KR20080023081A

KR20080023081A - 인간배아 줄기세포로부터 췌장전구세포로의 분화유도 방법

Info

Publication number: KR20080023081A
Application number: KR1020060118102A
Authority: KR
Inventors: 김종훈; 심중현
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2006-09-08
Filing date: 2006-11-28
Publication date: 2008-03-12
Also published as: KR100885854B1

Abstract

본 발명은 인간배아 줄기세포로부터 배아체가 형성되는 과정에서 혈청, 액티빈 (activin A) 및 레티노산 (retinoic acid)을 순차적으로 처리하여 췌장내배엽이 증가된 배아체를 유도하고, 이를 췌장으로 분화 가능한 췌장전구세포로 분화를 촉진시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 이미 어느 정도 분화가 진행된 성체줄기세포와는 달리 배아줄기세포는 여러 단계의 분화과정을 거쳐 기능성 체세포로 분화가 되며, 각 단계에서 원치 않는 세포로 분화될 가능성이 있으므로, 초기 내배엽으로의 효과적인 단계별 분화촉진 및 이에 뒤따르는 췌장세포로 분화시킬 수 있다. 또한, 배아줄기세포로부터 내배엽으로의 분화를 우선적으로 촉진시킨 뒤, 췌장세포로의 분화를 유도할 경우 기존의 분화유도방법보다 췌장세포로의 분화수율을 증가시켜 대량의 췌장베타세포를 획득할 수 있다.

인간배아 줄기세포, 췌장전구세포, 혈청, 액티빈, 레티노산, 췌장 내배엽, 배아체, 췌장베타세포

Description

인간배아 줄기세포로부터 췌장전구세포로의 분화유도 방법 {Method for differentiation of pancreatic progenitor cells from human embryonic stem cells}

도 1은 본 발명의 췌장세포 분화유도 방법에 사용된 원재료가 미분화 인간배아줄기세포의 대표적인 특성을 보유하고 있음을 증명하는 분석결과이다.

도 2는 배아줄기세포의 초기 분화과정인 배아체 (embryoid body) 형성 과정동안, 혈청 (fetal bovine serum), 액티빈 (activin A) 및 레티노산 (retinoic acid, RA)의 처리에 의하여 초기배아 발생과정에서 나타나는 삼배엽성 세포 (내배엽, 중배엽, 외배엽) 중 췌장으로 분화가 가능한 내배엽세포로의 분화가 능동적으로 촉진될 수 있음을 나타내는 분석결과이다.

도 3은 혈청 20 %, 액티빈 30 ng/ml 및 RA 10 μM를 순차적으로 처리한 배아체의 형태 및 면역형광염색기법으로 분석한 초기분화양상을 대조군 (SF10)과 비교한 결과이다.

도 4는 인간배아 줄기세포로부터 내배엽으로의 분화가 능동적으로 이루어짐을 보여주며, 내배엽으로 분화된 세포들이 췌장 전구세포로 분화되는 과정을 증명한 분석결과이다.

도 5는 혈청, 액티빈 및 RA의 순차적인 처리 (seurm/activin A/RA)하에 인간배아 줄기세포로부터 분화된 췌장전구세포들 (Pdx1 발현세포)이 추가적인 분화과정에서 정상 췌장에 존재하는 랑게르한스섬 (Langerhan's islets, pancreatic islet)과 유사한 세포 집합체를 형성함을 보여주는 분석결과이다.

도 6은 본 발명의 췌장전구세포 분화방법으로 인간배아 줄기세포에서 생산된 췌장전구세포의 기능 및 당뇨병치료의 가능성을 당뇨병 실험동물모델에서 입증한 분석결과이다.

본 발명은 인간배아 줄기세포로부터 췌장전구세포로의 분화유도 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 인간배아 줄기세포로부터 배아체가 형성되는 과정에서 혈청, 액티빈 (activin A) 및 레티노산 (retinoic acid)을 순차적으로 처리하여 췌장내배엽이 증가된 배아체를 유도하고, 이를 췌장으로 분화 가능한 췌장전구세포로 분화를 촉진시키는 방법에 관한 것이다.

현재 당뇨병은 2억 명 이상의 환자들이 겪고 있는 질병이며, 2025년에 이르면 환자의 수가 2배로 증가될 것으로 예상된다. 인슐린 의존성인 제 1형 당뇨병은 췌장 내 베타세포의 자가면역반응에 의해 파괴되는 질병으로서 이 병에 걸린 환자는 지속적으로 인슐린 주사를 맞아야 하고 망막질환, 심장 및 신장 질환, 신경장애 등의 합병증에 의해 극심한 고통을 겪게 된다. 최근 당뇨병을 근본적으로 치료하기 위한 한 방편으로서 랑게르한스섬의 이식이 시도되고 있으나 췌장의 공여자가 극히 부족한 실정이다.

배아줄기세포로부터 당뇨병 치료를 목적으로 하는 인슐린 분비성 췌장세포의 분화유도기술은 대부분이 마우스배아줄기세포를 이용한 연구결과에 의존적인 반면, 마우스와 인간의 발생과정에 차이점, 인간배아줄기세포와 마우스 배아줄기세포 간에 보여지는 형태학적, 세포생리학적 차이 및 배양조건의 차이에 기인하여 인간배아줄기세포에 적용가능한 분화유도기법의 개발이 필요한 상황이다. 그리고, 배아줄기세포로부터 외배엽 유래의 신경세포 및 중배엽 유래의 심혈관계 세포로의 분화유도에 관련해서는 최근 많은 연구보고가 있었으나, 내배엽성세포 분화유도의 기술적 어려움에 기인하여 췌장세포로의 연구보고는 매우 제한적으로 이루어지고 있다.

현재까지 보고된 인간배아줄기세포의 췌장세포 분화연구는 췌장세포의 원기인 내배엽세포를 능동적으로 순도 높게 분화시키지 않았으며, 수동적인 자연분화방식을 채택하여 분화된 췌장세포의 수가 매우 적으며, 분화시킨 췌장세포의 기능을 당뇨실험동물모델에서 검증하지 못하였다. 또한, 당뇨병의 세포치료적 관점에서 최근 랑게르한스섬 (pancreatic islet)의 이식이 당뇨병치료에 효과적임이 알려졌으나, 공여자의 부족 및 랑게르한스섬 체외증폭의 기술적 한계에 기인하여, 다량의 세포확보가 핵심이 되는 세포치료제로서의 효용성에 문제가 있다.

이러한 문제를 해결해 줄 수 있는 한가지의 수단이 무한 증식력을 보유하는 인간배아줄기세포를 이용하는 것이다. 따라서 본 발명이 이루고자 하는 궁극적인 목표는 임상적으로 이용 가능한 췌장세포를 인간배아줄기세포로부터 분화시켜 환자에게 공여하기 위하여 우선적으로 요구되는 인간배아 줄기세포로부터 인슐린 분비성 췌장베타세포의 능동적이고 효과적인 분화유도기술의 개발이다.

특히 본 발명에서는 인체를 구성하는 약 200여종의 세포로 분화될 수 있는 인간배아줄기세포를 원치 않는 세포로의 분화를 억제하고 당뇨병 치료를 위한 다량의 췌장 베타세포로 능동적으로 분화시키기 위한 기술개발에 초점을 맞추었다. 우선 배아체 형성과정 중 췌장 베타세포의 전구세포인 내배엽성세포로의 분화를 촉진시키는 인자를 그 농도 및 처리시점을 고려하여 처리하여 내배엽으로의 분화를 촉진 시킨 후 추가 분화과정을 통하여 췌장전구세포로 분화시키었으며, 그 췌장전구세로부터 형성된 랑게르한스섬과 유사한 세포집합 구조체들 (cell clusters)을 당뇨병 실험동물 모델에 이식하여 그 기능성을 검증하였다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 인간배아 줄기세포로부터 배아체가 형성되는 과정에서 혈청, 액티빈 (activin A) 및 레티노산 (retinoic acid)을 순차적으로 처리하여 췌장내배엽이 증가된 배아체를 유도하고, 이를 췌장으로 분화 가능한 췌장전구세포로 분화를 촉진시키는 경우, 랑게르한스섬과 유사한 세포집합 구조체들 (cell clusters)을 형성하여 당뇨병 실험동물 모델에 이식할 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 인간배아 줄기세포로부터 췌장세포의 원기인 내배엽세포를 능동적으로 순도 높게 분화시킬 수 있는 인간배아 줄기세포의 췌장전구세포로의 분화유도 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 인간배아 줄기세포로의 췌장전구세포로의 분화유도 방법을 이용하여 분화된 췌장전구세포를 랑게르한스섬과 유사한 세포집합 구조체들 (cell clusters)을 형성시켜 당뇨병 환자의 치료에 이용하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 인간배아 줄기세포로부터 배아체가 형성되는 과정에서 혈청, 액티빈 (activin A) 및 레티노산 (retinoic acid)를 순차적으로 처리하여 췌장내배엽이 증가된 배아체를 유도하는 것을 특징으로 하는 췌장으로 분화 가능한 췌장전구세포의 분화 유도 방법을 제공한다.

본 발명의 줄기세포로부터 췌장전구세포로 분화시키는 방법에 있어서, 인간배아 줄기세포를 혈청으로 처리하여 삼배엽성 배아체를 유도하는 1단계, 상기 1단계의 삼배엽성 배아체를 액티빈으로 처리하여 내배엽 (endoderm)성 배아체로 유도하는 2단계, 상기 2단계의 배아체를 레티노산으로 처리하여 췌장내배엽이 증가된 배아체로 유도하는 3단계, 및 상기 3단계의 췌장내배엽이 증가된 배아체를 배양접시에 부착하여 ITS (Insulin, Transferrin, Selenite)와 파이브로넥틴 (fibronectin)이 첨가된 무혈청 배양액에서 배양하는 4단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 1단계는 15 ~ 25 %의 혈청이 첨가된 배양액에서 3 ~ 5일간 배양하는 것이 좋으나, 바람직하게는 20 %의 혈청이 첨가된 배양액에서 4일간 배양하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 2단계는 바람직하게는 액티빈 25 ~ 35 ng/ml로 처리하여 3 ~ 5일간 배양하는 것이 좋으나, 바람직하게는 액티빈 30 ng/ml로 처리하여 4일간 배양하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 3단계는 5 ~ 15 μM 레티노산으로 처리하여 1 ~ 3일간 배양하는 것이 좋으나, 바람직하게는 10 μM 레티노산으로 처리하여 2일간 배양하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 실시예에서 무혈청 배양액 (serum-free), 혈청과 액티빈의 처리 (serum/activin A), 또는 혈청과 액티빈, RA의 순차적인 처리 (serum/activin A/RA)하에서 분화된 배아체를 내배엽성 및 췌장 전구세포의 표지인자로 염색한 후 분화효율을 측정한 결과, 혈청과 액티빈, RA의 순차적인 처리에 의해 내배엽 및 췌장 전구세포에 특이적인 유전자를 발현하는 세포의 수가 무혈청 배양액, 또는 혈청과 액티빈의 처리와 비교할 때 현저하게 증가되었다. 반면, 중내배엽 혹은 중배엽의 표지 유전자의 발현이 감소하였으며, 이는 중내배엽 (mesendoderm)으로부터 중배엽 (mesoderm)보다는 내배엽 (endoderm)으로의 분화가 촉진되었음을 증명하는 것이다 (도 4a 참조).

본 발명에 있어서, 상기 4단계는 인슐린 4 ~ 6 mg/l, 트랜스페린 40 ~ 60 mg/l, 셀레나이트 0.4 ~ 0.6 mg/l와 3 ~ 7 μg/ml의 fibronectin이 첨가된 무혈청 배지에서 10 ~ 15일간 배양하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 췌장전구세포를 증식과 세포이동과정을 통하여 3차원적 세포집합체를 형성시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 췌장전구세포의 증식이란 세포배양접시에서 ITS media에 배양했을때 세포분열이 일어나 세포수가 증가함을 의미하고 세포이동과정은 이렇게 췌장전구세포의 증식에 의해 볼모양의 세포집합 구조체가 형성되어 budding이 됨을 의미한다.

본 발명의 배아줄기세포로부터 혈청, 액티빈, RA의 순차적인 처리하에 분화된 배아체를 부분적으로 해체하여 파이브로넥틴이 첨가된 ITS 배양액에서 추가적으로 분화시킬 경우, 이러한 배아체는 췌장전구세포로 분화한 후 췌장전구세포 집합체 (monolayer 상태)를 형성하고 이후 추가분화 10 ~ 13일 사이에 랑게르한스섬과 유사한 3차원적 세포집합체구조를 형성한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 분화방법 또는 그 단계 중 어느 한 단계에 따른 방법으로 분화된 췌장전구세포를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 분화된 췌장전구세포를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료용 세포치료제를 제공한다.

본 발명의 당뇨병 치료용 세포치료제란 체외에서 인간배아 줄기세포로부터 췌장전구세포의 분화를 유도하여 췌장전구세포를 대량 증식 및 활성화시켜 당뇨병 환자에게 투여하여 췌장베타세포로 성장시키거나 혹은 랑게르한스섬과 같은 세포집합체를 형성시켜 당뇨병 치료에 이용할 수 있도록 만든 세포치료제를 말한다.

본 발명의 당뇨병 치료용 세포치료제는 당업계에 일반적인 제형, 예컨대, 주사제의 형태로 제조될 수 있으며, 외과수술적으로 췌장부위에 직접 이식하거나, 정맥에 투여된 후 췌장부위로 이동할 수 있다. 본 발명의 세포치료제의 투여량은 환자의 중함정도, 투여경로, 환자의 나이 및 성, 및 질병의 정도에 따라 변할 수 있으나, 바람직하게는 평균 성인의 경우, 1 × 10⁷ ~ 10¹¹ 세포를 투여한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 배아체의 형성과정 중 췌장내배엽세포를 포함하는 내배엽으로의 분화촉진 ( Enrichment of pancreatic endoderm during EB formation )

인간배아 줄기세포로부터 배아체 (embryoid body)를 형성함으로서 분화유도를 개시하였다. 배아체는 배아줄기세포를 부유 배양하였을 경우 형성되는 구형 세포집합체 (spherical cell cluster)로서, 체내에서 일어나는 초기 배발생 과정 특히 내배엽, 외배엽, 중배엽을 형성하는 시기인 낭배기 (gastrulation)와 매우 유사한 분화과정이 배아체 형성 과정중 진행되었다. 우선 본 발명에서 사용된 인간배아줄기세포가 미분화 배아줄기세포의 특성을 보유하는 지를 판단하기 위하여 배아줄기세포가 형성하는 세포콜로니의 형태 및 표지인자 (Oct4, Nanog, Rex1, SSEA4, Alkaline phosphatase)를 유전자와 단백질 수준에서 분석하였다 (도 1 참조).

도 1의 a는 전형적인 인간배아 줄기세포의 형태를 보유하는 세포콜로니를 나타내고, 도 1의 b는 인간배아 줄기세포에 특이적으로 나타나는 알칼라인 포스파타제 (청색) 활성을 나타낸다. 도 1의 c는 미분화 인간배아 줄기세포의 세포표면 항원 중의 하나인 SSEA4 (녹색)를 나타내며, 도 1의 d는 미분화 인간배아 줄기세포에 특이적으로 발현되는 전사조절인자인 Oct4 (적색)와 Nanog (녹색)를 나타낸다. 그리고, 도 1e는 인간배아 줄기세포가 미분화 표지인자인 Oct4, Nanog, 및 Rex1을 특이적으로 발현하고 있으며, 초기 자발적 분화가 일어났을 시에 나타나는 유전자 (Sox17, Foxa2, Mixl1, T (brachyury), Pax6, Sox1, Nestin)는 발현하고 있지 않음을 확인함으로써, 본 발명에 사용된 인간배아 줄기세포가 미분화 인간배아 줄기세포의 특성을 보유하고 있음을 RT-PCR 기법으로 검증한 것이다.

배아줄기세포로부터 배아체를 형성하기 위하여 콜라게나제 타입 4 (Collagenase type IV)를 처리하여 인간배아 줄기세포를 공동배양 (co-culture) 중인 마우스 배아 섬유아세포 (fibroblast, 인간배아줄기세포의 미분화유지에 필요)로부터 분리하였다.

췌장 전구세포로의 분화를 유도하기 위해 분리된 인간배아 줄기세포주 콜로니를 파이펫을 이용, 흡입과 배출을 반복하여 물리적으로 작은 세포집합체로 부순 뒤, 20 %의 혈청 (fetal bovine serum, Gibco)이 첨가된 배양액 (DMEM/F12 배지, Gibco)에서 4일간 배양하였다 (배아체형성). 이후 혈청이 첨가되지 않은 배양액 (DMEM/F12 배지에 20% serum replacement (Gibco)가 첨가된 배지)에서 배아체를 분화시키면서, 정상 배발생 과정 중 내배엽 및 중배엽으로의 분화에 관여하는 것으로 알려진 액티빈을 본 발명의 과정에서 췌장내배엽의 표지인자인 Pdx1의 발현에 최적농도로 증명된 30 ng/ml로 처리하면서 4일간 추가배양 하였다.

도 2a는 혈청 20 %를 4일 동안 처리한 뒤, 혈청이 첨가되지 않은 배양액에서 6일간 분화시킨 배아체 (S4/SF6)에서, 혈청이 첨가되지 않은 배양액 (SF10), 또는 혈청이 첨가된 배양액에서 지속적으로 10일간 분화시킨 배아체보다 내배엽-특이 유전인자 (Foxa2, Sox17)의 발현이 가장 높게 나타남을 나타낸다. 도 2b는 혈청을 배아체 형성 과정중 초기 4일간 처리한 배아체에서, 중배엽 (mesoderm)과 내배엽 (endoderm)으로의 분화가 모두 가능한 중내배엽 (mesendoderm)의 표지인자인 T를 발현 (녹색)하는 세포가 대조군 (SF10)에 비하여 2배 이상 증가되었음을 나타낸다. 도 2c는 혈청을 배아체 형성 과정 중 초기 4일간 처리한 뒤, 무혈청 배양액에서 여러 농도의 액티빈을 6일간 처리하여 배아체를 형성함을 나타내며, 각기 다른 농도의 액티빈 자극을 받은 배아체로부터, Pdx1 (췌장전구세포의 특이적 유전인자)의 발현양을 분석하여 췌장내배엽으로의 분화에 최적인 액티빈의 농도로서 30 ng/ml을 결정하였다.

혈청과 액티빈의 처리에 의해 내배엽으로의 분화가 촉진된 배아체 (도 2a 및 도 2b)를 DMEM/F12 배지에 20% serum replacement(Gibco)가 첨가된 배지에 추가적으로 30 ng/ml의 액티빈을 처리한 배지에서 정상 췌장발생에 관여하는 것으로 알려진 레티노산 (RA, 10 μM)을 2일간 더 처리하여 최종 10일간의 배아체 형성 과정을 완료하였다 (RA의 처리시점은 RA가 정상 배발생 과정 중 낭배기말기에 췌장형성을 유도한다는 사실에 착안하여 본 발명의 배아체 형성 과정 마지막 2일간 처리하였 다). 배아체 형성이 종료되면 배아체의 일부를 수획하여 원시내배엽, 중내배엽, 내배엽, 외배엽 그리고 췌장내배엽으로의 분화양상을 유전자발현 및 단백질생산 정도로 분석하여 (도 2d, 도 3 및 도 4) 내배엽으로의 분화촉진 및 원치 않는 세포 (원시내배엽, 중배엽, 외배엽)로의 분화억제정도를 면역형광염색 및 유전자발현분석으로 검증하였다.

도 2d는 혈청과 액티빈 30 ng/ml 및 RA 10 μM을 배아체 형성 과정 중 각각 4일, 4일 및 2일간 순차적으로 처리 (seurm/activin A/RA) 하였을 경우, 무혈청 배양액에서 10일간 (SF10) 분화시킨 배아체 및 RA가 업는 상태에서 혈청과 액티빈의 자극만을 각각 4일과 6일 동안 배아체 (seurm/activin A)에 비교하여, 신경외배엽 표지 유전인자 (Pax6와 Sox1)와 중내배엽의 표지 유전인자 (Mixl1과 T) 발현이 감소하는 동시에, 내배엽 (Foxa2와 Sox17)과 췌장 내배엽 (Pdx1과 Hlxb9) 특이적 유전인자의 발현이 유의성 있게 증가됨을 나타낸다.

도 3의 a와 b는 혈청이 첨가되지 않은 배양액 (serum-free culture)에서 분화된 배아체와 혈청, 액티빈 및 RA를 배아체 형성 과정 중 처리하여 분화시킨 배아체의 형태학적 차이를 나타내는 위상차 현미경 사진이다. 무혈청 배양액에서 분화된 배아체는 배아체의 일반적인 특징으로 나타나는 배아체 표면의 원시내배엽 (primitive endoderm)형성이 뚜렷하게 관찰되고 (도 3의 a에서 화살표머리), 반면에 혈청과 액티빈 및 RA의 자극을 받을 경우 원시내배엽의 형성이 관찰되지 않으며 배아체를 구성하는 세포들이 보다 밀집되어 있고 매끄러운 배아체 표면을 나타낸다 (도 3의 b) (원시내배엽, primitive endoderm은 췌장세포의 원기인 진정내배엽, definitive endoderm 혹은 장내배엽, gut endoderm과는 다른 조직으로 배아외조직 (extraembryonic tissue)인 태반형성에 관여함).

도 3의 c와 d는 a와 b에서 보인 형태학적 차이를 면역형광염색 기법으로 분석하여, 혈청, 액티빈 및 RA의 처리에 의하여 원시내배엽으로의 분화가 억제되고, 반면에 췌장의 원기인 장내배엽으로의 분화가 촉진됨을 보여주는 분석결과이다. 배아체 표면에 존재하며 GATA4 (녹색)와 α-fetoprotein (AFP, 적색)를 동시에 발현하는 세포는 원시내배엽이며, 배아체 내부에 존재하며 AFP의 발현 없이 GATA4만을 발현하는 세포는 장내배엽이다. GATA4와 AFP에 특이적인 항체를 이용하여 면역형광염색을 실시하였을 경우, 무혈청 배양액에서 분화된 배아체는 원시내배엽을 세포 표면에 보유 (a: 화살표부분을 의미하며 투명한 막과 같은 부분)하는 반면, 혈청과 액티빈, RA의 자극을 받은 배아체에서는 원시내배엽이 발견되지 않고 잘 발달된 장내배엽이 관찰된다 (b: a와 다르게 막과 같은 부분이 나타나지 않고 d,f에서와 같이 장내배엽 마커의 발현이 나타남). 도 3의 e와 f는 장내배엽에서 특이적으로 발현되는 Foxa2와 Sox17을 모두 발현하는 세포의 양이 무혈청배양액에서 자란 배아체 (도 3의 e)에 비하여, 혈청과 액티빈, RA의 순차적인 자극을 배아체 내에서 현저하게 증가되며, 이들 세포들이 위장관 (intestinal tube)과 유사한 구조물을 형성하는 것이 관찰됨 (도 3의 f).

도 3의 g와 h는 장내배엽과 달리 추후 분화가 진행되면 신경계를 형성하는 신경외배엽세포는 Pax6와 Nestin (Nes)을 발현하며, 이들 신경외배엽세포는 대조군인 무혈청배양액에서 분화된 배아체에서 다수 발견이 되지만 (도 3의 g), 혈청과 액티빈, RA의 순차적인 자극을 배아체 내에서 현저하게 감소됨이 관찰되었다 (도 3의 h).

따라서, 도 3은 배아체 형성과정 중 혈청과 액티빈, RA의 순차적인 처리에 의해 원시내배엽, 신경외배엽으로의 분화가 억제됨과 동시에, 췌장의 원기인 장내배엽의 분화가 촉진됨을 보여준다.

도 4a는 무혈청 배양액 (serum-free), 혈청과 액티빈의 처리 (serum/activin A), 혹은 혈청과 액티빈, RA의 순차적인 처리 (serum/activin A/RA)하에서 분화된 배아체를 내배엽성 및 췌장 전구세포의 표지인자로 염색한 후 분화효율을 계수화한 그래프이다. 혈청과 액티빈, RA의 순차적인 처리에 의해 내배엽 (Foxa2, Sox17, GATA4, Cdx2) 및 췌장 전구세포 (Pdx1)에 특이적인 유전자를 발현하는 세포의 수가 현저하게 증가함이 확인되었다. 반면에 중내배엽 혹은 중배엽의 표지 유전자인 T의 발현이 감소함이 나타나며, 이는 중내배엽 (mesendoderm)으로부터 중배엽 (mesoderm)보다는 내배엽 (endoderm)으로의 분화가 촉진되었음을 나타낸다.

도 4b는 본 발명에 사용된 Pdx1 항체가 실제 인간의 췌장내에 존재하는 Pdx1단백질에 특이성을 보유하고 있음을 검증한 분석결과이다 (녹색). 도 4c는 무혈청배양액 (serum-free) 혹은 혈청과 액티빈, RA의 순차적인 처리 (serum/activin A/RA)하에 분화된 배아체를 각각 췌장전구세포의 표지인자인 Pdx1 (녹색)과 Nestin (적색)으로 염색한 분석결과이다. 무혈청 배양액에서 분화된 배아체의 경우 다수의 세포들이 Nestin을 발현하고 있으며, 췌장전구세포의 특이 유전자인 Pdx1을 발현하는 세포는 본 발명의 도 4a에 나타난 계수화 그래프와 일치하여 무혈청 배양액에서 자란 배아체에서 매우 적게 관찰되지만, 혈청과 액티빈, RA의 순차적인 처리에 의해 분화된 배아체에서는 Pdx1을 발현하는 세포의 수가 현저하게 증가되었다. 또한 이들 Pdx1을 발현하는 세포들 중 일부가 내배엽 표지인자인 Foxa2를 동시에 발현하는 것을 보임으로서 이 세포들이 내배엽으로부터 췌장전구세포로 분화되는 중간과정에 있음을 증명하였다.

도 4d는 정상적인 배발생 과정 중 췌장은 원시장관 (primitive gut endoderm tube)에서 돌기 (bud)의 형태로 자라나 발생되어짐을 나타낸다. Cdx2는 원시장관에서 발현되는 전사조절인자로서, 혈청과 액티빈, RA의 순차적인 처리 (serum/activin A/RA) 하에 분화된 배아체의 단면을 면역형광염색 할 경우 Cdx2 (적색)를 발현하는 원시장관의 단면형태를 관찰할 수 있으며, 이들 Cdx2 발현 세포들 중 일부에서 돌기된 부분에 Cdx2와 Pdx1을 동시에 발현하는 세포가 관찰된다. 따라서 이러한 사실은 배아체내에서 장내배엽 (gut endoderm) 이 형성되었고 이들 세포가 췌장전구세포로 변화되는 과정임을 시사한다.

실시예 2. 분화촉진된 내배엽으로부터 췌장전구세포로 구성된 랑게르한스섬-유사 세포 집합체형성

도 5의 a는 도 4에서 혈청과 액티빈, RA의 순차적인 처리 (serum/activin A/RA)하에 분화된 배아체를 부분적으로 해체 (partial dissociation)하여 Fibronectin이 첨가된 ITS배양액 (발명의 상세한 설명 참조)에서 추가적으로 분화시킬 경우 추가분화 1일 (배아줄기세포로부터의 총 분화일수: 배아체 형성 10일 + 추가분화 1일 = 11일)에 보여지는 Pdx1-발현 췌장전구세포 집합체 (아직은 2차원적 monolayer 상태임)를 나타낸다.

혈청과 액티빈, 그리고 RA을 각각 4일, 4일 그리고 2일간 처리하여 총 10일간 분화시킨 배아체를 파이펫을 이용하여 분쇄한 후 ITS (Insulin 5 mg/l, Transferrin 50 mg/l, Selenite 0.516 mg/l, 제조사는 모두 Sigma)와 fibronectin (Sigma) (5 μg/ml)이 첨가된 무혈청 배양액에서 배양접시에 부착배양 (adherent culture) 하였다. 부착배양 개시 후 13일 간에 걸쳐 췌장전구세포에 특이적으로 발현되는 Pdx1 및 Nestin의 발현양상을 분석하였다 (도 5의 b ~ d).

도 5의 b는 추가분화 4일째 더욱 증식된 Pdx1-발현 췌장전구세포 집합체의 일부세포들이 Nestin을 발현하고 있음 (삽입도면의 화살표머리: Nestin을 발현하지 않는 Pdx1-발현세포들)을 나타내고, 도 5의 c는 추가분화 4일째 Nestin을 발현하는 세포집합체의 일부세포들이 Pdx1을 발현하고 있음 (삽입도면의 화살표머리: Pdx1을 발현하지 않는 Nestin-발현 세포들)을 나타낸다. 따라서 췌장을 형성하는 세포 중 Pdx1+Nestin+, Pdx1+Nestin-, 그리고 Pdx1-Nestin+의 3종의 세포들이 존재함을 증명하였다.

부착배양을 통해 추가적으로 분화된 췌장전구세포들은 증식과 세포이동과정을 통하여 랑게르한스섬과 유사한 3차원적 세포집합체 (3-dimensional cell cluster)를 형성한다. 이들 세포집합체의 일부를 Pdx1항체를 이용한 면역형광염색으로 분석하여 세포집합체내 췌장전구세포의 순도를 평가하며, RT-PCR기법에 의해 인슐린 분비성 췌장베타세포의 분화에 관련된 유전자의 발현을 분석하였다 (도 5의 e ~ g).

도 5의 d ~ f에서 나타난 바와 같이, 추가분화 10-13일 사이 (배아줄기세포로부터 20-23일)에 일부 Pdx1-발현세포들이 랑게르한스섬과 유사한 3차원적 세포집합체구조 (islet-like three-dimensional structures)를 형성하였고 (d), 일부 세포집합체는 더욱 증식함에 따라 배양접시로부터 떨어져 나왔으며 (e), 이들 세포집합제를 냉동절편하여 형광염색했을 경우 다수의 Pdx1과 Nestin을 발현하는 췌장전구세포가 발견되었다 (f).

도 5의 g에서와 같이, 랑게르한스섬과 유사한 3차원적 세포집합체구조를 형성하여 배양접시로부터 떨어져 나온 세포집합체의 유전자발현 RT-PCR기법으로 분석한 결과, 췌장전구세포 및 췌장세포에서 발현되는 유전자들의 발현이 검증하였다 (Neurog3, Neurogenin 3; ISL1, Islet1; INS, Insulin; GCG, Glucagon; SST, Somatostatin).

실시예 3. 분화유도과정을 통하여 생산된 췌장전구세포의 분화능력 및 기능성검증

인간배아 줄기세포로부터 배아체 형성 및 부착 추가배양을 통하여 (도 6의 a, 분화과정 모식도 참조) 생산된 췌장전구세포를 포함하는 랑게르한스섬과 유사한 3차원적 세포집합체의 체내 혈당감소능력은 인위적으로 당뇨병을 유발시킨 마우스모델을 이용하였다.

7주령 누드마우스 (nude mice)에 200 mg/kg의 스트렙토조토신 (STZ)을 복강주사를 하여 당뇨병을 유발시킨다. 6일 후 500 mg/dl 이상의 고혈당을 유지하는 마 우스를 선별하여 실험에 사용하였다. Ketamine/Xylazine을 복강주사하여 마취를 유도하고 마우스의 왼쪽 신장을 감싸고 있는 막과 신장사이 (left subcapsular renal space) 에 1 × 10⁶개의 췌장 전구세포를 이식하였다. 대조실험군에는 동일한 부피 (10 μl) 의 배양액을 신장에 주입하였다. 혈당은 4일 주기로 휴대용 혈당측정계를 이용하여 아침 9시와 11시 사이에 측정하며, 체중도 같은 시기에 측정하였다.

당뇨병이 유발된 마우스에 이식된 췌장전구세포가 이식 후 성숙한 췌장베타세포로 분화하여 인슐린을 분비하게 되면 이식 후 시점부터 혈당이 점진적으로 감소하게 되며, 체중도 정상으로 회복되었다 (도 6의 b 와 c). 이와 더불어 정상혈당 및 체중을 회복한 시점에서 이식되었던 조직을 제거하였을 경우 혈당이 다시 증가함을 확인하여 이식 후 일어난 정상혈당으로의 회복이 이식된 세포의 기능에 의하여 이루어짐을 검증하였다 (도 6의 b와 c).

도 6의 b는 스트렙토조토신 (streptozotocin, STZ: 췌장내의 인슐린분비세포를 선택적으로 파괴)으로 nude mice에서 당뇨병모델을 확립한 뒤 6일 후에 인간배아줄기세포로부터 분화된 췌장전구세포를 이식하거나 동일한 수술과정에서 세포가 아닌 배양액만을 이식 (sham) 한 경우 그 결과이다. 세포가 아닌 배양액만을 이식 받은 마우스는 고혈당을 유지하며 이식 후 10-16일 사이에 모두 죽은 반면, 인간배아줄기세포-유래 췌장전구세포를 이식받은 마우스는 STZ의 처리해 의해 증가된 혈당이 28일에 걸쳐 점진적으로 감소하여 이식 후 28일이 되면 정상혈당치로 감소되었다. 이식 후 28일에 이식된 조직을 다시 제거하면 고혈당이 재발되었으며, 제거 4일 후에 마우스가 죽음으로서 이식된 조직이 혈당감소에 중요한 역할을 담당했음을 증명하였다.

도 6의 c에서는 배양액만을 이식받은 마우스 (sham group)는 지속적으로 체중의 감소를 보이고 10-16일 사이에 모두 죽은 반면, 인간배아줄기세포-유래 췌장전구세포를 이식받은 마우스는 이식 후 점진적으로 체중이 증가하여 정상 체중을 회복하였다.

회수된 조직은 이식된 췌장전구세포의 분화능력을 검증하기 위하여 조직검사를 실시하였다. 세포내 인슐린 합성능력을 평가하기 위하여 인슐린합성 대사물인 proinsulin, insulin, C-peptide의 발현을 검증하였고 (도 6의 f, g, I, j), 인슐린을 합성하는 세포들이 인간배아줄기세포에서 유래된 것임을 증명하기 위하여 인간세포핵에서 특이적으로 소유하는 단백질에 특이적인 항체 (anti-human nuclei antibody)를 이용하여 분석하였다 (도 6의 h). 성숙한 췌장베타세포의 존재는 인슐린과 Pdx1을 동시에 합성하는 세포의 유무로 판정하였다 (도 6의 m).

도 6의 d와 e는 이식 후 28일째에 이식한 조직을 마우스로부터 회수하여 헤마톡실린/에오신 (hematoxyline-eosin으로 염색한 조직사진이고, 장 (d)과 랑게르한스섬 (e)과 유사한 구조가 발견되었다. 도 6의 f와 g에서는 이식된 조직에서 인슐린 합성의 전단계인 프로인슐린 (proinsulin, 갈색, f)과 인슐린 (녹색, g)이 발견되었다. 도 6의 h는 이식된 조직내에서 인슐린 (녹색) 을 합성하는 세포가 인간배아줄기세포에서 유래된 것임을 증명하기 위하여 인간세포의 핵에만 특이적으로 반응하는 항체 (적색)로 면역형광염색을 시행한 사진이다. 도 6의 i와 j는 이식된 세포가 능동적으로 인슐린을 합성하는 대사과정을 수행 있다는 것을 증명하기 위하여 인슐린항체 (녹색)와 함께 프로인슐린 (ProIns, 적색, i) 혹은 인슐린합성의 부산물인 씨펩타이드 (C-peptide, C-pep, 적색 j)의 항체로 동시 염색한 사진이다. 인슐린과 프로인슐린, 그리고 인슐린과 씨-펩타이드를 함께 보유하고 있는 세포들은 노란색 (적색+녹색)으로 나타났다. 도 6의 k ~ n에서는 췌장전구세포를 이식하였음으로 이식 후 28일에 회수한 조직 내에서는 여러 분화단계의 췌장세포가 나타났다. 아직 완전히 성숙되지 않은 세포에서는 인슐린과 글루카곤을 동시에 합성하고 있으며 (k ~ m, 화살표머리), Pdx1은 췌장발생과정 중 전구세포시기에 발현되다가 발현이 감소되며 추후 완전히 성숙한 인슐린합성세포에 다시 발현이 증가하였다 (n).

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 다능성 (pluripotency)을 보유하는 인간배아줄기세포를 원치 않는 세포로의 분화를 억제함과 동시에 당뇨병의 세포치료에 사용될 잠재력이 있는 췌장전구세포로 분화시킬 수 있다. 또한, 이러한 췌장전구세포로부터 대량의 췌장베타세포생산을 가능하게 하여, 현재 당뇨병의 세포치료에 가장 큰 문제점 중 하나인 베타세포 혹은 랑게르한스섬의 공여자 부족의 한계를 극복할 수 있다.

Claims

인간배아 줄기세포로부터 배아체가 형성되는 과정에서 혈청, 액티빈 (activin A) 및 레티노산 (retinoic acid)를 순차적으로 처리하여 췌장내배엽이 증가된 배아체를 유도하는 것을 특징으로 하는 췌장으로 분화 가능한 췌장전구세포의 분화 유도 방법.
제 1항에 있어서, 인간배아 줄기세포를 혈청으로 처리하여 삼배엽성 배아체를 유도하는 1단계, 상기 제 1단계의 삼배엽성 배아체를 액티빈으로 처리하여 내배엽 (endoderm)성 배아체로 유도하는 2단계, 상기 2단계의 배아체를 레티노산으로 처리하여 췌장내배엽이 증가된 배아체로 유도하는 3단계, 및 상기 3단계의 췌장내배엽이 증가된 배아체를 배양접시에 부착하여 ITS (인슐린, 트랜스페린, 셀레나이트)와 파이브로넥틴 (fibronectin)이 첨가된 무혈청 배양액에서 배양하는 4단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서, 상기 1단계는 15 ~ 25 %의 혈청이 첨가된 배양액에서 3 ~ 5일간 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서, 상기 2단계는 액티빈 25 ~ 35 ng/ml로 처리하여 3 ~ 5일간 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서, 상기 3단계는 5 ~ 15 μM 레티노산으로 처리하여 1 ~ 3일간 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서, 상기 4단계는 인슐린 4 ~ 6 mg/l, 트랜스페린 40 ~ 60 mg/l, 셀레나이트 0.4 ~ 0.6 mg/l와 파이브로넥틴 3 ~ 7 μg/ml이 첨가된 무혈청 배지에서 10 ~ 15일간 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서, 췌장전구세포를 증식과 세포이동과정을 통하여 3차원적 세포집합체를 형성시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 7항의 어느 한 항에 따른 방법으로 분화된 췌장전구세포.
제 8항의 췌장전구세포를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료용 세포치료제.