KR20080003418A - 배아 줄기세포의 췌장세포로의 유도방법 - Google Patents

배아 줄기세포의 췌장세포로의 유도방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 배아 줄기세포의 인슐린생성세포로의 분화를 유도할 수 있는 간단한 3단계 배양법에 관한 것이다. 상기 3단계 배양법은 액티빈A, RA 및 임의로 선택한 기타 성숙인자의 조합 유도를 기초로 한다. 본 발명은 또한 배아 줄기세포의 인슐린생성세포로의 분화를 유도할 때에 사용되는 키트에도 관련된다.

Description

배아 줄기세포의 췌장세포로의 유도방법{METHOD OF INDUCING EMBRYONIC STEM CELLS INTO PANCREATIC CELLS}
본 발명은 배아 줄기세포(ES 세포)의 유도방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 배아 줄기세포를 췌장세포로 유도하는 방법 및 이에 사용되는 키트에 관한 것이다.
당뇨병은 대사 장애성 질병의 한가지로서 전 세계적으로 약 4~5%의 인구가 이 질병의 영향을 받고 있다. 2010년에 이르면 당뇨병 환자의 인수가 3억5천만을 초과할 것으로 예상되고 있다. I형 당뇨병은 이자섬(pancreatic islets) 중의 β세포가 자가면역파괴를 받아 발생하는 질병인 바, 여러 연구팀들은 이러한 파괴된 인슐린 생성세포를 대체할 수 있는 방법을 찾기 위하여 힘을 기울이고 있다. 현재 인슐린주사 외에 유일하게 유효한 I형 당뇨병의 완치방법은 이자섬세포의 이식이다(Serup P, Madsen OD, Mandrup-Poulsen T. Islet and stem cell transplantation for treating diabetes. BMJ 2001;322:29-32). 그러나, 이식가능한 도너(donor)인 이자섬의 엄중한 결핍으로 인하여 이 방법은 광범위한 응용이 불가능한 상태이다.
ES 세포로부터 기능성 β세포를 획득할 수 있으면 상술한 이식가능한 이자섬이 결핍한 문제를 해결할 수 있다고 인정되고 있다. 이미 증명된 바와 같이, ES 세 포는 이자섬 모양의 집합체(clusters), 특히 췌장 β세포로 분화될 수 있다(Soria B, Roche E, Berna G, et al. Insulin-secreting cells derived from embryonic stem cells normalize glycemia in streptozotocin-induced diabetic mice. Diabetes 2000;49(2):157-162; Lumelsky N, Blondel O, Laeng P, et al. Differentiation of embryonic stem cells to insulin-secreting structures similar to pancreatic islets. Science 2001;292:1389-1394; Assady S, Maor G, Amit M, et al. Insulin production by human embryonic stem cells. Diabetes 2001;50(8):1691-169). 소리아(Soria) 등은 <세포포획> 방안을 통하여 처음으로 성공적으로 ES 세포를 유도하여 췌장 β세포로 분화시켰다(Soria B, Roche E, Berna G, et al. Insulin-secreting cells derived from embryonic stem cells normalize glycemia in streptozotocin-induced diabetic mice. Diabetes 2000;49(2):157-162). 그러나, 상기 방법은 그 과정이 복잡하고 게다가 유전자 방면의 조작도 필요하다. 루멜스키(Lumelsky) 등은 ES 세포를 유도하여 인슐린을 생성하는 이자섬 모양의 구조로 분화시키는 <5단계 방법>을 설계하였다(Lumelsky N, Blondel O, Laeng P, et al. Differentiation of embryonic stem cells to insulin-secreting structures similar to pancreatic islets. Science 2001;292:1389-1394). 이 방법에는 유전자 방면의 조작이 필요 없다. 호리(Hori) 등（Hori Y, Rulifson IC, Tsai BC, et al. Growth inhibitors promote differentiation of insulin-producing tissue from embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 2002;99(25):16105-16110) 및 블리스주쿠(Blyszczuk P, Czyz J, Kania G, et al. Expression of Pax4 in embryonic stem cells promotes differentiation of nestin-positive progenitor and insulin-producing cells. Proc Natl Acad Sci USA 2003;100(3):998-1003）등은 성장억제제 LY294002 또는 과도발현 유전자 pax4를 첨가하여 루멜스키를 개진하는 5단계 방법을 설계하였다. 그러나, 상술한 방법들은 모두 그 어떤 방면에서 과정이 복잡하고 주기가 길다. 한손(Hansson) 등은 <5단계 방법>을 사용하는 과정 중에, ES 세포가 배양과정에서 배지중의 인슐린을 흡수하여 거짓 양성을 나타내는 경우가 존재한다는 것을 발견하였다(Blyszczuk P, Czyz J, Kania G, et al. Expression of Pax4 in embryonic stem cells promotes differentiation of nestin-positive progenitor and insulin-producing cells. Proc Natl Acad Sci USA 2003;100(3):998-1003). 따라서 편리하고 신속하게 ES 세포를 유도하여 췌장 β세포로 분화시킬 수 있는 특이성 유도 인자를 찾아내는 것은 아주 필요한 과제로 되었다.
어떤 인자들은 이미 확정된 내배엽(endoderum)의 분화를 촉진할 수 있다고 보도된 적이 있다. TGF-β 슈퍼패미리의 맴버중의 하나인 액티빈A는 장배형성과정 (gastrulation)에서 내배엽과 중배엽의 형성에 중요한 작용을 일으키는 바, 고농도 하에서 주로 내배엽의 형성을 유도한다(Kumar M, Jordan N, Melton DA, et al. Signals from lateral plate mesoderm instruct endoderm toward a pancreatic fate. Developmental Biology 2003;259: 109-122; Hill CS. TGF-β signalling pathways in early Xenopus development. Curr Opin Genet Dev 2001;11(5):533-540). 모든-트랜스 레티노익산(All-trans retinoic acid(RA))은 충분히 특징된 신 호분자로서, 척추동물의 신경 외배엽과 중배엽의 전후패턴의 형성과정에서 중요한 작용을 일으킨다(Maden M. Role and distribution of retinoic acid during CNS development. Int Rev Cytol 2001;209:1-77). RA도 배아 내배엽의 분화패턴의 조절에 참여한다는 것이 현재의 연구결과에 의해 증명되었다. 특히 이자싹(pancreas bud)의 형성과정에서 상기 작용이 발휘되며, 이는 또한 췌장 β세포와 INS-1 세포계중 인슐린의 발현을 강화시킬 수 있다(Stafford D, Prince VE. Retinoic Acid signaling is required for a critical early step in Zebrafish pancreatic development. Current Biology 2002;12(14):1215-1220; Blumentrath J, Neye H, Verspohl EJ. Effects of retinoids and thiazolidinediones on proliferation, insulin release, insulin mRNA, GLUT2 transporter protein and mRNA of INS-1 cells. Cell Biochem Funct 2001;19:159-169). 이외에, 아프리카산 발톱 있는 두꺼비 체내에서의 액티빈A와 RA의 조합 작용은 워낙 외배엽으로 발육되어야 할 부분을 인슐린을 발현할 수 있는 췌장세포로 분화할 수 있다는 것도 이미 증명되었다 (Moriya N, Komazaki S, Takahashi S, et al. In vitro pancreas formation from Xenopus ectoderm treated with activin and retinoic acid. Develop Growth Differ 2000;42:593-602).
본 발명의 목적은 배아 줄기세포를 췌장세포로 유도하는 방법을 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 배아 줄기세포를 췌장세포로 유도하는 방법에 사용될 수 있는 키트(kit)를 제공함에 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 구성은 다음과 같다.
세포 배지 내에서 배아 줄기세포를 배양하여 배아체(embryonic bodies)를 형성하는 단계,
액티빈A를 이용하여 배아체를 부화하는 단계,
RA로 배아체를 부화하여 인슐린을 생성하는 전구세포로 발육시키는 단계를 상기 순서에 따라 포함하는 것을 특징으로 하는 배아 줄기세포의 유도방법.
배아 줄기세포가 생쥐 기원의 세포일 경우, 본 발명의 방법에 사용되는 배지는 약 10% 우태혈청(fetus calf serum)을 함유한 DMEM이고, 배아 줄기세포가 인간기원의 세포일 경우, 본 발명의 방법에 사용되는 배지는 CDM이다.
또한 상기 액티빈A의 농도는 약 50-300 ng/㎖ 배지이며 상기 RA의 농도는 약 1×10－7-1×10－5mol/L 배지이다.
상기 방법의 다른 하나의 실시형태는 상기 단계 외에 다음과 같은 단계를 더 포함할 수도 있다. 즉 액티빈A를 이용하여 배아체를 부화하기 전에 메트리겔 (Metrigel)이 피복된 배지에서 배아체를 부화하는 단계를 더 포함할 수도 있다. 상기 매트리겔의 배지 중에서의 질량 백분율은 약 1%이다.
또 하나의 실시형태중 액티빈A를 이용하여 배아체를 20시간 내지 4일간 부화하며, 그 후에 액티빈A를 포함하지 않는 배지 중에서 6시간 내지 8시간 동안 배양한다. 그리고 나서 RA를 이용하여 20시간 내지 4일간 부화하여 인슐린을 생성하는 전구세포로 발육시킨다.
또 하나의 실시형태중, 상기 방법은 상기 단계 외에 다음과 같은 단계를 더 포함할 수 있다. 즉, 성숙인자를 함유하고 있는 배지 중에서 이미 생성된 인슐린 생성 전구세포를 배양하여 이를 증가(expand)시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 성숙인자는 농도가 8-12 ng/㎖인 bFGF이다.
또 하나의 실시형태중, 상기 방법은 상기 단계 외에 다음과 같은 단계를 더 포함할 수 있다. 즉, 이미 증가된 인슐린생성 전구세포를 N2 첨가제, B27 첨가제, 라미닌(Laminin) 및 니코틴아미드를 함유하고 있는 배지 중에서 부화하여 인슐린생성세포로 발육시키는 단계를 포함할 수 있다. 또한 상기 배지는 N2 첨가제(1:100， Gibco로부터 구매가능), B27 첨가제(1:50，Gibco로부터 구매가능), 1 ㎍/㎖의 라미닌, 10 ng/㎖의 bFGF, 인슐린-트랜스페린-셀렌-A(1:100，Gibco로부터 구매가능) 및10 mmol/L의 니코틴아미드를 함유한 DMEM/F12 또는 CDM 배지이다.
본 발명은 배아 줄기세포를 유도분화시키는 키트에도 관련된다.
상기 키트는 액티빈A와 RA를 함유할 수 있다. 또 하나의 실시형태중, 상기 키트는 매트리겔을 함유할 수도 있다. 상기 키트는 또한 혈청 및/또는 일차 배지를 함유할 수도 있다. 상기 매트리겔은 상기 일차 배지 위에 피복되어 있을 수도 있다. 또한 매트리겔을 단독으로 제공할 수도 있다. 상기 일차 배지는 성숙인자, 예를 들어 bFGF를 함유할 수 있다. 상기 키트는 또한 bFGF를 함유한 이차 배지를 포함할 수도 있다.
도 1A는 본 발명에 의한 ES 세포의 인슐린 양성세포(insulin-positive cells)로의 분화를 유도할 수 있는 3단계 배양법을 나타내는 도면이다.
도 1B는 생쥐 ES-R1 세포로부터 형성된 EB 세포집합체의 사진이다.
도 1C는 3단계 배양법의 제2단계 중의 췌장 전구세포가 상피모양의 구조를 나타낸 상태의 사진이다.
도 1D- 도 1E는 3단계 배양법의 제3단계에서 나타난 세포집합체 모양 구조의 사진이다.
도 2A는 RT-PCR 측정을 통하여 제2단계 말기에 액티빈 A 또는 RA에 의해 각각 유도된 분화세포 표지유전자(marker genes)의 발현상황을 나타낸 도면이다.
도 2B는 RT-PCR 측정을 통하여 제2단계 말기에 액티빈 A 과 RA에 의해 유도된 분화세포 표지유전자의 발현상황을 나타낸 도면이다.
도 2C는 RT-PCR 측정을 통하여 제3단계 말기의 분화세포 표지유전자의 발현상황을 나타낸 도면이다.
도 3A는 3단계 배양법에 의해 얻어진 세포가 인슐린 1차항체에 의해 염색된 면역조직 화학적 측정결과이다.
도 3B는 3단계 배양법에 의해 얻어진 세포가 C-펩티드 1차항체에 의해 염색된 면역조직 화학적 측정결과이다.
도 3C는 액티빈A 와 RA의 유도를 거치지 않은 세포의 인슐린 디아미노벤지딘 테트라염산염(DAB) 염색 측정결과이다(200×).
도 3D는 액티빈A 와 RA의 유도를 거친 세포의 인슐린 DAB 염색 측정결과이 다(200×).
도 3E와 3G는 3단계 배양법에 의해 유도된, EGFP 리포터유전자가 트랜스펙션(transfection)된 ES-R1 세포의 EGFP 발현상태를 나타낸 도면이다. 그 중에서 E, G는 각각 다른 구조를 표시한다(200×).
도 3F와 3H는 3단계 배양법에 의해 유도된, EGFP 리포터 유전자가 트랜스펙션된 ES-R1 세포가 인슐린 1차항체에 의해 염색된 면역조직 화학적 분석결과를 나타낸 도면이다. 그 중에서 F, H는 각각 다른 구조를 표시한다(200×).
도 3I는 ELISA를 통하여 측정한 인슐린 방출결과이다.
도 4A는 분화세포가 이식된 당뇨병 생쥐(n=9)와 PBS가 이식된 당뇨병 생쥐 (n=12)의 생존율의 비교결과를 나타낸 도면이다.
도 4B는 분화세포가 이식된 당뇨병 생쥐(n=5)와 PBS가 이식된 당뇨병 생쥐 (n=3)의 혈액 포도당 수준의 분석결과이다.
도 5A는 PBS가 이식된 생쥐의 인슐린 발현 면역조직 화학분석 결과이다(200×).
도 5B는 분화세포가 이식된 생쥐의 인슐린 발현 면역조직 화학분석 결과이다 (200×).
도 6은 인간 배아 줄기(hES) 세포의 유도과정을 나타낸 도면이다.
도 7A는 CDM 작용/RA 방법에 따라 유도된 hES의 표지유전자의 발현상황을 나타낸 도면이다.
도 7B는 CDM만을 이용하여 배양한 대조 hES의 표지유전자의 발현상황을 나타 낸 도면이다.
도 8A-D는 유도완료된 hES 세포 발현 C-펩티드와 Pdx1 사진이다(400×).
도 8E-H는 유도완료된 hES 세포 발현 글루카곤과 C-펩티드 사진이다(400×).
도 8I-L는 유도완료된 hES 세포 발현 아밀라아제와 C-펩티드 사진이다(400×).
도 8M-P는 유도완료된 hES 세포 발현 C-펩티드와 소마토스타틴(성장호르몬 방출억제 호르몬) 사진이다(400×).
도 9A는 현탁과 부착 배양을 통하여 얻어진 말단분화세포 인슐린 분비량의 비교 결과이다.
도 9B는 현탁과 부착 배양을 통하여 얻어진 말단분화세포 C-펩티드 방출량의 비교 결과이다.
도 10A는 유도된 세포를 이식한 당뇨병 누드 생쥐와 PBS를 이식한 생쥐 및 유도를 거치지 않은 세포를 이식한 생쥐의 혈액 포도당 수준의 비교 결과이다.
도 10B는 조작을 거친 생쥐 복강내 포도당내성의 측정 결과이다.
도 11A는 유도된 세포중의 인간 C-펩티드발현 사진이다(400×).
도 11B는 인간핵 특이성 항체의 염색 결과로서 C-펩티드 양성세포 기원의 인간 ES 세포를 나타내었다(400×).
지금까지의 연구결과가 나타내는 바와 같이, 배아 줄기세포는 특이성 유도에 의하여 췌장 β세포로 분화될 수 있다(Blyszczuk P, Czyz J, Kania G, et al. Expression of Pax4 in embryonic stem cells promotes differentiation of nestin-positive progenitor and insulin-producing cells. Proc Natl Acad Sci USA 2003;100(3):998-1003； Hansson M, Tonning A, Frandsen U, et al. Artifactual Insulin Release From Differentiated Embryonic Stem Cells. Diabetes 2004; 53:2603-2609). 그러나, 대부분의 유도방안은 약 한 달 동안이나 지나서야 인슐린 양성세포를 얻을 수 있다.
본 발명은 신규 3단계 배양법을 제공하였는바, 상기 방법은 액티빈A, RA 및 기타 성숙인자 등의 조합작용을 기초로 한다. 상기 성숙인자는 매트리겔, 니코틴아미드 및 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF) 등을 예로 들 수 있다. 상기 3단계 배양방법의 제3단계 말기에 상술한 유도된 세포가 이자섬 모양의 집합구조를 형성하며 인슐린, pdx-1, glut2, isl1 및 hnf3β를 포함하는 췌장 β세포의 표지유전자를 발현한다. 또한 이식을 통하여 STZ 처리를 거친 당뇨병 생쥐를 구해낼 수 있다.
상기 3가지 인자, 예를 들어 액티빈A, RA 및 매트리겔은 본 발명의 췌장 β세포 실험 유도방안에서 매우 중요한 작용을 일으킨다. 액티빈A는 초기 확정된 내배엽의 발육에 중요한 역할을 일으킨다. 액티빈A는 두 유황원자 사이의 결합이 안정한 단백질로서 TGF-β 슈퍼패밀리에 속한다. 액티빈A는 세포표면의 수용체와 결합하여 mixl1와 구스코이드(goosecoid)를 포함하는 여러 가지 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 이는 초기 내배엽의 발육에 매우 중요한 영향을 준다(Kumar M, Jordan N, Melton DA, et al. Signals from lateral plate mesoderm instruct endoderm toward a pancreatic fate. Developmental Biology 2003;259:109-122； Hill CS. TGF-β signalling pathways in early Xenopus development. Curr Opin Genet Dev 2001;11(5):533-540). 쿠보(Kubo) 등은 액티빈 A가 ES 세포의 확정된 내배엽세포로의 분화를 유도할 수 있다고 보고하였다(Kubo A, Shinozaki K, Shannon JM, et al. Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture. Development 2004;131:1651-1662). 또한 액티빈A는 배양한 인간 이자섬 중에서 인슐린의 분비를 촉진할 수 있다(Florio P, Luisi S, Marchetti P, et al. Activin A stimulates insulin secretion in cultured human pancreatic islets. J Endocrinol Invest 2000;23(4):231-234). 액티빈A는 당뇨병에 걸린 갓난 생쥐의 β세포 발육과정에서 분화와 β세포의 재생을 제어조절할 수 있다(Lei L, Yi Z, Seno M, et al. Activin A and Betacellulin Effect on Regeneration of Pancreatic β cells in Neonatal Streptozotocin-Treated Rats. Diabetes 2004; 53:608-615). 액티빈A의 상술한 기능의 조합은 액티빈A가 본 발명의 시스템 중에서 어떻게 작용을 일으킬 수 있는 가를 설명할 수 있다.
RA는 최근에 외배엽과 중배엽의 발육을 유도하는 기능을 가질 뿐만 아니라 초기 배아 췌장의 발육과정에서도 중요한 신호분자로서 활약하고 있다는 것이 증명되었다(Maden M. Role and distribution of retinoic acid during CNS development. Int Rev Cytol 2001;209:1-77). 제브라피쉬(zebrafish)의 발육과정에서, RA의 상승 조절은 췌장과 간장 내배엽 전방의 현저한 증가를 유도할 수 있다. 반대로 BMS 493을 이용하여 RA를 억제하면, 배아 내배엽의 췌장에로의 초기 분화를 억제할 수 있다(Stafford D, Prince VE. Retinoic Acid signaling is required for a critical early step in Zebrafish pancreatic development. Current Biology 2002;12(14):1215-1220). 미카레프(Micallef) 등의 보고에 의하면, 생쥐 배아 줄기세포가 분화를 시작한 후 나흘째 되는 날에 RA를 첨가하면, pdx1 양성인 내배엽의 형성을 유도할 수 있다(Micallef SJ, Janes ME, Knezevic K, et al. Retinoic Acid Induces Pdx1-Positive Endoderm in Differentiating Mouse Embryonic Stem Cells. Diabetes 2004 Dec 7 [Epub ahead of print]). 췌장의 성숙에 관하여, RA의 내분비와 관세포(ductal cells) 분화중의 주요 작용은 파라 분비(paracrine) 및 pdx1 유전자의 발현 수준의 상승조절을 통하여 실현된다(Tulachan SS, Doi R, Kawaguchi Y, et al. All-trans retinoic acid induces differentiation of ducts and endocrine cells by mesenchymal/epithelial interactions in embryonic pancreas. Diabetes 2003; 52(1):76-84). 배측(dorsal) 췌장의 발육과정 중에, RA는 외분비부위의 분화를 억제하여 내분비부위의 발육을 촉진하는 것이 발견되었다(Chen Y, Pan FC, Brandes N, et al. Retinoic acid signaling is essential for pancreas development and promotes endocrine at the expense of exocrine cell differentiation in Xenopus. Developmental Biology 2004; 271:144-160). 따라서, RA는 췌장 전구세포와 내분비세포의 발육을 촉진할 수 있는 것을 확실히 알 수 있다. 액티빈A가 ES 세포의 내배엽으로의 분화를 유도하는 과정에서, RA는 내배엽의 췌장 전구세포로의 특이 분화를 더욱 촉진할 수 있다. 액티빈A와 RA를 이용하여 유도한 후, 분화된 배아 줄기세포는 예를 들어, pdx1, hnf3α 및 hnf4β 등과 같은 많은 췌장 전구세포의 표지유전자를 발현할 수 있다. 이러한 데이터는 액티빈A와 RA의 조합작용은 배아 줄기세포의 초기 췌장세포로의 분화를 유도할 수 있다는 것을 나타낸다. 본 발명의 결과도 액티빈A와 RA를 동시에 사용하여 유도를 진행하면 이중의 한가지만을 사용할 경우보다 더 효과적이라는 것을 증명하였다. 매트리겔이 췌장의 체외분화와 성숙과정에서 매우 중요한 세포외기질로 작용하는 것은 이미 증명된 사실이다. 라미닌 및 예를 들어 FGF와 TGF-β 등과 같은 성장인자를 포함하는 세포외기질의 혼합물인 매트리겔은 췌장 원시세포의 이동(migration), 3차원 낭포상구조의 형성과 이자섬싹의 돌출에 기본적인 작용을 한다(Gao R, Ustinov J, Pulkkinen MA, et al. Characterization of Endocrine Progenitor Cells and Critical Factors for Their Differentiation in Human Adult Pancreatic Cell Culture. Diabetes 2003; 52:2007-2015). 또한, 기테스(Gittes GK) 등도 매트리겔중의 제일 주요한 성분중의 하나인 라미닌이 생쥐 배아췌장 관 계열의 선택에 참여한다는 것을 증명하였다(Jiang FX, Cram DS, DeAizpurua HJ, et al. Laminin-1 promotes differentiation of fetal mouse pancreatic betacells. Diabetes 1999; 48:722-730； Crisera CA, Kadison AS, Breslow GD, et al. Expression and role of laminin-1 in mouse pancreatic organogenesis. Diabetes 2000; 49:936-944). 더욱이, 매트리겔 위에 배양된 인간 췌장 관상피세포는 인슐린 양성인 이자섬 모양집합체 구조를 형성할 수 있다(Bonner-Weir S, Taneja M, Weir GC, et al. In vitro cultivation of human islets from expanded ductal tissue. Proc Natl Acad Sci U S A 2000;97:7999-8004).
본 발명을 통하여 매트리겔이 유도과정 중에 작은 이자섬 모양 집합체 구조 의 형성에 필수 요소임이 증명되었다. 만일 ES 세포를 단독으로 라미닌 또는 젤라틴 상에서 배양하면 세포집합체를 충분히 형성할 수 없다. 아래의 실시예를 통하여 분화된 세포가 매트리겔 상에서 성장할 경우, 라미닌 또는 젤라틴 상에서 성장하는 경우보다 더욱 효과적이라는 것을 설명한다. 이들은 매트리겔이 라미닌 또는 젤라틴보다 더욱 많은 유도인자를 제공할 수 있다는 것을 설명한다.
본 발명은 짧은 기간내에 ES 세포의 기능성 인슐린생성세포로의 분화를 유도할 수 있는 3단계 배양법을 제공하였다. 상기 방법은 액티빈A, RA 및 기타 임의의 성숙인자의 조합을 기초로 한다. 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, TGF-b와 RA 신호는 췌장 β세포의 발육과 성숙에 매우 중요한 역할을 일으킨다. 인슐린 양성세포는 또한 예를 들어 인슐린I, pdx1, glut2, hnf3β 및 isl1 등과 같은 특이적인 췌장 β세포 표지유전자를 발현할 수 있다. 본 발명에서, 인슐린 프로모터 하류 (dowmstream)에 위치한 EGFP 리포터유전자를 휴대한 벡터를 이용하면, 거짓 양성율을 감소시킬 수 있고, ES 세포의 인슐린생성세포로의 분화를 더 진실하게 유도할 수 있다. 이외에 하기의 실시예에 나타난 바와 같이, 신장피막(renal capsule) 부위에 이식될 경우, 본 발명을 통하여 스트렙토조신(STZ) 유도된 당뇨병 생쥐를 구해낼 수 있다. 상술한 유도시스템은 췌장 β세포의 형성과 분화 메카니즘의 연구에 신규 체외유도 패턴을 제공함과 동시에 I형 당뇨병의 이식치료에도 인슐린생성세포의 잠재적인 공급원을 제공하였다.
상술한 내용은 본 발명에 대한 개괄적인 설명이고, 본 발명의 내용은 다음의 실시예를 통하여 더욱 깊이 이해할 수 있으리라고 생각된다. 이러한 실시예는 본 발명의 예에 불과한 것으로서 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니다.
실시예
실시예 1 생쥐 배아 줄기세포를 췌장세포로 유도
다음의 실시예에서 백분율은 특별한 설명이 없는 한 질량백분율을 의미한다.
20% 우태혈청(FBS)(Gibco-BRL), 1000 U/㎖ 백혈병억제인자(LIF, Gibco-BRL)를 함유한 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM, Gibco-BRL) 배지 내에서 이미 광범위하게 측정된 ES 세포계-ES-R1(Nagy A, Rossant J, Nagy R, et al. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993;90:8424-8428)를 배양하였다.
1. ES 세포의 배양과 분화의 조건
ES 세포를 췌장 β세포로 분화하는 방법은 다음과 같다(3단계 배양법, 도 1A 참조).
제1단계; 배아체(EB)의 형성을 유도한다. 트립신을 이용하여 ES 세포를 분리하고, LIF가 없는 10％ FBS/DMEM 배지를 함유한 페트리 디쉬(Petri dishes)(Alpha medical instrument)에 현탁시켰다. 24시간 내지 48시간 후(도 1B 참조), EB를 수집하여 LIF가 없는 10％ FBS/DMEM 배지를 함유함과 동시에 1% 매트리겔(BD Biosciences)이 피복된 페트리 디쉬에 이동시켰다. 두 시간이 지난 후, EB의 전개가 시작된다. 100 ng/㎖ 액티빈A(Sigma)를 함유한 10% FBS/DMEM 배지 중에서 24시 간 동안 배양하였다. 그리고나서 EB를 다시 10% FBS/DMEM 배지에 이동시켜 6-8시간 배양하여 중간기로 한다. 중간기가 끝난 후, 10-6 M RA(Sigma)를 함유한 10% FBS/ DMEM 배지를 이용하여, 분화된 EB 세포를 24시간 동안 더 배양하였다.
제2단계; 인슐린생성 전구세포의 증가를 위하여, 10 ng/㎖ bFGF(Sigma)를 함유한 10% FBS/DMEM 배지를 이용하여, 분화된 EB 세포를 3-5일간 배양하였다. 이 기간에 대부분 세포는 상피모양의 구조를 나타내었다(도 1C 참조).
제3단계; 인슐린생성세포의 성숙을 위하여, 제2단계에서 증가된 세포를 N2 보충제(1:100, Gibco-BRL), B27 보충제(1:50 Gibco-BRL), 1 ㎍/㎖ 라미닌(Sigma), 10 ng/㎖ bFGF(Sigma) 및 10 mM 니코틴아미드(Sigma)를 함유한 DMEM/F12 배지 (Gibco-BRL)에 이동시켜 3-5일간 더 배양하였다(Lumelsky N, Blondel O, Laeng P, et al. Differentiation of embryonic stem cells to insulin-secreting structures similar to pancreatic islets. Science 2001;292:1389-1394). 니콘(NIKON) 위상차현미경(TS-100)으로 세포의 형태를 관찰하였다. 그 결과 배양된 세포가 집합체구조를 형성하였음이 알려졌다(도 1D와 도 1E 참조).
2. RT-PCR를 이용하여 분화된 세포의 유전자발현 상황을 측정
Catrimox-14 RNA 키트(TaKaRa)를 이용하여 제2단계 또는 제3단계에서 얻은 액티빈A와 RA에 의하여 동시에 유도된 세포, 액티빈A와 RA의 유도를 거치지 않은 세포 및 액티빈A와 RA중의 한가지에 의하여 유도된 세포의 총RNA를 얻었다. MMLV 역전사효소(Promega)를 이용하여 RNA를 cDNA로 역전사하였다. PCR 완충액 중의 Ex Taq 중합효소(TaKaRa) 시스템을 이용하여 PCR 반응을 완성하였다. 순환조건은 다음과 같다. 94℃에서 5분간 반응한 후 35주기 순환하였다(94℃에서 50초 동안 변성, 56-58℃에서 30초 동안 아닐링, 72℃에서 40초 동안 연장). 마지막에 72℃에서 4분간 배양하였다. 프라임 프리미어(Prime Premier) 5.0를 이용하여 pdx1, glut2, isl1, b-액틴 등 PCR 프리미어(premier)를 디자인하였다. PCR 프리미어의 서열은 다음과 같다(센스 가닥과 안티센스 가닥을 각각 표시하였다).
인슐린I: TAGTGACCAGCTATAATCAGAG (SEQ ID No.1) 및 ACGCCAAGGTCTGAAGGTCC (288bp) (SEQ ID No.2);
hnf3β: ACCTGAGTCCGAGTCTGACC (SEQ ID No.3) 및 GGCACCTTGAGAAAGCAGTC (345bp) (SEQ ID No.4);
pdx1: CTTAGCGTGTCGCCACAGCCCTCCA (SEQ ID No.5) 및TCCAACAGCCGCCTTTCGTTATTCT (472bp) (SEQ ID No.6);
glut2: GGATAAATTCGCCTGGATGA(SEQ ID No.7) 및 TTCCTTTGGTTTCTGGAACT (299bp) (SEQ ID No.8);
isl1: ATTTGCCACCTAGCCACAGCACC (SEQ ID No.9) 및 CGCATTTGATCCCGTACAACCTG (335bp) (SEQ ID No.10);
b-actin: CCTGAACCCTAAGGCCAACCGTGAA (SEQ ID No.11) 및 ATACCCAAGAAGGAAGGCTGGAAAA (480bp) (SEQ ID No.12);
hnf4α: ACACGTCCCCATCTGAAG (SEQ ID No.13) 및 CTTCCTTCTTCATGCCAG (269bp) (SEQ ID No.14).
그 결과는 도 2A-2C에 나타낸 것과 같다. 도 2A의 제1항은 제2단계 말기에 얻은 액티빈A로만 유도한 세포가 주로 hnf3β와 pdx-1를 발현함을 나타내고, 제2항은 제2단계 말기에 얻은 RA만을 이용하여 유도한 세포는 hnf3β만을 발현함을 나타낸다. 도 2B는 제2단계 말기에 얻은 액티빈A와 RA를 동시에 이용하여 유도한 세포가 표지유전자 pdx-1, hnf3β, 인슐린I 및 hnf4α를 발현함을 나타낸다. 도 2C는 제3단계 말기에 액티빈A와 RA를 동시에 이용하여 유도한 세포가 주로 인슐린I, pdx-1, isl1, glut2 및 hnf3β를 발현함을 나타낸다(제3코스<+>). 도 2A-2C중 -RT는 역전사를 진행하지 않은 음성 대조예를 표시하며 블랭크(공백)는 음성 대조에서 물만 사용한 예를 표시한다. 도 2C중 제1코스의 <췌장>은 성숙한 생쥐 췌장세포의 양성 대조이며, 제2코스의 부호<->는 제3단계에서 액티빈A와 RA를 이용하여 유도하지 않은 생쥐 ES-R1 세포를 표시하며, 부호<+>는 제3단계에서 액티빈A와 RA를 이용하여 유도한 생쥐 ES-R1 세포를 표시한다.
상기 세포는 기타 췌장 내분비세포(비β세포)의 표지, 예를 들어 글루카곤 또는 소마토스타틴을 발현하지 않는다. 이 결과는 TGF-β와 RA 신호가 췌장 β세포의 발육과 성숙에 특이성을 갖고 있을 가능성이 있음을 의미한다. 이외에 유도과정이 액티빈A와 RA에 대하여 엄격한 의존성을 갖고 있음을 발견하였다. 만일 양자중의 하나가 결핍하면 작은 세포집합체를 거의 형성하지 않으며, 유도된 세포가 인슐린, pdx1, isl1, glut2 및 hnf3β를 발현하지 않거나 미약하게 발현한다(도 2C의 제2코스 참조). 또한 라미닌 또는 젤라틴으로 매트리겔을 대체하여 페트리 디쉬를 피복하면 제3단계에서 작은 세포집합체가 형성되지 않는 것도 발견하였다.
3. 면역조직 화학분석
유도된 인슐린 양성세포가 C-펩티드를 발현할 수 있다는 것을 증명하기 위하여 면역조직 화학분석을 진행하였다. 제3단계로부터 얻은 유도된 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정하고 PBS 세척을 3번 진행한 후, 10% 정상적인 산양 또는 토끼 혈청으로 실온에서 20분간 부화하였다. 산양 혈청을 버린 후, 각각 인슐린 1차항체 (토끼 다클론, IgG, 1:200, Santa Cruz) 또는 C-펩티드 1차항체(Linco)를 첨가하고 4℃에서 하루 저녁 세포를 배양하였다. 그 다음, 로다민 접합 산양 항토끼-2차항체IgG, FITC 접합 토끼 항산양-2차항체 IgG(1:200, Santa Cruz) 또는 비오틴 접합IgG(작업용액, Santa Cruz)를 이용하여 부화하였다. 비오틴 접합 IgG를 2차항체로 사용할 경우, 반응기질로서 DAB를 사용하였다. 올림퍼스(Olympus) 위상차현미경 (Olympus IX-71)으로 화상을 포획하였다. 그 결과 세포가 인슐린뿐만 아니라 C-펩티드도 발현한다는 것이 알려졌다(도 3A, 3B 참조).
DTZ 염색(Shiroi A, Yoshikawa M, Yokota H, et al. Identification of insulin-producing cells derived from embryonic stem cells by Zinc-Chelating Dithizone. STEM CELLS 2002;20(4):284-292)을 통하여, 상기 3단계 배양법으로 배양한 세포 또는 액티빈A와 RA의 유도를 거치지 않고 발육한 세포(대조그룹)를 측정하였다. 그 결과 3단계 처리를 거친 후, DTZ 양성 세포집합체(양홍색)가 나타났다(도 3D 참조). 그러나, 대조그룹에서는 DTZ 양성 세포집합체가 나타나지 않았다(도 3C 참조). 이 결과는 얻어진 세포집합체가 인슐린 양성인 세포를 함유하고 있다는 것을 설명한다.
4. EGFP 리포터유전자의 구성 및 ES 세포의 트랜스펙션(transfection)
ES 세포의 후대가 배지 기원의 인슐린을 흡수하여 인슐린 항체에 의하여 양성으로 염색될 수 있다는 것은 이미 증명된 사실이다(Hori Y, Rulifson IC, Tsai BC, et al. Growth inhibitors promote differentiation of insulin-producing tissue from embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2002;99(25):16105-16110). 인슐린이 확실히 유도된 세포집합체로부터 생성된 물질이라는 것을 확정하기 위하여 EGFP 리포터시스템을 이용하여 인슐린의 발현을 측정하였다. EGFP 리포터벡터를 이용하여 R1 ES 세포를 트랜스펙션하였다. 그 중 하나의 인슐린 프로모터에 의해 구동되는 녹색형광 단백질 cDNA를 함유한다. G418를 이용하여 상기 벡터에 이입된 ES 세포를 선별하고 액티빈A와 RA를 이용하여 유도를 진행하였다. 구체적인 방법은 다음과 같다.
인간 인슐린프로모터와 EGFP 벡터와의 접합을 구성하였다. pFOXCAT-362 hIns (Odagiri H, Wang JH, and German MS. Function of the Human Insulin Promoter in Primary Cultured Islet Cells. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 1996;271(4):1909-1915)로부터 잘라낸 0.4 kb의 인간 인슐린 프로모터를 함유한 Xba I와 Hind III 프라그먼트를, CMV 프로모터가 이미 AseI-HindIII 분해에 의하여 제거된 pCMV-EGFPN3 벡터(BD Biosciences)와 접합시켰다. 상기 네오마이신 항성을 구비한 벡터를 전기천공법(electroporation)을 통하여 ES R1 세포계에 트랜스펙션하고 250 ㎍/㎖ G418 (Gibco-BRL)로 양성 ES 클론을 선별하였다. 선별하여 낸 생쥐ES-R1 양성클론을 먼저 액티빈A와 RA 한쌍의 인자로 자극하고 EGFP를 이용하여 생 성된 작은 세포집합체를 측정하였다. EGFP 결과는 도 3E와 3G에 나타낸 것과 같다.얻어진 작은 세포집합체 중에서 EGFP의 발현을 검측해낼 수 있다. 또한 그 발현패턴이 인슐린 발현과 일치한다(도 3F와 3H 참조, 제3단계의 면역조직 화학분석방법에 근거하여 측정). 상술한 데이터로부터 알 수 있는 바와 같이, 액티빈A와 RA 및 기타 성숙인자의 조합작용은 ES 세포의 췌장세포에로의 분화를 유도할 수 있다.
5. ELISA에 의한 인슐린 분비량의 측정
유도된 세포의 인슐린 분비량이 포도당에 대하여 의존성을 갖고 있는가를 측정하기 위하여 두 가지 농도(5.5 mM와 27.7 mM)의 포도당을 사용하였다. 2.5 Mm의 포도당을 함유한 Krebs-Ringer 완충액(pH 7.4)으로 37℃에서 세포를 90분간 예비 부화하였다. 인슐린의 방출을 유도하기 위하여 또 27.7 mM 포도당을 함유한 Krebs-Ringer 완충액으로 37℃에서 15분간 부화하였다(샘플A). 다른 한 그룹의 세포를 먼저 2.5 Mm의 포도당을 함유한 Krebs-Ringer 완충액으로 37℃에서 세포를 90분간 예비 부화한 후 인슐린의 방출을 유도하기 위하여 5.5 mM 포도당을 함유한 Krebs-Ringer 완충액으로 37℃에서 15분간 부화하였다(샘플B, 대조예로 한다). 그리고, 이미 조절된 배지를 수집하였다. Rat/Mouse 인슐린 ELISA 키트(CRYSTAL CHEM INC)를 이용하여 두 개의 배지 샘플의 인슐린 분비량을 측정하였다. 세포 총단백량을BCATM 단백질 분석(Protein Assay) 키트(PIERCE)로 측정하였다. 그 결과, 고농도의 포도당 중에서 세포의 인슐린 분비량이 저농도 포도당보다 5배 정도 높다는 것이 알려졌다(도 3I 참조, 도 3I중 인슐린의 함유량 단위는 ng(인슐린)/mg(세포총단백 량))이다. 그중 칼럼 A는 27.7 mM 포도당으로 처리한 후의 인슐린 분비 수준을 나타내고, 칼럼B(5.5 mM 포도당처리)보다 5배 정도 높다. 상기 결과는 ES 기원의 인슐린 양성세포가 진행하는 인슐린의 분비가 포도당 농도에 의하여 조절될 수 있다는 것을 나타낸다.
6. 인슐린생성세포의 생쥐 신장피막으로의 이식
ES 세포 기원의 인슐린 양성세포가 당뇨병 생쥐를 구해낼 수 있는 지를 측정하기 위하여 분화세포를 STZ 유발성 당뇨병 생쥐의 좌측 신장피막에 이식하였다(n=9). 구체적인 방법은 다음과 같다.
세포 또는 PBS를 이식하기 전에 6-8 주간의 129 마리 숫생쥐 복강내에 50 mg/kg의 스트렙토조신(STZ, Sigma)를 연속 5일간 주사함으로써 실험 당뇨병의 형성을 유도하였다. STZ 처리를 거친 생쥐 혈액 포도당 농도가 13.9 mM보다 높을 때에, 생쥐의 좌측 신장피막에 1x106 개의 인슐린생성세포를 이식하였다. 대조그룹(n=12)에 대하여 PBS 처리를 진행하였다. GlucoTREND2(Roche)를 이용하여 잘라내진 꼬리중의 혈액 포도당 농도를 측정하였다. 수술을 거친 신장을 냉동 절편하고, 신장피막중의 이식세포의 인슐린 발현에 대하여 면역조직 화학분석을 진행하였다. 그 결과 분화세포에 의해 처리된 당뇨병 생쥐(n=9)의 생존기간이 더욱 길었으며, 생존율이 70%에 도달하였다. 이에 비하여 PBS를 이식한 당뇨병 생쥐(n=12, 실선)의 생존율은 25% 이었다(도 4A 참조). 생존한 생쥐는 정상적인 체중을 유지할 수 있었다. 약 두 주일이 지난 후, 세포이식 받은 당뇨병 생쥐의 혈액 포도당 농도가 정상수 준(13.9 mM 보다 낮은 농도)으로 회복되었다. 이와 반대로 PBS 이식을 받은 생쥐 (n=3)의 혈액 포도당 농도는 계속 비교적 높은 수준(13.9 mM 보다 높은 농도)을 유지하고 있었다(도 4B 참조). 세포이식을 받은 좌측 신장을 잘라낸 후 생쥐의 혈액 포도당 농도는 14 mM까지 상승되었다. PBS 주사한 좌측 신장에서는 인슐린 1차항체로 인슐린 양성세포를 측정해 낼 수 없었다(도 5A 참조). 분화세포처리를 거친 STZ-당뇨병 생쥐의 신장에서만 인슐린 양성세포를 측정해 낼 수 있었다(도 5B 참조). 상기 결과는 ES 세포 기원의 인슐린 양성세포가 당뇨병 생쥐를 구제할 수 있음을 나타낸다.
실시예 2 인간 배아 줄기세포의 췌장세포로의 유도
본 발명은 인간 ES 세포계 H1, H9를 사용하였다(Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science 1998;282:1145-1147). 상기 세포의 배양온도는 37℃이다.
배양시스템은 화학 조성성분이 확정된 배지이다(CDM：50% IMDM(Gibco), 50% F12(Gibco), 모노티오글리세롤(sigma) 450 μM, 인슐린-트랜스페린-셀렌-A(ITS, Gibco), 알부민 프라그먼트 V(Sigma) 5mg/㎖). 간단히, hES 세포를 CDM에 이입하여 분화를 진행하였다. 그리고 나서 액티빈A와 RA를 이용하여 hES 세포의 췌장 전구세포로의 분화를 유도하였다. 이러한 기초 하에서, mES 유도방법 중에서 설명한 이자섬 배양조건을 이용하여 hES 기원의 췌장 β세포를 한층 더 성숙시켰다.
분화를 진행하기 위하여 실험과정을 다음과 같이 설계하였다.
제1단계; hES 세포를 1% 매트리겔(B&D Biosciences)에 의해 피복된 조직 배양 디쉬(Nunc)위에 통과하였다. 그리고 나서 개량된 CDM(11)로 상술한 배지를 대체하였다. 상기 개량된 CDM(11)는 50% IMDM(Gibco)와 50% F12 NUT-MIX(Gibco)를 함유하며 인슐린-트랜스페린-셀렌-A(1:100, Gibco), 450 μM 모노티오글리세롤(sigma) 및 5 mg/㎖ 알부민 프라그먼트 V(Sigma)가 첨가되어 있다. 이틀이 지난 후 50 ng/㎖ 액티빈A(Sigma)를 함유한 CDM 배지로 상술한 세포를 4일간 유도하였다.
제2단계; 액티빈A를 4일간 유도한 후, 세포를10-6 M RA(Sigma)을 함유한 CDM에 이동하여 또 4일간 유도하였다.
제3단계; 배지를 CDM으로부터 개량된 이자섬 성숙배지(12)로 변환시켰다. 상기 이자섬 성숙배지(12)의 조성은 다음과 같다. DMEM/F12(Gibco), 인슐린-트랜스페린-셀렌-A(1:100, Gibco), 2 mg/㎖ 알부민 프라그먼트 V(Sigma)및 10 ng/㎖ bFGF이다. 세포를 상기 배지로 3일간 배양한 후, DMEM/F12(Gibco), 인슐린-트랜스페린-셀렌-A(1:100, Gibco), 2 mg/㎖ 알부민 프라그먼트 V(Sigma) 및 10 mM 니코틴아미드(Sigma)을 함유한 배지에 이입하여 2일간 배양하였다. 그리고 나서 0.5 mg/㎖의 분산효소(dispase, Gibco)를 이용하여 상술한 세포를 소화하고 나서 초저(Ultra Low) 부착 페트리 디쉬에 5일간 방치함으로써 현탁액을 형성하여 이자섬의 성숙을 완성하였다.
2. 분화세포중 유전자 발현에 관한 RT-PCR 분석
실시예 1의 제2 부분에서 설명한 방법에 따라, RT-PCR를 이용하여 소마토스 타틴(SST), Glut2, 아밀라아제(Amy), Sox17, Hnf4α pdx-1, 인슐린(INS), Hb9, 글루코키나아제(GCK), IFABP 등의 분화세포와 대조그룹 세포(액티빈A와 RA의 유도를 포함하지 않은 CDM 중에서 배양) 중에서의 발현을 측정하였다. 상기 분화세포는 상술한 3단계 배양법에 근거하여 획득한 성숙한 β세포를 의미하며, 대조그룹 세포는 액티빈A와 RA 중의 하나에 의해 유도된 세포를 의미한다. PCR 프리미어의 서열은 다음과 같다(센스 가닥과 안티센스 가닥을 각각 표시하였다).
gapd: GTCATTGAGAGCAATGCCAG (SEQ ID No.15) 및 GTGTTCCTACCCCCAATGTG (200bp) (SEQ ID No.16);
sox17: CAGTGACGACCAGAGCCAGACC (SEQ ID No.17) 및 CCACGACTTGCCCAGCATCTT (292bp) (SEQ ID No.18);
pdx1: ACCAAAGCTCACGCGTGGAAA (SEQ ID No.19) 및 TGATGTGTCTCTCGGTCAAGTT (200bp) (SEQ ID No.20);
hlxb9: CCTAAGATGCCCGACTTCAACTCCC (SEQ ID No.21) 및 GCCCTTCTGTTTCTCCGCTTCCTG (276bp) (SEQ ID No.22);
hnf4α: ATCAGAAGGCACCAACCTCAAC (SEQ ID No.23) 및 TGTCTTTGTCCACCACGCACT (197bp) (SEQ ID No.24);
인슐린: GAGGCCATCAAGCACCATCAC (SEQ ID No.25) 및 GGCTGCGTCTAGTTGCAGTA (373bp) (SEQ ID No.26);
glut2: GCTACCGACAGCCTATTCTA (SEQ ID No.27) 및 CAAGTCCACTGACATGAAG (267bp) (SEQ ID No.28);
아밀라아제(amy): CTGACAACTTCAAAGCAAA (SEQ ID No.29) 및 TACAGCATCCACATAAATACGA (358bp) (SEQ ID No.30) ;
소마토스타틴(SST): GATGCTGTCCTGCCGCCTCC (SEQ ID No.31) 및 TGCCATAGCCGGGTTTGA (292bp) (SEQ ID No.32);
sur1: TTGCCGAAACCGTAGAAGGA (SEQ ID No.33)와 TTGGAGACCATTAGGGCGTAG (268bp) (SEQ ID No.34);
글루카곤(GCG): AGGCAGACCCACTCAGTGA (SEQ ID No.35) 및 AACAATGGCGACCTCTTCTG (308bp) (SEQ ID No.36);
글루코키나아제(GCK): AGGGAATGCTTGCCGACTC (SEQ ID No.37) 및 CACTGGCCTCTTCATGGGT (375bp) (SEQ ID No.38).
상기 결과는 도 7A와 7B에 표시한 것과 같다. 분화된 ES 세포는 성숙된 β세포의 표지유전자, 예를 들어 인슐린, pdx-1, 글루코키나아제 및 glut2를 발현할 수 있다는 것을 알 수 있다(도 7A 참조). 이와 반대로, 대조그룹은 기본상 아무런 표지유전자도 발현하지 않는다는 것을 알 수 있다(도 7B 참조).
3. 면역조직 화학분석
4% 파라포름알데히드로 유도된 세포를 고정하고 PBS로 세번 세척한 다음, 0.3% tritonX-100(Sigma)와 10% 정상혈청을 함유한 PBS 중에서 실온에서 세포를 40분간 부화하였다. 그리고 나서 산양 항인간(goat anti-human) sox17 항체(1:40, R&D SYSTEMS) 1차항체, 생쥐 항인간 인슐린 단클론 항체(1:100, CHEMICON) 1차항체, 토끼 항인간 C-펩티드 항체(1:200, Linco) 1차항체, 글루카곤(산양 다클론 IgG, 1:200, Santa Cruz) 1차항체, pdx1(산양 다클론 IgG, 1:200, Santa Cruz) 1차항체, 아밀라아제(토끼 다클론 IgG, 1:500, Sigma) 1차항체, ngn3(산양 다클론 IgG, 1:200, Santa Cruz) 1차항체 또는 소마토스타틴(산양 다클론 IgG, 1:200, Santa Cruz)를 이용하여 4℃에서 하룻밤 부화하였다. 그 후에 다음의 2차항체를 이용하여 부화하였다. TRITC-접합 산양 항토끼 IgG，FITC-접합 토끼 항산양 IgG，FITC-접합 산양 항생쥐 IgG，FITC-접합 당나귀 항산양 IgG 또는 TRITC-접합 당나귀 항토끼 IgG（1:200，전부 Jackson ImmunoResearch, INC. 로부터 구입). DAPI (Sigma) 염색을 이용하여 세포핵을 검측하였다. 올림퍼스 위상차현미경(Olympus IX-71)으로 화상을 포획하였다. Image-Pro Plus 소프터웨어(Media Cybernetics)를 이용하여 C-펩티드 양성세포의 백분율을 계산하였다.
그 결과 상술한 세포가 췌장 β세포의 유전자, 예를 들어 C-펩티드, pdx-1 등을 발현할 수 있다는 것이 나타났다(도 8 참조).
4. 인슐린생성세포의 신장피막에로의 이식
ES 세포 기원의 인슐린양성세포가 체내환경에서 정상적인 기능을 발휘할 수 있는지를 증명하기 위하여 STZ 유발에 의한 당뇨병 생쥐의 좌측 신장피막(n=12)에 분화세포를 이식하였다. 구체적인 방법은 다음과 같다.
동물에 대한 조작은 모두 중국 북경대학 교육동물 보호 및 사용 위원회의 비준을 받았다. 세포 또는 PBS 이식전에 4주 내지 6주의 BALB/c 누드 숫생쥐 복강내에 40 mg/kg의 스트렙토조신(STZ, Sigma)을 연속적으로 5일간 주사하여 실험 당뇨병의 형성을 유도하였다. STZ 처리를 거친 생쥐가 당뇨병 생쥐로 전환되었을 때에 약 1x106 개의 유도세포를 좌측 신장피막에 이식하였다. 액티빈A와 RA 유도를 거치지 않은 PBS 또는 세포를 실험 대조용으로 사용하였다. 하룻밤 단식시킨 후 포도당 (2.5 g　kg-1 체중)을 이용하여 포도당 내성을 측정하였다. GlucoTREND2(Roche)를 이용하여 잘라낸 꼬리중의 혈액 포도당 수준을 측정하였다. 수술을 거친 신장을 냉동 절편하고 면역조직 화학분석을 통하여 세포가 이식된 신장피막중의 C-펩티드 발현을 확인하였다. 생쥐 항인간 핵단클론 항체(1:30, CHEMICON)를 이용하여 hES 기원의 세포를 검측하였다. 올림퍼스 위상차현미경(Olympus IX-71)으로 화상을 포획하였다. 그 결과, PBS를 주사한 신장에서는 인슐린 양성세포가 발견되지 않았다. 이식생쥐의 결과를 도 11A와 11B에 나타내었다. 인간 ES 기원의 분화세포를 이식한 실험예에서는 C-펩티드를 발현할 수 있었다(도 11A 참조). C-펩티드 양성세포는 인간핵 특이성 항체에 의하여 염색된다. 이는 상술한 세포가 인간 ES 세포로부터 기원되었음을 표시한다.
인간 배아 줄기세포의 췌장 β세포로의 실험 유도는 I형 당뇨병의 이식치료에 잠재적인 공급원을 제공하였다. 본 발명에 의한 3단계 배양법은 인간 배아 줄기세포의 기능성 인슐린생성세포로의 분화를 유도할 수 있다. hES 세포를 화학성분이 확정된 배지(CDM), 액티빈A, RA 및 기타 성숙인자 중에서 배양(도 6 참조)하는 것을 기초로 하는 방법은 체내 췌장발육신호의 전달을 모의하였다. RT-PCR 측정을 통하여 hES 기원의 세포가 췌장 β세포 표지유전자, 예를 들어 pdx1, 인슐린, 글루코키나아제 및 glut2를 발현가능하다는 것을 알 수 있다(도 7 참조). 상술한 세포는 C-펩티드, pdx1, 글루카곤, 소마토스타틴 또는 아밀라아제 양성이고, C-펩티드 양성은 인슐린이 면역조직 화학측정방법에 의해 흡수되는 가능성을 배제하였다(도 8참조). 유도된 세포의 인슐린 분비가 포도당 의존형인지를 분석하기 위하여 두 가지 농도의 포도당을 사용하였다(2.5 mM와 27.5 mM). Krebs-Ringer 완충액으로 37℃에서 세포를 90분간 예비 부화한 후, 2.5 mM 포도당을 함유한 Krebs-Ringer 완충액으로 37℃에서 15분간 예비 부화하였다. 인슐린의 방출을 유도하기 위하여 27.5 mM포도당으로 15분간 부화하였다. 그리고, 이미 조절된 배지를 각각 수집하였다. Rat/Mouse 인슐린 ELISA 키트(Linco)를 이용하여 두 개의 배지 샘플의 인슐린 분비량을 측정하였다. 세포내 C-펩티드 농도를 인간 C-펩티드 ELISA 키트(Linco)로 측정하였다. 세포 총단백량을 BCATM 단백질 분석 키트(PIERCE)로 측정하였다. 그 결과, 현탁 배양중 유도된 세포의 고농도 포도당 배지 중에서의 인슐린 분비량은 저농도 포도당 배지보다 200% 제고되었다(도 9A 참조). 또한 현탁 배양을 통하여 생성된 세포의 세포내 C-펩티드 함유량도 증가되었다(도 9B 참조). 그러나, 부착 배양을 통하여 획득한 세포의 인슐린 분비는 포도당의 자극에 응답하지 않았다(도 9A, 9B 참조). 상술한 데이터는 부착 배양에 비하여 현탁 배양이 이자섬 모양 세포의 더 효과적인 성숙을 일으켰다는 것을 설명한다.
유도된 세포가 체내에서 기능을 발휘할 수 있는가를 연구하기 위하여 당뇨병누드 생쥐의 신장피막에 분화세포를 이식하였다. 유도된 세포를 이식한 생쥐 중의 30%가 약 6주간 혈액 포도당이 정상적인 수준을 유지하였다(<13.9 mM)(도 10A 참 조). 포도당 내성 측정결과에 의하면 상기 30%의 구제(rescue)된 누드 생쥐는 대조조작을 진행한 생쥐에 비하여 포도당 제어능력을 개선하는 효과도 획득하였다(도 10B 참조). 이식하여 한 달이 지난 후, 상기 3단계 배양법을 통하여 유도된 세포를 이식한 신장피막에서 C-펩티드 양성세포를 검측하였다. 인간핵 특이성 항체를 이용하여 상술한 세포를 염색하였다. 그 결과, 상기 C-펩티드 양성세포가 주사한 hES 세포 기원의 세포라는 것이 알려졌다(도 11A와 11B 참조).
상술한 결과는 hES 세포 기원의 인슐린생성세포는 생존가능할 뿐만 아니라 체내에서 30%의 STZ에 의해 유발된 당뇨병 생쥐를 구제할 수 있다는 것을 명확히 나타내었다. 이 발견은 인류의 이자섬 세포의 발육 메카니즘의 연구에 신규 체외모델을 제공하였으며 hES 세포 기원의 인슐린 생성세포는 미래의 I형 당뇨병 이식치료에도 이용될 수 있다.
<110> Peking University <120> METHOD OF INDUCING EMBRYONIC STEM CELLS INTO PANCREATIC CELLS <130> 111 <160> 38 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tagtgaccag ctataatcag ag 22 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 acgccaaggt ctgaaggtcc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 acctgagtcc gagtctgacc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ggcaccttga gaaagcagtc 20 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cttagcgtgt cgccacagcc ctcca 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tccaacagcc gcctttcgtt attct 25 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ggataaattc gcctggatga 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ttcctttggt ttctggaact 20 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 atttgccacc tagccacagc acc 23 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 cgcatttgat cccgtacaac ctg 23 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 cctgaaccct aaggccaacc gtgaa 25 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 atacccaaga aggaaggctg gaaaa 25 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 acacgtcccc atctgaag 18 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 cttccttctt catgccag 18 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 gtcattgaga gcaatgccag 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gtgttcctac ccccaatgtg 20 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 cagtgacgac cagagccaga cc 22 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 ccacgacttg cccagcatct t 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 accaaagctc acgcgtggaa a 21 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 tgatgtgtct ctcggtcaag tt 22 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 cctaagatgc ccgacttcaa ctccc 25 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 gcccttctgt ttctccgctt cctg 24 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 atcagaaggc accaacctca ac 22 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 tgtctttgtc caccacgcac t 21 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 gaggccatca agcaccatca c 21 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 ggctgcgtct agttgcagta 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 gctaccgaca gcctattcta 20 <210> 28 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 caagtccact gacatgaag 19 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 ctgacaactt caaagcaaa 19 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 tacagcatcc acataaatac ga 22 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 gatgctgtcc tgccgcctcc 20 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 tgccatagcc gggtttga 18 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 ttgccgaaac cgtagaagga 20 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 ttggagacca ttagggcgta g 21 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 aggcagaccc actcagtga 19 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 aacaatggcg acctcttctg 20 <210> 37 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 agggaatgct tgccgactc 19 <210> 38 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 cactggcctc ttcatgggt 19

Claims (15)

  1. 세포 배지 중에서 배아 줄기세포를 배양하여 배아체를 형성하는 단계;
    액티빈A를 이용하여 상기 배아체를 부화하는 단계; 및
    RA를 이용하여 상기 배아체를 부화하여 이를 인슐린생성 전구세포로 발육시키는 단계를 상기 순서대로 포함하는 배아 줄기세포의 유도방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 배아 줄기세포가 생쥐 기원의 세포일 경우, 상기 배지가 10% 우태혈청을 함유한 DMEM이고, 상기 배아 줄기세포가 인간 기원의 세포일 경우, 상기 배지가 CDM인 것을 특징으로 하는 배아 줄기세포의 유도방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 액티빈 A의 농도가 약 50-300 ng/ml 배지이고, 상기 RA의 농도가 약 1×10－7-1×10－5 mol/L인 것을 특징으로 하는 배아 줄기세포의 유도방법.
  4. 제3항에 있어서, 세포 배지 중에서 배아 줄기세포를 배양하여 배아체를 형성하는 단계 전에, 매트리겔로 배지를 수용하는 배양용기를 피복하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 배아 줄기세포의 유도방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 매트리겔의 배지 중에서의 질량백분율이 약 1%인 것을 특징으로 하는 배아 줄기세포의 유도방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 배아체를 액티빈A와 함께 20시간 내지 4일간 부화한 후, 액티빈A를 함유하지 않는 배지 중에서 6시간 내지 8시간 동안 배양하고 나서, RA를 이용하여 20시간 내지 4일간 부화하여, 인슐린생성 전구세포로 발육시키는 것을 특징으로 하는 배아 줄기세포의 유도방법.
  7. 제6항에 있어서, 이미 획득한 인슐린생성 전구세포를 성숙인자를 함유한 배지 중에서 부화하여 인슐린생성 전구세포를 증가시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 배아 줄기세포의 유도방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 성숙인자가 bFGF를 포함하는 것을 특징으로 하는 배아 줄기세포의 유도방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 bFGF의 농도가 8-12 ng/ml인 것을 특징으로 하는 배아 줄기세포의 유도방법.
  10. 제9항에 있어서, N2 보충제, B27 보충제, 라미닌 및 니코틴아미드를 함유한 배지 중에서 상기 증가된 인슐린생성 전구세포를 부화하여 인슐린생성세포로 발육 시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 배아 줄기세포의 유도방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 배지가 N2 보충제, B27 보충제, 1 ㎍/㎖의 라미닌, 10 ng/㎖의 bFGF, 인슐린-트랜스페린-셀렌-A（1:100）및 10 mmol/L의 니코틴아미드를 함유한 DMEM/F12 또는 CDM인 것을 특징으로 하는 배아 줄기세포의 유도방법.
  12. 액티빈A와 RA를 포함한 배아 줄기세포의 유도에 사용되는 키트.
  13. 제12항에 있어서, 매트리겔을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  14. 제13항에 있어서, 일종의 일차 배지를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  15. 제14항에 있어서, 혈청을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
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