JP2014518509A - ターゲットを刺激する分子の濃度を制御するマイクロ流体システム - Google Patents

Abstract

【解決手段】本発明は、例えば一組の生細胞で形成されるターゲットを刺激する可能性がある分子の濃度マップを制御するマイクロ流体システムに関する。このシステムは、以下を有するマイクロ流体デバイス（１）を備える：ｎ≧１のマイクロ流体チャネル（４、４０）であって、少なくとも一つの流体用の少なくとも一つの入口オリフィスと、この流体用の少なくとも一つの出口オリフィスとが設けられている、マイクロ流体チャネル；マイクロ流体チャネル内に形成されるか様々なマイクロ流体チャネル内に分配されるｎ≧２の開口部（４７、４７０）であって、一つの同一面内に配置されてこの面内に少なくとも一つの寸法を有するネットワークを形成する開口部。マイクロ流体チャネルの数ｎと開口部の数ｎとは、関係式（１）、但し１≦ｉ≦ｎで結び付けられており、ｎはチャネルｃ_ｉに対する開口部の数である。開口部のネットワークを覆う少なくとも一つの微細孔メンブレン（５）。マイクロ流体チャネルとは反対のメンブレンの側にターゲットが配置される。システムは、マイクロ流体チャネルに流体を供給する一つまたは複数の流体供給手段を備える。これらの流体のうち少なくとも一つがターゲットを刺激する分子を含む。
【選択図】図２

Description

本発明は、マイクロ流体工学の分野に関する。

マイクロ流体工学は、マイクロメートル単位の寸法のシステムを実装する。そのサイズは、一般的に数十から数百ミクロンの間である。

これらのシステムは、細胞診断検査、薬の開発、基礎生物学または美容術などの多くの分野に応用される。

これらの分野では、特定の分子に対する生細胞の反応、特に、空間的または時間的に管理された濃度マップに対する反応を定量的に決定するマイクロ流体システムの要求がますます増加している。

例えば、化学療法に使用される分子に対するがん細胞の反応を測定しなければならないことがある。この反応を正確に求めるために、この反応を発生する分子の適用を制御する必要がある。この制御は、がん細胞と相互作用する分子の量、がん細胞が曝される分子の濃度マップ、これらの分子の量および／またはがん細胞に適用されるこれらの分子の濃度マップの経時的傾向などに関連しうる。

美容術の分野では、マイクロ流体システムを使用して、生細胞および／または細胞組織上の特定の分子の毒性を試験することができる。毒性しきい値を決定するためには、細胞に投与される毒性の可能性がある分子の量の制御、およびこれらの分子が投与される方法の制御が必要である。

生細胞の刺激に広く使用されているマイクロ流体システムの一例が、ＵＳ７３７４９０６に示されている。このマイクロ流体システムは、分子濃度勾配に生細胞を曝すことを可能にしている。分子濃度勾配のマップは、時間的に安定している線形プロファイルを有している。

このタイプのマイクロ流体システムの主な欠点は、生細胞を乱す剪断力を発生する流れに生細胞が曝されることである。神経細胞の成長円錐の遊走反応を研究しようとする場合、この剪断が特に問題になる。実際、最良のシナリオでもターゲット細胞の反応を変更する剪断応力を流れが発生させてしまい、細胞を死なせたり引き裂いたりしさえすることもある。

こうして研究される生細胞の生理的作用が、この文書に開示されているシステムで乱されてしまう。

したがって、流れによって生細胞を乱すことなく、分子濃度マップおよび／またはいくつかの異なる分子濃度マップの組み合わせに生細胞を曝すための解決策が提案されている。

この種のマイクロ流体システムは、例えば、Microfluidic device for the combinatorial application and maintenance of dynamically imposed diffusional gradients”, R.L. Smith & al. (2010) 9: 613-622に示されている。

マイクロ流体システムは、マイクロ流体デバイス１００と、デバイスに流体を供給する手段（図示せず）とを備える。

本文書に開示されるマイクロ流体デバイス１００は、図１に分解斜視図として表されている。

マイクロ流体デバイスは、互いに独立した複数の流体供給チャネル１３０ａ、１３０ｂ、１３０ｃ、１３０ｄで形成されるＰＤＭＳ構造を備える。

これらのチャネル１３０ａ、１３０ｂ、１３０ｃ、１３０ｄのそれぞれの上壁１２０は、この壁を通り抜ける一つまたは複数のオリフィス１１０を備えている。マイクロ流体チャネルと反対側の壁１２０の側には、アガロースなどのゲルの形態をとる培地１５０で満たされた生細胞用の培養チャンバ１４０がある。したがって、壁１２０はメンブレンを形成し、二つの環境、すなわち流体の循環を目的とするマイクロ流体チャネル１３０ａ、１３０ｂ、１３０ｃ、１３０ｄと培養チャンバ１４０とを分離可能としている。

ガラス板１６０を使用して、培養チャンバ１４０をその上部で封止している。

流体供給手段は図示されていない。しかしながら、一つまたは複数の流体をチャネル１３０ａ、１３０ｂ、１３０ｃ、１３０ｄのそれぞれに導入することができ、これらの流体は、拡散オリフィス１１０を介してＰＤＭＳ壁１２０を通過することによって生細胞を刺激することを目的とする分子を含むことに注意しなければならない。

空間内の生細胞の培養を制御するために、マイクロ流体デバイス１００を用いて、生細胞を刺激するための分子を含む流体をその中に送るチャネルを選択することができる。このようにして、これらの分子が培養チャンバ１４０内に拡散するオリフィス１１０を正確に選択可能になる。

さらに、生細胞の培養を時間的に制御するために、異なるチャネル１３０ａ、１３０ｂ、１３０ｃ、１３０ｄへの流体供給を時間的に調整することができる。

デバイス１００は、流体供給チャネル１３０ａ、１３０ｂ、１３０ｃ、１３０ｄのそれぞれが特有の供給手段を提供するので、使用可能な刺激分子の選択に高い自由度を与えている。

しかしながら、このマイクロ流体システムは、多くの欠点を有している。

流体供給チャネルから培養チャンバへの流体の通過を避けるために、ゲル形態の培地１５０を備える培養チャンバ１４０の使用が必要である。

この特定のケースでは、実際に製造され試験されるデバイスは、２０μｍ×２０μｍの正方形オリフィスを有する。この寸法は比較的大きく、培養チャンバ１４０への流体の通過に好都合である。

著者らは、より小さい寸法（例えば４μｍ×４μｍ）の正方形オリフィス１１０を想定可能であると明記している。とは言うものの、採用されている製造技術（ＤＲＩＥ）は、典型的に１：２０である最大アスペクト比未満のオリフィスの形成ができないことが知られている。ここでは、このアスペクト比は、オリフィスの側面の寸法とこのオリフィスの深さとの比によって定義される。オリフィス１１０の側面の所与の寸法に対して、この最大アスペクト比がオリフィスの深さを制限し、したがってこのオリフィスが与えることができる流体抵抗を制限する。したがって、チャネル１３０ａ、１３０ｂ、１３０ｃ、１３０ｄから培養チャンバ１４０に流体が通過するリスクが増大する。

オリフィスのサイズがなんであろうと、ゲル形態の培地１５０がない場合、流体が培養チャンバ１４０に通過することが分かるだろう。

ゲルの本質的な存在が、マイクロ流体デバイス１００の動作に欠点をもたらしていることにも注意すべきである。

実際、ターゲットとする生細胞への刺激分子の拡散を、ゲルが減速している。そのため、培養チャンバ１４０内でのこれら刺激分子の濃度マップの安定化が遅くなる。

さらに、刺激分子がゲル内であらゆる方向に拡散することにも注意すべきである。

その結果、他と独立して各オリフィス１１０について、壁１２０内に位置するオリフィス１１０の通過表面積よりも大きな表面積にわたり、ゲル内に位置するターゲットで刺激分子が広がる。刺激分子によるターゲットの刺激は、オリフィスの寸法を決定する事前の選択での理論的な値よりも正確さが低くなる。よって、ターゲット上では、オリフィスの寸法により理論的に提供される空間分解能と比較して、空間分解能が損なわれる。

さらに、拡散オリフィス１１０は壁１２０の表面上で特定の表面密度となり、この増加は難しいことに注意すべきである。適切な特定のケースでは、ＰＤＭＳ壁１２０内に製造される二つの隣接オリフィス間の距離は、３００μｍ〜４００μｍである。

この論文で採用されている製造方法を用いて達成できそうなオリフィス１１０の密度は限られている。実際、この論文でマイクロ流体デバイスを製造するのに採用されているＤＲＩＥ法は、達成可能なマイクロ流体チャネルの密度に関して限界がある。設計により、これらのマイクロ流体チャネルはそれぞれ単一のオリフィス１１０上で終了するので、オリフィス１１０の表面密度も制限される。

この欠点は、オリフィスの寸法によって理論的に提供されるターゲットの刺激の正確さが、ターゲット上で実際に得られるものとは異なるという事実に追加される。

本発明の目的の一つは、これらの欠点のうち少なくとも一つを軽減することである。

この目的を達成するために、本発明は、例えば一組の生細胞で形成されるターゲットを刺激する可能性がある分子の濃度マップを制御するマイクロ流体システムを提案する。このシステムは、以下を備えている。
−以下を有するマイクロ流体デバイス：
・ｎ_ｃ≧１のマイクロ流体チャネル。チャネルには、少なくとも一つの流体用の少なくとも一つの入口オリフィスと、この流体用の少なくとも一つの出口オリフィスとが設けられる。
・マイクロ流体チャネル内に形成されるか異なるマイクロ流体チャネル内に分配されるｎ_０≧２の開口部。この開口部は一つの同一面内に配置され、この面内にネットワークを形成する。
マイクロ流体チャネルの数ｎ_ｃと開口部の数ｎ_０とは、
、但し１≦ｉ≦ｎ_ｃ
の関係式で結び付けられており、ｎ_０／ｃｉは、チャネルｃ_ｉに対する開口部の数である（Σは総和演算子に相当する）
・開口部のネットワークを覆う少なくとも一つの微細孔メンブレン。ターゲットは、マイクロ流体チャネルとは反対のメンブレンの側に配置される。
−マイクロ流体チャネルに流体を供給する一つまたは複数の流体供給手段。これらの流体のうち少なくとも一つは、ターゲットを刺激する分子を含む。

このシステムは、単独のまたは組み合わされる他の技術的特徴を提供することができる。
−微細孔メンブレンに、水力直径が０．０５μｍ〜１２μｍ、好ましくは０．０５μｍ〜３μｍである孔が設けられる。
−微細孔メンブレンの孔の面密度が、１０^３〜１０^１０個／ｃｍ^２である。
−微細孔メンブレンは、ガラス、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート、石英、シリコン、シリカまたはシリコンカーバイドから選択される材料で作成される。
−マイクロ流体チャネルのカバーが設けられる。カバーは、ガラスまたはシリコン、非エラストマー光架橋ポリマー、金属、導電性合金または半導体合金、セラミック、石英、サファイア、エラストマーから選択される材料で作成される。
−流体用の少なくとも一つの入口オリフィスと少なくとも一つの出口オリフィスがカバー内に形成される。
−マイクロ流体チャネルはそれぞれ、光硬化性樹脂または熱硬化性樹脂からなる少なくとも一つの壁を備える。
−ターゲットに対して閉鎖培養チャンバが設けられるか、マイクロ流体チャネルの反対の微細孔メンブレンの側にマイクロ流体チャネルが配置される。このようにして、チャンバまたはもう一つのマイクロ流体チャネル内にターゲットが位置付けられる。
−チャンバまたはマイクロ流体チャネルは、光学的に透明な材料で作成されたベースを備える。このベースは、微細孔メンブレンに対して、チャンバまたはマイクロ流体チャネルの他方の側に配置される。
−チャンバまたはマイクロ流体チャネルは、光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂で作成された側壁を備える。
−マイクロ流体チャネルに供給する複数の手段が設けられる。これらの供給手段はそれぞれ、マイクロ流体チャネルのうちの一つに供給する。
−光学観察手段が設けられる。
−光学観察手段は、ＰＡＬＭ（photoactivation localization microscopy）技術またはＳＴＥＤ（stimulated-emission-depletion）顕微鏡技術を実装する。
−開口部は、その属する平面内に二次元ネットワークを形成する。
−二つの隣接する開口部のそれぞれの中心が、１０μｍ〜２５０μｍの距離だけ離れている。

本発明の他の特徴、目的および利点は、以下の図面を参照して与えられる以下の詳細な説明から明らかになる。

本発明にしたがったマイクロ流体システムの部分断面斜視図である。 図３（ａ）ないし図３（ｄ）は、図２に示すマイクロ流体デバイスの製造方法のステップ、またはこの方法の特定のステップの完了時に得られる中間構造を示す図である。 図４（ａ）ないし図４（ｃ）は、デバイスの底壁と側壁とによって形成されるアセンブリの製造中に得られる中間構造を示す図である。上記アセンブリは、図２のマイクロ流体デバイスの一部を形成するよう意図されている。 図５（ａ）は、図２に示す本発明に係るマイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネル内を流れる流体を示す図である。これらの流体のうちの一つは、ターゲット細胞の刺激分子を含む。図５（ｂ）は、図２のデバイスのチャンバ内の刺激分子の濃度プロファイルを示す図である。 本発明にしたがった別のマイクロ流体デバイスの断面図である。 図７（ａ）、図７（ｂ）、図７’（ａ）、図７’（ｂ）および図７（ｃ）〜図７（ｆ）は、図６のマイクロ流体デバイスの製造中のステップ、またはこのマイクロ流体デバイスの製造で得られる中間構造を示す図である。 図６のマイクロ流体デバイスを表す、下側からの部分図である。 各マイクロ流体チャネルが多数の開口部を備えるように構成された、図６のマイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルの斜視図である。 図６の変形例に係るマイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルの上側からの図である。各マイクロ流体チャネルがこのデバイスの微細孔メンブレン上に開口する開口部を備えるように、これらのチャネルが構成される。 図１０に示すデバイスの製造ステップを表す図である。 図１２（ａ）ないし図１２（ｄ）は、本発明にしたがったマイクロ流体デバイスの変形実施形態を製造する方法のステップ、またはこの方法の特定のステップの完了時に得られる中間構造を示す図である。

まず第１に、図２の支持のもと、二つのマイクロ流体チャネルを備えた、本発明にしたがったマイクロ流体デバイス１を提示する。これらのチャネルはそれぞれ、メンブレン上に開口する開口部が設けられており、その製造方法は図３（ａ）〜図３（ｄ）および図４（ａ）〜図４（ｄ）で支持されている。

このマイクロ流体デバイス１は、固いと有利である、マイクロ流体チャネル内で流体を循環させるためのオリフィス２１、２２が設けられたカバー２と、側壁３および中央壁３０と、を備える。側壁と中央壁の両方とも、光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂で作成されると有利である。より詳細には、デバイス１の側壁３は、光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂の単一層で製造される。

マイクロ流体デバイス１は、側壁３および中央壁３０の底を横切って延びる微細孔メンブレン５によって覆われた二つの開口部４７、４７０をその底部に備えている。開口部４７、４７０という用語は、デバイスの壁の間に延びメンブレン５によって覆われるよう意図されているチャネルの端面を意味すると理解されるべきである。

開口部４７、４７０は一つの同一面内に配置され、この面内で開口部のネットワーク（この場合は一次元）になぞらえることができる。本発明の文脈では、開口部の「ネットワーク」という用語は、開口部間のリンクが必ずしも必要なく、および／または属する開口部の面内においてこれらの開口部を特別に配置することなく、複数の開口部が存在するという事実を単に述べているに過ぎない。

例えば、図１において、開口部４７、４７０には、一つの同一面内に必然的に一列に配置される二つの異なるマイクロ流体チャネルによって供給される。他方、以下で説明する他の実施形態では、一部の開口部に一つの同一のチャネルによって供給されてもよいし、さらに、一部の開口部が一つおよび同一の面内で二次元的に配置されてもよい。

壁３、３０とカバー２は、微細孔メンブレン５によってそれぞれの開口部４７、４７０で閉じられた二つのマイクロ流体チャネル４、４０を画成することができる。これらのチャネル４、４０へのそれぞれの流体入口は、オリフィス２１または２２にそれぞれ対応する。これらのマイクロ流体チャネルの流体出口は図示されていない。

微細孔メンブレン５は、二つの環境、すなわちマイクロ流体チャネルとこのチャネルの外部環境とを分離する。この外部環境は例えば、刺激すべきターゲットが配置されるよう意図されている培養チャンバ８によって形成される。この点において、Smith & al.による文献で採用されているゲルはメンブレンではないことに注意すべきである。なぜなら、ゲルはマイクロ流体チャネルと培養チャンバとを分離しておらず、反対に、培養チャンバを満たす培地を形成しているからである。

さらに、微細孔メンブレン５は、マイクロ流体チャネル４、４０内に流れるように意図された流体が、このメンブレンの他の側を通過することを防止する。しかしながら、後者により分子がターゲットを刺激する可能性があり、マイクロ流体チャネル４、４０のうち少なくとも一つにおいて流体によって運搬されて拡散するおそれがある。これについては以下で詳細に説明する。本発明に係るデバイス１は、培養チャンバ８内のゲルの存在を必要としない。

マイクロ流体デバイス１は、固く透明であると有利であるベース６と、光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂で作成されると有利である側壁７ａ、７ｂとを備える。側壁７ａ、７ｂ、ベース６および微細孔メンブレンにより、チャンバ８を形成することができる。チャンバ８を形成するために、４つの側壁が設けられる。上記の製造法は有利なことにこれらの壁を単一部品として製造するので、実際にはこれらの側壁を単一の外形になぞらえることができる。

チャンバ８の底は、ベース６の上面６１によって形成される。ベースは、例えば生細胞によって形成されるターゲットを受け入れることを目的としている。この場合、生細胞は、チャンバ８のベース６上に、微細孔メンブレン５から離れて配置されるようにされている。こうして、マイクロ流体デバイス１から離して、標準状態で生細胞を培養することができる。

マイクロ流体チャネル４、４０は、ターゲットを刺激しそうな分子を含む流体を循環させることができる。これは、以下でさらに詳細に説明するように、微細孔メンブレン５を通してチャンバ８に拡散させ、その後、例えば刺激を要求する生細胞（ＣＶ）がその底に存在するチャンバ８を通した拡散によって、循環が行われる。

有利なことに、ベース６は光学的に透明な材料、例えばガラスで作られている。デバイスの外側に光学観察手段１８を配置して、例えばチャンバ８の底に配置された生細胞の刺激に対する反応を観察することができるので、これは興味深い。

カバー２は、ガラスまたはシリコン、非エラストマー光架橋ポリマー、金属、導電性合金または半導体合金、セラミック、石英、サファイア、エラストマーから選択される材料で作成することができる。

マイクロ流体チャネル４、４０とチャンバ８との間での流体の通過を避けるように、微細孔メンブレン５が選択される。実際には、微細孔メンブレン５を完全に流体密封にすることはできない。また、微細孔メンブレン５を通る流体の通過速度が限界値未満であれば、チャンバ８内に位置する細胞は流れに曝されていないとみなすことができる。

この限界速度は、例えば、１μｍ／ｓのオーダーであるとみなすことができる。この場合、細胞に付与される剪断応力は無視できる。

さらに、各マイクロ流体チャネル４、４０におけるこの速度は、１００μｍ／ｓ〜１００００μｍ／ｓであってもよく、１００００μｍ／ｓより大きくてもよい。

また、１μｍ／ｓの限界値を得るためには、微細孔メンブレン５の流体抵抗Ｒ_h,membraneは、チャネル４内の流体速度に応じて、マイクロ流体チャネル４、４０の流体抵抗Ｒ_h,channelの１００〜１００００倍であるべきである。

例えば、マイクロ流体チャネル４、４０内の流体の流速が１００００μｍ／ｓである場合、メンブレン５を通る流体の速度が１μｍ／ｓのみなし限界値をはるかに下まわるようにするためには、以下の不等式が観察されなければならない。
１００００＊Ｒ_h,channel＜Ｒ_h,membrane （Ｒ１）

さらに、高さｈ、幅ｗ、長さＬの長方形のマイクロ流体チャネル４、４０と、半径ｒ_pore、孔の面密度ρの同一の円筒形孔を有する厚さがｅの微細孔メンブレン５とを考慮すると、上記の関係（Ｒ１）は以下の形になる。

高さｈ＝１００μｍ、幅ｗ＝１０００μｍ、長さＬ＝１０００μｍのマイクロ流体チャネル４、４０に対して、上記の関係（Ｒ３）を観察するには、θが１０^−１０ｍ未満でなければならない。さらに、１μｍの半径を持つ円筒形孔と、厚さ１０μｍのメンブレンとを仮定すれば、孔の面密度ρは１０^５個／ｃｍ^２未満でなければならない。

当然、上記の関係（Ｒ３）は、微細孔メンブレン５を通過する流体の限界速度のみなし値と、マイクロ流体チャネル４、４０内でのこの流体の流速とにしたがって一般化することができる。

微細孔メンブレン５は、水力直径が０．０５μｍ〜１２μｍである孔を有することができる。より詳細には、孔が円筒形である場合、孔の水力直径はその直径に相当する。

しかしながら、この水力直径が０．０５μｍ〜３μｍであると有利である．実際には、水力直径が３μｍ未満である孔を持つメンブレンは、遭遇する可能性のある使用条件の大部分に対して、チャンバ８内への流れの通過を回避することに注意すべきである。

現在のところ、メンブレンの製造者は、水力直径が０．２μｍよりも概して大きい孔を持つメンブレンを市場で提供している。したがって、本発明の文脈では、孔の水力直径を０．２μｍ〜３μｍにすることができると有利である。しかしながら、理論上、孔の水力直径の下限値は存在しない。これは、０．０５μｍと同程度に小さい水力直径を持つ孔の実装を想定できる理由を説明している。

水力直径が３μｍよりも大きな孔を使用する場合、マイクロ流体デバイスを使用して微細孔メンブレン５を流体が通過しないようにすることは、先験的に（例えば、マイクロ流体チャネル４、４０内の流速の選択において）さらに困難になる。しかしながら、メンブレン５によって覆われる開口部４７、４７０のそれぞれに関連するメンブレンの孔の数の減少させることで、この水力直径の増加が起こることに注意すべきである。開口部当たりのメンブレンの孔の数のこの減少は、マイクロ流体デバイスの各開口部を通る水力抵抗を増加させるのに好都合である。

この理由のため、マイクロ流体チャネル４内で想定可能である流体の流速の範囲を限定することによって、水力直径が３μｍよりも大きい孔の使用を想定することができる。

Smith & al.のデバイスでは、本発明で提案するようなメンブレンが存在しないので、開口部は強制的に一つの、一つのみの拡散オリフィスに対応する。その結果、Smith & al.のデバイスでは、水力抵抗はデバイス内のオリフィス自体の直径によって決まる。

したがって、微細孔メンブレン５の実装により、ゲルおよびそれに付随する欠点をなしで済ますことができるので、かなり有利である。

微細孔メンブレン５の孔の密度は、その一部について、１０^３〜１０^１０個／ｃｍ^２であってもよい。孔の高さは、５０ｎｍ〜１００μｍであってもよい。

さらに、微細孔メンブレン５は、ガラス、石英、シリコン、シリカまたはシリコンカーバイドなどの様々な材料から作成することができ、マイクロ流体デバイスの残りの部分で使用される可能性のあるポリマーと同一の性質のポリマーで作成されてもよい。よって、ポリカーボネート、ポリエステルまたはポリエチレンテレフタレートを使用することができる。

第１実施例によると、例えばワットマン社のcycloporeタイプ（Whatman Cyclopore）の、孔の直径が０．２μｍ〜１μｍであるポリカーボネート製の微細孔メンブレン５を設けてもよい。第２実施例によると、コーニング社のTranswellタイプ（Corning Transwell ）の、孔の直径が０．４μｍ〜３μｍであるポリエステル製の微細孔メンブレン５を設けてもよい。第３実施例によると、ベクトン・ディッキンソン社の"Track-Etched"タイプの、孔の直径が０．４μｍ〜８μｍであるポリエチレンテレフタレート製の微細孔メンブレン５を設けてもよい。

これらの微細孔メンブレンは、マイクロ流体デバイス１の製造方法に適合する利点を提供する。この製造方法については、図３（ａ）〜図３（ｄ）を参照して以下で説明する。微細孔メンブレンは、生体適合性があり、様々な分子が浸透可能となるように機能付与できるという利点も提供する。機能付与という用語は、特定の機能（特定の種の保持、化学反応など）を実行するように微細孔メンブレン５を化学的に改良できることを意味すると解されるべきである。

一般に、デバイスは以下の寸法を有することができる。マイクロ流体チャネルの高さｈは、１μｍ〜１０００μｍ、有利には１０μｍ〜２００μｍであってもよい。その幅（図示せず）は、１０μｍ〜２ｍｍであってもよい。チャンバ８の高さｈ’は、１０μｍ〜１０００μｍであり、有利には５０μｍ〜２００μｍであってもよい。さらに、入口Ｅと出口Ｓの間の距離は、数ｃｍである。

前述したように、マイクロ流体デバイスに光学観察手段１８を関連付けることができる。この光学観察手段１８は、ターゲット細胞に与えられる刺激分子の濃度マップを知ることを可能にする。また、光学観察手段１８は、刺激分子に対する細胞の生物学的反応の機能的画像化を可能にする。したがって、ターゲット細胞の観察される挙動とターゲット細胞に与えられる濃度マップとの間の相関の実験的な実行がより容易になる。

光学的に透明な材料で作成されるベースを非常に薄くすることができるので、高い空間解像度でこの観察を実行することができる。例えば、厚さ１５０μｍのガラススライドで形成されたベースを用いることによって、ＰＡＬＭ（photoactivation localization microscopy）技術またはＳＴＥＤ（stimulated-emission-depletion）顕微鏡などの技術を用いて、高解像度、さらには超高解像度の蛍光顕微鏡検査法を実行することができる。

本発明に係るマイクロ流体デバイス１の製造方法の一例は、少なくとも以下のステップを含む方法である。
（ａ）エラストマー材料で作成されたスタンプ１’を使用して、微細孔メンブレン５に設けられた支持部２’上に配置された光硬化性および／または熱硬化性の液体に刻印する。
（ｂ）液体に光照射するか加熱して、微細孔メンブレン５によって底が閉じられた第１側壁３と、メンブレン５と接触している中央壁３０とを形成する。
（ｃ）オリフィス（図示せず）が設けられたカバー２を、支持部２’と反対の側で第１側壁３と中央壁３０の上に接着して、マイクロ流体チャネル４、４０を形成する。各マイクロ流体チャネル内で、流体が循環することができる。
（ｄ）支持部２’を取り除いた後、支持部２’の除去によってアクセス可能となる第１側壁３および中央壁３０の部分にアセンブリを接着してチャンバ８を形成する。アセンブリは、少なくとも一つのベース６と、光硬化性および／または熱硬化性樹脂で作成された上記少なくとも二つの第２側壁７ａ、７ｂとを少なくとも備える。

この方法は、ＷＯ２００８／００９８０３に開示された方法に基づいている。

ステップ（ａ）で実行される操作が、図３（ａ）に表されている。

ステップ（ａ）で用いられるスタンプ１’は、ＰＤＭＳなどのエラストマー材料で作成することができる。スタンプは、製造されるマイクロ流体デバイス１の外形と相補的である型として用いられる外形を備えている。スタンプ１’は、垂直スロット１’ｃが設けられた突起１’ａを有しており、マイクロ流体デバイス１の中央壁３０を形成する。スタンプ１’は、突起１’ａを取り囲む中空領域１’ｂを有している。この領域には、マイクロ流体デバイス１の上記第１側壁３が形成されることになる。支持部２’もＰＤＭＳで作成することができ、平坦な外形を有している。

微細孔メンブレン５が最初に支持部２’上に配置され、続いてスタンプ１’が支持部２’に対して押し付けられる。こうして、突起１’ａを介して支持部２’に対してスタンプ１’がメンブレン５を押し込む。

続いて、スタンプ１’と支持部２’との間に位置する体積が、特にスタンプ１’の中空領域１’ｂ内と突起１’ａに設けられたスロット内で、例えば光によって架橋可能および／または光によって重合可能である適切な量の液状の樹脂ＲＬで充填される。微細孔メンブレン５はスタンプ１’と支持部２’との間で動くことができないので、この充填が微細孔メンブレン５の位置を変えることはない。

光によって架橋可能な樹脂および／または光によって重合可能な樹脂は、モノマーおよび／またはプレポリマーに基づく溶液または分散である。本発明の方法は、接着剤、のりまたは表面コーティングとして通常使用されている光によって架橋可能な樹脂および／または光によって重合可能な樹脂を使用する。

有利なことに、接着剤、のりまたは表面コーティングは、光学ドメインで通常利用されているものの中から選択される。この種の樹脂は、光照射され光により架橋または重合すると、固体になる。泡または任意の他の凹凸なしに適切に形成された固体が透明であると好ましい。

この種の樹脂は、一般に、エポキシ、エポキシシラン、アクリレート、メタクリレート、アクリル酸、メタクリル酸タイプのモノマー／コモノマー／プレポリマーに基づくが、チオレン、ポリウレタンおよびウレタンアクリレートなどの樹脂も引用することができる。ポリアクリルアミドゲルなどの光によって架橋可能な水性ゲルで樹脂を置き換えることができ、これらは室温で液体となるように選択される。ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）で樹脂を置き換えることもできる。

本発明で使用可能である光によって架橋可能な樹脂の中で、例えばＮＯＡ８１、ＮＯＡ６０などの、ＮＯＡ（Norland Optical Adhesives）の商標名でNorland Optics社によって販売されている製品、“Dymax Adhesive and light curing systems”の範囲のDymax社によって販売されている製品、“UV adhesives”の範囲のBohle社によって販売されている製品、製品番号ＳＲ４９２、ＳＲ４９９でSartomer社によって販売されている製品を引用することができる。

これらの樹脂の重合化および／または架橋は、ＵＶ、可視光線、赤外線放射による照射などの任意の適切な手段を用いた光活性化によって実行される。

一度重合化および／または架橋すると固く柔軟でなくなる樹脂が選択されると好ましい。なぜなら、マイクロ流体デバイス１内で圧力下で流体が循環されると、エラストマー樹脂は変形する傾向があるからである。しかしながら、生細胞の弾力性の研究などの特定の用途に対しては、光によって架橋可能なエラストマー樹脂の使用は除外されない。

スタンプ１’と支持部２’の間に位置する体積に液体樹脂ＲＬが充填された後、スタンプ１’に圧力Ｐが付与され余分な樹脂を追い出す。図２では、突出部、特にエラストマーで作成されたスタンプ１’の突起１’ａが支持部２’と接触する。液体樹脂は、スタンプ１’の中空領域の形状をとる。

ステップ（ｂ）の完了時に得られる構造が図３（ｂ）に示されている。

ステップ（ｂ）では、スタンプ１’を通して、デバイスのベースと直角の軸において樹脂の照射が行われる。この照射は、それが望ましい場合、樹脂製の第１側壁３と中央壁３０の表面に、活性した重合部位および／または架橋部位が残るような方法で行われなければならない。続いて、デバイスからスタンプ１’が取り除かれる。図３（ｂ）は、スタンプ１’の中空領域の外形と相補的な外形を持つ、光によって重合した樹脂および／または光によって架橋した樹脂で作られた第１側壁３を示している。この同じ図に、マイクロ流体チャネル４を分離することができる中央壁３０も見ることができる。

エラストマー製のスタンプ１’を使用して液状の樹脂内にインプリントすることによって、非常に小さいサイズの構造を非常に高い解像度で得ることが可能になる。

続いて、ステップ（ｃ）で、マイクロ流体チャネル４、４０内で流体を循環させるためのオリフィスを備えるカバー２が、第１側壁３のスタンプ１’と前に接触していた側に固定される。続いて、支持部２’を取り除くことができる。ステップ（ｃ）の完了時に得られる構造が図３（ｃ）に示されているが、もう一方の面に位置するカバーのオリフィスは示されていない。

光によって重合した樹脂および／または光によって架橋した樹脂から微細孔メンブレンを剥がすことなく、および微細孔メンブレンを引きはがしたり部分的に破ることなく、支持部２’が取り除かれる。

カバー２は、ガラス、シリコン、固体ポリマーフィルム、金属、導電性合金または半導体合金、セラミック、石英、サファイア、エラストマーで製造することができる。

ガラススライド、ポリマーフィルム、またはシリコンスライドが選択されると好ましい。カバー２の形成に使用される材料は、マイクロ流体デバイス１が作成される用途に応じて選択される。

このため、ガラスなどの光学的に透明な材料で作成されるカバー２は、観察および光学検出（透明度）を容易にするのにより適している。ガラスの別の利点は、熱伝導性が非常に良好であり、デバイスの一様加熱が可能になることである。

マイクロ流体チャネル４の底部に微細孔メンブレン５を配置することで、メンブレンの使用が標準的な生細胞培養プロトコルと相性が良くなることに注意すべきである。実際、ベース６がその上で生細胞の培養が実行されるガラススライドであり、以下で説明するように、ステップ（ｃ）の完了時に得られる構造にこのスライドが固定され、チャンバ８（培養チャンバ）を形成することを想定可能である。

上述した製造方法により、Smith & al.の論文に述べられているような、寸法が５μｍに達し、１０μｍと同程度に小さくすることができる二つの隣接する開口部の間のピッチ（二つの隣接する開口部のそれぞれの中心間の距離）が１０μｍと３００μｍ未満の値の間であるような開口部を製造することが可能になる。より詳細には、このピッチは１０μｍ〜２５０μｍである。

ベース６と二つの第２側壁７ａ、７ｂとを備えるアセンブリを、以下の方法ステップから製造することができる。
（ｅ_１）光硬化性および／または熱硬化性液体樹脂ＲＬを受け入れるようにされた支持面３’ａと空洞３’ｂとを有するエラストマー材料製の開放鋳型３’を使用する。
（ｅ_２）型３’の支持面３’ａ上にベース６を配置する。
（ｅ_３）ベース６上にマスク４’を配置し、続いて光を照射または加熱して上記第２側壁７ａ、７ｂを形成する。

ステップ（ｅ_３）が液体樹脂の光照射から構成される場合のステップ（ｅ_１）〜（ｅ_３）の完了時に得られる構造が図４（ａ）に示されている。

スタンプ１’および支持部２’と同様に、型３’はＰＤＭＳなどのエラストマーで作成することができる。

これらのステップに使用される光硬化性および／または熱硬化性液体樹脂は、ステップ（ａ）で採用される液体樹脂について既に述べたものから選択することができる。ステップ（ａ）とステップ（ｅ_１）〜（ｅ_３）で採用される液体樹脂は同一であると好ましい。変形例として、上述したものまたはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などの、光により架橋する水性ゲルを使用してもよい。

ベース６は、カバーに採用される材料から選択することができる。光学的に透明な材料を使用して、専用のデバイスによる光学的な観察を手助けできるようにすると有利である。この光学的に透明な材料は、特にガラスであってもよい。このように、ベース６は、生細胞（ＣＶ）の培養に通常使用されるガラスカバーを形成する。ガラスの使用により、この基板のために存在する化学的または生物学的な表面処理を有効利用することができる。

マスク４’は、マイクロ流体デバイスの第２側壁７ａ、７ｂを形成するために液体樹脂の正確な領域を光照射できるようにするオリフィス４’ａ、４’ｂを有していてもよい。

ステップ（ｅ_３）が終了すると、残っているのは、ステップ（ｅ_４）においてマスク４’と型３’とを取り除いて、第２側壁７ａ、７ｂとベース６とで形成されるアセンブリのみを残すことだけである。このアセンブリが図４（ｂ）に示されている。

一般に、続いてステップ（ｅ_５）が実行される。ステップ（ｅ_５）は、例えば９０／１０の体積比のエタノール／アセトン混合物を使用して上記アセンブリを洗浄することからなる。この洗浄により、ベース６上に残っている可能性がある、光照射されていないか加熱されていない全ての樹脂を取り除くことができる。

続いて、ステップ（ｃ）が完了してステップ（ｄ）が始まる前に得られる構造を用いてこのアセンブリを構成する前に、生細胞（ＣＶ）の培養が実行される。

このため、このアセンブリは生体適合性を有していなければならない。

この目的のために、このアセンブリを例えばＵＶによって強い光で照射し、続いて水などの中性溶液内で数時間激しく洗浄してもよい。

変形例として、生体適合性のある材料を用いて、チャンバ、またはより一般的にデバイスの様々な部材を製造することができる。

最後に、図４（ｃ）に示すように、ベース６の上面６１上で生細胞の培養を実行することができる。この培養は標準状態で実行される。より詳細には、従来のガラススライドの形態のベース６上でこの培養を実行してもよい。

一旦この培養が終了すると、ステップ（ｄ）を実行することができる。

ステップ（ｄ）の間に実行される操作が図３（ｄ）に示されている。

ステップ（ｄ）が一旦実行されると、マイクロ流体デバイスを使用する準備ができる。これは、チャンバ８（培養チャンバ）内で微細孔メンブレン５とは反対の、ベース６の上面６１上にある生細胞を含む。

マイクロ流体デバイス１を操作するために、マイクロ流体システム内で、生細胞などのターゲットを刺激する可能性のある分子を含む流体をマイクロ流体チャネル４、４０のうち少なくとも一つに供給する少なくとも一つの手段にマイクロ流体デバイス１が関連付けられる。

例えば、二つの独立した流体容器を設けてもよい。一方は、ターゲット用の刺激分子を含む流体Ｆ_１をマイクロ流体チャネル４に供給する容器であり、他方は、中性流体Ｆ_２を第２マイクロ流体チャネル４０に供給する容器である。

これらの容器とともに使用される可能性のあるマイクロ流体チャネル４、４０の例が、図５（ａ）に模式的な平面図で示されている。

流体Ｆ_１は、入口Ｅ_４を通ってマイクロ流体チャネル４内に導入され、出口Ｓ_４を通ってこのチャネル４から出る。流体Ｆ_２は、その一部が入口Ｅ_４０を通ってマイクロ流体チャネル４０内に導入され、出口Ｓ_４０を通ってこのチャネル４０から出る。二つのマイクロ流体チャネル４、４０は、マイクロ流体デバイス１の中央壁３０によって分離されている。

中央壁３０による分離により、これらの流体の間で混合が生じ得ないので、マイクロ流体チャネル４、４０のそれぞれにおける流体の循環を再利用することが可能になる。さらに、この分離のおかげで、流体の流速を幅広い範囲の値、例えば１００μｍ／ｓ〜１００００μｍ／ｓに広げることができ、その上剪断力の影響下で二つの流体のあらゆる流体力学的混合が起こるリスクがない。さらに、デバイスの動作に問題を生じさせることなく、異なるチャネル間での流体の循環速度に差を持たせることができる。

流体Ｆ_１、Ｆ_２は、ターゲット細胞用の刺激分子が、二つの流体のうち一方に薄い濃度で存在する点のみが異なる。

入口Ｅ_４、Ｅ_４０は、図２の入口オリフィス２１、２２に相当することに注意すべきである。

図５（ｂ）は、縦断面図で模式的に示されているマイクロ流体デバイスの異なる部分における流体Ｆ_１、Ｆ_２の流れを模式的に示す図である。

したがって、各流体Ｆ_１、Ｆ_２は、マイクロ流体デバイス１のマイクロ流体チャネル４、４０のうち一方に流れるようにされている。両方の流体が微細孔メンブレン５に接触するがチャンバ８（培養チャンバ）内にはない。チャネル４、４０におけるこれらの分子の濃度マップが、階段状の曲線Ｃ１で示されている。

マイクロ流体チャネル４とチャンバ８のベース６上に置かれた生細胞との間での、生細胞を刺激しそうな（流体Ｆ_１に含まれる）分子の輸送が、微細孔メンブレン５を通したチャンバ８内への拡散によって行われる。

より詳細には、これらの分子の輸送は、最初に微細孔メンブレン５を通した拡散によって行われ、続いてチャンバ８を通した拡散によって行われ、最後に、生細胞が位置している、チャンバ８のベース６の上面６１に分子が到達する。

濃度マップはチャンバ８内で安定しなければならない。より詳細には、チャンバ８のベース６において、安定化時間ｔ_stabはｈ’^２／Ｄのオーダーである。ここで、ｈ’はチャンバ８の高さであり、Ｄは、チャンバ８内のターゲット細胞の刺激を目的とする分子の拡散係数である。安定化時間が過度に長くなるのを避けるために、チャンバの高さは通常５００μｍに制限されることに注意すべきである。

チャンバ８内で安定化される濃度マップが曲線Ｃ２によって示されている。これは「誤差関数（erf）」型の関数を表す曲線形式である。したがって、マイクロ流体チャネルのこの供給により、チャンバ８のベースにおいて、ゆえに刺激される生細胞上で、極めて特別な濃度マップを得ることができる。

図５（ａ）および図５（ｂ）の支持の下で説明した供給は、例示として与える一例に過ぎない。したがって、ターゲット細胞上で他のタイプの濃度マップを獲得するために、マイクロ流体チャネルへの流体の供給を異なる方法で実行してもよい。

別の例によると、チャンバ８内でさらに複雑な濃度マップを獲得するために、二つのマイクロ流体チャネル４、４０にそれぞれ流体Ｆ_１、Ｆ_２を供給可能とする供給手段を設けてもよい。

有利には側面のオリフィスを備えるマイクロ流体チャネルで、閉じたチャンバ８を置き換えることができる。しかし、試験の進行中には、このマイクロ流体チャネル内に流体を流すことが意図されていない。しかしながら、生細胞を化学的に分析するために、側面オリフィスにチャネルを接続して生細胞からの分泌を回復することができる。さらに、二つの試験の間に、迅速な洗浄または培地の交換を想定することができる。

さらに、チャンバ８またはマイクロ流体チャネルのベース上にはターゲット細胞を配置しないが、微細孔メンブレン５自体にはターゲット細胞を配置することも可能であることに注意すべきである。この場合、ターゲット細胞で獲得される濃度マップは、マイクロ流体チャネル４、４０内で生成される濃度マップに対応する。実際、この場合、マイクロ流体チャネル４、４０内を流れる流体と接触する側とは反対のメンブレン５の側に、ターゲット細胞が配置される。

さらに、チャンバまたはマイクロ流体チャネルを用いずにマイクロ流体デバイスを製造し、微細孔メンブレン５上に直接ターゲット細胞を配置することさえ可能である。この場合、デバイスを製造するのに、上述したステップ（ｅ_１）〜（ｅ_３）は不要であることが分かるだろう。

本発明に従う別のマイクロ流体デバイスについて、図６および図８を支持して説明する。また、このデバイスの製造方法について、図７（ａ）、図７（ｂ）、図７’（ａ）、図７’（ｂ）、および図７（ｃ）〜図７（ｆ）を支持して説明する。

図６に示すマイクロ流体デバイス１０１は、複数のマイクロ流体チャネル４０１、４０２を備える。各マイクロ流体チャネルは、微細孔メンブレン５００上に開口するいくつかの開口部４０１’、４０２’と、４０３’、４０４’を備えている。この場合、二つのマイクロ流体チャネルが設けられ、一方のマイクロ流体チャネル４０１は、図８に白で表す６つの開口部に供給し、他方のマイクロ流体チャネル４０２は、図８に黒で示す６つの開口部に供給する。これらの開口部４０１’、４０２’、４０３’、４０４’は一つの同一面Ｐ内に配置され、この面内に二次元である開口部のネットワークを形成している。平面Ｐは図６および図８に示されており、図８は、この平面Ｐの下方から見た開口部を表している。

微細孔メンブレン５００は、異なるマイクロ流体チャネルの側壁に対して横方向に延び、異なるチャネルを底部で覆い、したがって異なる開口部を覆っている。

有利なことに、微細孔メンブレン５００は、マイクロ流体チャネル４０１、４０２の開口部４０１’、４０２’、４０３’、４０４’の全てを覆っている。これにより、単一のメンブレンを用いて異なる開口部を覆うことが可能であり、これは開口部のネットワークが密であるときには特に実用的である。典型的に、本発明に係る方法により、互いに１０μｍのピッチだけ離れている５μｍの開口部を製造することが可能になる。ここで定めるピッチとは、二つの隣接する開口部のそれぞれの中心間の距離である。

微細孔メンブレン５００には孔が設けられている。このメンブレン５００の特徴は、図２、図３（ａ）〜図３（ｄ）、図４（ａ）〜図４（ｃ）により支持される上述したマイクロ流体デバイス１のメンブレン５と同一であってもよい。

マイクロ流体デバイス１０１は、マイクロ流体チャネル用のカバー２００も備える。このカバー２００は、ガラスまたはシリコン、非エラストマー光架橋ポリマー、金属、導電性合金または半導体合金、セラミック、石英、サファイア、エラストマーから選択される材料で作成することができる。

マイクロ流体チャネル４０１、４０２内で循環される流体用の入口オリフィスおよび出口オリフィスを、このカバー２００に形成してもよい（図示せず）。

微細孔メンブレン５００の孔の水力直径が、マイクロ流体チャネル４０１、４０２内を流れる流体がこのメンブレン５００を通過することを防止し、ターゲットを刺激する可能性のある分子のみがこのメンブレンを通過する。この点において、上で与えた関係式（Ｒ１）〜（Ｒ３）を参照すべきである。また、その速度よりも下ではマイクロ流体チャネル４０１、４０２内を流れる流体をメンブレンが通過させないとみなされる制限速度の選択を参照すべきである。

続いて、これらの刺激分子の濃度マップが、異なるマイクロ流体チャネル４０１、４０２のそれぞれの流体供給の選択によって生成される。図８から分かるように（微細孔メンブレン５００は図示されていない）、微細孔メンブレン５００上に開口する開口部４０１’、４０２’、４０３’、４０４’は、刺激分子用の拡散領域を形成しており、ターゲットに化学的な情報を供給するピクセルになぞらえることができる。

有利なことに、マイクロ流体デバイス１０１は、上記ターゲット用の閉鎖培養チャンバ８を提供する。このチャンバは、第１マイクロ流体チャネル４０１、４０２とは反対にある微細孔メンブレン５００の側に配置される。チャンバは、上述したマイクロ流体デバイス１のチャンバ８と同様の特徴を有するが、その寸法は適合させなければならない。

こうして、微細孔メンブレン５００がチャンバの側壁の間に横方向に広がり、上記チャンバをその上部で閉鎖する。

チャンバ８のベース６１上にターゲットを配置することができる。ベース６１は、微細孔メンブレン５００に対して、チャンバ８の他方の側に配置される。

変形例として、チャンバ８内にターゲットを配置したり、微細孔メンブレン５００上に直接ターゲットを配置したり、さらにはチャンバが無い場合に微細孔メンブレン上に直接ターゲットを配置することさえ完全に想定することができる。

ここでも、培養チャンバ８を、有利には側面のオリフィスを備えるマイクロ流体チャネルで置き換えることができるが、このチャネル内の流れは意図されていない。

チャンバ８またはマイクロ流体チャネルのベースが光学的に透明である場合は特に、上述し図２に示した手段１９のような光学観察手段をマイクロ流体デバイス１０１に関連付けてもよい。

マイクロ流体デバイス１０１の製造方法は、図２に示したマイクロ流体デバイスについて上述してステップ（ａ）〜（ｄ）と同様のステップに基づく。

図７（ｂ）に示す構造２００を製造するために、ステップ（ａ）および（ｂ）が実行される。ステップ（ａ）では、エラストマー材料製のスタンプ１０’を使用して、微細孔メンブレン５００が設けられた支持部２０’上に配置された光硬化性および／または熱硬化性液体ＲＬをインプリントする（図７（ａ））。続いて、ステップ（ｂ）において、液体の光照射および／または加熱が実行され、微細孔メンブレン５００とともにいくつかの壁を形成する。

同様に、図７’（ｂ）に示す別の構造２００’を製造するために、ステップ（ａ）および（ｂ）が実行される。より具体的には、ステップ（ａ）では、エラストマー材料製のスタンプ１０”を使用して、微細孔メンブレンがない支持部２０”上に配置された光硬化性および／または熱硬化性液体ＲＬをインプリントする（図７’（ａ））。続いて、ステップ（ｂ）において、液体の光照射および／または加熱が実行され、いくつかの壁を形成する。

続いて、互いに独立に製造された構造２００、２００’が、新たな光照射または新たな加熱によって、互いに結合される。これにより、構造２００と２００’の液体樹脂間に永久結合を形成することができる（図７（ｃ））。

一旦構造が組み立てられると、支持部２０’、２０”のうちの一方２０”が取り除かれ、構造２００、２００’の組立により形成された新たな構造２００”が現れる。続いて、上述したステップ（ｃ）を繰り返すステップが実行される。言い換えると、オリフィス（図示せず）が設けられたカバー２００が、微細孔メンブレン５００とは反対側で、構造２００”の異なる壁３’、３０’上に接着され、マイクロ流体チャネル４０１、４０２を形成する。

続いて、微細孔メンブレン５００に接触している支持部２０’が取り除かれる（図７（ｅ））。この図７（ｅ）には、マイクロ流体チャネル４０１、４０２が示されている。マイクロ流体チャネル４０１とマイクロ流体チャネル４０２は異なる深さを有しており、図９から分かるように平面内でチャネルを重ね合わせることができる

続いて、少なくともベース６と、光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂製の少なくとも二つの第２側壁７ａ、７ｂと、を備えるアセンブリが、上述したステップ（ｄ）にしたがってメンブレン５００上に接着され、チャンバ８を形成する。このアセンブリは、その一部について、図４（ａ）〜図４（ｃ）により支持される上述したステップ（ｅ１）〜（ｅ３）を繰り返す方法を用いて製造することができる。

このようにして得られるマイクロ流体デバイス１０１のマイクロ流体チャネル４０１、４０２の壁は、このデバイスのチャンバ８の壁と同様に、上述したような樹脂を用いて製造することができる。または、変形例として、室温で液体になるように選択された、ポリアクリルアミドゲルなどの光により架橋する水性ゲルを用いて、製造することができる。ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）で樹脂を置き換えてもよい。

図６のマイクロ流体デバイス１０１を動作させるために、マイクロ流体システムにおいて、生細胞などのターゲットを刺激する可能性のある分子を含む流体を、マイクロ流体チャネル４０１、４０２のうち少なくとも一方に供給する少なくとも一つの手段が、マイクロ流体デバイスに関連付けられる。

例えば、各マイクロ流体チャネル４０１、４０２に対して、流体容器などの特定の供給手段（図示せず）を設けてもよい。容器と関連するマイクロ流体チャネルとの間が毛細管によって接続されてもよい。

図８の断面Ａ−Ａに係る、開口部４０１’、４０２’、４０３’、４０４’に供給するチャネル４０１、４０２のみを表す部分斜視図として、マイクロ流体チャネル４０１、４０２が図９に模式的に示されている。この断面は、図７（ａ）〜図７（ｆ）、図７’（ａ）および図７’（ｂ）によって支持される製造方法を説明するために選択された図に対応する。

図９に示す構成によると、一つの供給部で複数の開口部に供給することが可能になるので、接続システムの数を減らして並列実験を行うことができる。

しかしながら、図８に示したような開口部の二次元ネットワークを保持することによって、マイクロ流体チャネルの構成を異なるものとしてもよい。

各チャネルが一つの開口部のみを備え、そのため開口部と同数のチャネルが存在するものも想定可能である。このような場合が図１０に示されている。図１０は、図８の１２個の開口部に関連する１２のマイクロ流体チャネルのうち、４つのチャネル４０１０、４０２０、４０３０、４０４０（それぞれ、開口部４０１０’、４０２０’、４０３０’、４０４０’に関連する）のみを示している。この図１０では、各マイクロ流体チャネルに、ターゲットを刺激するための分子を特に備えることができる専用の流体を供給することができる。

各チャネルへの供給は独立している。さらに、チャネル内に連続する少なくとも二つの流路を有することができるようにするバルブによって、入口で調整することができる。

したがって、適切に形成されたマイクロ流体デバイスは、図２の支持とともに説明したデバイスに対応するデバイスであるが、３以上の流体チャネルを備えている。

これらの条件で、図３（ａ）〜図３（ｃ）の支持とともに説明した製造ステップ、および、適切であれば図３（ｄ）、図４（ａ）〜図４（ｃ）の支持とともに説明したステップをデバイスが繰り返して、チャンバまたは別のマイクロ流体チャネルを形成するような製造方法を理解することができるだろう。

しかしながら、この目的のためには、垂直スロット１’ｃの代わりに、マイクロ流体チャネルを互いに分離する壁を形成するのに適したグリッド状の中空領域を突起１’ａが備えるようにするために、スタンプ１’の形状を修正して、図８の開口部のネットワークを最終的に得られるようにしなければならない。図１１は、図３（ａ）に示したステップに対応するステップにおいて、支持部２”を持つ突起上にこのグリッド状の中空領域１１’ｃを備える適切に修正されたスタンプ１１’を示す。

これは多数の可能性を提供する。

実際、ターゲットを刺激しそうな分子の所望の濃度マップにしたがって、流体を供給するマイクロ流体チャネルを選択することが可能になる。

また、ターゲットを刺激する異なるタイプの分子をマイクロ流体チャネルに供給することが可能になる。このようにして、生細胞培養の空間内で正確かつ可変の制御を実行することができる。

例えば、一つのマイクロ流体チャネルには刺激分子を含む流体を供給し、例えば最初のマイクロ流体チャネルのすぐ隣のもう一つのマイクロ流体チャネルには中性溶液を含む流体を供給することが可能である。続いて、チャンバ８内で流体が混合され、ターゲット細胞がベース上に位置するときに、チャンバのこのベースにおいて極めて特別な濃度マップが形成される。

マイクロ流体チャネル４０１、４０２、４０３、４０４の一方から他方に時間オフセットを持たせて、所望の開口部４０１’、４０２’、４０３’、４０４’を通してターゲットを刺激することも可能である。図８に示す他の開口部にも同様にして供給することができる。

想定可能であるマイクロ流体チャネルの他の構成は、以下の通りである。

ターゲット用の刺激分子を含む流体を循環させる単一のマイクロ流体チャネル（このチャネルは複数の開口部を備える）のみを提供することが実際に可能である。

例えば、４つの開口部を持つ一つのチャネルを備えており、マイクロ流体チャネルがこれら４つの開口部に流体を供給するデバイスの製造が必要なこともある。

チャンバ８も設けられる場合（図１２（ｄ））、このようなデバイスの製造方法が図１２（ａ）〜図１２（ｄ）に示されている。

スタンプ１０１’は、ＰＤＭＳなどのエラストマー材料で作成することができる。スタンプは、製造されるマイクロ流体デバイスの外形と相補的である型として使用される外形を備えている。スタンプ１０１’は、複数の垂直スロット１０１’ｃが設けられた突起１０１’を有しており、マイクロ流体デバイスの異なる壁３０１’を形成する。スタンプ１０１’は、突起１０１’ａを取り囲む中空領域１０１’ｂも有している。この領域には、マイクロ流体デバイスの側壁３００’が形成されることになる。支持部２０１’もＰＤＭＳで作成することができ、平坦な外形を有している。

微細孔メンブレン５００’が最初に支持部２０１’上に配置され、続いてスタンプ１０１’が支持部２０１’に対して押し付けられる。

続いて、スタンプ１０１’と支持部２０１’との間に位置する体積が、例えば光によって架橋可能および／または光によって重合可能である適切な量の液状の樹脂ＲＬで充填される。スタンプ１０１’と支持部２０１’の間に位置する体積に液体樹脂ＲＬが充填された後、スタンプ１０１’に圧力Ｐが付与され余分な樹脂を追い出す。

ステップ（ｂ）の完了時に得られる構造が図３（ｂ）に示されている。

スタンプ１０１’を通して樹脂が照射される。続いて、デバイスからスタンプ１０１’が取り除かれる。図１２（ｂ）では、スタンプ１０１’の中空領域と相補的な外形を持つ、光によって重合した樹脂および／または光によって架橋した樹脂からなる壁３００’、３０１’を観察することができる。

第１側壁３００’のスタンプ１０１’と前に接触していた側に、カバー２００’が固定される。続いて、支持部２０１’を取り除くことができる。このステップの完了時に得られる構造が図１２（ｃ）に示されている。

図４（ａ）〜図４（ｃ）により支持される上述した方法にしたがって、チャンバ８が製造され、続いて図１２（ｃ）に示す構造と組み付けられる。この組立動作が図１２（ｄ）に示されている。

チャネル内の流体の移動方向が、図１２（ｄ）にＦで示されている。メンブレン５００’上に開口する異なる開口部に連続して供給することに注意すべきである。

ここでも、既に提示した様々な材料を想定することができる。チャンバ８の存在は必須ではなく、このチャンバ８の代わりにチャネルを設けることができる。メンブレン５００’は、上述したメンブレン５、５００と同様の特性を有する。

このように、本発明は、孔の水圧直径を的確に選択して、マイクロ流体チャネルから、例えばチャンバまたは別のマイクロ流体チャネルを備えるメンブレンの反対側への流体の通過を回避するメンブレンを実装する。孔の水圧直径は、幅広い範囲にわたることができる。

したがって、本発明は、マイクロ流体チャネルからチャンバまたはこの他のマイクロ流体チャネルへの流体の通過を避けるためのゲル状の培地を必要としない。

したがって、培地内の拡散が、水などの液体培地内で行われる。よって、このチャンバ内の拡散は、ゲルを用いて製造される培地における拡散よりも高速である。これにより、試験をより迅速に実行し、また異なる試験を次々とより迅速に行うことが可能になる。

さらに、本発明に係るデバイスを用いて得られる、刺激分子がターゲットに到達する正確度は優れており、既知のデバイスよりもはるかに良好である。

これは、チャンバ内にゲルが存在しないことに特に関連している。これにより、ゲルの場合に観察される刺激分子の多方向への拡散が制限される。

さらに、本発明に係る方法は、直径が小さく面密度が高い開口部のネットワークの製造を可能にする。典型的に、開口部の寸法は５μｍに達することができ、二つの隣接する開口部の中心間の距離は１０μｍに達することができる。

最後に、開口部の寸法は、微細孔メンブレンの孔の水圧直径とは完全に独立している。このため、大きな孔（例えば３ミクロン）を有する微細孔メンブレンに関連付けて、小さな開口部（例えば３０ミクロン以下のサイズ）を持つマイクロ流体デバイスを製造することができる。また、小さな孔（例えば０．２ミクロン）を有する微細孔メンブレン５００に関連付けて、大きな開口部（例えば２０００ミクロンのサイズ）を持つマイクロ流体デバイスを製造することができる。

これにより、想定される用途に応じて、マイクロ流体デバイスの寸法選択の自由度が広くなる。

本発明は、生細胞を培養、観察、研究する生物学の分野に特に適用される。具体的には、本発明は、例えばニューラルネットワークを形成するために、特定分子に対する神経細胞の遊走反応を決定することができる。また、具体的には、本発明は、化学療法に採用される分子に対するがん細胞の反応を測定することができる。また、バイオチップの製造、組織の刺激、特に人工組織の製造のために、マイクロ流体システムを使用することができる。

本発明に関連する利点は、他の応用分野、例えば美容術における特定の分子の毒性しきい値の決定にも価値がある場合もある。

従来技術に係るマイクロ流体デバイスを表す図である。 本発明にしたがったマイクロ流体システムの部分断面斜視図である。 図３（ａ）ないし図３（ｄ）は、図２に示すマイクロ流体デバイスの製造方法のステップ、またはこの方法の特定のステップの完了時に得られる中間構造を示す図である。 図４（ａ）ないし図４（ｃ）は、デバイスの底壁と側壁とによって形成されるアセンブリの製造中に得られる中間構造を示す図である。上記アセンブリは、図２のマイクロ流体デバイスの一部を形成するよう意図されている。 図５（ａ）は、図２に示す本発明に係るマイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネル内を流れる流体を示す図である。これらの流体のうちの一つは、ターゲット細胞の刺激分子を含む。図５（ｂ）は、図２のデバイスのチャンバ内の刺激分子の濃度プロファイルを示す図である。 本発明にしたがった別のマイクロ流体デバイスの断面図である。 図７（ａ）、図７（ｂ）、図７’（ａ）、図７’（ｂ）および図７（ｃ）〜図７（ｆ）は、図６のマイクロ流体デバイスの製造中のステップ、またはこのマイクロ流体デバイスの製造で得られる中間構造を示す図である。 図６のマイクロ流体デバイスを表す、下側からの部分図である。 各マイクロ流体チャネルが多数の開口部を備えるように構成された、図６のマイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルの斜視図である。 図６の変形例に係るマイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルの上側からの図である。各マイクロ流体チャネルがこのデバイスの微細孔メンブレン上に開口する開口部を備えるように、これらのチャネルが構成される。 図１０に示すデバイスの製造ステップを表す図である。 図１２（ａ）ないし図１２（ｄ）は、本発明にしたがったマイクロ流体デバイスの変形実施形態を製造する方法のステップ、またはこの方法の特定のステップの完了時に得られる中間構造を示す図である。

Claims (14)

1. 例えば一組の生細胞で形成されるターゲットを刺激する可能性がある分子の濃度マップを制御するマイクロ流体システムであって、
   ・ｎ_ｃ≧１のマイクロ流体チャネル（４、４０、４０１、４０２、４０１０、４０２０、４０３０、４０４０）であって、少なくとも一つの流体用の少なくとも一つの入口オリフィスと、この流体用の少なくとも一つの出口オリフィスとが設けられている、マイクロ流体チャネルと、
   ・前記マイクロ流体チャネル内に形成されるか異なるマイクロ流体チャネル内に分配されるｎ_０≧２の開口部（４７’、４７０’、４０１’、４０２’、４０３’、４０４’、４０１０’、４０２０’、４０３０’、４０４０’）であって、一つの同一面内に配置されてこの面内にネットワークを形成する、開口部と、
   を有し、
   前記マイクロ流体チャネルの数ｎ_ｃと、前記開口部の数ｎ_０とは、
   、但し１≦ｉ≦ｎ_ｃ
   の関係式で結び付けられており、ｎ_０／ｃｉは、前記チャネルｃ_ｉに対する開口部の数であり、
   ・前記ターゲットを受け入れるベース（６）を備えるチャンバ（８）または別のマイクロ流体チャネルと、
   ・前記開口部のネットワークを覆う少なくとも一つの微細孔メンブレン（５、５００、５００’）であって、前記ベース（６）は、前記微細孔メンブレンに対して前記チャンバ（８）または前記他のマイクロ流体チャネルの他方の側に配置される前記ターゲットを受け入れるように構成される、微細孔メンブレンと、
   を有するマイクロ流体デバイス（１、１０１）と、
   前記マイクロ流体チャネルに流体（Ｆ_１、Ｆ_２）を供給する流体供給手段であって、これらの流体のうち少なくとも一つが前記ターゲットを刺激する分子を含む、一つまたは複数の流体供給手段と、
   を備え、
   前記供給手段が前記マイクロ流体チャネル（４、４０、４０１、４０２、４０１０、４０２０、４０３０、４０４０）に流体（Ｆ_１、Ｆ_２）のうち少なくとも一つを供給するとき、前記ターゲットを刺激する可能性のある分子が、前記微細孔メンブレン（５、５００、５００’）を通り、前記チャンバ（８）または前記他方のマイクロ流体チャネルを通過した後に拡散し、このチャンバ（８）またはこの他方のマイクロ流体チャネル内で前記ターゲットを刺激する可能性のある分子の前記濃度マップを制御することを特徴とするマイクロ流体システム。
2. 前記微細孔メンブレン（５、５００、５００’）に、水力直径が０．０５μｍ〜１２μｍ、好ましくは０．０５μｍ〜３μｍである孔が設けられることを特徴とする請求項１に記載のマイクロ流体システム。
3. 前記微細孔メンブレン（５、５００、５００’）の孔の面密度が１０^３〜１０^１０個／ｃｍ^２であることを特徴とする請求項１または２に記載のマイクロ流体システム。
4. 微細孔メンブレン（５、５００、５００’）が、ガラス、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート、石英、シリコン、シリカまたはシリコンカーバイドから選択される材料で作成されることを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載のマイクロ流体システム。
5. 前記マイクロ流体チャネルのカバー（２、２００）が設けられ、該カバーは、ガラスまたはシリコン、非エラストマー光架橋ポリマー、金属、導電性合金または半導体合金、セラミック、石英、サファイア、エラストマーから選択される材料で作成されることを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載のマイクロ流体システム。
6. 流体用の前記少なくとも一つの入口オリフィスと前記少なくとも一つの出口オリフィスが前記カバー内に形成されることを特徴とする請求項５に記載のマイクロ流体システム。
7. 前記マイクロ流体チャネルはそれぞれ、光硬化性樹脂または熱硬化性樹脂からなる少なくとも一つの壁を備えることを特徴とする請求項１ないし６のいずれかに記載のマイクロ流体システム。
8. 前記チャンバ（８）または前記他のマイクロ流体チャネルのベース（６）が、光学的に透明な材料で作成されることを特徴とする請求項１ないし７のいずれかに記載のマイクロ流体システム。
9. 前記チャンバまたは前記マイクロ流体チャネルは、光硬化性樹脂および／または熱硬化性樹脂で作成された側壁を備えることを特徴とする請求項８に記載のマイクロ流体システム。
10. 前記マイクロ流体チャネルに供給する複数の手段が設けられ、これらの供給手段はそれぞれ前記マイクロ流体チャネルのうちの一つに供給することを特徴とする請求項１ないし９のいずれかに記載のマイクロ流体システム。
11. 光学観察手段（１８）が設けられることを特徴とする請求項１ないし１０のいずれかに記載のマイクロ流体システム。
12. 前記光学観察手段（１８）は、ＰＡＬＭ（photoactivation localization microscopy）技術またはＳＴＥＤ（stimulated-emission-depletion）顕微鏡技術を実装することを特徴とする請求項１１に記載のマイクロ流体システム。
13. 前記開口部（４７’、４７０’、４０１’、４０２’、４０３’、４０４’）は、その属する平面内に二次元ネットワークを形成することを特徴とする請求項１ないし１２のいずれかに記載のマイクロ流体システム。
14. 二つの隣接する開口部のそれぞれの中心が、１０μｍ〜２５０μｍの距離だけ離れていることを特徴とする請求項１ないし１３のいずれかに記載のマイクロ流体システム。