FR2974360A1 - Systeme microfluidique pour controler une carte de concentration de molecules susceptibles de stimuler une cible - Google Patents

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Abstract

L'invention concerne un système microfluidique pour contrôler une carte de concentration de molécules susceptibles de stimuler une cible, par exemple formée par un ensemble de cellules vivantes, caractérisé en ce que le système comprend : un dispositif microfluidique (1) comportant : • n ≥ 1 canal(aux) microfluidique(s) (4, 40), le ou chaque canal étant muni d'au moins un orifice d'entrée pour au moins un fluide et d'au moins un orifice de sortie pour ce fluide ; • n ≥ 2 ouvertures (47, 470) formées dans le canal microfluidique ou réparties dans les différents canaux microfluidiques, lesdites ouvertures étant agencées dans un même plan de sorte qu'elles forment un réseau à au moins une dimension dans ce plan, les nombres n de canal(ux) microfluidique(s) et n d'ouvertures étant reliés par la relation avec 1 ≤ i ≤ n et no/c le nombre d'ouvertures pour le canal C ; • au moins une membrane microporeuse (5) recouvrant le réseau d'ouvertures, la cible étant destinée à être disposée du côté de la membrane qui est opposé au canal(aux) microfluidique(s); - un ou plusieurs moyen(s) d'alimentation en fluide pour alimenter le ou chaque canal microfluidique en fluide, l'un au moins de ces fluides comportant des molécules pour stimuler la cible.

Description

i
SYSTEME MICROFLUIDIQUE POUR CONTROLER UNE CARTE DE CONCENTRATION DE MOLECULES SUSCEPTIBLES DE STIMULER UNE CIBLE. La présente invention se rapporte au domaine de la 5 microfluidique. La microfluidique met en oeuvre des systèmes de dimensions micrométriques, dont la taille est généralement comprise entre quelques dizaines et quelques centaines de microns. Ces systèmes trouvent application dans de nombreux lo domaines comme les tests de diagnostic cellulaire, le développement de médicaments, la biologie fondamentale ou la cosmétologie. Dans ces domaines, il existe une demande croissante de systèmes microfluidiques pour déterminer quantitativement la réponse de cellules vivantes à certaines molécules et particulièrement, la réponse à une 15 carte de concentration spatialement et temporellement contrôlée. Par exemple, il peut s'agir de mesurer la réponse de cellules cancéreuses à des molécules utilisées pour la chimiothérapie. Pour déterminer avec précision cette réponse, il est nécessaire d'exercer un contrôle sur l'application des molécules qui vont engendrer cette réponse. Ce 20 contrôle peut concerner la quantité de molécules interagissant avec les cellules cancéreuses, la carte de concentration des molécules auxquelles les cellules cancéreuses sont soumises, l'évolution dans le temps de la quantité de ces molécules et/ou de la carte de concentration de ces molécules appliquées aux cellules cancéreuses, etc. 25 Dans le domaine de la cosmétologie, des systèmes microfluidiques peuvent servir à des tests de toxicité de certaines molécules sur des cellules vivantes et/ou des tissus cellulaires. Le contrôle de la quantité de molécules, éventuellement toxiques, administrée aux cellules et la façon dont ces molécules sont administrées est nécessaire pour déterminer le seuil 30 de toxicité.
Un exemple de système microfluidique largement utilisé pour stimuler des cellules vivantes est présenté dans le document US 7 374 906. Ce système microfluidique permet notamment de soumettre les cellules vivantes à un gradient de concentration de molécules, dont la carte est ici un profil linéaire, stable dans le temps. Un inconvénient majeur de ce type de système microfluidique est que les cellules vivantes sont soumises à un flux générant des forces de cisaillement les perturbant. Cet effet de cisaillement est particulièrement gênant lorsque l'on cherche à étudier la réponse chimiotactique du cône de lo croissance de cellules nerveuses. En effet, le flux génère des contraintes de cisaillement qui modifient la réponse des cellules cibles dans le meilleur des cas, voire qui provoquent la mort ou l'arrachement des cellules. Le comportement physiologique des cellules vivantes ainsi étudiées est perturbé avec le système divulgué dans ce document. is Des solutions ont donc été proposées pour soumettre des cellules vivantes à une carte de concentration de molécules et/ou à des combinaisons de plusieurs cartes de concentration de molécules différentes, sans qu'elles soient perturbées par un flux. Un tel système microfluidique est par exemple présenté dans 20 l'article « Microfluidic device for the combinatorial application and maintenance of dynamically imposed diffusional gradients », R.L. Smith & al., (2010) 9 : 613-622. Ce système microfluidique comprend un dispositif microfluidique 100 et des moyens (non représentés) pour alimenter le 25 dispositif avec des fluides. Le dispositif microfluidique 100 divulgué dans ce document est représenté sur la figure 1, selon une vue en perspective éclatée. Il comprend une structure en PDMS dans laquelle sont formés plusieurs canaux d'alimentation en fluide 130a, 130b, 130c, 130d 30 indépendants les uns des autres.
La paroi supérieure 120 de chacun de ces canaux 130a, 130b, 130c, 130d comporte un ou plusieurs orifice(s) 110 traversant cette paroi. Du côté de la paroi 120 opposé aux canaux microfluidiques, se situe une chambre de culture 140 pour des cellules vivantes remplie d'un milieu de culture 150 se présentant sous la forme d'un gel, tel que l'agarose. La paroi 120 forme donc une membrane, dans la mesure où elle permet de séparer deux milieux, à savoir les canaux microfluidiques 130a, 130b, 130c, 130d, dans lesquels un fluide est destiné à circuler, et la chambre de culture 140. Io Une plaque en verre 160 permet de fermer la chambre de culture 140, dans sa partie supérieure. Les moyens d'alimentation des fluides ne sont pas représentés. Il faut cependant noter qu'un ou plusieurs fluide(s) peut être introduit dans chacun des canaux 130a, 130b, 130c, 130d, ces fluides 15 comprenant des molécules destinées à stimuler les cellules vivantes, en traversant la paroi 120 en PDMS via les orifices de diffusion 110. Pour contrôler la culture des cellules vivantes dans l'espace, il est possible, avec le dispositif microfluidique 100, de choisir les canaux dans lesquels est envoyé un fluide comportant des molécules de stimulation des 20 cellules vivantes. On peut ainsi choisir avec précision les orifices 110 à partir desquels ces molécules diffuseront dans la chambre de culture 140. Par ailleurs, pour contrôler la culture des cellules vivantes dans le temps, il est possible de décaler dans le temps l'alimentation en fluide des différents canaux 130a, 130b, 130c, 130d. 25 Le dispositif 100 présente également une grande souplesse dans le choix des molécules de stimulation pouvant être utilisées, dans la mesure où chacun des canaux d'alimentation en fluide 130a, 130b, 130c, 130d prévoit un moyen d'alimentation qui lui est propre. Ce système microfluidique présente cependant plusieurs 30 inconvénients.
II nécessite l'emploi d'une chambre de culture 140 comportant un milieu de culture 150 sous forme de gel pour éviter le passage du fluide depuis les canaux d'alimentation en fluide vers la chambre de culture. Dans le cas d'espèce, le dispositif effectivement fabriqué et testé présente des orifices carrés de 20µm x 20µm. Ces dimensions sont relativement importantes et favorisent le passage du fluide vers la chambre de culture 140. Les auteurs précisent que des orifices 110 carrés de dimensions plus faibles, par exemple de 41am x 41.tm, pourraient être envisagés. Pour autant, la technique de fabrication employée (DRIE) est connue pour ne pas permettre la formation d'orifices au-dessous d'un rapport d'aspect maximal, typiquement de 1 : 20, ce rapport d'aspect étant ici défini par le ratio entre la dimension du côté de l'orifice sur la profondeur de cet orifice. Pour une dimension donnée du côté d'un orifice 110, ce rapport d'aspect maximal limite la profondeur de l'orifice et donc la résistance hydraulique que peut conférer cet orifice. On augmente donc le risque de passage de fluide d'un canal 130a, 130b, 130c, 130d vers la chambre de culture 140. Quelle que soit la taille des orifices, on comprend donc que le 20 fluide passerait vers la chambre de culture 140 en l'absence d'un milieu de culture 150 sous forme de gel. Il convient par ailleurs de noter que la présence indispensable du gel apporte des inconvénients dans le fonctionnement du dispositif microfluidique 100. 25 En effet, le gel ralentit la diffusion des molécules de stimulation vers les cellules vivantes ciblées. Ainsi, la stabilisation de la carte de concentration de ces molécules de stimulation au sein de la chambre de culture 140 est lente. De plus, il convient de noter que les molécules de stimulation 30 diffusent dans toutes les directions dans le gel.
En conséquence, pour chaque orifice 110 pris indépendamment des autres, les molécules de stimulation se répartissent, au niveau d'une cible située dans le gel, sur une surface plus grande que la surface de passage d'un orifice 110 situé dans la paroi 120. La stimulation de la cible par des molécules spécifiques est donc moins précise qu'elle ne l'est théoriquement avec un choix préalable pour le dimensionnement des orifices. Au niveau de la cible, on perd donc en résolution spatiale, par rapport à la résolution spatiale théoriquement fournie par les dimensions d'un orifice. En outre, il convient de noter que les orifices de diffusion 110 lo présentent une certaine densité surfacique à la surface de la paroi 120, qui peut difficilement être augmentée. Dans le cas d'espèce, la distance entre deux orifices voisins réalisés dans la paroi 120 en PDMS est comprise entre 3001,tm et 4001.tm. Or, la densité des orifices 110 susceptible d'être obtenue avec 15 le procédé de fabrication employé dans cet article est limitée. En effet, la méthode DRIE employée dans cet article pour fabriquer le dispositif microfluidique présente des limites concernant la densité des canaux microfluidiques pouvant être obtenue. Chacun de ces canaux microfluidiques débouchant, par conception, sur un seul orifice 110, il en résulte que la 20 densité surfacique des orifices 110 est en conséquence également limitée. Cet inconvénient s'ajoute au fait que la précision de la stimulation d'une cible théoriquement fournie par les dimensions d'un orifice n'est pas celle qui est réellement obtenue au niveau de la cible. Un objectif de l'invention est de pallier l'un au moins de ces 25 inconvénients. Pour atteindre cet objectif, l'invention propose un système microfluidique pour contrôler une carte de concentration de molécules susceptibles de stimuler une cible, par exemple formée par un ensemble de cellules vivantes, caractérisé en ce que le système comprend : 30 - un dispositif microfluidique comportant : - nc 1 canal(aux) microfluidique(s), le ou chaque canal étant muni d'au moins un orifice d'entrée pour au moins un fluide et d'au moins un orifice de sortie pour ce fluide ; - no >_ 2 ouvertures formées dans le canal microfluidique ou réparties dans 5 les différents canaux microfluidiques, lesdites ouvertures étant agencées dans un même plan de sorte qu'elles forment un réseau dans ce plan, les nombres nc de canal(ux) microfluidique(s) et no d'ouvertures étant reliés par la relation no = > 1 no/ci avec 1 i <_ ne et no/ci le nombre d'ouvertures pour le canal Ci (le terme > correspond à l'opérateur lo « somme »); - au moins une membrane microporeuse recouvrant le réseau d'ouvertures, la cible étant destinée à être disposée du côté de la membrane qui est opposé au canal(aux) microfluidique(s); - un ou plusieurs moyen(s) d'alimentation en fluide pour alimenter le ou is chaque canal microfluidique en fluide, l'un au moins de ces fluides comportant des molécules pour stimuler la cible. Le système pourra prévoir d'autres caractéristiques techniques, prises seules ou en combinaison : - la membrane microporeuse est munie de pores dont le diamètre 20 hydraulique est compris entre 0,051,tm et 12µm, de préférence entre 0,051.tm et 3µm ; - la densité surfacique des pores de la membrane microporeuse est comprise entre 103 et 1010 pores/cm2 ; - la membrane microporeuse est réalisée en un matériau choisi parmi : le 25 verre, le polycarbonate, le polyester, le polyéthylène téréphtalate, le quartz, le silicium, la silice ou le carbure de silicium ; - il est prévu un couvercle pour les canaux microfluidiques, ledit couvercle étant réalisé en un matériau choisi parmi : du verre ou du silicium, un polymère photoréticulé non élastomérique, un métal, un alliage conducteur 30 électrique ou semi-conducteur, une céramique, du quartz, du saphir, un élastomère ;
- ledit au moins un orifice d'entrée et ledit au moins un orifice de sortie pour les fluides sont formés dans le couvercle ; - les canaux microfluidiques comprennent chacun au moins une paroi en résine photodurcie et/ou thermodurcie ; - il est prévu une chambre de culture de ladite cible, fermée, ou un canal microfluidique, disposé du côté de la membrane microporeuse qui est opposé au(x) canal(aux) microfluidique(s), la cible étant ainsi située dans la chambre ou ledit un autre canal microfluidique ; - la chambre ou le canal microfluidique comprend une base réalisée en un io matériau optiquement transparent, cette base étant disposée de l'autre côté de la chambre ou du canal microfluidique, par rapport à la membrane microporeuse ; - la chambre ou le canal microfluidique comprend des parois latérales en résine photodurcie et/ou thermodurcie ; 15 - il est prévu une pluralité de moyens pour alimenter les canaux microfluidiques, chacun de ces moyens d'alimentation alimentant l'un des canaux microfluidiques ; - il est prévu un moyen de visualisation optique ; le moyen de visualisation optique met en oeuvre une technique de 20 microscopie de localisation par photoactivation ou une technique de microscopie de déplétion par émission stimulée ; - les ouvertures forment un réseau à deux dimensions dans le plan auquel elles appartiennent ; - les centres respectifs de deux ouvertures voisines sont séparés d'une 25 distance comprise entre 101lm et 2501.1m. D'autres caractéristiques, buts et avantages de l'invention seront énoncés dans la description détaillée ci-après faite en référence aux figures suivantes : - la figure 2 est un schéma d'un dispositif microfluidique conforme à 30 l'invention, selon une vue en perspective partiellement coupée;
- les figures 3(a) à 3(d) représentent, selon le cas, des étapes d'un procédé de fabrication du dispositif microfluidique représenté sur la figure 2 ou des structures intermédiaires obtenues à l'issue de certaines étapes de ce procédé ; - les figures 4(a) à 4(c) représentent des structures intermédiaires obtenues lors de la fabrication d'un ensemble formé par une base et des parois latérales du dispositif, ledit ensemble étant destiné à former une partie du dispositif microfluidique de la figure 2 ; - la figure 5(a) représente des fluides s'écoulant dans les canaux io microfluidiques du dispositif microfluidique selon l'invention représenté sur la figure 2, l'un de ces fluides comportant des molécules de stimulation pour les cellules cibles et la figure 5(b) représente un profil de concentration de molécules de stimulation dans une chambre du dispositif de la figure 2 ; - la figure 6 représente un autre dispositif microfluidique conforme à 15 l'invention, selon une vue en coupe ; - les figures 7(a), 7(b), 7'(a), 7'(b) et 7(c) à 7(f) représentent des étapes de fabrication du dispositif microfluidique de la figure 6 ou des structures intermédiaires obtenues dans la fabrication de ce dispositif microfluidique ; - la figure 8 est un schéma représentant le dispositif microfluidique de la 20 figure 6, selon une vue de dessous partielle ; - la figure 9 représente, selon une vue en perspective, des canaux microfluidiques du dispositif microfluidique de la figure 6, lesquels sont agencés de sorte que chaque canal microfluidique comprenne plusieurs ouvertures ; 25 - la figure 10 représente, selon une vue de dessus, des canaux microfluidiques d'un dispositif microfluidique selon une variante de la figure 6, ces canaux étant agencés de sorte que chaque canal microfluidique comprenne une ouverture débouchant sur une membrane microporeuse de ce dispositif ; 30 - la figure 11 représente une étape de fabrication du dispositif représenté sur la figure 10 ; - les figures 12(a) à 12(d) représentent, selon le cas, des étapes d'un procédé de fabrication d'une variante de réalisation d'un dispositif microfluidique conforme à l'invention ou des structures intermédiaires obtenues à l'issue de certaines étapes de ce procédé. s Tout d'abord, nous présentons à l'appui de la figure 2, un dispositif microfluidique 1 conforme à l'invention comportant deux canaux microfluidiques, chacun de ces canaux étant muni d'ouvertures débouchant sur la membrane, ainsi que son procédé de fabrication à l'appui des figures 3(a) à 3(d) et 4(a) à 4(c). i0 Ce dispositif microfluidique 1 comprend un couvercle 2, avantageusement rigide, muni d'orifices 21, 22 pour la circulation de fluides dans des canaux microfluidiques, une paroi latérale 3 et une paroi centrale 30, toutes deux avantageusement réalisées en résine photodurcie et/ou thermodurcie. En particulier, la paroi latérale 3 du dispositif 1 est réalisée dans is une seule couche de résine photodurcie et/ou thermodurcie. Le dispositif microfluidique 1 comprend également, dans sa partie inférieure, deux ouvertures 47, 470 recouvertes par une membrane microporeuse 5 s'étendant transversalement à la base de la paroi latérale 3 et de la paroi centrale 30. Par ouverture 47, 470, on entend la surface 20 d'extrémité du canal qui s'étend entre les parois du dispositif et qui est destinée à être recouverte par la membrane 5. Les ouvertures 47, 470 sont agencées dans un même plan et peuvent être assimilées à un réseau d'ouvertures, en l'occurrence à une dimension, dans ce plan. Dans le cadre de l'invention, le terme de « réseau » 25 d'ouvertures désigne simplement le fait qu'il existe plusieurs ouvertures, sans qu'il y ait nécessairement un lien entre ces ouvertures et/ou un agencement spécifique de ces ouvertures dans le plan auquel elles appartiennent. Par exemple, sur la figure 1, les ouvertures 47, 470 sont alimentées par deux canaux microfluidiques différents et nécessairement 30 disposées en ligne dans un même plan. En revanche, dans d'autres modes de réalisation qui sont décrits ci-après, certaines ouvertures peuvent être i0
alimentées par un même canal, les ouvertures étant par ailleurs agencées en deux dimensions dans un même plan. Les parois 3, 30 et le couvercle 2 permettent de définir deux canaux microfluidiques 4, 40, fermés au niveau de leurs ouvertures 47, 470 respectives par la membrane microporeuse 5. L'entrée de fluide pour chacun de ces canaux 4, 40 correspond respectivement à l'orifice 21 ou 22. Les sorties de fluide pour ces canaux microfluidiques ne sont pas représentées. La membrane microporeuse 5 sépare deux milieux, à savoir le canal microfluidique et le milieu extérieur de ce canal, ce milieu extérieur étant io par exemple formé par une chambre de culture 8 dans laquelle la cible à stimuler est destinée à être disposée. A cet égard, il convient de noter que le gel employé dans l'article de Smith & al. n'est pas une membrane, car elle ne sépare pas le canal microfluidique et la chambre de culture, mais forme au contraire un milieu de culture remplissant la chambre de culture. 15 De plus, la membrane microporeuse 5 empêche le fluide destiné à s'écouler dans les canaux microfluidiques 4, 40 de passer de l'autre côté de cette membrane, cette dernière laissant cependant diffuser les molécules susceptibles de stimuler la cible, qui sont susceptibles d'être transportées par le fluide dans l'un au moins des canaux microfluidiques 4, 40 20 comme cela sera détaillé dans la suite de la description. Le dispositif 1 selon l'invention ne nécessite pas la présence d'un gel dans la chambre de culture 8. Le dispositif microfluidique 1 comprend également une base 6, avantageusement rigide et transparente, et des parois 25 latérales 7a, 7b, avantageusement réalisées en résine photodurcie et/ou thermodurcie. Ces parois latérales 7a, 7b, la base 6 et la membrane microporeuse permettent de former la chambre 8. Pour former la chambre 8, quatre parois latérales sont prévues, ces parois pouvant en réalité être assimilées à un seul contour, car le procédé de fabrication réalise 30 avantageusement ces parois d'un seul tenant.
Le fond de la chambre 8 est formé par la face supérieure 61 de la base 6, laquelle est destinée à recevoir la cible par exemple formée de cellules vivantes. Dans ce cas, les cellules vivantes sont destinées à être disposées à l'écart de la membrane microporeuse 5, sur la base 6 de la chambre 8. Elles peuvent ainsi être cultivées dans des conditions standard, séparément du dispositif microfluidique 1. Les canaux microfluidiques 4, 40 permettent de faire circuler un fluide comportant des molécules susceptibles de stimuler la cible. Ceci s'effectue, comme cela sera expliqué de façon plus détaillée dans la suite de la description, par diffusion à travers la membrane microporeuse 5 vers la chambre 8, puis par diffusion à travers la chambre 8 (chambre de culture) au fond duquel se trouve, par exemple, des cellules vivantes (CV) qu'on cherche à stimuler. Avantageusement, la base 6 est réalisée en un matériau optiquement transparent, par exemple du verre. Ceci est intéressant, car il est alors possible de disposer un moyen de visualisation optique 18 à l'extérieur du dispositif pour visualiser, par exemple, la réponse à une stimulation des cellules vivantes disposées au fond de la chambre 8. Le couvercle 2 peut être réalisé en un matériau choisi parmi : 20 du verre ou du silicium, un polymère photoréticulé non élastomérique, un métal, un alliage conducteur électrique ou semi-conducteur, une céramique, du quartz, du saphir, un élastomère. La membrane microporeuse 5 est choisie pour éviter tout passage de fluide entre les canaux mircrofluidiques 4, 40 et la chambre 8. En 25 réalité, la membrane microporeuse 5 ne peut pas être totalement étanche à un passage de fluide. Aussi, on peut considérer que les cellules situées dans la chambre 8 ne sont soumises à aucun flux si la vitesse de traversée du fluide à travers la membrane microporeuse 5 est inférieure à une valeur limite. On peut par exemple considérer que cette vitesse limite est 30 de l'ordre 1µm/s. Dans ce cas, les contraintes de cisaillement appliquées aux cellules sont négligeables.
Par ailleurs, la vitesse dans chaque canal microfluidique 4, 40 peut être comprise entre 100µm/s et 1000011m/s, voire être au-delà de 10 000 µm/s. Aussi, pour obtenir la valeur limite de 1µm/s, la résistance hydraulique Rh,membrane de la membrane microporeuse 5 doit être, selon la vitesse du fluide dans le canal 4, 40 de 100 à 10 000 fois supérieure à la résistance hydraulique Rh, canal du canal microfluidique 4, 40. Par exemple, si la vitesse d'écoulement du fluide dans le canal microfluidique 4, 40 est de 10000µm/s, alors il faut respecter l'inégalité : 10 000*Rh, canal < Rh,membrane
pour s'assurer que la vitesse du fluide à travers la membrane 5 est bien inférieure à la valeur limite considérée de 1 µrem/s. Par ailleurs, si on considère un canal microfluidique 4, 40 rectangulaire de hauteur h, de largeur w et de longueur L, et une membrane microporeuse 5 d'épaisseur e et présentant des pores identiques et cylindriques de rayon rp0fe, avec une densité surfacique de pores p, alors la relation (R1) s'écrit sous la forme: 10 000*p.L/ (w.h3) < p.e/(rpore4. p. Lw) (R2) soit : 0 = rpore4.p/e < 10-4* h3/L2 (R3)
25 Pour un canal microfluidique 4, 40 de hauteur h = 100 µm, de largeur w = 1 000 µm et de longueur L = 1 000 lim alors le terme 0 doit être inférieur à 10-10 m pour respecter la relation (R3). De plus, si on considère des pores cylindriques de rayon de 1 µm et une épaisseur de membrane de 10 µm, alors la densité surfacique de pores p doit être inférieure 30 à 1 05 pores/cm2. 20
La relation (R3) peut bien entendue être généralisée en fonction de la valeur considérée de la vitesse limite du fluide passant à travers la membrane microporeuse 5 d'une part, et de la vitesse d'écoulement de ce fluide dans le canal microfluidique 4, 40 d'autre part.
La membrane microporeuse 5 pourra présenter des pores dont le diamètre hydraulique est compris entre 0,05 pm et 12 pm. En particulier, si le pore est cylindrique alors, le diamètre hydraulique du pore correspond à son diamètre. Avantageusement, ce diamètre hydraulique sera cependant compris entre 0,05 pm et 3pm. En effet, il convient de noter que l'utilisation d'une membrane avec des pores dont le diamètre hydraulique est inférieur à 31.tm évitera tout passage de flux dans la chambre 8, pour la plupart des conditions d'utilisation susceptibles d'être rencontrées. Actuellement, les fabricants de membranes proposent sur le marché des membranes dont le diamètre hydraulique des pores est généralement supérieur à 0,2 pm. Dans le cadre de l'invention, les pores pourront donc présenter des diamètres hydrauliques avantageusement compris entre 0,2 pm et 3pm. Cependant, il n'y a en théorie pas de limite inférieure pour le diamètre hydraulique des pores, ce qui explique pourquoi il est envisageable de mettre en oeuvre des pores dont le diamètre hydraulique atteint 0,05 pm. Si des pores dont le diamètre hydraulique est supérieur à 3µm sont utilisés, l'utilisation du dispositif microfluidique est a priori plus délicate (par exemple dans le choix des débits d'écoulement dans le canal microfluidique 4, 40) pour s'assurer que le fluide ne traverse pas la membrane microporeuse 5. II convient cependant de noter que l'augmentation de ce diamètre hydraulique s'accompagne d'une diminution du nombre de pores de la membrane associé à chacune des ouvertures 47, 470 recouvertes par la membrane 5. Or, cette diminution du nombre de pores de la membrane par ouverture favorise l'augmentation de la résistance hydraulique à travers chaque ouverture du dispositif microfluidique.
Pour cette raison, il est envisageable d'utiliser des pores dont le diamètre hydraulique va au-delà de 3µm en limitant la plage envisageable des débits de fluide dans les canaux microfluidiques. Dans le dispositif de Smith & al., une ouverture correspond obligatoirement à un et un seul orifice de diffusion car il n'y a aucune membrane telle que celle proposée dans l'invention. En conséquence, la résistance hydraulique dépend du diamètre de l'orifice lui-même dans le dispositif de Smith & al. La mise en oeuvre d'une membrane microporeuse 5 présente 10 donc un réel avantage, puisqu'elle permet de s'affranchir d'un gel et des inconvénients que ce gel implique. La densité des pores de la membrane microporeuse 5 peut quant à elle être comprise entre 103 et 1010 pores/cm2. La hauteur des pores peut être comprise entre 50 nm et 100 µm. 15 Par ailleurs, la membrane microporeuse 5 peut être réalisée dans divers matériaux tels que le verre, le quartz, le silicium, la silice ou le carbure de silicium ou encore des polymères de même nature que les polymères susceptibles d'être employés pour le reste du dispositif microfluidique. On peut ainsi employer du polycarbonate, du polyester ou du 20 polyéthylène téréphtalate. Selon un premier exemple, on peut prévoir une membrane microporeuse 5 en polycarbonate, dont le diamètre des pores est compris entre 0,2 µm et 1 µm, par exemple de type cyclopore de la société Whatman (Whatman CycloporeTM). Selon un deuxième exemple, on peut prévoir une 25 membrane microporeuse 5 en polyester, dont le diamètre des pores est compris entre 0,4 µm et 3 µm, par exemple de type Transwell de la société Corning (Corning® Transwell®). Selon un troisième exemple, on peut prévoir une membrane microporeuse 5 en polyéthylène téréphtalate, dont le diamètre des pores est compris entre 0,4 µm et 8 µm, par exemple de type « Track- 30 Etched » de la société Becton Dickinson.
Ces membranes microporeuses présentent l'avantage d'être compatibles avec un procédé de fabrication du dispositif microfluidique 1, qui est décrit ci-après en référence aux figures 3(a) à 3(d). Elles présentent également l'avantage d'être biocompatibles et fonctionnalisables pour être spécifiquement perméables à des molécules variées. Par fonctionnalisable, on entend que la membrane microporeuse 5 peut être modifiée chimiquement pour remplir une fonction particulière (rétention de certaines espèces, réactions chimiques,...). De manière générale, le dispositif pourra présenter les io dimensions suivantes. La hauteur h du canal microfluidique peut être comprise entre 1 µm et 1 000 µm, avantageusement entre 10 µm et 200 µm. Sa largeur (non représentée) peut être comprise entre 10 lm et 2 mm. La hauteur h' de la chambre 8 peut être comprise 10 µm et 1 000 µm, avantageusement entre 50 µm et 200 µm. Par ailleurs, la distance entre 15 l'entrée E et la sortie S est de quelques centimètres. Un moyen de visualisation optique 18 peut être associé au dispositif microfluidique, comme mentionné précédemment. Ce moyen de visualisation optique 18 permet de connaître la carte de concentration des molécules stimulantes appliquée aux cellules cibles. Il permet également de 20 réaliser une imagerie fonctionnelle de la réponse biologique des cellules aux molécules de stimulation. Il est donc beaucoup plus aisé d'effectuer expérimentalement des corrélations entre le comportement observé des cellules cibles et la carte de concentration qui leur est appliquée. Cette observation peut s'effectuer à haute résolution spatiale 25 car la base en matériau optiquement transparent peut être très fine. Par exemple, on peut réaliser de la microscopie de fluorescence de haute résolution, voire même de super-résolution, avec des techniques telles que la microscopie de localisation par photoactivation (PALM pour « Photo-Activated Localized Microscopy » selon la terminologie anglo-saxonne) ou la 30 microscopie de déplétion par émission stimulée (STED pour « STimulated-
Emission-Depletion » selon la terminologie anglo-saxonne), en utilisant par exemple une base formée avec une lamelle de verre de 150 µm d'épaisseur. Un exemple de procédé de fabrication du dispositif microfluidique 1 selon l'invention est un procédé qui comporte au moins les étapes consistant à: (a) utiliser un timbre 1' en un matériau élastomérique pour imprimer un liquide photodurcissable et/ou thermodurcissable placé sur un support 2' muni de la membrane microporeuse 5 ; (b) photo-irradier et/ou chauffer le liquide pour former d'une part, une io première paroi latérale 3 fermée à sa base par la membrane microporeuse 5 et d'autre part, une paroi centrale 30 en contact avec la membrane 5 ; (c) coller le couvercle 2 muni d'orifices (non représentés) sur la première paroi latérale 3 et sur la paroi centrale 30, du côté opposé au support 2' 15 pour former des canaux microfluidiques 4, 40 dans chacun desquels un fluide peut circuler; (d) après avoir retiré le support 2', coller sur les parties de la première paroi latérale 3 et de la paroi centrale 30 rendues accessibles par le retrait du support 2', un ensemble comprenant au moins la base 6 et 20 lesdites au moins deux deuxièmes parois latérales 7a, 7b en résine photodurcie et/ou thermodurcie, pour former la chambre 8. Ce procédé s'appuie sur le procédé divulgué dans le document WO 2008/009803. L'opération effectuée lors de l'étape (a) est représentée sur la 25 figure 3(a). Le timbre 1' utilisé lors de l'étape (a) peut être réalisé en matériau élastomère tel que le PDMS. Il comporte un profil utilisé comme moule complémentaire de celui du dispositif microfluidique 1 que l'on veut produire. Le timbre 1' comporte ainsi une protubérance l'a munie d'une fente 30 verticale 1'c pour former la paroi centrale 30 du dispositif microfluidique 1 que l'on souhaite obtenir. II comporte également une zone creuse 1'b entourant la
protubérance l'a, zone dans laquelle ladite première paroi latérale 3 du dispositif microfluidique 1 est destinée à être formée. Le support 2' peut également être réalisé en PDMS et présente un profil plan. La membrane microporeuse 5 est préalablement disposée sur le support 2', puis le timbre 1' est pressé contre le support 2'. Le timbre 1' coince ainsi la membrane 5 contre le support 2' par l'intermédiaire de la protubérance l'a. Ensuite, on remplit le volume situé entre le timbre 1' et le support 2' en quantité appropriée, notamment dans la zone creuse 1'b du timbre 1' et dans la fente réalisée dans la protubérance l'a, par exemple avec de la résine photoréticulable et/ou photopolymérisable sous forme liquide RL. Ce remplissage ne modifie pas la position de la membrane microporeuse 5, car cette dernière est coincée entre le timbre 1' et le support 2'. La résine photoréticulable et/ou photopolymérisable est une solution ou une dispersion à base de monomères et/ou de pré-polymères. On utilise dans le procédé de l'invention des résines photoréticulables et/ou photopolymérisables habituellement utilisées comme adhésifs, colles ou revêtements de surface. Avantageusement, on choisit des adhésifs, colles ou revêtements de surface habituellement employés dans le domaine optique. De telles résines, lorsqu'elles ont été irradiées et photoréticulées et/ou photopolymérisées, deviennent solides. De préférence, le solide ainsi formé est transparent, dépourvu de bulles ou de toute autre irrégularité. De telles résines sont généralement à base de monomères/comonomères/pré-polymères de type époxy, époxysilane, acrylate, méthacrylate, acide acrylique, acide méthacrylique, mais on peut encore citer des résines thiolène, polyuréthane, uréthane-acrylate. Les résines peuvent être remplacées par des gels aqueux photoréticulables comme des gels de polyacrylamide et elles sont choisies pour être liquides à la température ambiante. Les résines peuvent également être remplacées par du polydiméthylsiloxane (PDMS).
Parmi les résines photoréticulables utilisables dans la présente invention, on peut citer les produits commercialisés par la société Norland Optics sous la marque NOA® Norland Optical Adhesives, comme par exemple les produits NOA81 et NOA60, les produits commercialisés par la société Dymax dans la gamme « Dymax Adhesive and light curing systems », les produits commercialisés par la société Bohle dans la gamme « UV adhesives », les produits commercialisés par la société Sartomer sous les références commerciales SR492 et SR499. La polymérisation et/ou la réticulation de ces résines io s'effectue par photoactivation à l'aide de tout moyen approprié, tel qu'une irradiation par des rayonnements U.V., visible, I.R. On choisit préférentiellement une résine qui, une fois polymérisée et/ou réticulée, est rigide et non souple, car les résines élastomériques ont tendance à se déformer lorsque l'on fait circuler des is fluides sous pression dans le dispositif microfluidique 1. Toutefois, pour certaines applications, comme l'étude de l'élasticité de cellules vivantes, l'utilisation de résines photoréticulables élastomériques n'est pas exclue. Après le remplissage du volume situé entre le timbre 1' et le support 2' avec de la résine liquide RL, on applique alors une pression P au 20 timbre 1' pour chasser d'éventuels excès de résine. Sur la figure 2, les parties saillantes et notamment la protubérance 1'a du timbre 1' en élastomère sont au contact du support 2'. La résine liquide prend la forme des zones creuses du timbre 1'. La structure obtenue à l'issue de l'étape (b) est représentée 25 sur la figure 3(b). Lors de l'étape (b), l'irradiation de la résine est faite dans l'axe perpendiculaire à la base du dispositif, au travers du timbre 1'. L'irradiation doit être dosée de façon, si on le souhaite, à laisser sur la superficie de la première paroi latérale 3 et de la paroi centrale 30 en résines, des sites de 30 polymérisation et/ou de réticulation actifs. Puis, le timbre 1' est ôté du dispositif. Sur la figure 3(b), on observe la première paroi latérale 3 en résine photo-polymérisée et/ou photo-réticulée, de profil complémentaire de celui des zones creuses du timbre 1'. Sur cette même figure, on observe également la paroi centrale 30, qui permet de séparer les canaux microfluidiques 4, 40. L'impression à l'aide d'un timbre 1' en élastomère dans une s résine à l'état liquide permet d'obtenir des structures de très petites tailles avec une très bonne résolution. On fixe alors, lors de l'étape (c), le couvercle 2 comportant des orifices pour la circulation de fluide dans les canaux microfluidiques 4, 40, du côté de ladite première paroi latérale 3 précédemment en contact avec le 10 timbre 1'. Le support 2' peut alors être retiré. La structure obtenue à l'issue de l'étape (c) est représentée sur la figure 3(c), sans les orifices du couvercle, qui sont situés dans un autre plan. Le retrait du support 2' s'effectue sans que la membrane microporeuse ne se décolle de la résine photo-polymérisée et/ou photo- 15 réticulée, et sans qu'elle soit arrachée ou partiellement déchirée. Le couvercle 2 peut être réalisé avec du verre, du silicium, un film de polymère solide, un métal, un alliage conducteur ou semi-conducteur, une céramique, du quartz, du saphir, un élastomère. De préférence, on choisit une lamelle de verre, un film de 20 polymère ou une lamelle de silicium. Les matériaux utilisés pour former le couvercle 2 sont choisis en fonction de l'application qui sera faite du dispositif microfluidique 1. Ainsi, un couvercle 2 en matériau optiquement transparent, comme le verre, est plus approprié pour faciliter l'observation, la détection 25 optique (transparence). Un autre atout du verre est sa très bonne conductivité thermique qui permet d'effectuer un chauffage homogène des dispositifs. Il convient de noter que la disposition de la membrane microporeuse 5 en partie inférieure du canal microfluidique 4 rend son utilisation compatible avec les protocoles standards de culture de cellules 30 vivantes. En effet, il est alors envisageable que la base 6 soit une lamelle de verre sur laquelle s'effectue une culture de cellules vivantes, cette lamelle
étant ensuite fixée sur la structure obtenue à l'issue de l'étape (c) pour former la chambre 8 (chambre de culture), comme cela est expliqué dans la suite de la description. Il convient de noter que le procédé de fabrication décrit précédemment peut permettre la fabrication d'ouvertures dont les dimensions atteignent 5µm, avec un pas (distance entre les centres respectifs de deux ouvertures voisines) entre deux ouvertures voisines pouvant être aussi faible que 10µm, et donc notamment compris entre 10µm et des valeurs inférieures à 300µm, comme cela est mentionné dans l'article de Smith & al. En particulier, le pas peut être compris entre 10µm et 250µm. L'ensemble comprenant une base 6 et deux deuxièmes parois latérales 7a, 7b peut être réalisé à partir des étapes de procédé suivantes : (el) utiliser un moule 3' ouvert en matériau élastomérique présentant une face de support 3'a et une cavité 3'b destinée à recevoir une résine liquide RL photodurcissable et/ou thermodurcissable ; (e2) disposer la base 6 sur la face de support 3'a du moule 3' ; (e3) disposer un masque 4' sur la base 6, puis photo-irradier ou chauffer pour former lesdites deuxièmes parois latérales 7a, 7b. La structure obtenue à l'issue des étapes (el) à (e3) est 20 représentée sur la figure 4(a), dans le cas où l'étape (e3) consiste en une photo-irradiation de la résine liquide. Le moule 3', comme le timbre 1' et le support 2', peut être réalisé en un élastomère tel que le PDMS. La résine liquide photodurcissable et/ou thermodurcissable 25 utilisée pour ces étapes peut être choisie parmi les possibilités déjà décrites pour la résine liquide employée lors de l'étape (a). De préférence, les résines liquides employées pour les étapes (a) et (el) à (e3) sont les mêmes. En variante, on pourrait utiliser des gels aqueux photoréticulables tels que ceux décrits précédemment ou du polydiméthylsiloxane (PDMS). 30 La base 6 peut être choisie parmi les matériaux employés pour le couvercle. Avantageusement, on pourra utiliser un matériau
optiquement transparent pour faciliter la visualisation optique par un dispositif dédié. Ce matériau optiquement transparent peut notamment être du verre, la base 6 formant ainsi un couvercle de verre usuellement utilisé pour la culture de cellules vivantes (CV). L'utilisation du verre permet par ailleurs de profiter des traitements de surfaces chimiques et biologiques existant pour ce substrat. Le masque 4' peut présenter des orifices 4'a, 4'b permettant de photo-irradier des zones précises de la résine liquide afin de former lesdites deuxièmes parois latérales 7a, 7b du dispositif microfluidique. io Une fois l'étape (e3) terminée, il ne reste plus qu'à retirer le masque 4' et le moule 3' lors d'une étape (e4) pour ne laisser que l'ensemble formé par lesdites deuxièmes parois latérales 7a, 7b et la base 6. Cet ensemble est représenté sur la figure 4(b). Généralement, une étape (e5) est alors effectuée, celle-ci 15 consistant à rincer ledit ensemble, par exemple par un mélange éthanol/acétone dans des proportions volumiques 90/10. Ce rinçage permet de retirer toute la résine non photo-irradiée ou non chauffée susceptible de rester sur la base 6. Puis, on effectue une culture de cellules vivantes (CV) avant 20 que cet ensemble ne soit disposé avec la structure obtenue à l'issue de l'étape (c) et avant de commencer l'étape (d). Pour cela, cet ensemble doit être biocompatible. A cet effet, on peut photo-irradier fortement cet ensemble, par exemple par UV, puis effectuer un rinçage énergique dans une solution 25 neutre, telle que l'eau pendant plusieurs heures. En variante, il est possible de fabriquer les chambres, ou plus généralement les différents éléments du dispositif, avec des matériaux biocompatibles. Enfin, une culture de cellules vivantes peut alors être 30 effectuée sur la face supérieure 61 de la base 6, comme représenté sur la figure 4(c). Cette culture s'effectue dans des conditions standards. En particulier, cette culture peut s'effectuer sur une base 6 se présentant sous la forme d'une lamelle de verre classique. Une fois cette culture terminée, l'étape (d) peut être réalisée. L'opération effectuée lors de l'étape (d) est représentée sur la 5 figure 3(d). Une fois l'étape (d) réalisée, le dispositif microfluidique 1 est prêt à l'emploi. Il comprend notamment des cellules vivantes sur la face supérieure 61 de la base 6, laquelle est opposée à la membrane microporeuse 5 au sein de la chambre 8 (chambre de culture). io Pour faire fonctionner le dispositif microfluidique 1, celui-ci est associé, au sein d'un système microfluidique, à au moins un moyen pour alimenter au moins l'un des canaux microfluidiques 4, 40 avec un fluide comprenant des molécules susceptibles de stimuler une cible, telles que des cellules vivantes. 15 Par exemple, on peut prévoir deux réservoirs de fluide indépendants, l'un pour alimenter le canal microfluidique 4 avec un fluide FI comprenant des molécules de stimulation pour la cible, l'autre pour alimenter le deuxième canal microfluidique 40 avec un fluide neutre F2. Un exemple de canaux microfluidiques 4, 40 susceptibles 20 d'être utilisés avec ces réservoirs est schématisé sur la figure 5(a), selon une vue de dessus. Le fluide FI est introduit dans le canal microfluidique 4 par l'entrée E4, et ressort de ce canal 4 par la sortie S4. Le fluide F2 est quant à lui introduit dans le canal microfluidique 40 par l'entrée E40, et ressort de ce 25 canal 40 par la sortie S40. Les deux canaux microfluidiques 4, 40 sont bien entendus séparés par la paroi centrale 30 du dispositif microfluidique 1. La séparation effectuée par la paroi centrale 30 permet de recycler les fluides circulant dans chacun des canaux microfluidiques 4, 40, car aucun mélange ne peut s'effectuer entre ces fluides. De plus, grâce à 30 cette séparation, les vitesses d'écoulement des fluides peuvent s'étendre dans une large gamme de valeurs, par exemple entre 100 µm/s et 10 000 µm/s, voire plus, sans risquer un mélange hydrodynamique des deux fluides sous l'effet de forces de cisaillement. En outre, une différence de vitesse de circulation des fluides entre les différents canaux est envisageable sans que cela engendre un quelconque problème de fonctionnement du dispositif. Les fluides FI, F2 diffèrent seulement par la présence, dans l'un des deux fluides et en faible concentration, de molécules de stimulation pour les cellules cibles. Il convient de noter que les entrées E4, E40 sont à rapprocher lo des orifices d'entrées 21, 22 de la figure 2. La figure 5(b) schématise l'écoulement des fluides FI, F2 dans les différentes parties du dispositif microfluidique, lequel est schématisé selon une vue de coupe verticale. Chaque fluide FI, F2 est donc destiné à s'écouler dans l'un 15 des canaux microfluidiques 4, 40 du dispositif microfluidique 1, tous deux au contact de la membrane microporeuse 5, mais pas dans la chambre 8 (chambre de culture). La carte de concentration de ces molécules dans les canaux 4, 40 est représenté par le courbe Cl, en escalier. Le transport des molécules (contenues dans le fluide FI) 20 susceptibles de stimuler les cellules vivantes, entre le canal microfluidique 4 et lesdites cellules installées sur la base 6 de la chambre 8, s'effectue alors par diffusion dans la chambre 8, à travers la membrane microporeuse 5. Plus précisément, le transport de ces molécules s'effectue d'abord par diffusion à travers la membrane microporeuse 5, puis par diffusion 25 à travers la chambre 8, pour enfin atteindre la face supérieure 61 de la base 6 de la chambre 8, face 61 sur laquelle les cellules vivantes sont situées. La carte de concentration doit alors se stabiliser dans la chambre 8. En particulier, au niveau de la base 6 de la chambre 8, le temps de stabilisation tstab est de l'ordre de h'2/D où h' est la hauteur de la chambre 8 3o et D le coefficient de diffusion des molécules destinées à stimuler les cellules cibles dans la chambre 8. Il convient de noter que pour éviter des temps de
stabilisation trop élevés, la hauteur de la chambre sera généralement limitée à 500 µm. La carte de concentration ainsi stabilisée dans la chambre 8 est représentée par la courbe C2, laquelle présente la forme d'une courbe représentative d'une fonction de type « erf ». Avec cette alimentation des canaux microfluidiques, il est donc possible d'obtenir une carte de concentration bien particulière à la base de la chambre 8 et par suite, sur les cellules vivantes qu'on cherche à stimuler. L'alimentation décrite ci-dessus à l'appui des figures 5(a) lo et 5(b) n'est qu'un exemple donné à titre illustratif. Ainsi, l'alimentation en fluide des canaux microfluidiques pourrait être effectuée différemment afin d'obtenir d'autres types de cartes de concentration sur les cellules cibles. Ainsi, selon un autre exemple, on pourrait prévoir un moyen d'alimentation permettant d'alimenter chacun des deux canaux 15 microfluidiques 4, 40 avec les fluides FI et F2, afin d'obtenir des cartes de concentration plus complexes dans la chambre 8. La chambre 8, fermée, peut être remplacée par un canal microfluidique comprenant des orifices, avantageusement latéraux, bien qu'aucun fluide n'est alors destiné à s'écouler dans ce canal microfluidique 20 lorsqu'un test est en cours. Toutefois, on peut connecter des canaux aux orifices latéraux pour récupérer les sécrétions des cellules vivantes, dans le but de les analyser chimiquement. Par ailleurs, entre deux tests, on peut alors envisager un rinçage rapide ou un changement de milieu de culture. Par ailleurs, il convient de noter qu'on pourrait également 25 disposer les cellules cibles non pas sur la base de la chambre 8 ou du canal microfluidique, mais sur la membrane microporeuse 5 elle-même. Dans un tel cas, la carte de concentration obtenue au niveau des cellules cibles correspond à la carte de concentration générée dans les canaux microfluidiques 4, 40. En effet, dans ce cas, les cellules cibles sont situées du 30 côté de la membrane 5, qui est opposé au côté en contact avec les fluides qui s'écoulent dans les canaux microfluidiques 4, 40.
Par ailleurs, on peut même fabriquer un dispositif microfluidique 1 sans chambre ou sans canal microfluidique, les cellules cibles étant placées directement sur la membrane microporeuse 5. Dans ce cas, on comprend que les étapes (el) à (e3) décrites précédemment ne sont pas requises pour la fabrication du dispositif. Nous allons maintenant décrire un autre dispositif microfluidique conforme à l'invention à l'appui des figures 6 et 8 ainsi qu'un procédé de fabrication de ce dispositif à l'appui des figures 7(a), 7(b), 7'(a), 7'(b) et 7(c) à 7(f). lo Le dispositif microfluidique 101 représenté sur la figure 6 comprend plusieurs canaux microfluidiques 401, 402 comprenant chacun plusieurs ouvertures 401', 402' d'une part et 403', 404' d'autre part qui débouchent sur la membrane microporeuse 500. En l'occurrence, il est prévu deux canaux microfluidiques alimentant pour l'un 401, les six ouvertures 15 représentées en blanc sur la figure 8 et pour l'autre 402, les six ouvertures représentées en noir sur cette figure 8. Ces ouvertures 401', 402', 403', 404' sont agencées dans un même plan P, de sorte à former un réseau d'ouvertures qui est à deux dimensions dans ce plan. Le plan P est représenté sur la figure 6 ainsi que sur la figure 8, cette dernière représentant 20 lesdites ouvertures en vue de dessous au niveau de ce plan P. La membrane microporeuse 500 s'étend transversalement par rapport aux parois latérales des différents canaux microfluidiques pour recouvrir les différents canaux dans leurs parties inférieures et donc recouvrir les différentes ouvertures. 25 Avantageusement, la membrane microporeuse 500 recouvre l'ensemble desdites ouvertures 401', 402', 403', 404' des canaux microfluidiques 401, 402. Cela permet de recouvrir les différentes ouvertures avec une seule membrane, ce qui est particulièrement pratique lorsque le réseau d'ouvertures est dense. Typiquement, le procédé selon l'invention peut 30 permettre de fabriquer des ouvertures de 5µm, séparées l'une de l'autre d'un pas de 10 µm. Le pas est ici défini comme la distance séparant les centres respectifs de deux ouvertures voisines. La membrane microporeuse 500 est munie de pores. Les caractéristiques de cette membrane 500 peuvent être les mêmes que la membrane 5 du dispositif microfluidique 1 décrit précédemment à l'appui des figures 2, 3(a) à 3(d) et 4(a) à 4(c). Le dispositif microfluidique 101 comprend également un couvercle 200 pour les canaux microfluidiques. Ce couvercle 200 peut être réalisé en un matériau choisi parmi : du verre ou du silicium, un polymère Io photoréticulé non élastomérique, un métal, un alliage conducteur électrique ou semi-conducteur, une céramique, du quartz, du saphir, un élastomère. Les orifices d'entrée et de sortie pour les fluides destinés à circuler dans les canaux microfluidiques 401, 402 peuvent être formés dans ce couvercle 200 (non représentés). 15 Le diamètre hydraulique des pores de la membrane microporeuse 500 empêche les fluides s'écoulant dans les canaux microfluidiques 401, 402 de traverser cette membrane 500, seules les molécules susceptibles de stimuler la cible la traversant. A cet égard, il convient de se reporter aux relations (R1) à (R3) fournies précédemment et 20 au choix de la vitesse limite en dessous de laquelle on considère que la membrane ne laisse pas passer le fluide s'écoulant dans les canaux microfluidiques 401, 402. La carte de concentration de ces molécules de stimulation est alors générée par le choix de l'alimentation en fluide de chacun des différents 25 canaux microfluidiques 401, 402. Comme cela peut être constaté sur la représentation de la figure 8 (la membrane microporeuse 500 n'est pas représentée), les ouvertures 401', 402', 403', 404' débouchant sur la membrane microporeuse 500 forment des zones de diffusion pour les molécules de stimulation, que l'on peut assimiler à des pixels fournissant une 30 information chimique à la cible.
Le dispositif microfluidique 101 prévoit avantageusement une chambre de culture 8, fermée, pour ladite cible. Cette chambre est ainsi disposée du côté de la membrane microporeuse 500 qui est opposé aux premiers canaux microfluidiques 401, 402. La chambre présente des s caractéristiques similaires à celles de la chambre 8 du dispositif microfluidique 1 décrit précédemment, ses dimensions devant cependant être adaptées. Ainsi, la membrane microporeuse 500 s'étend transversalement entre les parois latérales de la chambre pour fermer ladite io chambre dans sa partie supérieure. La cible peut être disposée sur la base 61 de la chambre 8, base 61 qui est disposée de l'autre côté de la chambre 8, par rapport à la membrane microporeuse 500. En variante, il est tout à fait envisageable de disposer la cible 15 dans la chambre 8, directement sur la membrane microporeuse 500, voire même de disposer la cible directement sur la membrane microporeuse, en l'absence de toute chambre. Là encore, la chambre de culture 8 peut être remplacée par un canal microfluidique comprenant des orifices, avantageusement latéraux, 20 aucun fluide n'étant cependant destiné à s'écouler dans ce canal. Un moyen de visualisation optique tel que le moyen 18 décrit précédemment et représenté sur la figure 2, peut également être associé au dispositif microfluidique 101, en particulier si la base de la chambre 8 ou du canal microfluidique est optiquement transparente. 25 Le procédé de fabrication du dispositif microfluidique 101 s'appuie sur des étapes similaires aux étapes (a) à (d) décrites précédemment pour le dispositif microfluidique représenté sur la figure 2, en l'adaptant. Les étapes (a) et (b) sont ainsi mises en oeuvre pour réaliser 30 la structure 200 représentée sur la figure 7(b). Lors de l'étape (a), on utilise donc le timbre 10' en un matériau élastomérique pour imprimer un liquide RL
photodurcissable et/ou thermodurcissable placé sur un support 20' muni de la membrane microporeuse 500 (fig. 7(a)). Puis, lors de l'étape (b), on réalise une photo-irradiation et/ou un chauffage du liquide pour former plusieurs parois avec la membrane microporeuse 500.
De manière analogue, les étapes (a) et (b) sont mises en oeuvre pour réaliser une autre structure 200' représentée sur la figure 7'(b). Plus précisément, on utilise lors de l'étape (a) le timbre 10" en un matériau élastomérique pour imprimer un liquide RL photodurcissable et/ou thermodurcissable placé sur un support 20", en l'absence de toute membrane lo microporeuse (fig. 7'(a)). Puis, lors de l'étape (b), on réalise une photo- irradiation et/ou un chauffage du liquide pour former plusieurs parois. Ensuite, les structures 200', 200" qui ont été réalisées indépendamment l'une de l'autre sont assemblées l'une à l'autre, par le biais d'une nouvelle photo-irradiation ou d'un nouveau chauffage. Ceci permet de ls créer une liaison permanente entre les résines liquides des structures 200' et 200" (Fig. 7(c)). Une fois l'assemblage réalisé, on retire l'un 20" des supports 20', 20" pour faire apparaître une nouvelle structure 200" formé par l'assemblage des structures 200, 200'. Puis, on effectue une étape reprenant 20 l'étape (c) décrite précédemment. En d'autres termes, on colle ainsi un couvercle 200 muni d'orifices (non représentés) sur les différentes parois 3', 30' de la structure 200", du côté opposé à la membrane microporeuse 500, pour former les canaux microfluidiques 401, 402. On retire ensuite le support 20 au contact de la membrane 25 microporeuse 500 (Fig. 7(e)). Sur cette figure 7(e), les canaux microfluidiques 401, 402 apparaissent. On note que le canal microfluidique 401 d'une part, et le canal microfluidique 402 d'autre part, ont des profondeurs différentes ce qui permet de superposer les canaux dans un plan, comme cela peut être visualisé sur la figure 9. 30 Puis, on colle sur la membrane 500, conformément à l'étape (d) décrite précédemment, un ensemble comprenant au moins la
base 6 et lesdites au moins deux deuxièmes parois latérales 7a, 7b en résine photodurcie et/ou thermodurcie pour former la chambre 8. Cet ensemble est quant à lui fabriqué avec un procédé reprenant les étapes (el) à (e3) décrites précédemment à l'appui des figures 4(a) à 4(c).
Il convient de noter que les parois des canaux microfluidiques 401, 402 du dispositif microfluidique 101 ainsi obtenu, ainsi que les parois de la chambre 8 de ce dispositif peuvent être réalisées avec des résines telles que décrites précédemment ou, en variante, avec des gels aqueux photoréticulables, comme des gels de polyacrylamide, choisis pour io être liquides à la température ambiante. Les résines peuvent également être remplacées par du polydiméthylsiloxane (PDMS). Pour faire fonctionner le dispositif microfluidique 101 de la figure 6, celui-ci est associé, au sein d'un système microfluidique, à au moins un moyen pour alimenter au moins l'un des canaux microfluidiques 401, 402 15 avec un fluide comprenant des molécules susceptibles de stimuler une cible, telles que des cellules vivantes. Par exemple, on peut prévoir un moyen d'alimentation (non représenté) propre tel qu'un réservoir de fluide pour chaque canal microfluidique 401, 402. La connexion entre le réservoir et le canal 20 microfluidique associé peut s'effectuer par un capillaire. Les canaux microfluidiques 401, 402 sont schématisés sur la figure 9, selon une vue en perspective partielle qui ne représente que les canaux 401, 402 alimentant les ouvertures 401', 402', 403', 404' selon la vue de coupe A-A de la figure 8, coupe qui correspond également à la vue choisie 25 pour décrire le procédé de fabrication à l'appui des figures 7(a) à 7(f), 7'(a) et 7'(b). L'agencement représenté sur la figure 9 permet de paralléliser les expériences avec un nombre réduit de connectiques, dans la mesure où une alimentation va permettre d'alimenter plusieurs ouvertures.
Toutefois, l'agencement des canaux microfluidiques peut être différent, en conservant un réseau d'ouvertures à deux dimensions tel que celui qui est représenté sur la figure 8. Ainsi, on peut envisager que chaque canal ne comporte qu'une seule ouverture, si bien qu'il existe autant de canaux que d'ouvertures. Un tel cas est représenté sur la figure 10, laquelle ne représente que quatre canaux 4010, 4020, 4030, 4040 (associés respectivement à une ouverture 4010', 4020', 4030', 4040') sur les douze canaux microfluidiques associés aux douze ouvertures de la figure 8. Sur cette figure 10, chaque io canal microfluidique peut être alimenté par un fluide dédié, pouvant notamment comporter des molécules pour stimuler la cible. L'alimentation de chaque canal est ainsi indépendante. Par ailleurs, elle peut alors être modulée en entrée par des vannes permettant de faire passer au moins deux fluides successivement dans le canal. 15 Le dispositif microfluidique ainsi formé est donc un dispositif comparable au dispositif décrit à l'appui de la figure 2. Il comporte cependant plus de deux canaux microfluidiques. Dans ces conditions, on comprend que le procédé de fabrication d'un tel dispositif reprendra les étapes de fabrication décrites à 20 l'appui des figures 3(a) à 3(c) et, le cas échéant, l'étape décrite à l'appui des figures 3(d), 4(a) à 4(c) pour former une chambre ou un autre canal microfluidique. A cet effet, il faut cependant modifier la forme du timbre 1' afin que la protubérance l'a comprenne, à la place de la fente verticale 1'c, une 25 zone creuse en forme de grille apte à former les parois séparant les canaux microfluidiques les uns des autres, pour finalement obtenir le réseau d'ouvertures de la figure 8. On a représenté, sur la figure 11, le timbre 11' ainsi modifié comportant cette zone creuse en forme de grille 11'c sur la protubérance avec le support 2", lors de l'étape correspondant à l'étape 30 représentée sur la figure 3(a). Ceci offre de nombreuses possibilités.
En effet, il est possible de choisir les canaux microfluidiques à alimenter en fluide, en fonction de la carte souhaitée de concentration en molécules susceptibles de stimuler la cible. Il est également possible d'alimenter des canaux microfluidiques avec différents types de molécules stimulant la cible. Par ce biais, on peut effectuer un contrôle précis et varié dans l'espace de la culture de cellules vivantes. Par exemple, il est possible d'alimenter un canal microfluidique avec un fluide comportant des molécules de stimulation et un autre canal microfluidique, par exemple immédiatement attenant au premier canal microfluidique, avec un fluide comportant une solution neutre. Les fluides se mélangent alors dans la chambre 8 pour former une carte de concentration bien particulière au niveau de la base de la chambre, lorsque les cellules cibles sont situées sur cette base.
Il est également possible de stimuler la cible par l'ouverture 401', 402', 403', 404' souhaitée avec un décalage dans le temps d'un canal microfluidique 401, 402, 403, 404 à l'autre. Les autres ouvertures représentées sur la figure 8 peuvent alors être alimentées de la même façon. Un autre agencement envisageable des canaux microfluidiques est le suivant. II est en effet possible de ne prévoir qu'un seul canal microfluidique dans lequel circule un fluide comportant des molécules de stimulation pour la cible, ce canal comportant plusieurs ouvertures. Par exemple, on peut souhaiter fabriquer un dispositif comportant un canal avec quatre ouvertures, le canal microfluidique alimente donc en fluide ces quatre ouvertures. Un procédé de fabrication d'un tel dispositif est présenté à l'appui des figures 12(a) à 12(d), dans le cas où une chambre 8 est par ailleurs prévue (figure 12(d)).
Le timbre 101' peut être réalisé en matériau élastomère tel que le PDMS. II comporte un profil utilisé comme moule complémentaire de
celui du dispositif microfluidique que l'on veut produire. Le timbre 101' comporte ainsi une protubérance 101'a munie de plusieurs fentes verticales 101'c pour former les différentes parois 301' du dispositif microfluidique. II comporte également une zone creuse 101'b entourant la protubérance 101'a, zone dans laquelle la paroi latérale 300' du dispositif microfluidique est destinée à être formée. Le support 201' peut également être réalisé en PDMS et présente un profil plan. La membrane microporeuse 500' est préalablement disposée sur le support 201', puis le timbre 101' est pressé contre le support 201'. lo Ensuite, on remplit le volume situé entre le timbre 101' et le support 201' en quantité appropriée, par exemple avec de la résine photoréticulable et/ou photopolymérisable sous forme liquide RL. Après le remplissage du volume situé entre le timbre 101' et le support 201' avec de la résine liquide RL, on applique alors une pression P au timbre 101' pour 15 chasser d'éventuels excès de résine. La structure obtenue à l'issue de l'étape (b) est représentée sur la figure 3(b). La résine est irradiée au travers du timbre 101'. Puis, le timbre 101' est ôté du dispositif. Sur la figure 12(b), on observe les 20 parois 300', 301' en résine photo-polymérisée et/ou photo-réticulée, de profils complémentaires aux zones creuses du timbre 101'. On fixe alors le couvercle 200', du côté de ladite première paroi latérale 300' précédemment en contact avec le timbre 101'. Le support 201' peut alors être retiré. La structure obtenue à l'issue de cette 25 étape est représentée sur la figure 12(c). La chambre 8 est fabriquée selon le procédé précédemment décrit à l'appui des figures 4(a) à 4(c), puis assemblé avec la structure représentée sur la figure 12(c). Cette opération d'assemblage est représentée sur la figure 12(d).
Le sens du parcours du fluide dans le canal est noté F sur la figure 12(d). On note qu'il alimente successivement les différentes ouvertures débouchant sur la membrane 500'. Là encore, les différents matériaux déjà présentés précédemment peuvent être envisagés. La présence de la chambre 8 n'est pas obligatoire, un canal pouvant notamment être prévu à la place de cette chambre 8. La membrane 500' présentera les mêmes caractéristiques que les membranes 5, 500 décrites précédemment. L'invention met ainsi en oeuvre une membrane dont le lo diamètre hydraulique des pores est judicieusement choisi pour éviter le passage du fluide depuis les canaux microfluidiques vers le côté opposé de la membrane, comprenant par exemple la chambre ou un autre canal microfluidique. Le diamètre hydraulique des pores peut par ailleurs s'étendre dans une large gamme. is L'invention ne nécessite donc aucun milieu de culture sous forme de gel pour éviter le passage de fluide depuis les canaux microfluidiques vers la chambre ou cet autre canal microfluidique. La diffusion dans la chambre de culture s'effectue donc dans un milieu de culture liquide, tel que l'eau. Cette diffusion dans la chambre est 20 donc plus rapide que dans un milieu de culture réalisée avec un gel. Ceci permet d'effectuer un test plus rapidement et d'enchaîner également différents tests plus rapidement. Par ailleurs, la précision avec laquelle des molécules de stimulation atteigne une cible obtenue avec le dispositif selon l'invention est 25 excellente, et bien meilleure qu'avec les dispositifs connus. Ceci est notamment lié à l'absence de gel dans la chambre, ce qui limite la diffusion multidirectionnelle des molécules de stimulation constatée avec ce gel. De plus, le procédé selon l'invention permet de fabriquer un 30 réseau d'ouvertures de faibles dimensions, avec une densité surfacique élevée. Typiquement, la dimension des ouvertures peut atteindre 5µm et la
distance entre les centres respectifs de deux ouvertures voisines peut atteindre 101_tm. Enfin, le dimensionnement des ouvertures est totalement indépendant du diamètre hydraulique des pores de la membrane microporeuse. Ainsi, il est possible de fabriquer un dispositif microfluidique avec de petites ouvertures (taille de 30 microns ou moins par exemple), associées à une membrane microporeuse présentant de grands pores (3 microns par exemple). Il est également possible de fabriquer un dispositif microfluidique avec de grandes ouvertures (taille de 2000 microns io par exemple), associées à une membrane microporeuse 500 présentant de petits pores (0,2 micron par exemple). Cela laisse une grande liberté de choix dans le dimensionnement du dispositif microfluidique, en fonction de l'application envisagée.
15 L'invention trouve en particulier application dans le domaine de la biologie, pour la culture, l'observation et l'étude de cellules vivantes. En particulier, on peut déterminer la réponse chimiotactique de cellules nerveuses à certaines molécules, par exemple afin d'élaborer des réseaux neuronaux. En particulier également, on peut mesurer la réponse de cellules 20 cancéreuses à des molécules employées pour la chimiothérapie. On peut également utiliser le système microfluidique pour la fabrication de biopuces ou pour la stimulation de tissus, notamment pour la réalisation de tissus artificiels. Les avantages liés à l'invention peuvent être intéressants pour 25 d'autres domaines d'application, par exemple pour déterminer des seuils de toxicité de certaines molécules en cosmétologie. 30

Claims (8)

  1. REVENDICATIONS1. Système microfluidique pour contrôler une carte de concentration de molécules susceptibles de stimuler une cible, par exemple formée par un ensemble de cellules vivantes, caractérisé en ce que le système comprend : - un dispositif microfluidique (1, 101) comportant : - no >_ 1 canal(aux) microfluidique(s) (4, 40, 401, 402, 4010, 4020, 4030, 4040), le ou chaque canal étant muni d'au moins un orifice 10 d'entrée pour au moins un fluide et d'au moins un orifice de sortie pour ce fluide ; - no >_ 2 ouvertures (47, 470, 401', 402', 403', 404', 4010', 4020', 4030', 4040') formées dans le canal microfluidique ou réparties dans les différents canaux microfluidiques, lesdites ouvertures 15 étant agencées dans un même plan de sorte qu'elles forment un réseau dans ce plan, les nombres no de canal(ux) microfluidique(s) et no d'ouvertures étant reliés par la relation no = rnc1 no/oi avec 1 i no et no/oi le nombre d'ouvertures pour le canal Ci ; 20 - au moins une membrane microporeuse (5, 500, 500') recouvrant le réseau d'ouvertures, la cible étant destinée à être disposée du côté de la membrane qui est opposé au canal(aux) microfluidique(s); un ou plusieurs moyen(s) d'alimentation en fluide pour alimenter 25 le ou chaque canal microfluidique en fluide, l'un au moins de ces fluides comportant des molécules pour stimuler la cible.
  2. 2. Système microfluidique selon l'une des revendications précédentes, dans lequel la membrane microporeuse (5, 500, 500') est munie de 30 pores dont le diamètre hydraulique est compris entre 0,05µm et 14m, de préférence entre 0,051.t,m et 3µm.
  3. 3. Système microfluidique selon la revendication précédente, dans lequel la densité surfacique des pores de la membrane microporeuse (5, 500, 500') est comprise entre 103 et 1010 pores/cm2.
  4. 4. Système microfluidique selon l'une des revendications précédentes, dans lequel la membrane microporeuse (5, 500, 500') est réalisée en un matériau choisi parmi : le verre, le polycarbonate, le polyester, le polyéthylène téréphtalate, le quartz, le silicium, la silice ou le carbure de silicium. i0
  5. 5. Système microfluidique selon l'une des revendications précédentes, dans lequel il est prévu un couvercle (2, 200) pour les canaux microfluidiques, ledit couvercle étant réalisé en un matériau choisi parmi : du verre ou du silicium, un polymère photoréticulé non 15 élastomérique, un métal, un alliage conducteur électrique ou semi-conducteur, une céramique, du quartz, du saphir, un élastomère.
  6. 6. Système microfluidique selon la revendication précédente, dans lequel ledit au moins un orifice d'entrée et ledit au moins un orifice de sortie 20 pour les fluides sont formés dans le couvercle.
  7. 7 Système microfluidique selon l'une des revendications précédentes, dans lequel les canaux microfluidiques comprennent chacun au moins une paroi en résine photodurcie et/ou thermodurcie. 25
  8. 8. Système microfluidique selon l'une des revendications précédentes, dans lequel il est prévu une chambre (8) de culture de ladite cible, fermée, ou un autre canal microfluidique, disposé du côté de la membrane microporeuse (5, 500, 500') qui est opposé au(x) canal(aux) 30 microfluidique(s), la cible étant ainsi située dans la chambre (8) ou ledit un autre canal microfluidique.9. Système microfluidique selon la revendication précédente, dans lequel la chambre (8) ou le canal microfluidique comprend une base réalisée en un matériau optiquement transparent, cette base étant disposée de l'autre côté de la chambre ou du canal microfluidique, par rapport à la membrane microporeuse (500). 10. Système microfluidique selon l'une des revendications 8 ou 9, dans lequel la chambre ou le canal microfluidique comprend des parois latérales en résine photodurcie et/ou thermodurcie. 11. Système microfluidique selon l'une des revendications précédentes, dans lequel il est prévu une pluralité de moyens pour alimenter les canaux microfluidiques, chacun de ces moyens d'alimentation alimentant l'un des canaux microfluidiques. 15 12. Système microfluidique selon l'une des revendications précédentes, dans lequel il est prévu un moyen de visualisation optique (18). 13. Système microfluidique selon la revendication précédente, dans lequel 20 le moyen de visualisation optique (18) met en oeuvre une technique de microscopie de localisation par photoactivation ou une technique de microscopie de déplétion par émission stimulée. 14. Système microfluidique selon l'une des revendications précédentes, 25 dans lequel les ouvertures (47', 470', 401', 402', 403', 404') forment un réseau à deux dimensions dans le plan auquel elles appartiennent. 15. Système microfluidique selon l'une des revendications précédentes, dans lequel les centres respectifs de deux ouvertures voisines sont 30 séparés d'une distance comprise entre 101am et 2501am.10
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