MX2010004284A - Metodo para la diferenciacion de celulas troncales adultas en celulas secretoras de insulina. - Google Patents

Abstract

Se divulga un método para diferenciar células troncales adultas en células secretoras de insulina. Se indujo células troncales adultas, aisladas de los tejidos adiposçs subcutáneos de alrededor de los ojos, para diferenciarse en células secretoras de insulina en un medio en presencia, de citoquinas y factores de crecimiento, incluyendo suplemento B27, factor de crecimiento de fibroblastos-2, factor de crecimiento epidérmico, nicotinamida, péptido tipo glucagón-1, activina A, factor de crecimiento tipo insulina, betacelulina, etc., con un cambio de glucosa desde una concentración alta hasta una concentración baja. Al tener la capacidad de producir altos niveles de insulina y péptido C, las células secretoras de insulina pueden ser una excelente cura para la diabetes mellitus de tipo 1.

Description

MÉTODO PARA LA DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS TRONCALES ADULTAS EN CÉLULAS SECRETORAS DE INSULINA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la Invención La presente invención se relaciona con la inducción de células troncales humanas adultas para diferenciarse en células secretoras de insulina.

Descripción del Arte Relacionado La diabetes mellitus de tipo 1, también llamada diabetes mellitus insul ino - dependiente , está caracterizada por la pérdida de las células productoras de insulina, que resulta generalmente de un ataque autoinmune, de los islotes de Langerhans en el páncreas, lo que conduce a una deficiencia de insulina. La insulina juega un rol crucial en la homeostasis del nivel de azúcar en la sangre dentro del cuerpo. Cuando la insulina está ausente o se produce en baja cantidad, aumenta el nivel de azúcar, lo que lleva a complicaciones en varios órganos, tales como los ríñones, nervios, retina, etc. El tratamiento de la diabetes mellitus de tipo 1 se basa mayormente en el uso de insulina; al requerir inyecciones durante toda la vida del paciente, el uso de insulina no es · una cura fundamental de la diabetes mellitus de tipo 1. Por otra parte, un transplante con un páncreas o con células beta exógenos cura la diabetes mellitus de tipo 1. Sin embargo, esta medida sufre de muchas limitaciones histológicas debido al transplante quirúrgico de un páncreas exógeno . Por ejemplo, las células t ransplantadas pueden ser destruidas por la reacción autoinmune del receptor. Recientemente, muchos estudios se han enfocado en el uso de células troncales en el desarrollo de una terapia para la diabetes, representadas por células troncales embrionarias y adultas. Los estudios han reportado que las células troncales embrionarias pueden ser diferenciadas ex vivo en células productoras de insulina, las que se ha demostrado que son capaces de curar la hiperglicemia cuando son transplantadas en ratones diabéticos [Fujikawa T, Oh SH, Pi L, Hatch HM, Shupe T, Petersen BE (2005) Teratoma formation leads to failure of treatment for type I diabetes using embryonic stem cell-derived insulin-producing cells. (La formación de teratomas lleva a una falla del tratamiento de la diabetes de tipo I usando células productoras de insulina derivadas de células troncales embrionarias.) Am J Pathol, 166, 1781- 1791; D'Amour KA, Bang AG , Eliazer S, Kelly OG, Agulnick AD , Smart NG, Moorman MA, Kroon E, Carpenter MK , Baetge EE (2006) Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. (Producción de células endocrinas que expresan hormonas pancreáticas a partir de células troncales embrionarias.) Na t Biotechnol, 24, 1392 - 1401] . Sin embargo, las células troncales embrionarias presentan el gran problema clínico de generar cáncer cuando son transplantadas [Kroon E, Martinson LA, Kadoya K, Bang AG , Kelly OG, Eliazer S, Young H, Richardson M , Smart NG , Cunningham J, Agulnick AD , D'Amour KA, Carpenter MK, Baetge EE (2008) Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin- secret ing cells in vivo. (El endodermo pancreático derivado de células troncales embrionarias humanas genera células secretoras de insulina que responden a la glucose in vivo.) . Na t Biotechnol., 26, 397-398] .

Ha habido reportes que indican que las células progenitoras endodérmicas pueden diferenciarse en células productoras de insulina [Hori Y, Gu X, Xie X, y Kim SK. (2005) Differentiation of insulin-producing cells from human neural progenitor cells. (Diferenciación de células productoras de insulina a partir de células progenitoras neurales humanas.) LPLOS Med. 2, 103] y que las células epiteliales del conducto pancreático pueden diferenciarse en las mismas estructuras que las de los islotes de Langerhans en el páncreas [Bonner-Weir S, Taneja M, Weir GC, . "Tatarkiewicz K, Song KH, Sharma A y O'Neil JJ (2000) . In vitro cultivation of human islets from expanded ductal tissue.. (Cultivo in vitro de islotes humanos a partir de tejido de conducto expandido.) Proc Nati Acad Sci USA. 97, 7999-8004] . Lo primero no es conveniente debido a que las células productoras de insulina fueron obtenidas a partir de células cerebrales que pueden inducir tumores en los receptores. [Amariglio N, Hirshberg A, Scheithauer BW, Cohén Y, Loewenthal R, Trakhtenbrot L, Paz N, Koren-Michowitz M, Waldman D, Leider-Trejo L, Toren A, Constantini S, Rechavi G. Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient. (Tumor cerebral derivado del donante después de un transplante de células troncales en un paciente con ataxia telangiectasia.) PLoS Med. 2009 Feb 17; 6(2) : el000029] . Lo último tampoco es conveniente debido a que sólo puede obtenerse una cantidad muy limitada de células a partir de tejidos de conducto. Además, se ha reportado que cuando las células troncales embrionarias son inducidas a diferenciarse en un medio que contiene insulina, la insulina secretada por las. células diferenciadas es de hecho la insulina captada desde, el medio, tal como ha sido demostrado por el hecho de que un propéptido que se divide en insulina y péptido C no es secretado [Rajagopal J, Anderson J, Kume S, Martínez 01, y Melton DA (2003) Insulin staining of ES cell progeny from insulin uptake . (Tinción de insulina de la progenie de células troncales embrionarias mediante captación de insulina.) Science.299, 363; Hansson M, Tonning A, Frandsen U, Petri A, Rajagopal J, Englund MC, Heller RS, Hakansson J, Fleckner J, Skold HN, Melton K, Semb H, y. Serup P (2004) Artifactual insulin reléase from differentiated embryonic stem cells. (Liberación de insulina artefactual a partir de células troncales embrionarias.) Diabetes . 53, 2603-2609] . De acuerdo a lo anterior, se ha hecho muchos intentos recientemente para inducir la diferenciación de células troncales embrionarias en ausencia de insulina. Hay reportes acerca de la diferenciación de células troncales en células productoras de insulina en presencia de factores de crecimiento tipo insulina o de betacelulina, tal cómo se resume en la Tabla 1 más abajo. Los problemas éticos y la generación de cánceres, como se mencionó anteriormente, hacen difícil el uso dé células troncales embrionarias en la terapia para la diabetes mellitus. Adicionalmente , sólo se observa niveles notablemente bajos de insulina y péptido C después de la diferenciación de células troncales pluripotenciales basadas en fibroblastos de piel humana o células troncales mesenquimatosas .

TABLA 1 Estudios acerca de diferenciación ex vivo de células troncales en células productoras de insulina ' Jiang J, Au M, Lu , Eshpeter A, Korbutt G, Fisk G, Majumdar AS (2007) Generation of insulin-próducing islet-like clusters from human embryonic stem cells. (Generación de racimos tipo islote productores de insulina a partir de células troncales embrionarias humanas.) . Stem Cells 25, 1940 - 1953. 2) Tateishi K, He J, Taranova O, Liang G, D'Alessio AC, Zhang Y (2008) Generation of insulin-secreting islet-like clusters f rom human skin fibroblasts. (Generación de racimos tipo islote productores de insulina a partir de fibroblastos de piel humana.) J Biol Chem. 283, 31601-31607. 3) Li L, Li F, Qi H, Feng G, Yuan K, Deng H, Zhou H. (2008) Coexpression of Pdxl and betacellulin in mesenchymal stem cells could promote the dif f erentiation of nestin-posi tive epithelium-like progenitors and pancreatic islet-like spheroids . (La coexpresión de Pdxl y betacelulina en células troncales me senquimatosas puede promover la diferenciación de progenitores tipo epitelio positivos para nestina y esferoides tipo islote pancreático.) Stem Cells Dev.17, 815-823.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La investigación intensiva y acuciosa que condujo a la presenté invención se llevó a cabo en un centro de terapia para diabetes mellitus de tipo 1 por los presentes inventores. Esta investigación resultó en el hallazgo de que la incubación de células troncales humanas adultas, cuando se realiza en presencia de varias citoquinas y factores de crecimiento conocidos por ser efectivos para la diferenciación en células beta en el medio, y en donde la concent ación de glucosa en el medio se cambia desde un nivel alto hasta un nivel bajo, permite la diferenciación de células troncales adultas en células productoras de insulina altamente ef icientes .

Por ende, un objeto de la presente invención es proporcionar un método para diferenciar células troncales adultas en células secretoras de insulina.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS El objetivo anterior y otros, las características y otras ventajas de la presente invención se comprenderán más claramente a partir de la siguiente descripción' : detallada tomada en conjunto con las ilustraciones anexas, en las que: La Figura 1 son mi crofotograf í as ópticas que muestran morfologías celulares después de inducir la diferenciación de células troncales derivadas de la capa subcutánea de alrededor del ojo en células secretoras de insulina durante tres semanas bajo condiciones variadas; La Figura 2 es un gráfico de barras que muestra las cantidades de insulina secretada después de inducir la diferenciación de células troncales derivadas de la capa subcutánea de alrededor del ojo en células secretoras de insulina durante tres semanas bajo condiciones variadas y expuestas durante 2 horas a glucosa 25 mM , medidas mediante un ensayo de inmunoadsorc ión ligado a enzimas; La Figura 3 es un gráfico de barras que muestra las cantidades de péptido C secretado después de inducir la diferenciación de células troncales derivadas de la capa subcutánea de alrededor del ojo en células secretoras de insulina durante tres semanas bajo condiciones variadas y expuestas durante 2 horas a glucosa 25 mM , medidas mediante un ensayo de inmunoadsorc ión ligado a enzimas; La Figura 4 muestra microfotograf ías ópticas que muestran la expresión de insulina, proinsulina, CK19 y péptido C después de inducir la diferenciación de células troncales derivadas de la capa subcutánea de alrededor del ojo en células secretoras de insulina durante tres semanas bajo condiciones variadas, medida mediante un ensayo inmunoci toquímico ; La Figura 5 es una fotografía de un gel de agarosa que muestra la expresión de genes característicos de células beta, aislados a partir de las células obtenidas después de la diferenciación de células troncales derivadas de la capa subcutánea de alrededor del ojo en células secretoras de insulina durante tres semanas La Figura 6 son microfotograf ías que muestran la tinción con ditizona, específica para células beta productoras de insulina, de las células obtenidas después de la diferenciación de células troncales derivadas de la capa subcutánea de alrededor del ojo en células secretoras de insulina durante tres semanas La Figura 7 es un gráfico de barras que muestra las cantidades de insulina secretada después de inducir la diferenciación de células troncales derivadas de la capa subcutánea de alrededor del ojo en células secretoras de insulina durante tres semanas bajo condiciones variadas y expuestas durante 2 horas a glucosa 25 mM , medidas mediante un ensayo de inmunoadsorc ión ligado a enzimas; y La Figura 8 es un gráfico de barras que muestra las cantidades de péptido C secretado después de inducir la diferenciación de células troncales derivadas de la capa subcutánea de alrededor del ojo en células secretoras de insulina durante tres semanas bajo condiciones variadas y expuestas durante 2 horas a glucosa 25 ttiM , medidas mediante un ensayo de inmunoadsorcion ligado a enzimas.

DESCRIPCIÓN DE LAS IMPLEMENTACIONES PREFERIDAS La presente invención pudo obtenerse mayormente a través de dos experimentos: uno que examinó los efectos de factores de crecimiento tipo insulina sobre ' la diferenciación, y otro en donde la diferenciación se llevó a cabo en presencia de betacelulina en lugar de activina A.

De acuerdo a uno de los aspectos de la invención, la presente invención proporciona un método para la diferenciación ex vivo dé células troncales adultas en células secretoras de insulina, que comprende: cultivar células troncales adultas durante 4 - 10 días en un medio que contiene 20 - 30 mM de glucosa, suplementado con 5 - 20% de suero fetal bovino, 1 - 10 nM de activina A, 5 - 20 nM de péptido tipo glucagón-1 y 10 - 30 ng/ml de factor de crecimiento de f ibroblas tos - 2 , y luego durante 10 -20 días en un medio que contiene 4 - 7 itiM de glucosa, suplementado con 5 - 20% de suero fetal bovino, 5 - 20 mM de nicot inamida , 1 - 10 nM de activina A, 5 - 20 nM de péptido tipo glucagón-1 y 10 - 100 ng/ml de factor de crecimiento tipo insul ina .

En detalle, se indujo células troncales adultas, aisladas de los tejidos adiposos subcutáneos de alrededor de los ojos, para diferenciarse en células secretoras de insulina para el tratamiento de la diabetes mellitus de tipo 1, en un medio en presencia de citoquinas y factores de crecimiento, incluyendo factor de crecimiento de f ibroblastos - 2 , ni cot inamida , un péptido tipo glucagón-1, activina A, un factor de crecimiento tipo insulina, etc. , con un cambio de glucosa desde una concentración alta en un primer cultivo hasta una concentración baja en un segundo cultivo.

Este método de cultivo en dos pasos se aplicó en tres grupos. Se trató un control durante 4 - 10 días con un medio que contiene 20 - 30 mM de glucosa en presencia de nicotinamida , activina A y un péptido tipo glucagón-1 (NAG) , seguido por una incubación durante 10 - 20 días en un medio que contiene 4 - 7 mM de glucosa en presencia de las mismas citoquinas [grupo NAG] , como se describe en la Solicitud de Patente Coreana No. 2007-44663, presentada previamente en mayo de 2007 por los presentes inventores. Para un segundo grupo, el tratamiento primario se llevó a cabo durante 4 - 10 días en un medio que contiene 20 - 30 mM de glucosa en combinación con suero fetal bovino, activina A, un factor- de crecimiento de f ibroblas tos - 2 y un péptido tipo glucagón-1 antes de la segunda incubación durante 10 - 20 días en un medio que contiene'' 4 - 7 mM de glucosa en combinación con suero fetal bovino, ni cot inamida , activina A, un péptido tipo glucagón-1 y factor de crecimiento tipo insulina-1 [grupo NAGI1] . Para el tercer grupo, su diferenciación se indujo de la misma manera qué para el segundo grupo, con la excepción de que se usó factor de crecimiento tipo insulina-2 en lugar de factor de crecimiento tipo insulina-1 en el segundo paso.

De acuerdo a otro de los aspectos de la invención, la presente invención proporciona uri método para la diferenciación ex vivo de células troncales adultas en células secretoras de insulina, caracterizado por el uso de betacelulina (conocida por ser efectiva para la diferenciación) y suplemento B27 (conocido por ser un suplemento del suero) . para establecer condiciones para la diferenciación y secreción de insulina con alta eficiencia (Ejemplo 7) .

Para diferenciar células troncales adultas, en detalle, se lleva a cabo una incubación durante 1 -7 días en un medio que contiene 20 - 30 mM de glucosa (medio alto en glucosa) suplementado con suplemento B27, factor de crecimiento de f ibroblas tos - 2 , y un factor de crecimiento epidérmico, y luego durante 1 - 7 días en un medio con la misma concentración de glucosa, suplementado con suero fetal bovino, activina A, factor de crecimiento de f ibrobl as tos - 2 y péptido tipo glucagón- 1.

A continuación, las células se cultivaron durante 1 - 7 días en un medio que contiene 4 - 7 mM de glucosa (medio bajo en glucosa) en presencia de citoquinas y factores de crecimiento que incluyen suero fetal bovino, activina A, factor de crecimiento de f ibroblas tos - 2 , péptido tipo glucagón-1, y finalmente durante 10 - 20 días en un medio que contiene 4 - 7 mM de glucosa suplementado con suero fetal bovino, betace luí ina , nicotinamida y péptido tipo glucagón-1.

El DMEM (medio Eagle modificado de Dulbecco) o el DMEM/ F12 (1:1 de medio Eagle modificado de Dulbecco : Mezcla de nutrientes F-12) .

Más adelante se entregará una descripción detallada de la inducción de células troncales adultas para diferenciarse en células secretoras de insul ina .

La grasa obtenida quirúrgicamente de las capas subcutáneas de alrededor del ojo o de la mejilla, se trata a 37°C durante 30 minutos con colagenasa de tipo I y luego se centrifuga. El aglomerado de células así obtenido se cultiva en un medio suplementado con suero fetal bovino para producir células troncales adultas.

Para la diferenciación en células secretoras de insulina, las células troncales se cultivan durante 15- - 30 días en medio de inducción de diferenciación. Primero, se incuban durante los primeros 4 - 10 días en un medio alto en glucosa suplementado con 5 - 20% de suero fetal bovino, 5 - 20 nM de péptido tipo glucagón-1, 1 - 10 nM de activina A y 10 - 30 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos - 2 en una placa de cultivo recubierta con colágeno. A continuación, se transfieren a un medio bajo en glucosa suplementado con 5 - 20% de suero fetal bovino, 5 - 20 mM de ni cot inami da , 5 -20 nM de péptido tipo glucagón-1, 1 - 10 nM de activina A y 10 - 100 ng/ml de factor de crecimiento tipo insulina, seguido por una incubación durante 10 - 20 días .

Al finalizar la incubación durante 15 - 30 días, las células son tratadas durante 10 - 15 horas con albúmina de suero bovino (BSA) en un medio bajo en glucosa antes de ser expuestas a un medio alto en glucosa durante 2 horas. El cultivo así obtenido finalmente se analiza cuantitativamente para medir la insulina y el péptido C usando un ensayo de inmunoadsorc ion ligado a enzimas. Se ha encontrado que la condición de diferenciación definida en la presente invención induce la secreción de insulina y péptido C en una cantidad mejorada en comparación con la condición de no diferenci ción (control negativo) . Aunque no hubo diferencias en la secreción de insulina y péptido C entre el grupo NAGI1 ( suplementado con péptido tipo insulina-1) y el grupo NAG , el uso de péptido tipo insulina-2 (grupo NAG12) permitió la secreción de ocho veces más de insulina y seis veces más de péptido C que el uso de péptido tipo insulina-1 (grupo NAGI1) . El análisis genético de las células diferenciadas en presencia de péptido tipo insulina-2 indicó que ND (neuro DI) , PC (prohormona convertasa) 1/3, PC2 , NGN3 , Glut (Transportador de glucosa) 1, Glut 2, pax4 , pdxl - todos conocidos como genes específicos de células beta del páncreas - comienzan a ser expresados cuando su diferenciación fue inducida en el medio de cultivo del primer paso y que los genes nkx 6-1 y el de la insulina se expresaron durante la incubación en el medio de cultivo del segundo paso. Además, se observó que las células expresan CK19, proinsulina, insulina y péptido C en su interior, según se demostró mediante tinción inmunoquímica , y se tiñeron fuertemente con ditizona, un pigmento específico para las células beta del páncreas.

En consecuencia, el método para diferenciar células troncales adultas en células secretoras de insulina de acuerdo a la presente invención, comprende esencialmente un proceso de cultivo en dos pasos, en donde las células troncales adultas son inducidas a diferenciarse primero en un medio alto en glucosa en presencia de factor de crecimiento de f ibroblas tos - 2 , activina A y un péptido tipo glucagón-1 y luego en un medio bajo en glucosa en presencia de nicot inamida , activina A, péptido tipo glucagón-1 y factor de crecimiento tipo insulina-2, que es superior en la eficiencia de secreción de insulina que el que se aplicó al grupo NAG , descrito en la Solicitud de Patente Coreana No. 2007-44663, presentada en mayo de 2007.

De manera alternativa, puede diferenciarse células secretoras de insulina a partir de células troncales adultas de acuerdo a la presente invención tal como sigue.

Las células troncales adultas se cultivan durante 1 - 7 días en un medio alto en glucosa que contiene 20 - 30 mM de glucosa, 0,5X - 4X de suplemento B27, 10 - 30 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos - 2 y 10 - 30 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico, posteriormente durante 1 - 7 días en un medio alto en glucosa que contiene 20 - 30 mM de glucosa, 5 - 20% de suero fetal bóvino, 1 - 10 nM de activina A, 5 - 20 nM de péptido tipo glucagóri-1 y 10 - 30 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos - 2 , luego durante 1 - 7 días en un medio bajo en glucosa que contiene 4 - 7 mM de glucosa, 5 - 20% de suero fetal bovino, 1 - 10 nM ' de activina A, 5 - 15 nM de péptido tipo glucagón-1 y 10 - 30 ng/ml de factor de crecimiento de f ibroblas tos - 2 ; y finalmente durante 10 - 20 días en un medio bajo en glucosa que contiene 5 - 20% de suero fetal bovino, 5 - 20 mM de ni cot inami da , 1 -10 ng/ml de betacelulina y 5 - 20 nM de péptido tipo glucagón- 1.

Después de la diferenciación en presencia de betacelulina, se encontró que las células diferenciadas (BTC) producen tanto insulina como péptido C, cada uno en una cantidad seis veces mayor que en el grupo NAG .

Por ende, las células diferenciadas en presencia de suplemento B27 y betacelulina en lugar de suero fetal bovino y activina A, respectivamente, pueden secretar insulina más efectivamente que el grupo NAG .

Puede obtenerse una mejor comprensión de la presente invención a través de los siguientes ejemplos que se exponen a modo ilustrativo, pero no están concebidos para limitar la presente invención.

EJEMPLO 1: Aislamiento de Células Troncales El tejido adiposo, extirpado quirúrgicamente a partir de la capa subcutánea alrededor del ojo en un hospital de cirugía plástica, con el permiso del paciente, fue tratado a 37°C durante 30 minutos con una solución al 0,075% de colagenasa de tipo 1, y luego con el mismo volumen de un medio suplementado con suero fetal bovino igual al de la solución de colagenasa, para terminar la actividad enzimática. Después de una centrifugación, el aglomerado de células así formado se lavó dos veces con un medio de cultivo y se incubó en DMEM-LG suplementado con un 10% de suero fetal bovino.

EJEMPLO 2: Cultivo de Células Troncales Las células troncales obtenidas fueron cultivadas durante 21 días en un medio inductor de diferenciación. Para esto, primero se sembró las células a una densidad de 5xl03 células/pocilio en placas de 48 pocilios recubiertos con. colágeno, a las cuales se agregó un medio que contiene 25 mM de glucosa (DMEM-HG) , suplementado con 10% de suero fetal bovino, 4 nM de activina A, 10 nM de péptido tipo glucagón-1 y 20 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos - 2 , y luego se incubaron durante 7 días . A continuación, las células fueron cultivadas adicionalmente durante 14 días adicionales en un medio que contiene 5,5 mM de glucosa (DMEM-LG) , suplementado con 10% de suero fetal bovino, 10 mM de ni cot inamida , 4 nM de activina A, 10 nM de péptido tipo glucagón-1 y .50 ng/ml de factor de crecimiento tipo insulina-1 o de factor de crecimiento tipo insul ina - 2.

Durante la incubación, el medio se recambió con medio fresco a intervalos regulares de 3 - 4 días. Después de la incubación durante un total de 3 semanas, la diferenciación de las células fue examinada como se describe a continuación.

EJEMPLO 3 : Cambios Morfológicos de las Células después de la Diferenciación Se aisló células troncales a partir de la grasa subcutánea de alrededor del ojo y se las cultivó, monitoreando los cambios morfológicos de las mismas. Mientras ' que éstas permanecen sin cambios morfológicos durante la incubación en medio libre de factores y citoquinas, se observó que las células troncales sufrieron un cambio morfológico hacia una forma redondeada cuando se las trató con, factores de crecimiento y/o citoquinas tales como nicot inamida , activina A, y péptido tipo- glucagón-1 o factor de crecimiento tipo insulina-1 o -2 (Figura 1) . En la semana 3 después de la inducción de la diferenciación, las células tomaron una morfología redondeada, formando racimos de células.

EJEMPLO 4: Examen de la Secreció de Insulin y Péptido C Después de completar la tercera semana de cultivo, se trató las células durante 12 horas con un medio de baja glucosa (DMEM-'LG) suplementado con 0,5% de albúmina de suero bovino. Luego, las células fueron expuestas durante 2 horas a un medio DMEM-HG y se las analizó cuantitativamente respecto su secreción de insulina usando un ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (Figura 2) . Además, también se midió la cantidad de péptido C, derivado junto con la insulina a partir de la proinsulina, usando un ' ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (Figura 3) . Para los ensayos de inmunoadsorción ligado a enzimas para insulina y péptido C, se empleó kits . comerciales de Mercodia, Suecia. Las soluciones estándar de concentraciones ya conocidas y los cultivos, obtenidos anteriormente se plaquearon en una cantidad de 25 µ? por pocilio en microplacas de 96 pocilios recubiertos con insulina o péptido C humanos, después de lo cual se agregó a las placas anticuerpos contra insulina o péptido C y se las incubó durante 1 hora. Posteriormente, una incubación con un sustrato T B durante 30 minutos fue seguida de una medición de absorbancia. No se secretó insulina ni péptido C a partir de células en las que no se indujo diferenciación, mientras que se detectó que en los grupos que fueron cultivados usando el método de dos pasos de la presente invención se produjo tanto insulina como péptido C. Particularmente, se detectó que el grupo cultivado en presencia de péptido tipo insulina-2 (grupo NAGI2) secretó insulina en cantidad alrededor de ocho veces mayor y péptido C en cantidad seis veces mayor que el grupo NAG .

EJEMPLO 5: Expresión de Proteínas Específicas de Células Secretoras de Insulina Después de inducir las células troncales obtenidas a .partir de la grasa subcutánea de alrededor del ojo a diferenciarse en presencia de péptido tipo insulina-2, que probó ser el más efectivo de acuerdo a la medición mediante un ensayo de inmunoadsorc ión ligado a enzimas, las células secretoras de insulina resultantes fueron ensayadas según la expresión de CK19, insulina, péptido C y proinsulina (que permanece sin cortar antes de la secreción extracelular ) , usando un ensayo inmunoc i toquimico (Figura 4) . Después de que la diferenciación continuara durante 3 semanas, las células fueron expuestas durante 2 horas a una alta concentración de glucosa, fijadas a 4°C durante 90 minutos en paraformaldehído al 4% y lavadas tres veces con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . Las células fueron tratadas durante 10 minutos con peróxido de hidrógeno al 10% para remover la peroxidasa endógena, seguido por una incubación a temperatura ambiente durante 60 minutos con PBS suplementado con albúmina de suero bovino al 2% para bloquear las señales de fondo. Los cultivos de células se hicieron reaccionar a 4°C durante 12 horas con diluciones en PBS de anticuerpos primarios contra CK19 (1:400), péptido C (1:500), insulina (1:500) y proinsulina (1:500) humanos. Para los controles negativos, se usó PBS libre de anticuerpos primarios. Las células fueron tratadas durante 20 minutos con cada anticuerpo secundario conjugado con biotina y es treptavidina conjugada con peróxido de hidrógeno, seguido de tinción con 3,3'-diaminobencidina ( DAB ) . En comparación con el control en que no se indujo diferenciación, se observó que los · grupos tratados con nicotinamida , activina A y péptido tipo glucagón tienen niveles de expresión notablemente elevados de CK19, péptido C, insulina y proinsulina (Figura 4) .

EJEMPLO 6: Expresión de Genes Involucrados en la Secreción de Insulina Usando una reacción de cadena de polimerasa para transcripción reversa (RT-PCR), se examinó células tomadas en los días 7, 14 y 21 después de que las células troncales derivadas de la capa subcutánea alrededor del ojo fueran inducidas a diferenciarse, para verificar la expresión de genes característicos de las células secretoras de insulina.

Inicialmente , se aisló ARN total de las células diferenciadas. Se agregó un mililitro de Tri-reagent (reactivo Tri) a las células en un tubo y se mezcló meticulosamente con 200 pL de cloroformo, seguido de una incubación a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de una centrifugación a 14.000 rpm durante 15 minutos, el sobrenadante formado de este modo se transfirió a un nuevo tubo y se mezcló con isopropanol. Una centrifugación a 14.000 rpm durante 10 minutos formó un aglomerado al cual se agregó a continuación etanol al 75%. Esta suspensión' fue centrifugada nuevamente a 14.000 rpm durante 10 minutos. Se retiró el sobrenadante y se evaporó el etanol al 75% remanente, después de lo cual se disolvió el residuo en agua desionizada estéril y sé incubó a 650 C durante 5 minutos para eluir el ARN. Este ARN fue analizado cuantitativamente leyendo la absorbancia a 260 nm en un espec trofotómetro UV . Se mezcló un total de 7,5 g de ARN con amortiguador de reacción lx, dNTPs 1 mM , 0,5 mg/ml de oligo-dT, 20 U de inhibidor de ARNasa y 20 U de transcriptasa reversa M-MuLV, y se agregó agua desionizada estéril para completar un volumen final de 50 pL antes de incubar la mezcla a 42°C durante 60 minutos.

Se llevó a cabo una PCR en una solución de mezcla que contiene amortiguador de Taq lx, MgCl2 2 mM , 0,25 U de polimerasa Taq y 10 pmol de cada partidor cuya secuencia es complementaria a cada gen en el ADNc , como se muestra en la Tabla 2.

La PCR comenzó con una predenaturación a 94 °C durante 5 minutos, luego 35 ciclos de denaturación a 94 °C durante 30 segundos, alineamiento a las temperaturas respectivas durante 30 segundos y extensión a 72 °C durante 30 segundos, y luego una post -elongación a 72°C durante 5 minutos. Se cargó 15 ' µL de cada uno de los productos de PCR así obtenidos junto con amortiguador de carga 6x (0,25% de azul de bromofenol, 0,25% de xilencianol, 40% de sacarosa) en un gel de agarosa al 2% y se corrió durante 30 minutos en presencia de un campo eléctrico de 100 V. Después de finalizar la elec trof oresis , se tiñó los géles con bromuro de étidio y' se los observó en un trans i luminador UV (Vilber Lourmat , Francia) . Se determinó .el nivel de expresión de cada gen y se comparó con el dé- la gliceralde ído-3 -fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como control. Para realizar análisis comparativos, se obtuvo datos a partir de tres mediciones.

Las secuencias de los partidores usados en la RT-PCR para la amplificación de los genes respectivos característicos de células secretoras de insulina, sus nombres y los tamaños de los productos de PCR, se listan en la Tabla 2 de más abajo, TABLA 2 Temp . de Tamaño Gen pare idor a 1 ineami e n o Nota (pb) CC| 5 ' - acaac 11 gg t a t c g t ggaa - 3 ' (ID SEC NO. 1) GAPDH 456 53 NM_002046 5' -aaattcgttgtcataccagg-3' (ID SEC NO . 2 ) 5' -aaccaacacctgtgcggctc-3' (ID SEC NO. 3) Insulina 320 59 J00265 5' -aagggctttattccatctctctcg- 3' (ID SEC NO. 4) 5' -cgtgaactccttgaactgagcag- 3' (ID SEC NO. 5) ng n 3 211 S 1 AF234829 5' -tggcactcctgggacgagtttc-3 ' (ID SEC NO . 6 ) 5 ' - c c c a t gga t gaag c t acg - 3 ' ( ID SEC NO . 7 ) pdxl 262 54 NM_000209 5' - gtcctcctcctttttccac-3 ' ( ID SEC NO . 8 ) 5 ' -gaataccccccagagaccttttc- 3' (ID SEC NO. 9) GK 182' 61 M90299 5' -ggtttcctcctgagccagcg-3' (ID SEC NO. 10) 5' -agcatcaatgtcctctcaacttcc- 3 ' (ID SEC NO . 11) I S .11 493 57 N _002202 5' -tgtttggcaaggcaatgacc-3' (ID SEC NO. 12) 5 ' -acacgagacccactttttccg-3' (ID SEC NO. 13) Nkx6.1 336 59 NM_006168 5' -tgctggacttgtgcttcttcaac- 3' (ID SEC NO. 14) 5 ' -agctttgcagttggtggaat-3' (ID SEC NO. 15) Glut 2 300 57 NM_000340 5' -aataagaatgcccgtgacga-3' (ID SEC NO. 16) 5 ' - c agaac c aggac a t g c c c - 3 ' (ID ND SEC O. 17 i 216 60 NM_002500 5' -atcaaaggaagggctggtg-3' (ID SEC NO. 18) 5 ' - atgaacgaggacaagcgc - 3 ' (ID SEC NO . 19) Glucagón 5 ' - g a c a c c a c c a c 11 - 3 ' (ID 236 57 NM_002054 SEC NO . 20) Tal como es evidente a partir de los datos de la Figura 5, neuro D e islet 1, ambos conocidos por tener roles importantes en el desarrollo del páncreas, y glucagón, SST (somatostatina) y PP (polipéptido pancreático) , todos secretados por células aparte de las células beta entre las células endocrinas del páncreas, se expresaron en las células en las que no se indujo diferenciación, pero cuando se indujo la diferenciación, las células comenzaron a expresar PC2 , PC1/3, GLP1R, neurogenina 3, Glut2, Glutl, pax4 y pdxl en el Día 7, y Nkx6-1 e insulina en el Día 14, y sus niveles de expresión aumentaron significativamente en el Día 21.

EJEMPLO 7: Tinción con ditizona Se sabe que la insulina es capaz de acomplejarse con iones zinc (Zn2+) para formar hexámeros . La ditizona es un agente quelante de zinc conocido por teñir selectivamente las células beta pancreáticas debido a su alto contenido de zinc. Por esto, las células diferenciadas en presencia de péptido tipo insulina-2 fueron sometidas a tinción usando ditizona. Para este efecto, se disolvió 50 mg de polvo de ditizona en 5 mi de dime t i 1 sul f óxi do (D SO) y se diluyó 10 ]iL de la solución de ditizona en 1 mi del medio de cultivo. Después de ser filtrada a través de un filtro de nylon de 0,2 pm, la solución de tinción de ditizona se hizo gotear sobre la placa de cultivo y se incubó a 37°C durante 15 minutos. Se lavó las células tres veces con PBS y se las observó bajo el microscopio óptico. Como se ve en la Figura 6, las células diferenciadas se tiñeron claramente,-mostrando un color profundo que se encontró en los racimos de células.

En resumen, como se ha descrito más arriba, cuando las células troncales derivadas de la grasa subcutánea de alrededor del ojo son tratadas primariamente con una alta concentración de glucosa en combinación con activina A, factor de crecimiento de f ibroblas tos - 2 y péptido tipo glucagón-1, seguido de una exposición a una baja concentración de glucosa en presencia de nicotinamida , activina A, péptido tipo glucagón-1 y factor de crecimiento tipo insulina-2, se diferencian en células secretoras de insulina, que produjeron insulina, péptido C y próinsulina en gran cantidad. Además, expresaron genes característicos de las células beta pancreáticas, y también fueron teñidas claramente con ditizona. En consecuencias, el método definido de acuerdo a la presente invención permite diferenciar efectivamente las células troncales adultas en células beta secretoras de insulina.

EJEMPLO 8: Cultivo de Células Troncales Las células troncales obtenidas fueron cultivadas durante 21 días en un medio inductor de diferenciación. Para esto, primero se sembró las células a una densidad de 5xl03 células/pocilio en placas de 48 pocilios recubiertos con colágeno, a las cuales se agregó un medio que contiene 25 m de glucosa (DMEM-HG) , suplementado con lx de suplemento B27, ' 20 ng/ml de factor de crecimiento de f ibroblas tos - 2 , y 20 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico, y luego se incubaron durante 3 días. A continuación, las células se cultivaron durante 4 días adicionales en un medio que contiene 25 mM de glucosa, suplementado con 10% de suero fetal bovino, 4 nM de activina A, 20 ng/ml de factor de crecimiento de f ibroblas tos - 2 y 10' nM de péptido tipo glucagón-l. A continuación, se cultivó las células durante 3 días en un medio que contiene 5,5 mM de glucosa (DMEM-LG) , suplementado con un 10% de suero fetal bovino, 4 nM de activina A, 20 ng/ml de factor de crecimiento de f ibroblas tos - 2 y 10 nM de péptido tipo glucagón-l, y luego se las transfirió a un nuevo medio que contiene 5,5 nM de glucosa (DMEM-LG), suplementado con 10 mM de nicot inamida , 10 nM de péptido tipo glucagón-l y 10 ng/ml de betacelulina antes de ser incubadas durante 10 días adi c iona 1 es.

Durante la incubación, el medio se recambió con medio fresco a intervalos regulares de 3 - 4 días.

Después de la incubación durante un total de 3 semanas, la diferenciación de las células fue examinada como se describe a continuación.

EJEMPLO 9: Examen de la Secreción de Insulina y Péptido C Después de completar la tercera semana de cultivo, se trató las células durante 12 horas con un medio de baja glucosa (DMEM-LG) suplementado con 0,5% de albúmina de suero bovino. Luego, las células fueron expuestas durante 2 horas a un medio DMEM-HG y se las analizó cuantitativamente respecto a su secreción de insulina usando un ensayo de inmunoadsorc ión ligado a enzimas (Figura 7) . Además, también se midió la cantidad de péptido C, derivado junto con la insulina a partir de la proinsulina, usando un ensayo inmunocitoquímico (Figura 8) . Para los ensayos de inmunoadsorción ligado a enzimas para insulina y péptido C, se empleó kits comerciales de Mercodia, Suecia. Las soluciones estándar de concentraciones ya conocidas y los cultivos obtenidos anteriormente se plaquearon en una cantidad de 25 µ? por pocilio en microplacas. de 96 pocilios recubiertos con insulina o péptido C humanos, después de lo cual se agregó a los pocilios anticuerpos contra insulin o péptido C y se las incubó durante 1 hora. Después, se agregó a los pocilios 200 yL de una solución de sustrato TMB . Después de una incubación durante 30 minutos, se midió su absorbancia. No se secretó insulina ni péptido C a partir de células en las que no se indujo diferenciación, mientras que se detectó que en los grupos que fueron cultivados usando el método de dos pasos de la presente invención se produjo tanto insulina como péptido C. Particularmente, se detectó que el grupo cultivado de la misma manera que en el Ejemplo 8 secretó alrededor de 6 veces más insulina y alrededor de 6 veces más péptido C que el grupo NAG .

Al producir insulina y péptido C en cantidades 7 8 veces mayores que las producidas por el grupo NAG que se divulga en la Solicitud de Patente Coreana No. 2007-44663 presentada en mayo de 2007, se espera que las células secretoras de insulina diferenciadas a partir de células troncales adultas en un medio de cultivo de acuerdo a la presente invención, como se ha descrito hasta ahora, sean una cura excelente para la diabetes mellitus de tipo 1.

Aunque se ha divulgado las implementaciones preferidas de la presente invención con fines ilustrativos, aquéllos experimentados en el arte podrán ver que son posibles "varias modificaciones, adiciones y sustituciones, sin alejarse del alcance y el espíritu de la invención como se divulga en las reivindicaciones anexas.

Claims (3)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Un método para la diferenciación ex vivo de células troncales adultas en células secretoras de insulina, CARACTERIZADO porque comprende: cultivar las células troncales adultas durante 4 - 10 días en un medio que contiene 20 - 30 mM de glucosa suplementado .con 5 - 20% de suero fetal bovino, 1 - 10 nM de activina A, 5 - 20 nM de péptido tipo glucagón-1 y 10 - 30 ng/ml de factor de crecimiento de f ibroblas tos - 2 ; y cultivar las células troncales cultivadas durante 10 - 20 días en un medio que contiene 4 - 7 mM de glucosa suplementado con 5 - 20% de suero fetal bovino, 5 - 20 mM de nicotinamida , 1 - 10 nM de activina A, 5 - 20 nM de péptido tipo glucagón-1 y 10 - 100 ng/ml de factor de crecimiento tipo insul ina .

2. El método de acuerdo a la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque el factor de crecimiento tipo insulina es el factor de crecimiento tipo insulina-2

3. Un método para la diferenciación ex vivo de células troncales adultas en células secretoras de insulina, CARACTERIZADO porque comprende cultivar secuencialmente las células troncales adultas: durante 1 - 7 días en un medio que contiene 20 - 30 mM de glucosa, suplementado con suplemento B27, 10 - 30 ng/ml de factor de crecimiento . de fibroblastos - 2 y 10 - 30 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico; durante 1 - 7 días en un medio que contiene 20 - 30 mM de glucosa suplementado con 5 - 20% de suero fetal bovino, 1 - 10 nM de activina A, 5 - 20 nM de péptido tipo glucagón-1 y 10 - 30 ng/ml de factor de crecimiento de f ibrob'las tos - 2 ; durante i - 7 días en un medio que contiene 4 - 7 mM de glucosa suplementado con 5 - 20% de suero fetal bovino, 1 - 10 nM de activina A, 5 - 20 nM de péptido tipo glucagón-1 y 10 - 30 ng/ml de factor de crecimiento de f ibroblas tos - 2 ; y durante 10 - 20 días en un medio que contiene 4 - 7 mM de glucosa suplementado con 5 - 20% de suero fetal bovino, 5 - 20 mM de nicot inamida , 1 - 10 ng/ml de betacelulina y 5 - 15 nM de péptido tipo glucagón.