于的层粘连蛋白、纤连蛋白、聚赖氨酸或更广泛地包含胺官能团的聚合物或包含阳离子部分的聚合物。这也可能包含带有生物聚合物或蛋白质的表面或有利于细胞粘附或细胞生长的培养基，如基质胶、胶原蛋白。这也可能包括具有一些疏水特性的表面，如细胞培养皿中常用的，如聚苯乙烯……。

还优选地，排斥区域具有不利于细胞粘附或细胞生长的特性，或不具有对活体的亲和性，或者具有比引导轨道更少的利于细胞粘附或细胞生长的特性，或具有比引导轨道少的对活体的亲和性。例如，“排斥区域”可以是没有表面处理的区域，或者具有亲水性、优选不带电的、天然的区域，或者带有氟化聚合物的区域，或者升高的形貌结构，或者细胞不能穿透构造该装置的材料的体积中的区域等等……。

在一些优选的实施方案中，所述连接的网络具有与发射隔室的多个连接或者与接收隔室的多个连接，或者优选地是上述的组合。

在优选的实施方案中，排斥区域的与从发射(或接收)隔室产生的引导轨道接触的侧部也面向所述发射(或接收)隔室。然而，在其它实施方案中，例如如果引导轨道的网络具有改变细胞突起的大体增殖方向的弯曲形状，则可不是上述这种情况。

引导轨道的网络与隔室的连接可以是不同类型的。例如，如果引导轨道是微米通道，则它们可以是流体连接，但是如果引导轨道包含或包括细胞粘附表面处理，则所述连接也可以仅仅是所述表面处理与所述隔室的细胞粘合剂表面处理的连续性。

在一些实施方案中，面向或连接到发射隔室的排斥区域的尖角中的至少一些具有小于150°的尖角角度，优选地小于140°或130°或120°或110°或者100°，甚至更优地选小于90°。

在一些其它实施方案中，面向或连接到接收隔室的排斥区域没有尖角角度小于90°的任何尖角。优选地，面向或连接到接收隔室的排斥区域没有尖角角度小于96°、100°、120°、150°、154°、160°或170°的任何尖角。

在一些实施方案中，面向或连接到接收隔室的排斥区域具有范围从90°到180°、从96°到180°从100°到180°、从120°到180°、从150°到180°、从154°到180°、从160°到180°或从170°到180°的尖角角度。

在一些实施方案中，引导轨道限定了在边缘方向的变化。方向的这种改变被限定为凸角的正向。在一个实施方案中，与至少一个第二引导轨道互相连接并且被引导到第一隔室的至少一个第一引导轨道在互相连接点处呈现出从+90°到-90°、从+84°至-84°、从+80°至-80°、从+70°至-70°、从+60°至-60°、从+50°至-50°、从+40°至-40°、从+30°至-30°、从+26°至-26°、从+20°至+-20°或从+10°至-10°的方向的变化。

在优选实施方案中，所述引导轨道对至少一些活体呈现亲和性，其高于装置的不是所述引导轨道的部分的区域的亲和性。

在优选实施方案中，所述发射隔室或接收隔室的至少一部分对至少一些活体具有亲和性，其高于装置的不是所述引导轨道的部分的区域的亲和性。

设计本发明的装置的另一种方便的方法是以拱形形状形成对连接发射隔室和接收隔室的网络的一些引导轨道部分，并且使它们的内凹部面向接收隔室。这些设计的示例在图3b、图4、图5、图6和图7b中示出。对于拱形，我们通常指的是具有非线性形状的通道或引导轨道，全体呈现朝向一侧的内凹部和朝向另一侧的外凸部。所述拱形可以具有规则的半径，但是它也可以呈现更复杂的形状，以上所阐明的关于外凸部提供的一般性质是保守的。

设计本发明的装置的另一种方便的方法是形成连接发射隔室和接收隔室的一些引导轨道以及连接两个相邻引导轨道的一些横穿引导轨道。所述横穿引导轨道包括至少弯曲部分，所述弯曲部分呈现内凹部和外凸部，其中所述弯曲部分的内凹部面向发射隔室，而所述弯曲部分的外凸部面向接收隔室。

本发明的这种设计允许在发射隔室中培养的活体被引导到接收隔室，但不允许在接收隔室中培养的活体被引导到发射隔室。

因此，本发明的另一个目的是提出一种用于控制、生长、选择、处理或培养活体的微米流体装置，其至少包括称为“发射隔室”的第一隔室、称为“接收隔室”的第二隔室以及具有与每个所述隔室的多个连接点的引导轨道的连接网络，其中所述引导轨道中的至少一些在其长度的至少一部分上具有拱形形状，所述拱形形状具有朝向所述接收隔室的内凹部。

设计本发明的装置的另一种方法是以圆形瓦片形状形成一些排斥区域，其具有面向发射隔室的外凸部区域。图4示出了这种设计的示例。

因此，本发明的另一个目的是提出一种用于控制、生长、选择、处理或培养活体的微流体装置，其至少包括称为“发射隔室”的第一隔室、称为“接收隔室”的第二室以及在它们之间限定排斥区域的引导轨道的连接网络，其中所述排斥区域中的一些具有圆形瓦片形状，其外凸部部分面向发射隔室。

在许多情况下，微米流体技术领域的技术人员或细胞培养领域的技术人员将易于用上述说明设计本发明的装置。然而，本发明的另一个目的是提供另外的方法来帮助用户进行这样的设计，例如通过使用一些定性的规则，或者通过可用于优化排斥区域的形状的一些算法或数学公式。示例6给出了算法的一个例子。下面给出几个示例性的定性规则和设计原则。

根据实施方案，本发明中的排斥区域可以以各种方式相互组织。在一些实施方案中，它们被组织成至少一列并沿着发射隔室和接收隔室之间的至少一行。然而，在许多优选实施方案中，它们被组织成至少两列，或者甚至优选地被组织成至少三列。

在其它优选的实施方案中，排斥区域没有按规则的列组织排列，但是有利的是，从发射隔室到接收隔室的路径遇到多个引导轨道和/或几个排斥区域。

因此，在一些优选的实施方案中，本发明的排斥区域或引导轨道以这样的方式组织形成，即从发射隔室到接收隔室的划出的至少一条直线穿过至少两个排斥区域，优选地为穿过三、四或五个排斥区域，或者与至少一个引导轨道交叉，优选地与二、三、四或五个引导轨道交叉。在所述实施方案中，微米流体装置包括至少一个引导轨道，所述引导轨道通过直线连接发射隔室和接收隔室，并且所述至少一个引导轨道连接到至少一个横穿引导轨道，并且优选地连接到二、三、四、五或六个横穿引导轨道。

在其它优选实施方案中，有利地与上述结合，它们被组织成至少两行。例如，图4b、图4c、图4e示出了具有三列排斥区域的本发明的装置的示例。图4a、图4e示出了具有两列的装置的示例。图4h示出了本发明的装置的示例，其中排斥区域在“自下而上”的方向上组织成几列，但在左右方向上随机地组织。

在层内或层间或沿着行或沿着列的排斥区域的组织也可以变化。值得注意的是，所述排斥区域的重心至少部分地在规则的二维网格上可以或不可以组织形成。在一些优选实施方案中，所述网格是正方形网格。在一些其它实施方案中，所述网格可以是六边形或矩形，或者为菱形的形状，或随机的呈现不同水平。例如，图4a、图4b涉及具有以矩形网格组织的重心的排斥区域。图4c、图4d代表具有以菱形网格组织的重心的排斥区域。图4g、图4h代表以非规则或仅部分规则的网格的重心的组织的区域。

而且，属于不同层或不同行或列的排斥区域的重心可以沿轴线对齐，或者可以从一层、一行或一列转移到另一层、另一行或另一列。在优选实施方案中，它们被转移。例如，图4a、图4b、图4c代表具有对齐的重心的设计，而图5d代表转移的重心。

在一些实施方案中，连接通道或引导结构的形状还可以包括一些其它特征。在一些优选实施方案中，例如，所述通道或结构中的至少一些可以呈现漏斗形状。在这种情况下，漏斗的较宽部分优选地在与发射隔室相连的通道或引导结构的一侧上，并且较窄部分优选地在与接收隔室相连接的一侧上。所述设计的一个示例在图2中给出。

引导轨道的宽度可以具有不同的尺寸，但是优选地它们大于所引导的胞体的自然宽度。在一些优选的实施方式中，为了研究人类细胞，它们具有小于50μm，优选地小于30μm，并且非常优选地小于20μm的宽度，或者它们具有1μm至20μm之间的宽度，或者2μm至15μm之间的宽度，或者3μm与50μm之间的宽度。在另一个实施方案中，为了研究多细胞生物体，引导轨道可以具有大于200μm的宽度。

还在一些优选的实施方案中，引导轨道不会出现大的和突然的宽度变化，应理解的是，这并不排除宽度逐渐变化的可能性，或者在引导轨道交叉处发生的不可避免的宽度变化。因此典型地，在一些优选实施方案中，引导轨道不会在等于变化之前和之后的两个宽度中的最小者的长度上出现超过因数2或3或5或10的宽度变化，或分别为所述长度的2、3、5或10倍。

而且，在一些优选实施方案中，有利的是，引导轨道的宽度，至少一些交叉点的宽度呈现为所引导的细胞体的尺寸的至少2倍的宽度，优选地至少为3、4、5、7、10、15或20倍的宽度。例如，为了引导神经突，所述宽度优选为至少3μm、4μm、5μm、7μm、10μm、15μm、20μm或30μm。但对于其它物种，所述宽度范围为1μm至100μm。

根据另一个实施方案，发射隔室与接收隔室之间的长度范围为50μm到10cm，优选地在50μm至5cm之间。

根据一个实施方案，将发射隔室连接到接收隔室的引导轨道的长度的长度的范围为50μm到10cm。

本发明通过由通道或引导轨道的网络连接的至少两个隔室来发挥其积极作用，但是当然，在一些实施方案中，其可以包括多于两个的隔室，特别是多于两个通过网络(优选地引导轨道的互相连接网络)连接的隔室。也可以以各种方式组织隔室，例如，平行地或径向地。隔室和/或引导轨道也可以组织形成在一个二维层中，或者组织形成在几个二维层中，或以组织形成在任何三维布置中。

而且，在一些实施方案中，本发明中的引导轨道中的至少一些或更广泛地通道或隔室中的至少一些可以包含凝胶介质或可经历转变成凝胶状态的介质。

本发明对控制、生长、选择、处理或培养活体特别有用。因此，本发明的目的还在于提出一种如上所述的装置，其另外包括活体；优选地，所述活体占据至少一个隔室或至少一个通道或引导轨道。

在优选的实施方案中，至少一些所述活体是细胞。

在一些优选的实施方案中，所述细胞是神经细胞、神经元、神经胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、许旺细胞中的任何一种或者允许获得上述细胞的类型的任何前体细胞类型。

在一些其它优选的实施方案中，所述细胞可以是内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、肝细胞、心肌细胞、来自特定器官的细胞中的任何一种。

所述细胞可以是来自任何生物体的细胞。在优选的实施方案中，尽管它们是来自哺乳动物，特别是人类细胞，或来自灵长类动物的细胞或来自啮齿动物的细胞。

在一些优选的实施方案中，所述细胞是来自细胞系的细胞。

在一些其它实施方案中，所述细胞是原代细胞。

在又一些特别优选的实施方案中，所述细胞是干细胞或iPSC细胞。

由于本发明，可以在细胞上或利用细胞进行在现有技术装置中不能完成或不能有效完成的不同类型的操作。因此，本发明的目的还在于提出一种用于培养细胞的器械，用于筛选生物或化学物质，特别是药物，并且因此器械用于(作为示例的非限制性列举)药物发现、药物测试、干细胞生长、干细胞分化、干细胞培养、干细胞制备、癌症研究，用于医学、生物技术、生命科学、食品工业、环境筛选等等，所述器械包括如上所述的本发明的微流体装置。

由于其比现有技术具有更好地控制细胞形状的可能性，本发明还提出了具有上述特征的至少一些的可植入装置。作为非限制性列举，所述可植入装置可以是用于部分神经系统再生的装置，用于改善各种类型的不利因素，特别是马达或传感器功能的损伤。在其它实施方案中，所述可植入装置可以是上皮的组成部分、内皮的组成部分、血管系统的组成部分、器官的组成部分。

当然，除了如上所述的微流体装置或包括隔室和通道或引导轨道的网络的芯片之外，本发明的器械或装置还可以包括细胞培养、生物学研究、医学、显微镜学、仪器学或微米流体领域已知的任何种类的附加元件，诸如成像部件、光学部件、磁性部件、声学部件、机械部件、流量控制部件、储存器、培养箱、显微镜、芯片支架、显微操作器、电子部件、计算机、软件等。

如上所述，本发明对于控制活体的运动、形状或位置特别有意义。

因此，本发明的另一个目的是提出一种用于控制活体的运动、形状、变形、生长空间定向或位置的方法，所述方法包括将所述活体置于本发明的微流体装置内的步骤。

在其它实施方案中，本发明还提出了用于培养细胞、用于筛选生物或化学物种、用于药物发现、药物测试、干细胞生长、干细胞分化、干细胞培养、干细胞生产、癌症研究、用于医学、生物技术、生命科学、食品工业、环境筛选的方法，其包括在本发明的装置中培养活体的步骤。

本发明的一个目的是一种装置，其包括通过至少三个引导轨道的网络连接的第一隔室和第二隔室，其中至少第一引导轨道连接到第一隔室，并且至少第二引导轨道连接到所述第二隔室，所述至少第一引导轨道和第二引导轨道用至少第三引导轨道彼此连接，其中所述至少三个引导轨道在相交时形成物体，所述物体具有基本朝向所述第一隔室定向的近端和基本朝向所述第二隔室定向的远端，其中所述近端包括从150°到180°的至少一个内角，并且其中所述远端包括小于150°的至少一个内角(图4a至图4f)。

根据一个实施方案，所述装置包括由引导轨道交叉点形成的至少两个物体，其具有基本朝向第一隔室定向的近端和基本朝向第二隔室定向的远端，其中近端包括从150°至180°的至少一个内角，并且其中所述远端包括至少一个小于150°的内角，并且所述第二物体的所述远端通过引导轨道与所述第一物体的所述近端分离。

根据一个实施方案，物体的长度范围从20μm到10mm。

本发明的一个目的是提供一种装置，其包括由至少四个引导轨道的网络连接的第一隔室和第二隔室，其中至少第一引导轨道连接到第一隔室，并且至少第二引导轨道连接到所述第二隔室，所述至少第一引导轨道和第二引导轨道通过至少第三引导轨道和第四引导轨道彼此连接，其中所述至少四个引导轨道在相交时形成物体，所述物体具有基本朝向所述第一隔室的近端和基本朝向所述第二隔室定向的远端，其中所述近端包括从150°至180°的至少一个内角，并且其中所述远端包括至少一个小于150°的内角(图4i和图4j)。

根据本发明的实施方案，近端包括从150°、155°、160°、165°、170°或175°至180°的至少一个内角。

根据本发明的实施方案，远端包括小于150°、145°、140°、135°、130°、125°、120°、115°、110°、105°、100°、95°、90°、85°、80°、75°、70°、65°、60°、55°、50°、45°、40°、35°、30°、25°、20°、15°、10°的至少一个内角。

根据本发明的一个实施方案，近端是外凸的半圆形或该外凸的半圆形的部分。根据本发明的一个实施方案，近端具有外凸的半圆形或半椭圆形或该外凸的半圆形或半椭圆形的部分。根据本发明的一个实施方案，近端具有外凸的多面体或外凸的多边形形状。

根据本发明的一个实施方案，远端是其内凹的半圆形或该内凹的半圆形的部分。根据本发明的一个实施方案，远端具有内凹的半圆形或内凹的半椭圆形或该内凹的半圆形或内凹的半椭圆形的部分。根据本发明的一个实施方案，远端具有内凹的多面体或多边形形状。

根据本发明的一个实施方案，上述装置与专利申请PCT/FR09/01198中描述的装置结合，在此引入作为参考。

根据本发明的一个实施方案，引导轨道从第一隔室的末端到第二隔室的开始处具有逐渐减小的宽度。

根据本发明的一个实施方案，引导轨道的宽度减小是线性的。

根据本发明的一个实施方案，引导轨道的宽度减小是成指数形式的。

根据本发明的实施方案，引导轨道的宽度减小根据具有负指数的幂函数。

根据一个实施方案，从第一隔室的末端到第二隔室的开始处的引导轨道的宽度包括在10微米到50微米之间。

根据一个实施方案，从第一隔室的末端到第二隔室的开始处的引导轨道的宽度包括在10微米至40微米之间。

根据一个实施方案，从第一隔室的末端到第二隔室的开始处的引导轨道的宽度被包括在10微米至30微米之间。

根据一个实施方案，从第一隔室的末端到第二隔室的开始处的引导轨道的宽度被包括在10微米到20微米之间。

根据一个实施方案，从第一隔室的末端到第二隔室的开始处的引导轨道的宽度为大约15微米。

根据本发明的一个实施方案，引导轨道从第二隔室的末端到第一隔室的开始处具有逐渐增加的宽度。

根据一个实施方案，引导轨道的宽度增加是线性的。

根据一个实施方案，引导轨道的宽度增加是成指数形式的。

根据一个实施方案，引导轨道的宽度增加根据具有正指数的幂函数。

根据一个实施方案，从第二隔室的末端到第一隔室的开始处的引导轨道的宽度包括在10微米到50微米之间。

根据一个实施方案，从第二隔室的末端到第一隔室的开始处的引导轨道的宽度包括在10微米到40微米之间。

根据一个实施方案，从第二隔室的末端到第一隔室的开始处的引导轨道的宽度包括在10微米到30微米之间。

根据一个实施方案，从第二隔室的末端到第一隔室的开始处的引导轨道的宽度包括在10微米到20微米之间。

根据一个实施方案，从第二隔室的末端到第一隔室的开始处的引导轨道的宽度为大约15微米。

根据本发明的一个实施方案，引导轨道从近端到远端具有逐渐减小的宽度。

根据一个实施方案，引导轨道的宽度减小是线性的。

根据一个实施方案，引导轨道的宽度减小是成指数形式的。

根据一个实施方案，引导轨道的宽度减小根据具有负指数的幂函数。

根据一个实施方案，引导轨道从近端到远端的宽度包括在10微米到300微米之间。

根据一个实施方案，引导轨道从近端到远端的宽度包括在10微米到50微米之间。

根据一个实施方案，引导轨道从近端到远端的宽度包括在10微米到40微米之间。

根据一个实施方案，引导轨道从近端到远端的宽度包括在10微米到30微米之间。

根据一个实施方案，引导轨道从近端到远端的宽度包括在10微米到20微米之间。

根据一个实施方案，引导轨道从近端到远端的宽度为大约15微米。

根据本发明的一个实施方案，引导轨道从远端到近端具有逐渐增加的宽度。

根据本发明的一个实施方案，引导轨道的宽度增加是线性的。

根据本发明的一个实施方案，引导轨道的宽度增加是成指数形式的。

根据本发明的实施方案，引导轨道的宽度增加根据具有正指数的幂函数。

根据一个实施方案，引导轨道从远端到近端的宽度包括在10微米到50微米之间。

根据一个实施方案，引导轨道从远端到近端的宽度包括在10微米到40微米之间。

根据一个实施方案，引导轨道从远端到近端的宽度在10微米到30微米之间。

根据一个实施方案，引导轨道从远端到近端的宽度在10微米到20微米之间。

根据一个实施方案，引导轨道从远端到近端的宽度为大约15微米。

根据本发明的一个实施方案，物体的宽度包括在10微米至200微米之间。

根据本发明的一个实施方案，物体的宽度包括在50微米至150微米之间。

根据本发明的一个实施方案，物体的宽度从60微米、70微米、80微米、90微米、100微米、110微米、120微米、130微米、140微米至150微米。

根据一个实施方案，物体的宽度可以线性或成指数形式地变化，或者根据具有正或负指数的幂函数变化。

根据一个实施方案，物体的宽度范围从装置宽度的2倍到装置宽度的50倍。

根据一个实施方案，物体的宽度范围从装置宽度的3倍到装置宽度的20倍。

根据本发明的一个实施方案，物体的长度为10微米至200微米。

根据本发明的一个实施方案，物体的长度为50微米至150微米。

根据本发明的一个实施方案，物体的长度为60微米、70微米、80微米、90微米、100微米、110微米、120微米、130微米、140微米至150微米。

根据本发明的一个实施方案，物体的高度为1微米至10微米。

本发明的另一个目的是提供一种装置，其包括通过至少一个引导轨道连接的第一隔室和至少一个第二隔室，其中连接到引导轨道的第二隔室的壁的高度高于引导轨道的高度，并且引导轨道在第二隔室的壁的某一位置处连接至第二隔室，引导轨道的底部优选地位于第二隔室的底部上方(图8B、图8C、图8D)，从引导轨道的底部至隔室底部的的竖直距离为至少5μm，优选地至少10μm，非常优选地至少20μm。

示例

通过以下示例进一步说明本发明。

示例1：

如图1所示的不同类型的引导提示的示例，以及现有技术中用于制备化学类型(表面处理)、物理类型(微米沟槽、微米通道)的引导图案的方法，或者制备结合物理和化学引导提示的引导图案(模内图案化)。图1中的灰色表面代表可进入的区域，而白色表面则代表不易进入/排斥区域。

可以进行基于引导图案(图1a)的表面的创建，例如通过微接触印刷，如 A等人的软质物质，2007；3：290-8。可以制造微米沟槽或微米通道(图1b、图1c)，例如，通过传统的软光刻技术，通过在母版上模制诸如硅树脂(PDMS)的聚合物，例如在Park J等人J Neurosci Methods,2014；221：166-74；模具图案化技术中的混合(图1d)，例如，最后可以如Zhang J等人的生物材料，2006；27：5734-9所述的那样进行。

示例2：

现有技术的引导图案设计的示例。

在下面的示例中给出的引导图案可以无差别地指代现有技术的不同图案化方法，如图1所示，包括化学性质(表面处理)、物理性质(微米沟槽、微米通道)的引导图案或者物理和化学引导提示(模内图案化)的组合。例如在Peyrin的WO 2010040920中(图2A)呈现了各种设计。其中，使用细胞体(特别是轴突)相比于较窄的入口(只有3微米宽)更高概率的进入更宽的入口(这里为15μm宽)，如图2B所示的漏斗形微米通道用于产生轴突生长的定向过滤。然而，制造这种锥形通道需要高分辨率，进而需要成本很高的微制造手段，并且在一些实施方案中，轨道的变窄会对轴突或其它细胞体产生有害影响，并且损害隔室之间的扩散。

示例3：

本发明装置的设计示例。

相反，在本发明的装置中，可以在没有任何通道变窄的情况下获得选择性，避免了上述缺点。图3A显示了轴突的惊人特性，这里通过β-微管蛋白的免疫染色证实，优先沿着引导图案的边缘，所述引导图案提供了以足够低的速率偏离生长方向的这些边缘。特别是，轴突可以沿着结构的边缘，甚至沿着角度小于180°的尖角达到特定的临界角(这里在154°至96°之间)。图3B显示了利用轴突的边缘亲和性来产生从发射隔室到接收隔室的神经元之间的方向性连接的引导图案的示例，并且轴突的典型特性是这种引导图案。取决于它们是从发射隔室还是接收隔室生长，这些轴突在互相连接点处的特性不同：它们在遇到来自具有尖锐尖角的一侧的互相连接点时趋向于笔直，而它们在遇到来自具有圆边的一侧的相互连接点趋向于沿着边缘并掉头(make U-turns)。

为了创建不对称连接性，利用边缘亲和性的引导图案的其它示例包括图4中给出的那些。

示例4：

用于制造本发明的装置的模具。

图5示出了可用于制造本发明的装置的模具的轮廓立体图，其中引导轨道为物理性的，即如示例1中所述的沟槽或微米通道。模具遵循微化学的SU-8指南通过在SU-8涂层硅晶片上光刻而制造。从该模具中，例如在聚二甲基硅氧烷(PDMS)中，本发明的装置可以被浇注、固化并从模具中取出。PDMS部件可以通过等离子粘合而用玻璃基片密封以形成微米通道或直接用作微米沟槽。这种模具的凹模也可用来制造用于微接触印刷和模内图案化的印模(图1)。

在该具体实施方案中，中间列(其它列未完整示出)在朝向接收隔室的一侧包括两个尖角，并且没有尖角面向发射隔室。分隔中间列中的排斥区域的通道或沟槽另外具有漏斗形状，类似于图4E中描述的那些。最大的通道(左下)宽度为15μm，最小的通道(右上)宽度为2μm。

示例5：

本发明的装置用于体外控制轴突生长。

图6示出了具体实施方案，在该实施方案中引导图案是与图4d中所描述的那些类似的PDMS微米通道，具有两列排斥区域。在这个具体实施方案中，引导轨道的宽度为10微米，分别在图像的左侧和右侧的两个隔室之间的距离为1毫米。该装置用来自小鼠胚胎的原代皮质神经元接种在发射隔室或接收隔室，并允许它们在引导图案内在9天体外(DIV)生长轴突。使用脂质体3000(载体)用绿色荧光蛋白表达质粒在7天体外转染神经元，从而产生少量荧光神经元。利用适当的滤光片，观察了在差分干涉对比(DIC)和荧光显微镜下观察到的装置。图6A和图6B分别显示装置的相同区域的DIC和荧光图像，其中神经元接种在发射隔室。图6C和图6D表示神经元以相同密度接种在接收隔室中的区域。因为在DIC图像上可以看到，当神经元接种在发射隔室时，生长到相对隔室的轴突的数量更大。这可以归因于在连接处各个轴突所采取的路径，这在荧光成像中明显可见。

示例6：

对本发明的设计和优化有用的理论模型。

通过在适当的方向上迭代地添加新的片段，模型设计为模拟在环境图上生长的轴突。在[-pi，pi]上定义的概率密度函数的每个时间步骤绘制与先前生长方向的偏差，其考虑了轴突的持续长度以及轴突对边缘和其它轴突的亲和性。所有这些参数均来自实验观察。

该密度函数首先由反映自由生长的轴突的特征持续长度的内在生长参数确定。然后受到环境调制器的影响，其考虑了像素图中不同区域的可访问性(1代表可访问像素，0代表不可访问像素)。此外，边缘和轴突在环境图上显示为特殊像素值。环境调制器功能是通过在各个方向上探测轴突尖角周围的基底而获得的。对于每个方向，环境调制器的值是在环境图上沿着这个方向的最大像素值，并且在距离尖角的距离d内(或之前，如果遇到不可访问的区域)。通过将内在概率分布与环境调制器相乘并对结果进行归一化(图7A、图7B和图7C)，最终获得有效概率分布。

该模型表示一种对于设计新实施方案有用的工具，或者通过已教导的过程来优化现有实施方案。例如，可以构造和使用实施方案的第一具体设计或一些这样的设计来优化模型的参数，例如相对于给定类型的活体。然后，具有这些参数的模型可以应用于实施方案的其它设计，并有助于预测其性能，而无需针对所有可能的设计进行实验。然而，这种模型不能在所有情况下都起作用，例如它可能不适用于某些不是轴突的其它活体，它并不是要表示对发明的操作模式的特定解释，或者不是本发明发挥其优势的唯一方式。因此，不应以任何方式将该模型看作用于定义或限制本发明的领域的手段，其可以在没有该模型的情况下使用，并且实际上可能在一些实施方案中产生不适合该模型的结果。

示例7：

在垂直于装置的主平面的平面中包括尖角不对称的实施方案的示例。

图8a至图8d在三维视图(顶部)中以及沿着垂直于装置的主平面(底部)的竖直切割线来表示不同装置。所有装置包括第一发射隔室1、第二接收隔室2和引导轨道3，引导轨道在此为微米通道的形式(该装置有利地可以包括在两个隔室之间平行的多个所述微米通道，单个通道在此作为代表只是为了方便)。为了有利于神经元的粘附，微米通道的底部和隔室的底部呈现经聚赖氨酸或纤连蛋白处理的表面。

根据图8a的装置，轴突将容易地从发射隔室移动到接收隔室，但由于存在尖角，轴突将被阻碍从接收隔室进入微米通道。

如上所述，没有平面尖角的引导轨道也可以组合或链接，以构成更有效的网络。例如，图8d表示本发明的另一个装置，其中类似于图8b的设计重复沿着发射隔室1到接收隔室6之间的路径穿过中间隔室6。

Claims (17)

1.一种用于控制、选择、处理或培养活体的微米流体装置，包括第一隔室(1)、第二隔室(2)和引导轨道的网络，其中：

-所述引导轨道的网络包括至少一个第一引导轨道(4)和至少一个第二引导轨道(4)，所述至少一个第一引导轨道(4)连接所述第一隔室(1)和所述第二隔室(2)，所述至少一个第二引导轨道(4)以至少两个互相连接点(5)连接所述至少一个第一引导轨道(4)；并且

-所述至少一个第二引导轨道(4)包括弯曲部分；所述弯曲部分呈现为内凹部，其面向第二隔室(2)或网络的连接至第二隔室(2)的部分。

2.根据权利要求1所述的微米流体装置，其中，所述引导轨道的网络包括至少两个第一引导轨道(4)，所述至少两个第一引导轨道(4)连接所述第一隔室(1)和所述第二隔室(2)，并且其中每个第一引导轨道(4)包括与至少一个第二引导轨道(4)的至少一个互相连接点(5)。

3.根据权利要求1所述的微米流体装置，其中，每个第一引导轨道(4)包括与至少一个第二引导轨道(4)的至少两个互相连接点(5)。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的微米流体装置，其中，所述引导轨道的网络包括至少两个第二引导轨道(4)，其中每个第二引导轨道(4)将至少一个第一引导轨道(4)与至少两个互相连接点(5)连接。

5.根据权利要求4所述的微米流体装置，其中，每个第一引导轨道(4)连接到至少两个第二引导轨道(4)。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的微米流体装置，其中，每个互相连接点(5)是三通互相连接点。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的微米流体装置，其中，在至少一个第一引导轨道(4)与至少一个第二引导轨道(4)之间面向第二隔室(2)或面向网络的连接至所述第二隔室(2)的部分的内角范围为从90°到180°、从100°到180°、从120°到180°、从150°到180°、从160°到180°或从170°到180°。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的微米流体装置，其中，在至少一个第一引导轨道(4)与至少一个第二引导轨道(4)之间面向第一隔室(1)或面向网络的连接至所述第一隔室(1)的部分的内角小于150°、140°、130°、120°、110°、100°或90°。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的微米流体装置，其中，沿着一个第一引导轨道(4)的两个相邻互相连接点(5)之间的空间范围为20μm至5mm。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的微米流体装置，其中，本发明的装置上的区域或体积不是任何引导轨道或任何隔室的一部分，而是排斥区域(3)或排斥体积(3)；所述排斥区域(3)或排斥体积(3)呈现出的支持活体生长或粘附的能力低于引导轨道或隔室的支持细胞生长或粘附的能力。

11.一种微米流体装置，包括至少一个第一隔室(1)和通过至少一个第一引导轨道(4)连接的至少一个第二隔室(2)，其中所述至少一个第一隔室(1)和所述至少一个第二隔室(2)均包括底部，并且其中：

-至少一个第一引导轨道(4)在至少一个第一隔室(1)的底部的水平处连接至所述至少一个第一隔室(1)；以及

-至少一个第一引导轨道(4)在比至少一个第二隔室(2)底部的水平高的水平处连接至所述至少一个第二隔室(2)，从而设计所述至少一个第二隔室(2)的底部与所述至少一个第一引导轨道(4)之间的高度差。

12.根据权利要求11所述的微米流体装置，进一步包括至少一个第三隔室(6)，所述至少一个第三隔室(6)通过至少一个第二引导轨道(4)连接至所述至少一个第二隔室(2)。

13.根据权利要求11至12中任一项所述的微米流体装置，其中，至少一个引导轨道(4)在其表面的至少一个上包括一个或多个微切口。

14.根据权利要求12或13所述的微米流体装置，其中，所述至少一个第三隔室(6)包括底部，并且其中：

-至少一个第二引导轨道(4)在至少一个第二隔室(2)的底部的水平上连接至所述至少一个第二隔室(2)；以及

-至少一个第二引导轨道(4)在比至少一个第三隔室(6)底部的水平高的水平上连接至所述至少一个第三隔室(6)，从而设计所述至少一个第三隔室(6)的底部与所述至少一个第二引导轨道(4)之间的高度差。

15.根据权利要求11至14中任一项所述的微米流体装置，其中，至少一个第二隔室(2)的底部不与至少一个第一隔室(1)的底部平行。

16.一种用于控制、选择、处理或培养活体的方法，包括以下步骤：

-提供根据权利要求1至15中任一项所述的微米流体装置；

-在至少一个第一隔室(1)中培养至少一个活体并且在至少一个第二隔室(2)中培养至少一个活体；

-将至少一个活体从所述至少一个第一隔室(1)引导至所述至少一个第二隔室(2)，而不将所述至少一个活体从所述至少一个第二隔室(2)引导至所述至少一个第一隔室(1)。

17.根据权利要求16所述的方法，其中活体为细胞、神经突、轴突、树突、侵入性伪足、丝状伪足、细胞膜、细胞突起、鞭毛、微触须、生长锥、神经胶质细胞、真菌、植物细胞、丝状真菌、整个生物体、蠕虫、酵母菌、粘菌、动物细胞、多细胞球体、类器官或胚胎。