CN104450670B - 一种提高宿主细胞产酶活性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及农业、食品、医药卫生及环境工程行业中利用宿主细胞生产各类酶制品制剂的技术领域，具体涉及一种提高宿主细胞产酶活性的方法，它采用如下的技术方案：先采用摇瓶培养，在1 m³发酵罐培养发酵培养基，培养结束后采用对发酵菌及酶液施加直流电压0.1‑5V/cm，直流电流1‑120分钟；它在发酵工程细胞的产酶的过程中，对发酵产生的细胞及酶液混合物应用直流电场刺激，可明显提高细胞产酶活力20%～30%，且操作工艺简单，可控性强，适宜于大批量发酵生产，可有效降低应用细胞工程生产饲料、食品、医药卫生等工业用酶的生产成本，节约能源和资源，社会经济效益显著，符合国家关于发酵工业节能降耗的绿色发展趋势。

Description

一种提高宿主细胞产酶活性的方法

技术领域

本发明涉及农业、食品、医药卫生及环境工程行业中利用宿主细胞生产各类酶制品制剂的技术领域，具体涉及一种提高宿主细胞产酶活性的方法。

背景技术

酶作为生物催化剂，已广泛地应用于农业、食品、医药卫生产业的各个生产领域。随着酶工程不断的技术性突破，在工业、农业、医药卫生、能源开发及环境工程等方面得到越来越广泛的应用。如食品加工工业中常用到的淀粉酶、乳糖酶、纤维素酶、蛋白酶等 ；医药卫生领域用到的白介素、各类表皮生长因子、胰酶、胶原蛋白酶 ；饲料工业中用到的植酸酶、环境工程中用到的等。

直流电场的作用主要有电荷作用、极化作用、热学效应、化学效应和生物效应等。直流电场作用下可增加细胞膜透性，促进分泌细胞向外分泌酶类。此外，已有研究表明直流电场具有众多的细胞效应。如促进伤口愈合修复、改变高尔基体排列方式、促进植物根尖组织生长等一系列的特殊生物学效应。

对于生物大分子蛋白质，直流电场施加于溶液时产生电荷效应（改变蛋白质表面电荷分布），温升效应（电能转换为热能），自由基效应，微流效应等，可以有效地改变蛋白质的二级、三级和更高级的构象。直流电场作用于酶分子时，释放的能量可导致酶分子的构象和结构发生变化， 从而影响到催化活性的变化。

综上所述，直流电场具有促进细胞分泌、改变蛋白质三级结构的作用，同时电场具有高效、廉价、无污染、易施加等特点，因此，直流电场的作用在酶工程上的应用将为食品、医药卫生等领域带来广阔应用前景。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供一种结构简单，设计合理、使用方便的一种提高宿主细胞产酶活性的方法，它在发酵工程细胞的产酶的过程中，对发酵产生的细胞及酶液混合物应用直流电场刺激，从而实现促进细胞产酶活性的提高。

本发明所述的一种提高宿主细胞产酶活性的方法，它采用如下的技术方案：

步骤一：摇瓶培养，采用如下的方法步骤：

（1）250 mL 的锥形瓶中装摇瓶培养基 50 mL，从斜面上接种一环种子，放置于旋转式摇床上在 26℃下培养 120 h，摇床转速 220 r ／ min，得发酵培养基；

（2）将发酵培养基 ( 按 18 L 装液量 ) 配好并装入发酵罐内，121℃下灭菌 30min，冷却至 26℃后接种 1 个茄型瓶种子 ( 用无菌水将菌种刮下 )，搅拌转速 500 r ／min，通风量 1VVM；

（3）1 m³ 发酵罐培养：将放大发酵培养基 ( 按 60％装液量 ) 配好并装入罐内，121℃下灭菌 30 min，冷却至 26℃后接种 3 个茄型瓶种子 ( 用无菌水将菌种刮下 )，搅拌转速 200r ／ min，通风量 1 VVM；

步骤二 ：直流电刺激，采用如下方法步骤：

（1）发酵培养周期结束后，对发酵菌及酶液施加直流电压 0.1-5V/cm，直流电流1-120分钟；

（2）其产酶水平能从未施加电场时的 5000 IU ／ mL 达到 6000 IU/mL；

步骤三 ：脂肪酶酶活的测定，采用如下方法步骤 ：

（1）采用橄榄油乳化液测定法，配制 2％ ( W ／ V) 的聚乙烯醇 (PVA 1750) 溶液，与橄榄油按体积比 3 ：1 混合后高速搅拌 3 min 制得橄榄油乳化液，取 5 mL 乳化液与 4 mL 磷酸缓冲液 (0．1mol ／ L，pH 8．0) 混合，在 40° C 水浴中预热 5 min，加入样液反应 10 rnin后加入 15 mL 无水乙醇终止反应，以酚酞作指示剂，用 0．05 tool ／ L的 NaOH 溶液滴至液体呈粉红色；

（2）与空白样对比计算其酶活。在测定条件下，每分钟释放出 1μmol 脂肪酸的酶量定义为 1 个酶活单位 (IU)。

进一步地，所述步骤二中，其发酵菌细胞为真核生物细胞或原核生物细胞。

进一步地，所述提高宿主细胞产酶活性的方法，其发酵过程中或发酵结束对粗发酵液施加直流电场。

进一步地，所述粗发酵液为细胞悬液、细胞及酶液混合物或发酵产生的粗酶液。

采用上述结构后，本发明有益效果为 ：本发明所述的一种提高宿主细胞产酶活性的方法，它在发酵工程细胞的产酶的过程中，对发酵产生的细胞及酶液混合物应用直流电场刺激，从而实现促进细胞产酶活性的提高。

【附图说明】

此处所说明的附图是用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，但并不构成对本发明的不当限定，在附图中：

图 1 是本发明流程框图 ；

【具体实施方式】

下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，其中的示意性实施例以及说明仅用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。

如图 1 所示，本具体实施方式所述的一种提高宿主细胞产酶活性的方法，它采用如下的技术方案：

步骤一 ：摇瓶培养，采用如下的方法步骤：

（1）250 mL 的锥形瓶中装摇瓶培养基 50 mL，从斜面上接种一环种子，放置于旋转式摇床上在 26℃下培养 120 h，摇床转速 220 r ／ min，得发酵培养基；

（2）将发酵培养基 ( 按 18 L 装液量 ) 配好并装入发酵罐内，121℃下灭菌 30min，冷却至 26℃后接种 1 个茄型瓶种子 ( 用无菌水将菌种刮下 )，搅拌转速 500 r ／min，通风量 1VVM；

（3）1 m³ 发酵罐培养：将放大发酵培养基 ( 按 60％装液量 ) 配好并装入罐内，121℃下灭菌 30 min，冷却至 26℃后接种 3 个茄型瓶种子 ( 用无菌水将菌种刮下 )，搅拌转速 200r ／ min，通风量 1 VVM；

步骤二：直流电刺激，采用如下方法步骤：

（1）发酵培养周期结束后，对发酵菌及酶液施加直流电压 0.1-5V/cm，直流电流1-120分钟；

（2）其产酶水平能从未施加电场时的 5000 IU ／ mL 达到 6000 IU/mL；

步骤三 ：脂肪酶酶活的测定，采用如下方法步骤：

（1）采用橄榄油乳化液测定法，配制 2％ ( W ／ V) 的聚乙烯醇 (PVA 1750) 溶液，与橄榄油按体积比 3 ：1 混合后高速搅拌 3 min 制得橄榄油乳化液，取 5 mL 乳化液与 4 mL 磷酸缓冲液 (0．1mol ／ L，pH 8．0) 混合，在 40° C 水浴中预热 5 min，加入样液反应 10 rnin后加入 15 mL 无水乙醇终止反应，以酚酞作指示剂，用 0．05 tool ／ L的 NaOH 溶液滴至液体呈粉红色；

（2）与空白样对比计算其酶活。在测定条件下，每分钟释放出 1μmol 脂肪酸的酶量定义为 1 个酶活单位 (IU)。

所述步骤二中，其发酵菌细胞为真核生物细胞或原核生物细胞。

所述提高宿主细胞产酶活性的方法，其发酵过程中或发酵结束对粗发酵液施加直流电场。

所述粗发酵液为细胞悬液、细胞及酶液混合物或发酵产生的粗酶液。

本发明的具体实施例如下 :

实施例 1 直流电刺激提高假丝酵母发酵产脂肪酶酶活水平

1）发酵培养

250 mL的锥形瓶中装摇瓶培养基50 mL，从斜面上接种一环种子，放置于旋转式摇床上在 26℃下培养 120 h，摇床转速 220 r ／ min。将发酵培养基 ( 按 18 L 装液量 )配好并装入发酵罐内，121℃下灭菌 30 min，冷却至 26℃后接种 1 个茄型瓶种子 ( 用无菌水将菌种刮下)，搅拌转速500 r／min，通风量1 VVM。1 m³ 发酵罐培养 ：将放大发酵培养基(按60％装液量 ) 配好并装入罐内，121℃下灭菌 30 min，冷却至 26℃后接种 3 个茄型瓶种子 ( 用无菌水将菌种刮下 )，搅拌转速 200 r ／ min，通风量 1 VVM。

2）直流电刺激工艺

发酵培养周期结束后采用直流电刺激，对发酵菌及酶液施加 0.2V/cm 直流电 30分钟。

检测酶活结果显示，其产酶水平能从未施加电场时的5000 IU／mL达到6000 IU/mL的水平。发酵酶活比未施加直流电处理提高约 20%。

实施例 2 直流电刺激提高 SOD 产量水平

1) 菌种的活化：将耐辐射球菌划线接种于 TGY 固体培养基上，培养基组成为蛋白胨5g/L，酵母提取物 3g/L，葡萄糖 1g/L，30-32℃培养 45-48h，挑取单菌落接种于三角瓶中摇瓶培养至对数生长期；

2) 发酵培养条件：将上述种子液按 3-5％体积的接种量接入发酵液体培养基中，30-32℃培养 38-42h；

3)SOD 的直流电刺激 ：菌体生长到 38-42h，即稳定早期，菌浓度＞ 108/ml，菌体形态多数呈二联体，此时是进行直流电刺激的最佳时期 ；将菌体培养物置于直流电刺激平台，施加0.5V/cm 直流电压，菌体所接受直流电处理的总时间为 20 min；

4) 菌体直流电刺激后培养的条件：经辐射诱导后的菌体，需要在 30-32℃条件下培养30-60min，目的是使菌体在接受外界刺激后，大量合成 SOD 酶； 5) 粗酶液的提取：①菌液离心 5000-10000rpm，0-4℃，10-15min，收集菌体细胞沉淀。用 50-60mM，pH7.0 的磷酸盐缓冲液洗涤三次，离心收集菌体细胞。 ②按每克菌体加入三倍缓冲液制成菌悬液，600-700w功率下超声波处理菌细胞 8-10min，每处理 2-3 秒间隔 4-6 秒，菌体破碎率可达 85％以上。③ 10000-12000rpm，0-4℃条件下离心 10-20min，收集上清液，即为 SOD 粗酶液。

实施例 3 直流电刺激提高利福霉素 SV 发酵产量水平：

1）发酵培养

按种子和发酵培养基配方配置培养液，湿热灭菌后降温至 28℃，按 3%-5% 的接种量将地中海拟无枝酸菌的合瓶种子液接入一级种子罐。一级种子罐温控制在 28℃，无菌空气流量按 0.8 vvm 控制，搅拌转速为 160 r/min，罐压控制在 0.03-0.04 MPa，培养48h 后无菌操作补入二级种子罐；二级种子罐温控制在 28℃，无菌空气流量按 0.8 vvm控制，搅拌转速为 160 r/min，罐压控制在 0.03-0.04 MPa，培养 48h 后无菌操作补入三级发酵罐；三级发酵罐温按 28℃控制，转速为 160 r/min，无菌空气流量控制在 0.5-0.8vvm，罐压控制在0.03-0.05 MPa，培养周期为 136 h；

2）直流电刺激工艺：

发酵培养周期结束后，对发酵菌及酶液施加 0.5 V/cm 直流电 30 分钟。

本发明产生的优点如下：

通过该方法可明显提高细胞产酶活力 20% ～ 30%，且操作工艺简单，可控性强，适宜于大批量发酵生产，可有效降低应用细胞工程生产饲料、食品、医药卫生等工业用酶的生产成本，节约能源和资源，社会经济效益显著，符合国家关于发酵工业节能降耗的绿色发展趋势。

本发明所述的一种提高宿主细胞产酶活性的方法，它在发酵工程细胞的产酶的过程中，对发酵产生的细胞及酶液混合物应用直流电场刺激，从而实现促进细胞产酶活性的提高。

以上所述仅是本发明的较佳实施方式，故凡依本发明专利申请范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均包括于本发明专利申请范围内。

Claims (1)

1.一种提高宿主细胞产酶活性的方法，其特征在于：它采用如下的技术方案：

步骤一：摇瓶培养，采用如下的方法步骤：

(1)250mL的锥形瓶中装摇瓶培养基50mL，从斜面上接种一环种子，放置于旋转式摇床上在26℃下培养120h，摇床转速220r/min，得发酵培养基；

(2)将发酵培养基，按18L装液量，配好并装入发酵罐内，121℃下灭菌30min，冷却至26℃后接种1个茄型瓶种子，搅拌转速500r/min，通风量1VVM；

(3)将放大发酵培养基，按60％装液量，配好并装入罐内，121℃下灭菌30min，冷却至26℃后接种3个茄型瓶种子，搅拌转速200r/min，通风量1VVM；

步骤二：直流电刺激提高假丝酵母发酵产脂肪酶酶活水平，采用如下方法步骤：

(1)发酵培养周期结束后，对假丝酵母发酵菌及酶液施加直流电压0.2V/cm，直流电流30分钟；

(2)其产酶水平从未施加电场时的5000IU/mL达到6000IU/mL；脂肪酶酶活的测定，采用如下方法步骤：

采用橄榄油乳化液测定法，配制2％的聚乙烯醇溶液，与橄榄油按体积比3：1混合后高速搅拌3min制得橄榄油乳化液，取5mL乳化液与4mL0.1mol/L，pH 8.0磷酸缓冲液混合，在40℃水浴中预热5min，加入样液反应10 min 后加入15mL无水乙醇终止反应，以酚酞作指示剂，用0.05mol/L的NaOH溶液滴至液体呈粉红色；

与空白样对比计算其酶活，在测定条件下，每分钟释放出1μmol脂肪酸的酶量定义为1个酶活单位。