CN103842084A

CN103842084A - 用于控制分子浓度以刺激目标的微流体系统

Info

Publication number: CN103842084A
Application number: CN201280030700.4A
Authority: CN
Inventors: M·达昂; M·莫雷尔; J-C·加拉; V·施图德; D·巴尔托洛
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Victor Segalen Bordeaux 2; Ecole Normale Superieure; Fonds ESPCI Georges Charpak
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Victor Segalen Bordeaux 2; Ecole Normale Superieure; Fonds ESPCI Georges Charpak
Priority date: 2011-04-22
Filing date: 2012-04-20
Publication date: 2014-06-04
Anticipated expiration: 2032-04-20
Also published as: FR2974360B1; WO2012143908A1; AU2012245910A8; AU2012245910B2; CA2833857A1; US9164083B2; EP2699353A1; JP6140684B2; MX2013012365A; US20140113366A1; RU2603473C2; RU2013151882A; KR20140063521A; FR2974360A1; CN103842084B; AU2012245910A1; JP2014518509A

Abstract

本发明涉及一种用于控制能够刺激目标的分子的浓度分布的微流体系统，所述目标例如由一组活细胞形成，其特征在于，所述系统包括：微流体装置（1），其包括：n≥1个微流体通道（4、40），所述通道或每个通道设有用于至少一种流体的至少一个入口孔以及用于所述流体的至少一个出口孔；形成在微流体通道中或者分配在不同微流体通道中的n≥2个开口（47、470），所述开口布置在同一平面中形成在该平面中的至少一维网络，微流体通道的数目n和开口的数目n具有关系式（I），其中1≤i≤n，并且n为用于通道c的开口数目；覆盖开口网络的至少一个微孔薄膜（5），目标位于薄膜的与微流体通道相反的一侧上；用于为所述微流体通道或者每个微流体通道供应流体的一个或多个流体供应机构，所述流体的至少其中一种包括用于刺激目标的分子。

Description

用于控制分子浓度以刺激目标的微流体系统

技术领域

本发明涉及微流体领域。

背景技术

微流体应用系统具有微米尺寸，其尺寸通常在几十微米到几百微米之间。

所述系统可用于许多领域，例如，细胞诊断试验、医学产品研制、基本的生物科学或者美容术。

在所述领域中，存在对用于定量测定活细胞对某些分子的反应（响应：response）且特别是对空间上和时间上受控的浓度分布的反应的微流体系统的增加的需求。

例如，可能存在测量癌细胞对用于化学疗法的分子的反应的问题。该反应的精确测定要求对产生该反应的分子施加控制。该控制可涉及与癌细胞相互作用的分子的数量、癌细胞暴露于其中的分子的浓度分布、所述分子的数量和/或用在癌细胞上的所述分子的浓度分布随时间的变化等。

在美容术领域，可以使用微流体系统来测试某些分子对活细胞和/或细胞组织的毒性。对给予细胞的可以是有毒的分子数量的控制和给予所述分子的确定方式在确定毒性阈值时是必需的。

在文件US7374906中提出了一种广泛用于刺激活细胞的微流体系统的实例。该微流体系统特别是允许活细胞经受分子的浓度梯度，该浓度梯度的分布是直线型的并且在时间上是稳定的。

该类微流体系统的主要缺点是使活细胞经受产生剪切力的流体，使其紊乱。当旨在研究神经细胞的生长锥的趋化性反应时，该剪切效应是特别麻烦的。实际上，流体产生的剪切应力更改了最佳情况中的目标细胞的反应或者引起了细胞的死亡或者分离。

利用该文件中所公开的系统按该方式来研究活细胞的生理特性是受到了干扰的。

因此，已经提出了在不受流体干扰的情况下使活细胞经受分子浓度分布和/或几种不同分子浓度分布的组合的解决方案。

例如，在R.L.Smith等人于2010年发表的文章“Microfluidic device for thecombinatorial application and maintenance of dynamically”的第9卷第613-622页中提出了这样一种微流体系统。

该微流体系统包括微流体装置100和用于向所述装置供应流体的机构（未显示）。

图1中按分解透视图的形式示出了该文件中公开的微流体装置100。

其包括聚二甲基硅氧烷（PDMS）结构，在所述PDMS结构中形成有彼此独立的多个流体供应通道130a、130b、130c、130d。

这些通道130a、130b、130c、130d的每个的顶壁120包括穿过该壁的一个或多个开口110。在壁120的与微流体通道相对的一侧上，具有填充有凝胶状培养介质150（例如琼脂）的用于活细胞的培养腔室140。壁120因此形成薄膜，由此可以分隔为两个环境，即，流体在其中流通的微流体通道130a、130b、130c、130d以及培养腔室140。

玻璃板160用于从上部密封培养腔室140。

没有示出流体供应机构。然而应当注意一种或多种流体可以被引入通道130a、130b、130c、130d的每个中，这些流体包括用于经由扩散孔110穿过PDMS壁120刺激活细胞的分子。

为了从空间上控制活细胞的培养，可以使用微流体装置100选择包括用于刺激活细胞的分子的流体所被送入的通道。由此可以精确地选择孔110，来自所述孔的分子将扩散到培养腔室140中。

此外，为了从时间上控制活细胞的培养，可以从时间上错开将流体供应给不同的通道130a、130b、130c、130d。

装置100还在可使用的刺激分子的选择上提供较高的灵活度，由此流体供应通道130a、130b、130c、130d中的每个提供特定的供应机构。

然而，该微流体系统也具有许多不足。

需要使用包括凝胶形式的培养介质150的培养腔室140以避免流体从流体供应通道进入培养腔室。

在这种特殊的情况下，实际上制造和测试的装置具有20μm×20μm的方形孔。这些尺寸相对较大并且有利于流体进入培养腔室140。

作者要求方形孔110具有较小的尺寸，例如可以设想4μm×4μm。即，已知所利用的制造技术不允许形成低于最大长径比（一般为1：20）的孔，该长径比由孔的侧向尺寸与孔的深度的比例限定。对于给定的孔110的侧向尺寸，该最大长径比限制孔的深度，因此限制孔所具有的水力阻力。因此增加了流体从通道130a、130b、130c、130d通入培养腔室140的风险。

不管小孔的尺寸如何，应当可以理解，在没有凝胶形式的培养介质150的情况下，流体将进入培养腔室140。

还应当注意，凝胶的存在给微流体装置100的操作带来不足。

实际上，凝胶会减慢刺激分子向目标活细胞的扩散。由此，会减慢这些刺激分子在培养腔室140中的浓度分布的稳定。

此外，应当注意，刺激分子在凝胶中向所有方向扩散。

结果，对于相对彼此独立的每个孔110，刺激分子在位于凝胶中的目标处，在比位于壁120中的孔110的通过的表面区域大的表面区域上分散。通过特定分子对目标的刺激因此比理论上用先前对孔的尺寸的选择的精确度要低。因此在目标上，与由孔的尺寸提供的理论空间分辨率相比有空间分辨率的损失。

此外，应当注意，扩散孔110具有在壁120的表面上的某一表面密度，这很难增加。在特殊情况下，在PDMS壁120中产生的两个相邻孔之间的距离在300μm至400μm之间。

目前，使用该文章中所用制造方法获得的孔110的密度很可能受到限制。实践中，该文章中所用的制造微流体装置的DRIE方法在可以获得的微流体通道的密度方面具有限制。因为，通过设计，这些微流体通道中的每个端止于单个孔110，其结果是孔110的表面密度因此受到限制。

不足在于，由孔的尺寸理论上提供的目标刺激精确度不是目标上实际获得的。

发明内容

本发明的一个目的在于缓解以上不足的至少其中一个。

为了实现该目标，本发明提出一种用于控制能够刺激目标的分子的浓度分布的微流体系统，所述目标例如由一组活细胞形成，其特征在于，所述系统包括：

-微流体装置，其包括：

●n_C≥1个微流体通道，所述通道或每个通道设有用于至少一种流体的至少一个入口孔以及用于所述流体的至少一个出口孔；

●形成在微流体通道中或者分配在不同微流体通道中的n_Q≥2个开口，所述开口布置在同一平面中形成在该平面中的网络，微流体通道的数目n_C和开口的数目n_O具有如下关系：

其中1≤i≤n_C，并且

为用于通道C_i的开口数目（∑对应“求和”运算符）；

●覆盖开口网络的至少一个微孔薄膜，目标用于被布置在膜的与微流体通道相反的一侧上；

-用于为所述微流体通道或者每个微流体通道供应流体的一个或多个流体供应机构，所述流体的至少其中一种包括用于刺激目标的分子。

该系统将能够提供单独或者组合的其他技术特征，如下：

-微孔薄膜设置有水力直径在0.05μm到12μm之间，优选在0.05μm到3μm之间的小孔；

-微孔薄膜的小孔的表面密度在10³至10¹⁰小孔/cm²之间；

-微孔薄膜由选自以下的材料制成：玻璃、聚碳酸酯、聚酯、聚对苯二甲酸乙二酯、石英、硅、二氧化硅或碳化硅；

-为微流体通道设置盖子，所述盖子由选自以下的材料制成：玻璃或硅、非弹性体光致交联型聚合物、金属、导体或半导体合金、陶瓷、石英、蓝宝石、弹性体；

-用于流体的所述至少一个入口孔和所述至少一个出口孔形成在所述盖子中；

-微流体通道每个包括至少一个光致固化和/热固化树脂的壁；

-为所述目标设置的封闭培养腔室或者微流体通道布置在微孔薄膜的与微流体通道相反的一侧上，目标由此位于培养腔室或所述一个其它微流体通道中；

-腔室或者微流体通道包括由光学透明材料制成的底座，所述底座布置在腔室或者微流体通道的相对于微孔薄膜相反的一侧上；

-腔室或者微流体通道包括由光致固化和/或热固化树脂制成的侧壁；

-设置多个机构用于供应微流体通道，所述供应机构的每个供应微流体通道的其中之一；

-设置光学观察机构；

-所述光学观察机构实施光激活定位显微镜技术或者受激发射损耗显微镜技术；

-开口在所述开口所属的平面中形成二维网络；

-两个相邻开口的各自中心分隔开的距离在10μm到250μm之间。

附图说明

通过以下参考附图的详细说明，本发明的其它特征、目标和优点将更加情况，所附附图：

-图2是根据本发明的微流体系统的局部剖视透视图；

-图3（a）至3（d）根据情况示出用于制造图2所示的微流体系统的方法的步骤或者该方法的某些步骤结束时获得的中间结构；

-图4（a）至4（c）示出在制造装置的底座和侧壁形成的组件期间获得中间结构，所述组件用于形成图2的微流体装置的一部分；

-图5（a）示出在图2示出的根据本发明的微流体装置的微流体通道中流动的流体，这些流体的其中之一包括用于目标细胞的刺激分子，图5（b）示出图2的装置的培养腔室中刺激分子的浓度图表；

-图6用剖视图示出根据本发明的另一微流体装置；

-图7（a）、7（b）、7’（a）、7’（b）以及7（c）至7（f）示出制造图6的微流体装置的方法步骤或者该微流体装置的制造中获得的中间结构；

-图8是示出图6的微流体结构的仰视局部视图的简图；

-图9用透视图示出图6的微流体装置的微流体通道，布置成使得每个微流体通道包括多个开口；

-图10用俯视图示出根据图6的一个变型的微流体装置的微流体通道，这些通道布置成使得每个微流体通道包括在该装置的微孔薄膜上所开的开口；

-图11示出图10中所示的装置的制造步骤；

-图12（a）至12（d）示出，根据该情况下用于制造根据本发明的微流体装置的一个变型实施例的方法步骤或者在该方法的某些步骤结束时获得的中间结构。

具体实施方式

首先，图2示出根据本发明的微流体装置1，包括两个微流体通道，这些通道中的每个设有开在薄膜上的开口，图3（a）至3（d）以及4（a）至4（c）示出该装置的制造方法。

微流体装置1包括：有利的是刚性的盖子2，所述盖子设有用于微流体通道中的流体流通的孔21、22；侧壁3和中央壁30，有利地两者皆由光致固化和/或热固化树脂制成。特别是，装置1的侧壁3由单层光致固化和/或热固化树脂制成。

微流体装置1还包括在其底部中的两个开口47、470，所述两个开口被相对于侧壁3和中央壁30的底座横向延伸的微孔薄膜5覆盖。应当理解，术语开口47、470的意思是在装置的壁之间延伸并且被薄膜5覆盖的通道的端部表面。

开口47、470被布置在同一平面中并且可以联接至该平面中的开口网络，在这种情况下是一维的。在本发明的文本中，术语开口“网络”简单地描述了，具有多个开口，而这些开口和/或这些开口的特定布置之间在它们所属的平面中不是必须联接。

例如，图1中，开口47、470被必须在同一平面中成线性布置的两个不同的微流体通道供应。另一方面，在下面将要描述的其它实施例中，一些开口可以被同一通道供应，此外，开口在同一平面中二维布置。

壁3、30和盖子2可以限定两个微流体通道4、40，所述两个微流体通道在它们各自的开口47、470处被微孔薄膜5封闭。这些通道4、40中的每个的流体入口分别对应孔21或22。这些微流体通道的流体出口没有示出。

微孔薄膜5分隔开两个环境，即，微流体通道和该通道的外部环境，该外部环境例如由培养腔室8形成，要被刺激的目标布置在所述培养腔室中。在这个方面，应当注意，Smith等人的文章中所用的凝胶不是薄膜，因为其不分隔微流体通道和培养腔室，而是相反地形成填充培养腔室的培养介质。

此外，微孔薄膜5阻止趋于流入微流体通道4、40中的流体通到薄膜的另一侧，然而，所述薄膜允许分子可以刺激目标，所述分子可以被流体输送到微流体通道4、40的至少其中一个中以便扩散，下面将进行详细说明。根据本发明的装置1不要求在培养腔室8中具有凝胶。

微流体装置1还包括底座6以及侧壁7a、7b，所述底座有利地是刚性和透明的，所述侧壁有利地由光致固化和/或热固化树脂制成。这些侧壁7a、7b，底座6以及微孔薄膜可以形成腔室8。为了形成腔室8，设置四个侧壁，这些壁可以实际上看作单一轮廓，因为制造方法有利地将这些壁制成单件。

腔室8的底部由底座6的上表面61形成，用于接收例如由活细胞形成的目标。在这种情况下，活细胞用于被布置成在腔室8的底座6上远离微孔薄膜5。因此，他们可以在标准条件被culvated成与微流体装置1隔开。

微流体通道4、40使得包括能够刺激目标的分子的流体可以流通。这通过穿过微孔薄膜5扩散至腔室8然后扩散通过腔室8（培养腔室）实现，在所述腔室的底部，例如有需要刺激的活细胞（CV），在下面的说明书中将更加详细地解释。

有利地，底座6由光透明材料、例如玻璃制成。这是重要的，因为进而可以在装置外侧布置光学观察机构18，以观察例如布置在腔室8底部的活细胞对刺激的反应。

盖子2可由选自以下的材料制成：玻璃或硅、非弹性体光致交联型聚合物、金属、导体或半导体合金、陶瓷、石英、蓝宝石、弹性体。

选择微孔薄膜5以完全避免流体在微流体通道4、40和腔室8之间通过。实际上，微孔薄膜5不能完全不漏流体。而且，如果流体通过微孔薄膜5的通过速度低于一个限制值，就可以认为位于腔室8中的细胞不经受任何流体。

可以认为该限制速度例如约为1μm/s。在这种情况下，施加至细胞的剪切力可以忽略。

此外，每个微流体通道4、40中的速度可以在100μm/s至10000μm/s之间，甚至高于10000μm/s。

而且，为了获得1μm/s的限制值，取决于通道4、40中的流体速度，微孔薄膜5的水力阻力R_h,membrane应当是微流体通道4、40的水力阻力R_h,channel的100至10000倍。

例如，如果微流体通道4、40中的流体流动速度是10000μm/s，则可以得到以下不等式：

10000*R_h,channel<R_h,membrane （R1）

以确保流体通过薄膜5的速度恰好低于假定的限制值1μm/s。

此外，采用高度为h，宽度为w以及长度为L的矩形微流体通道4、40，以及厚度为e并且具有半径为r_pore的相同圆柱形小孔的微孔薄膜5，小孔表面密度为ρ，则关系式（R1）可以写成下面的形式：

10000*μ.L/(w.h³)<μ.e/(r_pore ⁴._ρ.Lw) (R2)

或者：θ=r_pore ⁴._ρ/e<10^-4*h³/L² (R3)

对于高度h=100μm，宽度w=1000μm，长度L=10000μm的微流体管道4、40，θ必须小于10^-10m以满足关系式（R3）。此外，假设圆柱形小孔的半径为1μm，薄膜厚度为10μm，小孔表面密度ρ必须小于10⁵小孔/cm²。

当然，一方面，可以将关系式（R3）归纳为通过微孔薄膜5的流体的限制速度的假定值的函数，另一方面，归纳为该流体在微流体通道4、40中的流速的函数。

微孔薄膜5可具有水力直径在0.05μm到12μm之间的小孔。特别是，如果小孔是圆柱形的，则小孔的水力直径相当于其直径。

然而，有利地，该水力直径将在0.05μm到3μm之间。实践中，应当注意到，对于可能遇到的大部分使用条件，使用具有水力直径小于3μm的小孔的薄膜完全避免了流体流入腔室8中。

目前，薄膜制造厂提供其小孔的水力直径大体上大于0.2μm的薄膜。在本发明的上下文中，因此小孔可有利地具有在0.2μm到3μm之间的水力直径。然而，理论上，小孔的水力直径没有下限，这说明了为什么考虑应用水力直径达到0.05μm的小孔。

如果使用水力直径大于3μm的小孔，使用微流体装置更难以（例如选择微流体通道4、40的流量）用来确保流体不会通过微孔薄膜5。然而，应当注意水力直径的增长伴随着与被薄膜5覆盖的开口47、470中的每个相关联的薄膜的小孔数目减少。现在，这种每个开口的薄膜的小孔数目的减少有利于增加通过微流体装置的每个开口的水力阻力。

为此，可以设想通过限制微流体通道中设想的流体流速范围使用水力直径大于3μm的小孔。

在Smith等人提出的装置中，开口强制规定为对应于一个，并且仅仅是一个扩散孔，因为没有本发明中提出的薄膜。因此，水力直径取决于Smith等人的装置中孔本身的直径。

因此，实施微孔薄膜5具有实实在在的优势，因为其可以省去凝胶及其带来的不足。

至于微孔薄膜5的小孔密度，可以在10³到10¹⁰小孔/cm²之间。小孔高度可以在50nm到100μm之间。

此外，微孔薄膜5可以由多种材料制成，例如玻璃、石英、硅、二氧化硅或碳化硅或者甚至是与可能在微流体装置的其余部分中应用的聚合物相同性质的聚合物。因此可以利用聚碳酸酯、聚酯或者聚对苯二甲酸乙二酯。

根据第一示例，可是设置聚碳酸酯的微孔薄膜5，小孔直径在0.2μm至1μm之间，例如Whatman公司的Cyclopore类型（Whatman Cyclopore^TM）。根据第二示例，可以设置聚脂微孔薄膜5，其中小孔直径在0.4μm到3μm之间，例如为Corning公司的Transwell类型

根据第三示例，可以设置聚对苯二甲酸乙二醇酯微孔薄膜5，其中小孔直径在0.4μm到8μm之间，例如为Becton Dickinson公司的“Track–Etched”类型。

这些微孔薄膜具有适合以下参见图3（a）到3（d）所描述的微流体装置1的制造方法的优点。其还具有生物相容和具体地说可渗透多种分子的可功能化（functionalizable）的优点。应当理解，“可功能化”是指可以在化学性质上改进微孔薄膜5以满足特殊功能（某些生物种的保持力、化学反应等）。

通常，装置可具有以下尺寸。微流体通道的高度h可以在1μm到1000μm之间，有利地在10μm到200μm之间。其宽度（未显示）可以在10μm到2mm之间。腔室8的高度h’可以在10μm到1000μm之间，有利地在50μm到200μm之间。此外，进口E和出口S之间的距离为几厘米。

如前所述，微流体装置可以联接有光学观察机构18。该光学观察机构18可以得知施加至目标细胞的刺激分子的浓度分布。还可以形成细胞对刺激分子的生物学反应的功能图像。因此，能够更加容易地从实验上展现目标细胞的观测行为和施加到所述目标细胞的浓度分布之间的关联。

可以用高光学分辨率执行该观测，这是因为由光学透明材料制成的底座可以非常薄。可以通过使用例如由150μm厚的玻璃载片形成的底座用例如光激活定位显微镜（PALM）或者受激发射损耗（STED）显微镜技术执行例如高分辨率、甚至是超高分辨率的荧光显微镜检查。

根据本发明的微流体装置1的制造方法的一个示例为至少包括以下步骤的方法：

(a)使用由弹性体材料制成的印模1’来压印放置在设有微孔薄膜5的衬底2’上的可光致固化和/或热固化的液体；

(b)光照和/或加热液体以一方面形成在其底座处被微孔薄膜5封闭的第一侧壁3，另一方面形成与薄膜5相接触的中央壁30；

(c)在与衬底2’相对的一侧，将设有孔（未示出）的盖子2粘附到第一侧壁3和中央壁30上以形成微流体通道4、40，流体可以在所述微流体通道的每个中流通；

(d)在已经移除了衬底2’之后，将至少包括由光致固化和/或热固化的树脂制成的至少两个第二侧壁7a、7b和底座6的组件粘附到第一侧壁3和中央壁30的可通过移除衬底2’来接近的那部分上，以形成腔室8。

该方法是基于文件WO2008/009803中所公开的方法。

图3（a）中示出了步骤（a）期间执行的操作。

用于步骤（a）的印模1’可以由例如PDMS的弹性体材料制成。其包括用作与所希望生产的微流体装置1互补的模具的轮廓。因此，印模1’具有设置有竖直凹槽1’c的凸起1’a以形成希望获得的微流体装置1的中央壁30。其还具有包围凸起1’a的中空区域1’b，其是用来形成微流体装置1的所述第一侧壁3的区域。衬底2’也可以由PDMS制成并且具有平坦的轮廓。

微孔薄膜5首先设置在衬底2’上，然后将印模1’压到衬底2’上。因此，印模1’通过凸起1’a将薄膜5挤压到衬底2’上。

然后，将例如呈液态形式的可光致交联和/或光致聚合的树脂RL按合适数量填充到位于印模1’与衬底2’之间的空间中，特别是注入到印模1’的中空区域1’b和凸起1’a中的凹槽中。该填充不会改变微孔薄膜5的位置，因为微孔薄膜5被固定在印模1’与衬底2’之间。

可光致交联和/或光致聚合的树脂是基于单体和/或预聚物的溶液或者悬浮液。在本发明的方法中通常使用可光致交联和/或光致聚合的树脂用作粘合剂、胶水或者表面涂料。

有利地，选择通常用于光学领域的粘合剂、胶水或者表面涂料。一旦树脂已经被照射和光致交联和/或光致聚合，则其变成固体。优选是，如此形成的固体是透明的，并且没有气泡或者任何其他不规则性。

这样的树脂通常基于环氧、环氧硅烷、丙烯酸盐、异丁烯酸、丙烯酸、甲基丙烯酸类的单体／共聚单体／预聚物，但是还可以列举硫醇烯（thiolene）、聚氨酯和氨基甲酸乙酯-丙烯酸酯树脂。所述树脂可以例如由聚丙烯酰胺凝胶的可光致交联的含水凝胶来代替，并且选择其在室温下为液体的。所述树脂还可以由聚二甲基硅氧烷（PDMS）来代替。

在可用于本发明的可光致交联树脂之中，可以列举Norland Optics公司按商标“Norland Optical Adhesives”销售的产品，例如，NOA81和NOA60，由Dymax公司以“Dymax Adhesive和光固化系统”类别销售的产品，由Bohle公司以“UV粘合剂”类别销售的产品，由Sartomer公司在商业标准SR492和SR499下销售的产品。

通过利用例如以紫外线（UV）、可见光照射或者红外线（IR）辐射的任何合适方法的光激活来进行所述树脂的聚合和/或交联。

优选是，选择一种树脂，其一旦被聚合和/或交联，则为刚性的和非柔性的，这是因为当流体在压力下在微流体装置1中流通时弹性树脂趋向于变形。然而，对于某些应用，例如活细胞的弹性研究，并不排除使用可光致交联的弹性体树脂。

在以液态树脂RL填充位于印模1’与衬底2’之间的空间中之后，在印模1’上施加压力以将任何可能过剩的树脂排出。在图2中，弹性体制成的印模1’的凸出部且特别是凸起1’a与衬底2’接触。液态树脂呈现出印模1’中中空区域的形状。

在图3（b）中示出了步骤（b）结束时获得的结构。

在步骤（b）期间，通过印模1’，沿垂直于装置的底座的轴线进行树脂的照射。必须正确地控制剂量照射，以便如果需要，在树脂制成的第一侧壁3和中央壁30的表面上留下能起作用的聚合和/或交联点。然后，从该装置去除印模1’。图3（b）显示了由光致聚合和/或光致交联的树脂制成的第一侧壁3，其具有与印模1’的中空区域互补的轮廓。在该图中，还示出可以分隔微流体通道4、40的中央壁30。

利用弹性体制成的印模1’压印到液态的树脂中允许获得具有很好分辨率的非常小尺寸的结构。

然后，在步骤（c）期间，将包括用于使流体在微流体通道4、40中流通的孔的盖子2固定在所述第一侧壁3预先接触印模1’的一侧处。然后，可以移除衬底2’。在图3（c）中示出了步骤（c）结束时获得的结构，盖子上没有孔，所述孔位于其它平面中。

在没有将微孔薄膜从光致聚合和/或光致交联的树脂上松开的情况下并且在没有撕下或者局部地撕下的情况下进行衬底2’的移除。

盖子2可由玻璃、硅、固态聚合物膜、金属、导体或半导体的合金、陶瓷、石英、蓝宝石、弹性体制成。

优选选择玻璃载片、聚合物膜或者硅载片。依据微流体装置1的目的应用来选择用来形成盖子2的材料。

因此，由例如玻璃的光学透明材料制成的盖子2更适于方便观测和光检测（透明性）。玻璃的另一优点是其很好的导热性，其允许均匀地加热装置。

应当注意到，微孔薄膜5布置在微流体通道4的底部处使得其用途和活细胞培养的标准规约相适合。实践中，然后可设想，底座6是在其上培养活细胞的玻璃载片，然后将该载片固定到步骤（c）结束时所获得的结构上以形成腔室8（培养腔室），下面将进行说明。

应当注意，以上描述的制造方法可以制造尺寸达到5μm的开口，两个相邻开口之间的间距（两个相邻开口各自中心之间距离）可以小至10μm，因此尤其在10μm至小于300μm的值之间，如同Smith等人的文章中提到的。特别是，间距可以在10μm至250μm之间。

可以根据以下方法步骤来生产包括底座6和两个第二侧壁7a、7b的组件：

(e₁)使用由弹性体材料制成的敞口模具3’（open mold），其具有用来接收可光致固化和/或热固化的液态树脂RL的衬底表面3’a和凹腔3’b；

(e₂)将底座6设置到模具3’的衬底表面3’a上；

(e₃)将掩模4’设置到底座6上，然后光照或者加热以形成所述第二侧壁7a、7b。

在步骤（e₃）由光照液态树脂构成的情况下，图4（a）示出了在步骤（e₁）到（e₃）结束时所获得的结构。

类似于印模1’和衬底2’，模具3’可以由例如PDMS的弹性体制成。

用于这些步骤的可光致固化和/或热固化的液态树脂可以选自于已经描述了其特征的用于步骤（a）的液态树脂。优选是，用于步骤（a）和（e₁）到（e₃）的液态树脂是相同的。作为一变型，可使用例如如上所述的可光致交联的含水凝胶或者聚二甲基硅氧烷（PDMS）。

底座6可以选自于用于盖子的材料。有利地，可以使用光学透明材料以便于利用专用设备来进行光学观察。该光学透明材料可特别是玻璃，因此通常应用形成为玻璃盖子的底座6来培养活细胞（CV）。此外，使用玻璃允许获得该衬底可用的化学和生物表面处理的优点。

掩模4’可具有孔4’a、4’b，使得允许光照液态树脂的精确区域以形成微流体装置的所述第二侧壁7a、7b。

一旦完成步骤（e₃），所有剩下的就是在步骤（e₄）中移除掩模4’和模具3’以仅留下由所述第二侧壁7a、7b和底座6所形成的组件。图4（b）中示出了该组件。

通常，然后进行步骤（e₅），包括例如利用按体积计算90/10比例的乙醇／丙酮混合物来冲洗所述组件。该冲洗允许移除没有被光照或者没有被加热而可能保持在底座6上的所有树脂。

然后，在布置步骤（c）结束时所获得结构的该组件之前并且在开始步骤（d）之前，培养活细胞（CV）。

为此，需要使组件生物相适合。

为了该目的，可以例如利用UV强烈地光照组件，紧跟着在例如水的中性溶液中猛烈地冲洗几小时。

作为变型，可以用生物相适合的材料制造腔室，或者更一般地，装置的各种元件。

最后，然后可以在底座6的上表面61处进行活细胞的培养，如图4（c）中所示。在标准条件下进行该培养。特别是可以在呈传统的玻璃载片形式的底座6上进行所述培养。

一旦完成该培养，则可以进行步骤（d）。

在图3（d）中所示的步骤（d）期间执行该操作。

一旦已经执行步骤（d），则随时可使用微流体装置1。其特别是包括底座6的上表面61上的活细胞，所述上表面61与腔室8（培养腔室）中的微孔薄膜5相对。

为了操作该微流体装置1，使其与微流体系统中的至少一种流体供应机构结合到一起，该供应机构允许给微流体通道4、40的至少其中之一供应包含可刺激目标（例如活细胞）的分子的流体。

例如，可以设置两个独立的流体容器，一个为微流体通道4供应包括刺激目标的分子的流体F₁，另一个用于为第二微流体通道40供应中性流体F₂。

图5（a）中以平面图的形式示意性地显示了可与这些容器一起使用的微流体通道4、40的示例。

流体F₁通过入口E₄被引入微流体通道4中，并且通过出口S₄离开通道4。流体F₂本身通过入口E₄₀被引入微流体通道40，并且通过出口S₄₀离开该通道40。当然，两个微流体通道4、40被微流体装置1的中央壁30分隔开。

由中央壁30提供的分隔使得流体循环可以在微流体通道4、40的每个中流通，因为在这些流体之间不会发生混合。此外，借助该分隔，流体的流速在宽广的数值范围内延伸，例如在100μm/s至10000μm/s之间，甚至在剪切力效应下，两种流体没有任何流体动力混合的风险。此外，可以设想在不同通道之间流体的流通速度不同，而不会导致任何装置操作问题。

流体F₁、F₂的不同之处仅在于在两种流体的其中之一中具有较小浓度的用于目标细胞的刺激分子。

应当注意，入口E4、E40与图2的入口孔21、22类似。

图5（b）在竖直剖视图中示意性示出在微流体装置的不同部分中的流体流F₁、F₂。

因此，每种流体F₁、F₂用于在微流体装置1的微流体通道4、40的其中之一中，但是不在腔室8（培养腔室）中流动，均与微孔薄膜5接触。通道4、40中的分子浓度分布通过阶梯形式的曲线C1示出。

用于刺激活细胞的分子（包含在流体F₁）在微流体通道4和安装在腔室8的底座6上的所述细胞之间的输送通过在腔室8中穿过微孔薄膜5的扩散进行。

更具体地，这些分子的输送首先通过扩散穿过微孔薄膜5，然后扩散穿过腔室8最后到达腔室8的底座6的上表面61进行，活细胞位于表面61上。

腔室8中的浓度分布必须稳定。特别是，在腔室8的底座6处，稳定时间t_stab约为h’²/D，其中h’是腔室8的高度，并且D是用来刺激腔室8中的目标细胞的分子的扩散系数。应当注意到，为了避免过长的稳定时间，腔室的高度大体上限制到500μm。

在腔室8中稳定的浓度分布用曲线C2表示，具有“erf”型函数的典型曲线形式。因此使用这种对微流体通道的供应，可以在腔室8的底座处被刺激的活细胞上获得非常特殊的浓度分布。

以上结合图5（a）和5（b）所述的供应仅作为一个示意性示例。因此对微流体通道的流体供应可以不同，以在目标细胞上获得其他类型的浓度分布。

因此，根据其他示例，可以设置供应机构使得能够为两个微流体通道4、40中的每个供应流体F₁和F₂，以在腔室8中获得更加复杂的浓度分布。

可用包括孔（有利地为侧向孔）的微流体通道代替封闭的腔室8，尽管进行测试时没有流体在该微流体通道中流动。然而，可以使通道与侧向孔连接起来以回收活细胞的分泌物，对其进行化学分析。此外，在两次测试之间，可以设想对培养介质进行快速冲洗或者更换培养介质。

此外，应当注意，可以既不把目标细胞布置在腔室8的底座上也不在微流体通道的底座上，而是在微孔薄膜5本身上。在这种情况下，在目标细胞上获得浓度分布对应于微流体通道4、40上产生的浓度分布。在该情况下，实践中，目标细胞位于薄膜5的一侧上，该侧与和微流体通道4、40中流动的流体相接触的一侧相反。

此外，甚至可以制造没有腔室或者没有微流体通道的微流体装置1，目标细胞被直接放置在微孔薄膜5上。在这种情况下，应当理解，制造装置就不需要前面描述的步骤（e₁）至（e₃）了。

下面将参考图6和8介绍根据本发明的另一种微流体装置，并且参考图7（a）、7（b）、7’（a）、7’（b）以及7（c）至7（f）介绍制造该装置的方法。

图6中示出的微流体装置101包括多个微流体通道401、402，所述微流体通道每个包括开在微孔薄膜500上的若干开口401’、402’（一方面）和403’、404’（另一方面）。在这种情况下，设置两个微流体通道，其中一个401供应图8中白色表示的六个开口，另一个402供应图8中黑色表示的六个开口。这些开口401’、402’、403’、404’布置在同一平面P中，以形成在该平面中的二维开口网络。图6和图8中示出平面P，图8中示出在该平面P的水平处从下方看所述开口。

微孔薄膜500相对于不同微流体通道的侧壁横向延伸，以覆盖它们底部中的不同通道并且由此覆盖不同开口。

有利地，微孔薄膜500覆盖微流体通道401、402的所有所述开口401’、402’、403’、404’。这使得可以用单个薄膜覆盖不同的开口，这在开口网络密集时尤其可行。典型地，根据本发明的方法可以制造5μm的开口，彼此以10μm间距分隔开。这里间距被定义为两个相邻开口各自中心分隔开的距离。

微孔薄膜500设有小孔。薄膜500的特征可以与参考图2、3（a）至3（d）以及4（a）至4（c）描述的微流体装置1的薄膜5相同。

微流体装置101还包括用于微流体通道的盖子200。盖子200可以由选自以下的材料制成：玻璃或硅、非弹性体光致交联型聚合物、金属、导体或半导体合金、陶瓷、石英、蓝宝石、弹性体。

用于在微流体通道404、402中流通的流体的入口孔和出口孔可以形成在盖子200（未示出）中。

微孔薄膜500的小孔的水力直径阻止流体在微流体通道401、402中流动通过该薄膜500，仅有能够刺激目标的分子能够通过该薄膜。在这个方面，应当参考先前给出的关系式（R1）至（R3）以及选择限制速度，在低于所述限制速度时薄膜被看作不允许流体在微流体通道401、402流动通过。

这些刺激分子的浓度分布通过用于供应不同微流体通道401、402中的每个的流体的选择产生。如图8中所示（微孔薄膜500没有示出），开在微孔薄膜500上的开口401’、402’、403’、404’形成用于刺激分子的扩散区域，这可以被比作向目标供应化学信息的像素。

微流体装置101有利地设有用于所述目标的封闭培养腔室8。该室被布置在微孔薄膜500的与第一微流体通道401、402相对的一侧上。该腔室的特征与先前描述的微流体装置1的腔室8的特征相似，但是其尺寸需要进行适配。

由此，微孔薄膜500在腔室的侧壁之间横向延伸从所述腔室的顶部将其封闭。

目标被防止在腔室8的底座61上，所述底座61位于腔室8的相对于微孔薄膜500的另一侧上。

作为变型，优选可以设想将目标直接放置在腔室8中的微孔薄膜500上，甚至在没有任何腔室的情况下将目标直接放置在微孔薄膜上。

再次可以用包括孔，有利地侧向孔，的微流体通道替换培养腔室8，在没有流体在该通道中流动。

微流体装置101可以联接有光学观察机构，例如先前描述的在图2中所示的机构18，尤其是如果腔室8的底座或者微流体通道的底座是光学透明的话。

制造微流体装置101的方法基于与先前描述的制造图2中所示的微流体装置的步骤（a）至（d）相似，需要适配。

由此实施步骤（a）和（b）以生产图7（b）中所示的结构200。在步骤（a）中，由弹性体材料制成的印模10’因此用于压印放置在设有微孔薄膜500衬底20’上的可光致固化和/或热固化的液体RL（图7（a））。然后，在步骤（b）中，光照和/或加热液体以形成具有微孔薄膜500的若干壁。

类似地，实施步骤（a）和（b）以生产图7’（b）中所示的结构200’。更具体地，在步骤（a）中，由弹性体材料制成的印模10”因此用于压印放置在衬底20”上的可光致固化和/或热固化的液体RL，所述衬底上没有任何微孔薄膜（图7’（a））。然后，在步骤（b）中，光照和/或加热液体以形成若干壁。

然后，彼此独立制成的结构200’、200”通过新的光照或新的加热互相接合。这使得可以在结构200’和200”的液体树脂之间形成永久结合（图7（c））。

一旦结构被组装好，衬底20’、20”的其中之一20”被移除以显示出由结构200、200’的组件形成的新结构200”。然后，执行先前描述过的冲洗步骤（c）。换句话说，将设有孔（未示出）的盖子200粘附到结构200”的在微孔薄膜500的相反侧的不同壁3’、30’上，以形成微流体通道401、402。

然后将与微孔薄膜500相接触的衬底20’移除（图7（e））。在图7（e）中示出微流体通道401、402。应当注意，一方面微流体通道401，另一方面微流体通道402具有不同的深度，使得可以与平面中通道重叠，如图9中所示。

然后，根据先前描述的步骤（d），至少包括由底座6和光致固化和/或热固化树脂制成的所述至少两个第二侧壁7a、7b的组件被粘附到薄膜500上，以形成腔室8。该组件本身用重复先前参考图4（a）至4（c）描述过的步骤（e₁）至（e₃）的方法制造。

应当注意，由此获得的微流体装置101的微流体通道401、402的壁以及该装置的腔室8的壁可以用先前描述的树脂制成，或者，作为变型，用选择成室温下是液体的可光致交联的含水凝胶，例如聚丙烯酰胺凝胶，制成。树脂也可以被聚二甲基硅氧烷（PDMS）代替。

为了操作图6的微流体装置101，在微流体系统中，所述微流体装置与为微流体通道401、402的至少其中之一供应流体的至少一个机构相关联，所述流体包括能够刺激目标（例如活细胞）的分子。

例如，可以为每个微流体通道401、402设置特定供应机构（未示出），例如流体容器。容器和相关联的微流体通道之间的连接可以通过毛细管形成。

图9中用局部透视图示意性示出微流体通道401、402，仅示出根据图8的A-A剖视图供应开口401’、402’、403’、404’的通道401、402，该剖面也对应于参考图7（a）至7（f），7’（a）和7’（b）描述制造方法的视角。

图9中示出的布置使得可以进行连接系统数目减少的平行试验，其中，一个供应源可以供应多个开口。

然而，通过保持图8中所示的二维开口网络，微流体通道的布置可以不同。

由此，可以设想每个通道仅包括单个开口，这样通道和开口同样多。图10中示出了这种情况，其中仅示出与图8的十二个开口相关联的十二个微流体通道中的四个通道4010、4020、4030、4040（分别与开口4010’、4020’、4030’、4040’相关联）。在图10中，每个微流体通道可以供有专用流体，所述专用流体尤其可以包括用于刺激目标的分子。

因此对每个通道的供应是独立的。此外，可在入口处设置阀，使得可以有至少两种流体相继流入通道中。

因此这样形成的微流体装置与参考图2描述的装置相似。然而，其包括多于两个微流体通道。

在这些条件下，应当理解，用于制造这种装置的方法将重复参考图3（a）至3（c）描述的步骤，必要时重复参考图3（d）、4（a）至4（c）描述的步骤以形成腔室或其它微流体通道。

然而，为此，印模1’的形状需要改变以使凸起1’a包括适于形成使微流体通道彼此分隔开的壁的网格形中空区域，而非竖直凹槽1’c，以便最终获得图8的开口网络。图11示出在与图3（a）中所示的步骤对应的步骤中，包括在凸起上的该网格形11’c中空区域的修改后印模11’以及衬底2”。

这提供多种可能性。

实践中，可以根据能够刺激目标的分子的期望浓度分布选择微流体通道以供应流体。

也可以为微流体通道供应不同类型的刺激目标的分子。这样可以在活细胞培养的空间中实行精确和可变的控制。

例如，可以为一个微流体通道供应包括刺激分子的流体，为例如紧挨第一微流体通道的其它微流体通道供应包括中性溶液的流体。当目标细胞位于底座上时，流体在腔室8中混合以在腔室的底座处形成非常特殊的浓度分布。

还可以通过期望的开口401’、402’、403’、404’刺激目标，使得微流体通道401、402、403、404彼此之间具有时间差距。图8中示出的其它开口也可以同样的方式供应。

也可以设想微流体通道的其它布置，具体如下。

实际上可以仅提供单个微流体通道，包括用于目标的刺激分子的流体在所述微流体通道中流通，该通道包括多个开口。

例如，可能需要制造包括一个四开口通道的装置，因此微流体通道向这四个开口供应流体。

参考图12（a）至12（d）示出制造这种装置的方法，这种情况仍然设置腔室8（图12（d））。

印模101’可由弹性体材料，例如PDMS制成。其包括与要生产的微流体装置的轮廓互补的用作模具的轮廓。印模101’包括设有多个竖直凹槽101’c的凸起101’a，以形成微流体装置的不同壁301’。其还包括包围凸起101’a的中空区域101’b，微流体装置的侧壁300’在所述区域中形成。衬底201’也可由PDMS制成并且具有平坦轮廓。

微孔薄膜500’首先布置在衬底201’上，然后将印模101’压在衬底201’上。

然后，向印模101’和衬底201’之间的空间填充适量的例如可光致固化和/或光致聚合的液态树脂RL。在向印模101’和衬底201’之间的空间填充液态树脂RL之后，向印模101’施加压力P以将任何过剩的树脂排出。

图3（b）示出步骤（b）结束时获得的结构。

通过印模101’照射树脂。然后，将印模101’从装置中移除。在图12（b）中，可以观察到光致聚合和/或光致交联树脂的壁300’、301’，具有与印模101’的中空区域互补的轮廓。

盖子200’被预先固定在所述第一侧壁300’与印模101’相接触的一侧上。衬底201’可以被移除。图12（c）示出该步骤结束时获得的结构。

根据先前参考图4（a）至4（c）描述的方法制造腔室8，然后与图12（c）中示出的结构组装起来。该组装操作在图12（d）中示出。

图12（d）中用F标出通道中流体的行进方向。应当注意，其依次供应开在薄膜500’上的不同开口。

这里，可以设想前面已经描述过的不同材料。不是必须具有腔室8，尤其可以设置通道代替该腔室8。薄膜500’将具有与先前描述的薄膜5、500相同的特征。

本发明由此实施薄膜，精心选择其中小孔的水力直径以避免流体从微流体通道通向薄膜的相反侧，包括例如腔室或其它微流体通道。小孔的水力直径可以此外在较宽的范围上延伸。

本发明因此不需要任何凝胶形式的培养介质以避免流体从微流体通道通向腔室或该其它微流体通道。

因此培养腔室中的扩散在液态培养介质（例如水）中进行。在腔室中的扩散因此比在凝胶制成的培养介质中要快。这使得可以进行更加快速的测试并且更快地按顺序进行不同的测试。

此外，使用根据本发明的装置所获得的刺激分子到达目标的精确性是优异的并且比已知的装置要好的多。

这尤其与腔室中不存在凝胶有关，这限制了使用该凝胶所观察到的刺激分子的多方向扩散。

此外，根据本发明的方法使得可以制造小尺寸、高表面密度的开口网络。典型地，开口的尺寸可以达到5μm，并且两个相邻开口的各自中心之间的距离可以达到10μm。

最后，开口的尺寸设定完全独立于微孔薄膜的小孔的水力直径。由此，可以制造与具有较大小孔（例如3微米）的微孔薄膜相关联的例如具有小开口（例如30微米尺寸或更小）的微流体装置。可以制造与具有较小小孔（例如0.2微米）的微孔薄膜500相关联的具有较大开口（例如2000微米尺寸）的微流体装置。

这给根据期望的应用选择微流体装置的尺寸带来了较大的自由度。

本发明尤其可以应用在生物学领域，培养、观测以及活细胞研究。特别是，可以确定神经细胞对某些分子的趋化性反应，例如以形成神经网。还特别是，可以测量癌细胞对用于化学疗法的分子的反应。还可以使用用于制造生物芯片或者用于刺激组织，尤其是用于形成人造组织的微流体系统。

本发明带来的优点对于其它应用领域也是重要的，例如用于确定美容术中某些分子的毒性阈值。

Claims

1.一种用于控制能够刺激目标的分子的浓度分布的微流体系统，所述目标例如由一组活细胞形成，其特征在于，所述系统包括：

-微流体装置（1、101），其包括：

●n_C≥1个微流体通道（4、40、401、402、4010、4020、4030、4040），所述通道或每个通道设有用于至少一种流体的至少一个入口孔以及用于所述流体的至少一个出口孔；

●形成在微流体通道中或者分配在不同微流体通道中的n_O≥2个开口（47、470、401’、402’、403’、404’、4010’、4020’、4030’、4040’），所述开口布置在同一平面中形成在该平面中的网络，

微流体通道的数目n_C和开口的数目n_Q具有如下关系：其中1≤i≤n_C，并且

为用于通道C_i的开口数目；

●包括用于接收目标的底座（6）的腔室（8）或其它微流体通道；

●覆盖开口网络的至少一个微孔薄膜（5、500、500’），所述底座（6）用于接收布置在腔室（8）或者其它微流体通道的相对于微孔薄膜的另一侧上的目标；

-用于为所述微流体通道或者每个微流体通道供应流体（F₁、F₂）的一个或多个流体供应机构，所述流体的至少其中一种包括用于刺激目标的分子；

使得当供应机构为所述微流体通道或每个微流体通道（4、40、401、402、4010、4020、4030、4040）供应所述流体（F₁、F₂）的至少其中一种，然后能够刺激目标的分子扩散，在穿过微孔薄膜（5、500、500’）之后，通过腔室（8）或所述一个其它微流体通道，以控制在所述腔室（8）或所述其它微流体通道中能够刺激目标的分子的浓度分布。

2.根据权利要求1所述的微流体系统，其中，微孔薄膜（5、500、500’）设置有水力直径在0.05μm到12μm之间，优选在0.05μm到3μm之间的小孔。

3.根据权利要求2所述微流体系统，其中，所述微孔薄膜（5、500、500’）的小孔的表面密度在10³至10¹⁰小孔/cm²之间。

4.根据前述权利要求中任一项所述的微流体系统，其中，所述微孔薄膜（5、500、500’）由选自以下的材料制成：玻璃、聚碳酸酯、聚酯、聚对苯二甲酸乙二酯、石英、硅、二氧化硅或碳化硅。

5.根据前述权利要求中任一项所述的微流体系统，其中，为微流体通道设置盖子（2、200），所述盖子由选自以下的材料制成：玻璃或硅、非弹性体光致交联型聚合物、金属、导体或半导体合金、陶瓷、石英、蓝宝石、弹性体。

6.根据权利要求5所述的微流体系统，其中，用于流体的所述至少一个入口孔和所述至少一个出口孔形成在所述盖子中。

7.根据前述权利要求中任一项所述的微流体系统，其中，所述微流体通道每个包括至少一个光致固化和/热固化树脂的壁。

8.根据权利要求7所述的微流体系统，其中，所述腔室（8）或者所述其它微流体通道的底座（6）由光透明材料制成。

9.根据权利要求8所述的微流体系统，其中，腔室或者微流体通道包括由光致固化和/或热固化树脂制成的侧壁。

10.根据前述权利要求中任一项所述的微流体系统，其中，设置多个机构用于供应微流体通道，所述供应机构的每个供应微流体通道的其中之一。

11.根据前述权利要求中任一项所述的微流体系统，其中，设置光学观察机构（18）。

12.根据权利要求11所述的微流体系统，其中，所述光学观察机构（18）实施光激活定位显微镜技术或者受激发射损耗显微镜技术。

13.根据前述权利要求中任一项所述的微流体系统，其中，开口（47’、470’、401’、402’、403’、404’）在所述开口所属的平面中形成二维网络。

14.根据前述权利要求中任一项所述的微流体系统，其中，两个相邻开口的各自中心分隔开的距离在10μm到250μm之间。