JP2022528917A - 幹細胞由来の胚体内胚葉からの膵臓内胚葉の生成 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ヒト多能性幹（ＰＳ）細胞由来のヒト胚体内胚葉から膵臓内胚葉を効率的に生成する方法に関する。本発明はまた、本発明の方法によって得られる膵臓内胚葉細胞に関する。最後に、本発明は、ＲＡＲアンタゴニストを含む培養培地および組成物、ならびに膵臓内胚葉細胞の誘導における該ＲＡＲアンタゴニストの使用に関する。本発明は、高められた効率で、より均質かつ同調した膵臓細胞集団を提供する。

Description

本発明は、ヒト多能性幹（ＰＳ）細胞由来のヒト胚体内胚葉から膵臓内胚葉を効率的に生成する方法に関する。
ベータ細胞（ＢＣ）移植は、Ｉ型糖尿病の最終的な治癒をもたらす可能性がある。しかしながら、ドナーベータ細胞の利用可能性が限られているため、臨床療法としてのこの処置の使用は制約される。多能性幹（ＰＳ）細胞は、無限に増殖し、多くの細胞型に分化することができる。したがって、ＰＳ細胞は、ベータ細胞のための有望な源であるが、ＰＳ細胞が糖尿病を治療するために使用され得る前に、膵臓細胞に効率的かつ再現可能に分化する必要がある。
脊椎動物の胚発生中、多能性細胞は、３つの胚葉：外胚葉、中胚葉、および内胚葉を生じさせる。胚体内胚葉（ＤＥ）の誘導は、内胚葉由来組織の形成への最初のステップである。ＤＥ細胞からの膵臓内胚葉（ＰＥ）の生成は、インスリン産生ベータ細胞の生成に必要である。内分泌前駆細胞（ＥＰ）になる可能性があるＰＥ細胞は、２つの重要な転写因子、ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１の共発現を特徴とする。
段階的インビトロ分化プロトコルは、ＰＳ細胞から膵臓細胞を生成するために確立されてきた。これらのプロトコルは概して、ＳＯＸ１７およびＦＯＸＡ２を共発現するＤＥ、原腸、後方前腸、ＰＥ、ＥＰ、および最終的には成熟ベータ細胞の形成などの、いくつかの段階を含む、膵臓発生の主要な事象を模倣する。今日まで、ｈＥＳ細胞の効率的なＤＥ分化は、アクチビンＡ処置によって達成されてきた。膵臓ベータ細胞の生成における次の主要なステップは、ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１を共発現するＰＥを生成することである。いくつかのグループは、ＰＳ細胞をＤＥおよびＰＥに分化することができるインビトロプロトコルを開発しており、ほとんどすべての公開されたプロトコルは、ＰＥの誘導においてレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アゴニストを添加するステップを含む。
１型糖尿病患者は、ヒトドナーからの膵島の移植を用いて治療され得、一部の患者は、インスリン非依存性を達成する。しかしながら、ドナー膵島は不足しており、可変品質を有し、多能性幹細胞由来のインスリン産生細胞は、膵島の魅力的な代替手段を提供する。重要な分化ステップは、ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１の共発現を特徴とする、胚体内胚葉（ＤＥ）から膵臓内胚葉（ＰＥ）への分化であるが、ＤＥへの以前の分化ステップよりも効率が悪く、バッチ間変動がしばしば観察される分化ステップである。ＰＥ誘導の効率の向上により、ベータ細胞を形成することができる内分泌前駆細胞（ＥＰ）の数は増加し、また、望ましくない細胞型の数は低減する。バッチ間の分化効率の変動は、周知の問題であり、分化安定性の改善は、大規模産生プロセスおよび臨床試験に移行する際に重要になる。したがって、分化プロトコルは、最終ステップにおいて多数の機能的ベータ細胞（ＢＣ）を得るために、すべての段階において最適化されなければならない。したがって、現在の分化プロトコルの効率および安定性を高める必要があり、これは、これらの細胞の内分泌系統へのさらなる発生にとって重要である。
本発明は、膵臓運命に委ねられるＰＥ細胞の特徴であるＮＫＸ６．１／ＰＤＸ１二重陽性細胞の割合を増加させる方法を提供することによって、ヒトＰＳ細胞を成熟ベータ細胞に分化する効率を改善する。
さらに、本発明は、より効率的、より均質かつ同調した(synchronised)膵臓細胞集団を提供し、これは、これらの細胞の内分泌系統へのさらなる発生にとって重要である。
一態様では、本発明は、ヒト多能性幹（ＰＳ）細胞由来のヒト胚体内胚葉から膵臓内胚葉細胞を誘導するための方法に関する。
一態様では、本発明は、ヒト多能性幹（ＰＳ）細胞由来のヒト胚体内胚葉から膵臓内胚葉前駆体を誘導するための方法に関し、該方法は、胚体内胚葉をＲＡＲアンタゴニストと共に培養するステップを含む。
一態様では、本発明は、ヒト多能性幹（ＰＳ）細胞由来のヒト胚体内胚葉から膵臓内胚葉細胞を誘導するための方法に関し、該方法は、胚体内胚葉をＲＡＲアンタゴニストと培養して、膵臓内胚葉前駆体を得て、その後に膵臓内胚葉前駆体をＲＡＲアゴニストと培養することによって、膵臓内胚葉細胞を誘導するステップを含む。
一態様では、本発明は、ヒト多能性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞を膵臓内胚葉前駆体に分化する方法に関し、本方法は、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストを含む培養培地中で胚体内胚葉（ＤＥ）を培養するステップを含む。
一態様では、本発明は、方法は、ＲＡＲアゴニストを含む細胞培養培地中で膵臓内胚葉前駆体を培養し、それによって膵臓内胚葉（ＰＥ）を誘導するステップをさらに含み、該細胞は、ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋二重陽性である。
一態様では、本発明は、本発明の方法によって得ることが可能な膵臓内胚葉細胞または膵臓内胚葉細胞前駆体に関する。
別の態様では、本発明は、本発明の方法によって得ることが可能な同調した膵臓内胚葉細胞(synchronized pancreatic endoderm cells)または同調した膵臓内胚葉細胞前駆体(synchronized pancreatic endoderm cell precursors)に関する。
一態様では、本発明は、ＲＡＲアンタゴニストおよびＲＡＲアゴニストを含む培養培地およびまたは組成物に関する。
一態様では、本発明は、ヒト多能性幹細胞由来の胚体内胚葉をＲＡＲアンタゴニストに曝露して、膵臓内胚葉前駆体を得て、その後に膵臓内胚葉前駆体をＲＡＲアゴニストに曝露して、膵臓内胚葉を得ることによって産生される、膵臓内胚葉細胞に関する。
一態様では、本発明は、ヒト多能性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞から膵臓内胚葉前駆体を誘導するための、ＲＡＲアンタゴニストの使用に関する。
一態様では、本発明は、ヒト多能性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞から膵臓内胚葉細胞を誘導するための、ＲＡＲアンタゴニストの使用、その後のＲＡＲアゴニストの使用に関する。
一態様では、本発明は、本発明の方法によって得られる膵臓内胚葉前駆細胞または膵臓内胚葉細胞集団を含む、バイオリアクターに関する。
一態様では、本発明は、改善された膵臓内胚葉細胞集団、すなわち、ＮＫＸ６．１＋／ＰＤＸ１＋二重陽性細胞の割合が増加したＰＥを提供する。
一態様では、本発明は、より均質な膵臓内胚葉細胞集団を提供する。
一態様では、本発明は、より同調した膵臓内胚葉細胞集団を提供する。
本発明はまた、例示的な実施形態の開示から明らかになるさらなる問題も解決し得る。
図１は、ＰＥ分化の１０日目（ＰＥ１０）のＰｄｘ１／Ｎｋｘ６．１発現に対するＦＡＣＳ分析によって評価される標準ＰＥ誘導プロトコルと比較したＡＧＮ １９３１０９の効果を示す。この図は、標準ＰＥを、ＡＧＮ １９３１０９処置（１Ａ）、ならびに代表的な実験からのＦＡＣＳプロットの一例（１Ｂ）と比較した４つの独立した実験における、Ｐｄｘ１／Ｎｋｘ６．１二重陽性細胞の割合の平均を示す。さらに、標準プロトコルを使用して準最適な誘導に適用される場合の、ＰＥ１０誘導に対するＡＧＮ１９３１０９の効果の一例を示す（１Ｃ）。 図２は、膵臓内胚葉のマーカーの発現に対するＡＧＮ １９３１０９の効果を示す。図２Ａは、遺伝子発現のＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析によって評価される、ＰＥ２～３のＡＧＮ１９３１０９によるＲＡシグナル伝達の阻害またはＡＭ５８０によるＲＡシグナル伝達の活性化の、ＰＥ１０の膵臓内胚葉マーカーＮｋｘ６．１、ＣＰＡ１、Ｐｔｆ１ａ、およびＤｌｋ１の発現に対する効果を示す。図２Ｂは、ＡＧＮ １９３１０９処置と比較した、標準プロトコルにおけるＰＥ１１のＮｋｘ６．１に対するＤｌｋ１の発現のＦＡＣＳプロットを示す。 図３は、ＰＥ１０の未成熟内分泌分化に対するＡＧＮ１９３１０９１の効果を示す。図３Ａは、遺伝子発現のＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析によって評価される標準プロトコルと比較した、膵臓内胚葉段階における膵臓内分泌マーカーＮｅｕｒｏＤおよびＮｇｎ３に対する、ＰＥ２～３のＡＧＮ１９３１０９によるＲＡシグナル伝達の阻害およびＡＭ５８０によるＲＡシグナル伝達の活性化の効果を示す。図３Ｂは、ＰＥ２～３のＡＧＮ １９３１０９処置と比較した、標準プロトコルにおけるＰＥ１０の膵臓内分泌マーカーＮｋｘ２．２の発現のＦＡＣＳプロットを示す。 図４は、ＰＥ１０のＰｄｘ１／Ｎｋｘ６．１についてのＦＡＣＳ分析によって評価される標準プロトコルと比較した、膵臓内胚葉誘導に対する、ＰＥ２～３のＡＭ５８０によるＲＡＲ活性化およびＡＧＮ １９３１０９によるＲＡＲ阻害の効果を示す。 図５は、ＰＥ１０のＰｄｘ１／Ｎｋｘ６．１についてのＦＡＣＳ分析によって評価される２つの例における、ＰＥ誘導に対するＡＧＮ １９３１０９の用量反応効果を示す。一実験では、ＰＥ２～３の濃度１、３、および１０μＭのＡＧＮ １９３１０９を試験した（５Ａ）。別の実験では、ＰＥ２～３の濃度０，５、１、１０、および２０μＭのＡＧＮ１９３１０９を試験した（５Ｂ）。 図６は、ＰＥ１０のＰｄｘ１／Ｎｋｘ６．１についてのＦＡＣＳ分析によって評価される、ＡＧＮ １９３１０９のタイミングの効果を示す。一実験では、ＰＥ０～３からの４日間のＬＤＮ段階中、２日間（ＰＥ２～３）から３日間（ＰＥ１～３）または４日間（ＰＥ０～３）まで、１０μＭのＡＧＮ １９３１０９の曝露時間を増加させる（６Ａ）。別の実験では、１０μＭのＡＧＮ １９３１０９での２日間の処置を維持し、ＬＤＮ１９３１０９（ＬＤＮ）段階を４日間から３日間または２日間に短縮する（６Ａ）。 図７は、Ｃ－ｐｅｐ、Ｎｋｘ６．１、およびグルカゴン発現に対するベータ細胞分化の６～９日目（ＢＣ６～９）についてのＦＡＣＳ分析によって評価される、ＢＣ段階の細胞の誘導に対するＡＧＮ １９３１０９の効果を示す。図７Ａは、ＰＥ２～３の標準プロトコルをＡＧＮ １９３１０９を比較した４つの独立した実験における、Ｃ－ｐｅｐ／Ｎｋｘ６．１二重陽性細胞の割合の平均を示す。図７Ｂは、標準プロトコルをＡＧＮ １９３１０９を比較した代表的な例を示す。 図８は、ＰＥ１０のＰｄｘ１／Ｎｋｘ６．１についてのＦＡＣＳ分析によって評価される、バイオリアクターにおけるＡＧＮ １９３１０９を用いたプロトコルの機能を示す。この図は、ＰＥ２～３の１０μＭのＡＧＮ１９３１０９の添加ありおよびなしの、バイオリアクター（ＤＡＳｇｉｐ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）の１Ｌタンク内で実行された２つの代表的な実験の例を示す。 図９は、ＢＣ６およびＢＣ１３のＣ－ｐｅｐ／Ｎｋｘ６．１についてのＦＡＣＳ分析によって評価される、ＢＣ３の凍結保存および解凍、その後の標準ＰＥプロトコルまたはＡＧＮ１９３１０９で処置された細胞の長期培養後のＢＣ表現型を示す。
本発明は、ヒト多能性幹細胞由来の胚体内胚葉から膵臓内胚葉前駆体および膵臓内胚葉を生成する方法に関する。
本発明は、ヒト多能性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞を、膵臓内胚葉ＮＫＸ６．１＋／ＰＤＸ１＋二重陽性に分化する方法に関し、本方法は、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストを含む培養培地中で胚体内胚葉を培養して、膵臓内胚葉前駆体を得るステップ、その後に、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストを含む培養培地中で膵臓内胚葉前駆体を培養するステップを含む。
本発明は、高められた効率で、より均質かつ同調した膵臓内胚葉細胞集団を提供する。
転写因子ＮＫＸ６．１およびＰＤＸ１は、内分泌細胞集団に達するために必要な細胞段階のうちの１つであるＰＥ細胞集団のマーカーである。ＰＥ細胞集団におけるＮＫＸ６．１／ＰＤＸ１二重陽性細胞の割合の増加は、効率を高める。
本発明の分化方法は、ＰＥ細胞集団の著しく増加した割合の、すなわち、より高い効率で、ＮＫＸ６．１／ＰＤＸ１＋二重陽性細胞をもたらす。
さらに、本発明は、より均質かつ同調した膵臓内胚葉細胞集団を提供し、これは、これらの細胞の内分泌系統への、すなわち、ベータ細胞またはインスリン産生細胞へのさらなる発生にとって重要である。
本発明では、ＰＥ誘導の効率および安定性を高める方法を記載し、これはまた、インスリン産生ベータ細胞へのさらなる分化の効率も改善する。
ＰＥプロトコルの第１の段階（ＬＤＮ段階、すなわち、ＰＥ０～ＰＥ３と称される４日間）中に、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニスト（ＡＧＮ １９３１０９）を誘導することによって、レチノイン酸受容体アゴニスト（ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋膵臓内胚葉の割合）を含有する第２の段階（すなわち、ＰＥ４～ＰＥ１１と称される８日間）において、ＰＥ誘導を有意に増加させることができる。さらに、バッチ間の変動を低減してＰＥ誘導を安定化する。最後に、ＰＥの追加のマーカーであるＰｔｆ１ａの発現が増加するため、膵臓内胚葉の品質が改善される。
また、本発明では、膵臓内胚葉のマーカーとしてのＤＬＫ１も記載し、ＤＬＫ１がＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１高細胞において主に発現することを示す。ＤＬＫ１は、表面マーカーであり、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳなどの方法を使用した生細胞選別による、膵臓内胚葉段階における膵臓内胚葉の濃縮のために使用され得る。
ＰＥ細胞は、ＥＰ細胞に分化することができ、これはＢＣ細胞にさらに分化することができる。最後に、ＰＥステップの改善は、ＢＣ分化効率の全体的な改善につながり、より多数のＣ－ｐｅｐ／ＮＫＸ６．１二重陽性細胞をもたらす。
定義：
幹細胞
幹細胞は、自己複製前駆細胞、非複製前駆細胞、および最終分化細胞を含む、子孫細胞を産生するために自己複製および分化の両方を行う単一細胞レベルでの能力によって定義される未分化細胞である。幹細胞はまた、複数の胚葉（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）からの様々な細胞系統の機能細胞にインビトロで分化し、かつ移植後に複数の胚葉の組織を生じさせ、胚盤胞への注射後に全部ではないが実質的にほとんどの組織に寄与する能力を特徴とする。
幹細胞は、発生能によって次に分類される：（１）全能性（すべての胚および胚体外細胞型を生じさせることができることを意味する）、（２）多能性（すべての胚細胞型を生じさせることができることを意味する）、（３）多分化能性（細胞系統のサブセットを生じさせることができるが、すべて特定の組織、臓器、または生理系内であることを意味する（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己複製）、血液細胞制限少能性前駆細胞、ならびに血液の正常な構成成分であるすべての細胞型および要素（例えば、血小板）を含む子孫を産生することができる））、（４）少能性（多分化能性幹細胞よりも細胞系統のより制限されたサブセットを生じさせることができることを意味する）、ならびに（５）単能性（単一細胞系統を生じさせることができることを意味する（例えば、精子形成幹細胞））。
ヒト多能性幹細胞
本明細書で使用される場合、「ヒト多能性幹細胞」（ｈＰＳＣ）は、任意の源由来であり得、かつ適切な条件下で、３つすべての胚葉（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）の誘導体である異なる細胞型のヒト子孫を産生することができる細胞を指す。ｈＰＳＣは、８～１２週齢ＳＣＩＤマウスにおいて奇形腫を形成する能力、および／または組織培養中で３つすべての胚葉の識別可能な細胞を形成する能力を有し得る。ヒト多能性幹細胞の定義には、文献中でヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞（例えば、Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）、Ｈｅｉｎｓ ｅｔ ａｌ．．（２００４）を参照されたい）と表されることが多いヒト胚盤胞由来幹（ｈＢＳ）細胞、ならびに誘導多能性幹細胞（例えば、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）を参照されたい）を含む、様々なタイプの胚細胞が含まれる。本明細書に記載される様々な方法および他の実施形態は、様々な源からのｈＰＳＣを必要または利用し得る。例えば、使用に適したｈＰＳＣは、発生中の胚から得られ得る。加えて、またはあるいは、好適なｈＰＳＣは、樹立細胞株および／またはヒト誘導多能性幹（ｈｉＰＳ）細胞から得られ得る。
本明細書で使用される場合、「ｈｉＰＳＣ」は、ヒト誘導多能性幹細胞を指す。
ＥＳ細胞株はまた、子宮外胚を破壊することなく、かつ臨床転帰に影響を及ぼすことなく、単一割球から得られ得る（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．．（２００６）およびＫｌｉｍａｎｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．（２００６））。
胚盤胞由来幹細胞
本明細書で使用される場合、「胚盤胞由来幹細胞」という用語は、ＢＳ細胞と表され、ヒト形態は、「ｈＢＳ細胞」と呼ばれる。文献中、細胞は、胚性幹細胞、より具体的には、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）と称されることが多い。
したがって、本発明で使用される多能性幹細胞は、例えば、ＷＯ０３／０５５９９２およびＷＯ２００７／０４２２２５に記載されているように、胚盤胞から調製される胚性幹細胞であり得るか、または市販のｈＢＳ細胞もしくは細胞株であり得る。しかしながら、例えば、Ｙｕ，ｅｔ ａｌ．（２００７）、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）、およびＹｕ ｅｔ ａｌ．（２００９）に開示されるようなＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＬＩＮ２８などの、ある特定の転写因子で成体細胞を処置することによって、多能性細胞に再プログラム化される分化成体細胞を含む、任意のヒト多能性幹細胞が本発明で使用され得ることがさらに想定される。
一実施形態では、ＰＥ細胞を含む細胞集団は、体細胞集団から得られる。別の実施形態では、体細胞集団は、胚様幹（ＥＳ、例えば、多能性）細胞に脱分化するように誘導されている。そのような脱分化細胞もまた、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）と呼ばれる。
一実施形態では、ＰＥ細胞を含む細胞集団は、胚性幹（ＥＳ、例えば、多能性）細胞から得られる。別の実施形態では、膵臓細胞を含む細胞集団は、ＥＳ様細胞などの多能性細胞である。
一実施形態では、ＰＥ細胞を含む細胞集団は、胚性分化幹（ＥＳまたは多能性）細胞である。分化は、胚様体中および／もしくは単層細胞培養中、またはそれらの組み合わせで起こる。
一実施形態では、細胞集団は、幹細胞の集団である。別の実施形態では、細胞集団は、膵臓内胚葉系統に分化した幹細胞の集団である。
一実施形態では、さらに分化した幹は、ヒト胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞である。
分化
本明細書で使用される場合、「分化する」または「分化」は、細胞が未分化状態から分化状態に、未成熟状態からあまり未成熟ではない状態に、または未成熟状態から成熟状態に進行するプロセスを指す。例えば、初期未分化胚性膵臓細胞は、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、およびＰＴＦ１ａのような特徴的マーカーを増殖および発現することができる。成熟または分化膵臓細胞は、増殖せず、高レベルの膵臓内分泌ホルモンまたは消化酵素を分泌する。例えば、完全に分化したベータ細胞は、グルコースに応答して高レベルでインスリンを分泌する。細胞相互作用および成熟の変化は、細胞が未分化細胞のマーカーを失うか、または分化細胞のマーカーを得ると生じる。単一マーカーの喪失または獲得は、細胞が「成熟しているか、または完全に分化している」ことを示すことができる。
「分化因子」という用語は、膵臓細胞に添加されて、インスリン産生ベータ細胞も含有する成熟内分泌細胞へのそれらの分化を強化する化合物を指す。
例示的な分化因子としては、肝細胞成長因子、ケラチン生成細胞成長因子、エキセンジン－４、塩基性線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子－１、神経成長因子、表皮成長因子、血小板由来成長因子、およびグルカゴン様ペプチド１が挙げられる。
一実施形態では、細胞の分化は、１つ以上の分化因子を含む培地中で細胞を培養することを含む。
胚体内胚葉細胞（ＤＥ細胞）
胚体内胚葉細胞は、マーカーＳＯＸ１７の発現を特徴とする。ＤＥのさらなるマーカーは、ＦＯＸＡ２およびＣＸＣＲ４である。
「ＳＯＸ１７」（ＳＲＹ－ボックス１７）は、本明細書で使用される場合、胚発生の制御および細胞運命の決定に関与する転写因子のＳＯＸ（ＳＲＹ関連ＨＭＧ－ボックス）ファミリーのメンバーである。
「ＦＯＸＡ２」（フォークヘッドボックスＡ２）は、本明細書で使用される場合、ＤＮＡ結合タンパク質のフォークヘッドクラスのメンバーである。
「ＣＸＣＲ４」（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体４）は、本明細書で使用される場合、ストローマ細胞由来因子１に特異的なＣＸＣケモカイン受容体である。
ＤＥ誘導プロトコルの非限定的な例は、従来のＤ’Ａｍｏｕｒプロトコル（Ｎｏｖｏｃｅｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃ ２００６，２００８）、およびＷＯ２０１２／１７５６３３（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるプロトコルである。
一実施形態では、本発明の方法のＤＥ細胞は、ＳＯＸ１７＋陽性である。
一実施形態では、本発明の方法のＤＥ細胞は、ＳＯＸ１７＋／ＦＯＸＡ２二重陽性である。
一実施形態では、本発明の方法のＤＥ細胞は、ＳＯＸ１７＋／ＦＯＸＡ２＋／ＣＸＣＲ４＋三重陽性である。
膵臓内胚葉前駆体
本明細書で使用される場合、「膵臓内胚葉前駆体」または「膵臓内胚葉細胞前駆体」は、ＲＡＲアンタゴニストを含む培養培地中で、ヒト多能性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞を培養することから得られる細胞である。
これらの細胞は、ＲＡＲアゴニストを含む培養培地中でさらに培養された場合、以下に定義されるような膵臓内胚葉細胞の誘導をもたらす。
膵臓内胚葉細胞（ＰＥ細胞）
膵臓内胚葉細胞は、少なくとも５％ ＮＫＸ６．１＋／ＰＤＸ１＋二重陽性のマーカーの発現を特徴とする。ＰＥのさらなるマーカーは、ＰＴＦ１ＡおよびＣＰＡ１である。
「ＰＤＸ１」は、本明細書で使用される場合、膵臓発生に関わるホメオドメイン転写因子を指す。
「ＮＫＸ６．１」は、本明細書で使用される場合、ＮＫＸ転写因子ファミリーのメンバーである。
「ＰＴＦ１Ａ」は、本明細書で使用される場合、膵臓転写因子１複合体（ＰＴＦ１）の構成成分であり、哺乳動物膵臓発生において役割を果たすことが知られているタンパク質である。
「ＣＰＡ１」は、本明細書で使用される場合、亜鉛メタロプロテアーゼのカルボキシペプチダーゼＡファミリーのメンバーである。この酵素は、膵臓で産生される。
一実施形態では、本発明は、ＤＥをＰＥに分化する方法に関し、該細胞は、ＮＫＸ６．１＋／ＰＤＸ１＋二重陽性である。
一実施形態では、本発明は、ＤＥをＰＥに分化する方法に関し、該ＰＥ細胞の少なくとも５％が、ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１を共発現する。
一実施形態では、本発明は、ＤＥをＰＥに分化する方法に関し、該ＰＥ細胞の少なくとも５％、少なくとも１０％、１０～３０％、１０～４０％、５～７０％、１０～８０％、または５～１００％が、ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋二重陽性である。
一実施形態では、本発明は、ＤＥをＰＥに分化する方法に関し、該ＰＥ細胞の少なくとも７０％が、ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋二重陽性である。
一実施形態では、本発明は、ＤＥをＰＥに分化する方法に関し、該ＰＥ細胞の少なくとも８０％が、ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋二重陽性である。
一実施形態では、本発明は、ＤＥをＰＥに分化する方法に関し、該ＰＥ細胞の少なくとも９０％が、ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋二重陽性である。
一実施形態では、本発明は、ＤＥをＰＥに分化する方法に関し、該ＰＥ細胞の少なくとも９５％が、ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋二重陽性である。
一実施形態では、本発明は、ＤＥをＰＥに分化する方法に関し、該ＰＥ細胞の少なくとも９８％が、ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋二重陽性である。
一実施形態では、本発明は、ＤＥをＰＥに分化する方法に関し、該ＰＥ細胞の８０～１００％が、ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋二重陽性である。
一実施形態では、本発明は、ＤＥをＰＥに分化する方法に関し、該ＰＥ細胞の９０～１００％が、ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋二重陽性である。
一実施形態では、本発明は、本発明の方法によって得ることが可能なインビトロまたはインビボ膵臓内胚葉細胞集団に関する。
一実施形態では、本発明は、本発明の方法によって得ることが可能なインビトロ膵臓内胚葉細胞集団に関する。
一実施形態では、本発明は、本発明の方法によって得ることが可能なインビボ膵臓内胚葉細胞集団に関する。
一実施形態では、本発明は、ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１の共発現が増加した、すなわち、ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋二重陽性細胞の発現が増加した、膵臓内胚葉細胞集団を提供する。
一実施形態では、本発明は、／ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋二重陽性細胞の発現が増加した、本発明の方法によって得ることが可能な膵臓内胚葉細胞集団に関する。
一実施形態では、本発明は、本発明の方法によって得ることが可能な膵臓内胚葉細胞集団に関し、該膵臓内胚葉細胞は、少なくとも７０％ ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋二重陽性である。
一実施形態では、本発明は、本発明の方法によって得ることが可能な膵臓内胚葉細胞集団に関し、該膵臓内胚葉細胞は、８０～１００％ ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋二重陽性である。
一実施形態では、本発明は、本発明の方法によって得ることが可能な膵臓内胚葉細胞集団に関し、該膵臓内胚葉細胞は、９０～１００％ ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋二重陽性である。
一実施形態では、本発明は、ＬＤＮ段階を短縮する、より短いＬＤＮ段階を有する方法を提供する。
一実施形態では、本発明は、ＬＤＮ段階を半分、すなわち、２日間に短縮する、より短いＬＤＮ段階を有する方法を提供する。
一実施形態では、本発明は、ＬＤＮ段階を２日間に短縮する、標準的な方法よりも短い継続時間を有する方法に関する。
機能的ベータ細胞の収率を増加させる追加のアプローチは、分化プロセス中のある段階における生細胞の選別を伴う。膵臓内胚葉段階における選別は、望ましくない細胞がこのステップにおいて膵臓系統にコミットする際に魅力的である。このアプローチは、表面抗原を認識し、したがって生細胞選別を可能にする抗体の使用を必要とする。したがって、ヒトＥＳ細胞由来膵臓内胚葉の表面マーカーとしての、デルタ様非標準Ｎｏｔｃｈリガンド１（ＤＬＫ１）の発見を記載する。
同調したＰＥ集団は、内分泌分化を誘導するためのシグナルが細胞培養に適用されるまで、内分泌前駆細胞（ＥＰ）への任意の未成熟なさらなる分化が生じない集団である。ＰＥ段階における未成熟内分泌分化は、多くの公開されたプロトコルの共通する特徴である。同調したＰＥ集団は、内分泌系統およびベータ細胞の誘導におけるより良好な制御を可能にするという点で利点である。
同調した細胞を得ることは、それがより均質な細胞集団をもたらして、ベータ細胞またはインスリン産生細胞へのさらなる分化を続けるため、利点である。
ベータ細胞段階における分化細胞の移植は、ＡＧＮ１９３１０９の添加がベータ対アルファ細胞比を改善する傾向を示し、グルカゴン陽性細胞に対するインスリン陽性細胞の割合が、免疫組織化学および定量的画像分析によって評価される、移植の８週間後のＡＧＮ１９３１０９処置でより高いことを意味する。
「ＤＬＫ１」は、本明細書で使用される場合、細胞成長の調節因子として機能する複数の表皮成長因子リピートを含有する膜貫通タンパク質である。コードされたタンパク質は、いくつかの細胞型の分化に関与する。ＤＬＫ１は、非標準ｎｏｔｃｈリガンドである。
「ＮＫＸ２．２」は、本明細書で使用される場合、ホメオドメイン転写因子である。Ｎｋｘ２．２は、膵臓生成中の適切な膵島細胞系統の仕様の重要な調節因子である。
一実施形態では、本発明は、より選択的に、より均質に、かつより効率的にＥＰ細胞およびベータ細胞集団に誘導されるＰＥ内胚葉細胞集団を提供する。
一実施形態では、本発明の方法によって得られる膵臓内胚葉細胞集団は、より均質かつより同調しており、より効率的にＥＰ細胞およびベータ細胞集団に誘導する。
さらに、ＤＬＫ１は、ＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１発現が改善されたＰＥ細胞集団において高度に発現される表面マーカーである。
一実施形態では、本発明の方法によって取得可能なＰＥ細胞は、ＤＬＫ１陽性である。
一実施形態では、本発明の方法によって得ることが可能なＰＥ細胞は、少なくとも５％のＤＬＫ１を発現する。
一実施形態では、本発明の方法によって得ることが可能なＰＥ細胞は、５～３０％のＤＬＫ１を発現する。
一実施形態では、本発明は、ＰＥ細胞集団に関し、該細胞は、ＤＬＫ１陽性である。
一実施形態では、本発明は、ＰＥの表面マーカーＤＬＫ１に関し、該細胞は、ＮＫＸ６．１＋／ＰＤＸ１＋二重陽性である。
一実施形態では、本発明は、ＰＥの表面マーカーＤＬＫ１に関し、該細胞は、約８０％ ＮＫＸ６．１＋／ＰＤＸ１＋二重陽性である。
一実施形態では、本発明は、ＰＥの表面マーカーＤＬＫ１に関し、該細胞は、８０％超ＮＫＸ６．１＋／ＰＤＸ１＋二重陽性である。
一実施形態では、本発明は、ＤＬＫ１の少なくとも５％の発現を有する改善されたＰＥ細胞集団を提供する。
一実施形態では、本発明は、ＤＬＫ１の少なくとも１０％の発現を有する改善されたＰＥ細胞集団を提供する。
一実施形態では、本発明は、ＤＬＫ１の少なくとも２０％の発現を有する改善されたＰＥ細胞集団を提供する。
一実施形態では、本発明は、ＤＬＫ１の少なくとも３０％の発現を有する改善されたＰＥ細胞集団を提供する。
一実施形態では、本発明は、ＤＬＫ１の３０～８０％の発現を有する改善されたＰＥ細胞集団を提供する。
一実施形態では、本発明は、ＤＬＫ１の２０～８０％の発現を有する改善されたＰＥ細胞集団を提供する。
一実施形態では、本発明は、ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋二重陽性を発現する少なくとも７０％の膵臓内胚葉細胞を示す、ヒト多能性幹細胞由来の同調した細胞集団に関する。
一実施形態では、本発明は、ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋二重陽性を発現する膵臓内胚葉細胞の少なくとも７０％を提示するヒト多能性幹細胞由来の同期細胞集団に関し、該細胞集団は、ＰＴＦ１ａをさらに発現する。
一実施形態では、本発明は、ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋二重陽性を発現する少なくとも７０％の膵臓内胚葉細胞を示す、ヒト多能性幹細胞由来の同調した細胞集団に関し、該細胞集団は、５～３０％のＤＬＫ１をさらに発現する。
一実施形態では、本発明は、ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋二重陽性を発現する少なくとも７０％の膵臓内胚葉細胞を示し、１％未満のＮＫＸ２．２を発現する、ヒト多能性幹細胞由来の同調した細胞集団に関する。
一実施形態では、本発明は、１％未満のＮＫＸ２．２陽性を示す幹細胞由来の同調した細胞集団に関する。
一実施形態では、本発明の方法によって得ることが可能なＰＥ細胞は、１％未満のＮＫＸ２．２陽性である。
一実施形態では、本発明は、ＤＥをＰＥに分化させる方法に関し、該ＰＥ細胞は、１％未満のＮＫＸ２．２陽性である。
一実施形態では、本発明は、ＮＧＮ３およびＮｅｕｒｏＤの発現の低減を特徴とする、より均質かつ同調した、すなわち、ＰＥ段階において未成熟内分泌分化のより低い誘導を有する、膵臓内胚葉細胞集団を提供する。
一実施形態では、本発明は、ＮＧＮ３およびＮｅｕｒｏＤの発現が低減した、本発明の方法によって得ることが可能な膵臓内胚葉細胞集団に関する。
一実施形態では、本発明は、ＮＧＮ３およびＮｅｕｒｏＤの発現が少なくとも２倍低減した、本発明の方法によって得ることが可能な膵臓内胚葉細胞集団に関する。
一実施形態では、本発明は、本発明の方法によって得ることが可能な膵臓内胚葉細胞集団に関し、該ＰＥ集団は、少なくとも４０％のＣ－ＰＥＰ＋／ＮＫＸ６．１＋二重陽性を有するベータ細胞にさらに分化する。
内分泌前駆細胞（ＥＰ細胞）
内分泌前駆細胞は、内分泌細胞運命に委ねられるＥＰ細胞の特徴であるマーカーＮＧＮ３、ＮｅｕｒｏＤ、およびＮＫＸ２．２の発現を特徴とする。
本明細書で使用される場合、「ＥＰ細胞集団」は、膵臓ベータ細胞前駆体の集団であり、細胞集団の少なくとも５％がＮＫＸ６．１／ＮＫＸ２．２二重陽性である。
「ＮＧＮ３」は、本明細書で使用される場合、塩基性ループ－ヘリックス－ループ転写因子のニューロゲニンファミリーのメンバーである。
「ＮＫＸ２．２」および「ＮＫＸ６．１」は、本明細書で使用される場合、ＮＫＸ転写因子ファミリーのメンバーである。
「ＮｅｕｒｏＤ」は、本明細書で使用される場合、塩基性ヘリックス－ループ－ヘリックス（ｂＨＬＨ）転写因子のＮｅｕｒｏＤファミリーのメンバーである。
ベータ細胞
本明細書で使用される場合、「ベータ細胞」という用語は、膵臓内のランゲルハンス島と呼ばれる小さい細胞クラスター内に存在する細胞を指す。
ベータ細胞は、ＩＮＳ／ＮＫＸ６．１およびＣ－ＰＥＰ／ＮＫＸ６．１の共発現を特徴とする。
ベータ細胞は、他の組織に作用して、例えば、グリコーゲン合成によるエネルギー貯蔵を促進する肝臓内で、血液からのグルコース取り込みを促進するペプチドホルモンインスリン（ＩＮＳ）を分泌することによって、高血糖値に応答する。
一実施形態では、本発明による方法によって得られるＰＥ細胞のさらなる誘導によって得ることが可能なＥＰ細胞は、任意選択的にグルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド、および／またはグレリン産生細胞に分化した細胞と共に、インスリン産生細胞にさらに分化している。
本明細書で使用される場合、「インスリン産生細胞」は、検出可能な量のインスリンを産生および貯蔵または分泌する細胞を指す。「インスリン産生細胞」は、個々の細胞または細胞の集合であり得る。
一実施形態では、本発明は、Ｃ－ＰＥＰ＋／ＮＫＸ６．１＋の発現が増加したベータ様細胞集団の誘導をもたらす、改善されたＰＥ細胞集団を提供する。
レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニスト
レチノイン酸受容体アンタゴニストは、レチノイン酸受容体サブタイプ、ＲＡＲα、ＲＡＲＡβ、およびＲＡＲγのうちの１つ以上に対するレチノイドの効果に選択的に反作用する。
ＡＧＮ １９３１０９は、オールトランスレチノイン酸／ＡＴＲＡ（ＲＡＲα／β／γ Ｋｄ＝９／１２／１９ｎＭ）よりも高い親和性（ＲＡＲα／β／γ Ｋｄ＝２ｎＭ）で、３つすべてのＲＡＲサブタイプを標的とする、経口的に活性なレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストである。ＡＧＮ １９３１０９は、ＲＡＲα、ＲＡＲβ、およびＲＡＲγトランスフェクトされたＣＶ－１細胞におけるＡＴＲＡ誘導性転写に対して強く拮抗する（それぞれ、ＡＴＲＡに対する等モルのＡＧＮ １９３１０９で、８５％、６２％、および１００％）。ＡＧＮ １９３１０９はまた、経口（１～１０ｍｇ／ｋｇ）または局所（０．３～３６μｍｏｌ／ｋｇ）投与を介して、インビボでマウスおよびラットにおけるＲＡＲ媒介性の生理学的および病理学的プロセスを遮断するために広く採用されている。
ＲＡＲアンタゴニストの非限定的な例としては、ＡＧＮ１９３１０９、ＡＧＮ １９４４３１、ＡＧＮ １９４３０１、ＳＲ １１３３５、ＢＭＳ ４５３、ＢＭＳ １９５６１４、ＬＥ １３５、ＬＧ １００８１５、ＭＭ１１２５３、ＣＤ ２６６５、ＥＲ ５０８９１が挙げられる。
一実施形態では、ＲＡＲアンタゴニストは、ＡＧＮ１９３１０９、ＡＧＮ １９４４３１、ＡＧＮ １９４３０１、ＳＲ １１３３５、ＢＭＳ ４５３、ＢＭＳ １９５６１４、ＬＥ １３５、ＬＧ １００８１５、ＭＭ１１２５３、ＣＤ ２６６５、およびＥＲ ５０８９１から選択されるが、これらに限定されない群から選択される。
一実施形態では、ＲＡＲアンタゴニストは、ＡＧＮ１９３１０９である。
一実施形態では、本発明は、ヒト多能性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞を膵臓内胚葉前駆細胞に分化する方法に関し、本方法は、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストを含む培養培地中で胚体内胚葉を培養するステップを含む。
一実施形態では、本発明は、ヒト多能性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞を膵臓内胚葉前駆細胞に分化する方法に関し、本方法は、ＡＧＮ １９３１０９を含む培養培地中で胚体内胚葉を培養するステップを含む。
一実施形態では、本発明は、ＤＥをＰＥに分化する方法に関し、本方法は、ＲＡＲアンタゴニストを含む培養培地中でＤＥを培養して、膵臓内胚葉前駆体を得る第１のステップと、その後の、ＲＡＲアゴニストを含む細胞培養培地中で膵臓内胚葉前駆体を培養する第２のステップとを含む。
一実施形態では、本発明は、ＤＥをＰＥに分化する方法に関し、本方法は、ＡＧＮ １９３１０９を含む培養培地中でＤＥを培養して、膵臓内胚葉前駆体を得る第１のステップと、その後の、ＡＭ５８０を含む細胞培養培地中で膵臓内胚葉前駆体を培養する第２のステップとを含む。
一実施形態では、本発明は、ＤＥをＰＥに分化する方法に関し、本方法は、ＲＡＲアンタゴニストを含む培養培地中でＤＥを培養して、膵臓内胚葉前駆体を得る第１のステップと、その後の、ＲＡＲアゴニスト、線維芽細胞成長因子、およびＲｏｃｋ阻害剤、ならびに任意選択的にＢＭＰ阻害剤を含む細胞培養培地中で膵臓内胚葉前駆体を培養する第２のステップとを含む。
一実施形態では、本発明は、ＤＥをＰＥに分化する方法に関し、本方法は、ＲＡＲアンタゴニストを含む培養培地中でＤＥを培養して、膵臓内胚葉前駆体を得る第１のステップと、その後の、ＲＡＲアゴニスト、ＦＧＦ２、およびＴｉｇｅｒまたはＹ２７６３２、ならびに任意選択的にＬＤＮ１９３１８９を含む細胞培養培地中で膵臓内胚葉前駆体を培養する第２のステップとを含む。
一実施形態では、本発明は、ヒト多能性幹細胞由来の胚体内胚葉から膵臓内胚葉前駆細胞を誘導するためのＲＡＲアンタゴニストの使用に関する。
一実施形態では、本発明は、ヒト多能性幹細胞由来の胚体内胚葉から膵臓内胚葉前駆細胞を誘導するためのＲＡＲアンタゴニストの使用、その後の、膵臓内胚葉を誘導するためのＲＡＲアゴニストでの膵臓内胚葉前駆細胞の処置に関する。
一実施形態では、本発明の方法は、０，５～１００μＭ、１～５０μＭ、１～３００μＭ、１～２５０μＭ、１～２０μＭ、３～１７μＭ、５～１５μＭ、または７～１２μＭの範囲の濃度のＲＡＲアンタゴニストを含む。
一実施形態では、本発明の方法は、０，５～１００μＭの範囲の濃度のＲＡＲアンタゴニストを含む。
一実施形態では、本発明の方法は、０，５～５０μＭの範囲の濃度のＲＡＲアンタゴニストを含む。
一実施形態では、本発明の方法は、０，５～３０μＭの範囲の濃度のＲＡＲアンタゴニストを含む。
一実施形態では、本発明の方法は、０，５～２５μＭの範囲の濃度のＲＡＲアンタゴニストを含む。
一実施形態では、本発明の方法は、０，５～２０μＭの範囲の濃度のＲＡＲアンタゴニストを含む。
一実施形態では、本発明の方法は、１～２０μＭの範囲の濃度のＲＡＲアンタゴニストを含む。
一実施形態では、本発明の方法は、１０～２０μＭの範囲の濃度のＲＡＲアンタゴニストを含む。
一実施形態では、本発明の方法は、７～１２μＭの範囲の濃度のＲＡＲアンタゴニストを含む。
一実施形態では、本発明の方法は、約１０μＭの濃度のＲＡＲアンタゴニストを含む。
一実施形態では、本発明の方法は、約１５μＭの濃度のＲＡＲアンタゴニストを含む。
一実施形態では、本発明の方法は、約２０μＭの濃度のＲＡＲアンタゴニストを含む。
一実施形態では、本発明は、ヒト多能性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞から膵臓内胚葉細胞を誘導するための、ＲＡＲアンタゴニストの使用、その後のＲＡＲアゴニストの使用に関する。
一実施形態では、本発明は、ヒト多能性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞から膵臓内胚葉細胞を誘導するための、０，５～１００μΜの範囲の濃度のＲＡＲアンタゴニストの使用、その後のＲＡＲアゴニストの使用に関する。
一実施形態では、本発明は、ヒト多能性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞から膵臓内胚葉前駆細胞を誘導するための、１０μΜの濃度のＲＡＲアンタゴニストの使用に関する。
一実施形態では、本発明は、ヒト多能性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞から膵臓内胚葉細胞を誘導するための、１０μΜの濃度のＲＡＲアンタゴニストの使用、その後のＲＡＲアゴニストの使用に関する。
一実施形態では、本発明は、ヒト多能性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞から膵臓内胚葉前駆細胞を誘導するための、２０μΜの濃度のＲＡＲアンタゴニストの使用に関する。
一実施形態では、本発明は、ヒト多能性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞から膵臓内胚葉細胞を誘導するための、２０μΜの濃度のＲＡＲアンタゴニストの使用、その後のＲＡＲアゴニストの使用に関する。
一実施形態では、本発明は、は、ヒト多能性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞から膵臓内胚葉細胞を誘導するための、ＬＤＮ、その後にＡＭ５８０と組み合わせた、ＲＡＲアンタゴニストの使用に関する。
一実施形態では、本発明は、ＲＡＲアゴニストで膵臓内胚葉前駆細胞を処置することによって膵臓内胚葉細胞を誘導する前の、膵臓内胚葉前駆細胞の同調を改善するためのＲＡＲアンタゴニストの使用に関する。
一実施形態では、本発明は、ＤＥをＰＥに分化する方法に関し、本方法は、ＲＡＲアンタゴニストを含む培養培地中でＤＥを培養して、膵臓内胚葉前駆体を得る第１のステップと、その後の、ＲＡＲアゴニストを含む細胞培養培地中で膵臓内胚葉前駆体を培養する第２のステップとを含み、該第１のステップは、１時間～６日間または１～４日間の継続時間を有する。
一実施形態では、本発明は、ＤＥをＰＥに分化する方法に関し、本方法は、ＲＡＲアンタゴニストを含む培養培地中でＤＥを培養して、膵臓内胚葉前駆体を得る第１のステップと、その後の、ＲＡＲアゴニストを含む細胞培養培地中で膵臓内胚葉前駆体を培養する第２のステップとを含み、該第１のステップは、２日間の継続時間を有する。
一実施形態では、本発明は、ＤＥをＰＥに分化する方法に関し、本方法は、ＲＡＲアンタゴニストを含む培養培地中でＤＥを培養して、膵臓内胚葉前駆体を得る第１のステップと、その後の、ＲＡＲアゴニストを含む細胞培養培地中で膵臓内胚葉前駆体を培養する第２のステップとを含み、該第１のステップは、２日間未満の継続時間を有する。
レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アゴニスト
レチノイン受容体アゴニストは、レチノイン酸受容体サブタイプ、ＲＡＲα、ＲＡＲＡβ、およびＲＡＲγのうちの１つ以上に選択的に結合し、活性化する。
ＲＡＲアゴニストの非限定的な例としては、ＡＭ５８０、オールトランスレチノイン酸、９－シスレチノイン酸、ＡＣ ２６１０６６、ＡＣ ５５６４９、アダパレン、ＡＭ ８０、ＢＭＳ ７５３、ＢＭＳ ９６１、ＣＤ １５３０、ＣＤ ２３１４、ＣＤ ４３７、Ｃｈ ５５、イソトレチノイン、タザロテン、ＴＴＮＴＢ、およびＥＣ１９が挙げられる。
一実施形態では、ＲＡＲアゴニストは、ＡＭ５８０である。
一実施形態では、本発明は、ヒト多能性幹細胞から膵臓内胚葉細胞を誘導するための、ＲＡＲアンタゴニストが先行する、０，０５～１０μΜの範囲の濃度のＲＡＲアゴニストの使用に関する。
一実施形態では、本発明は、ヒト多能性幹細胞から膵臓内胚葉細胞を誘導するための、ＲＡＲアンタゴニストが先行する、１μΜの濃度のＲＡＲアゴニストの使用に関する。
一実施形態では、本発明は、ヒト多能性幹細胞から膵臓内胚葉細胞を誘導するための、ＲＡＲアンタゴニストが先行する、１０μΜの濃度のＲＡＲアゴニストの使用に関する。
ＢＭＰ阻害剤
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、標的細胞に局所的に作用して、細胞の生存、増殖、および分化に影響を与えるシグナル伝達分子である。最初に骨誘導剤として特定されたが、ＢＭＰは、現在では多くの臓器系の形成および機能に影響を及ぼすことが知られている。ＢＭＰ受容体アンタゴニストまたはＢＭＰ阻害剤は、特に、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、およびＡＬＫ６によるＳｍａｄ１／５／８リン酸化を阻害することによって、ＢＭＰシグナル伝達を阻害する。
ＢＭＰ阻害剤の非限定的な例としては、ＬＤＮ １９３１８９、ドルソモルフィン、ノギン、コーディン、ＬＤＮ ２１２８５４、ＬＤＮ ２１４１１７、ＭＬ ３４７、ＤＭＨ１、ＤＭＨ２、およびＫ ０２２８８が挙げられる。
一実施形態では、ＢＭＰ阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９である。
一実施形態では、本発明は、ＢＭＰ阻害剤ＬＤＮと組み合わせたＲＡＲアンタゴニストの使用に関し、該ＢＭＰ阻害剤は、２５～２００ｎＭの濃度範囲である。
一実施形態では、本発明は、ＢＭＰ阻害剤ＬＤＮと組み合わせたＲＡＲアンタゴニストの使用に関し、該ＢＭＰ阻害剤は、５０ｎＭの濃度である。
一実施形態では、本発明は、ＢＭＰ阻害剤ＬＤＮと組み合わせたＲＡＲアンタゴニストの使用に関し、該ＢＭＰ阻害剤は、約５０ｎＭの濃度である。
ＲＯＣＫ阻害剤
Ｒｈｏ関連コイル状コイル含有キナーゼ（ＲＯＣＫ）は、ＲｈｏＡ小ＧＴＰａｓｅのエフェクターであり、セリン／トレオニンキナーゼのＡＧＣファミリーに属する。ＲＯＣＫキナーゼは、細胞の収縮、遊走、アポトーシス、生存、および増殖を含む多くの機能を有する。ＩＲｈｏ関連、コイル状コイル含有プロテインキナーゼＲＯＣＫ阻害剤は、ｒｈｏキナーゼを標的とし阻害する一連の化合物である。
一実施形態では、Ｒｏｃｋ阻害剤は、ＴｉｇｅｒまたはＹ２７６３２である。
一実施形態では、本発明は、Ｒｏｃｋ阻害剤と組み合わせたＲＡＲアンタゴニストの使用に関し、該Ｒｏｃｋ阻害剤は、１～２０μＭの濃度範囲である。
一実施形態では、本発明は、Ｒｏｃｋ阻害剤と組み合わせたＲＡＲアンタゴニストの使用に関し、該Ｒｏｃｋ阻害剤は、５μＭの濃度である。
ｂＦＧＦ
塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は、ＦＧＦ２としても知られ、ＦＧＦ２遺伝子によってコードされる成長因子およびシグナル伝達タンパク質である。
一実施形態では、成長因子は、ｂＦＧＦである。
一実施形態では、本発明は、ｂＦＧＦと組み合わせたＲＡＲアンタゴニストの使用に関し、該ｂＦＧＦは、２５～２００ｎＭの濃度範囲である。
バイオリアクター
懸濁培養バイオリアクターは、制御されかつ再現可能な培養システムでの幹細胞および／またはその子孫の大規模な増殖および分化を可能にする。これらのシステムは、温度、ｐＨ、および酸素濃度などの条件が監視および制御され得る均質な培養環境を提供する。さらに、これらのシステムは、一貫した培養条件下で、かつ培養変動性が最小限で、多数の細胞の産生を可能にする。
培養培地／組成物
微生物または細胞の成長を支持するように設計された固体、液体、または半固体。異なるタイプの商業用培地が、異なるタイプの細胞の成長に使用される。
一実施形態では、本発明は、ヒト多能性幹細胞由来の胚体内胚葉から膵臓内胚葉前駆体を生成するための、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストを含む培養培地に関する。
一実施形態では、本発明は、ヒト多能性幹細胞由来の胚体内胚葉から膵臓内胚葉前駆体を生成するための、ＡＧＮ １９３１０９を含む培養培地に関する。
一実施形態では、本発明は、ヒト多能性幹細胞由来の胚体内胚葉から膵臓内胚葉／ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋を生成するための、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニスト、その後にＲＡＲアゴニストを含む培養培地に関する。
一実施形態では、本発明は、ヒト多能性幹細胞由来の胚体内胚葉から膵臓内胚葉／ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋を生成するための、ＡＧＮ １９３１０９とそれに続くＡＭ５８０を含む、培養培地に関する。
一実施形態では、本発明は、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストを含む培養培地に関する。
一実施形態では、本発明は、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストを含み、その後にレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アゴニストが添加される培養培地に関する。
別の実施形態では、本発明は、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストおよびＢＭＰ阻害剤を含み、その後にレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アゴニストが添加される培養培地に関する。
別の実施形態では、本発明は、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニスト、ＢＭＰ阻害剤、およびＲｏｃｋ阻害剤を含み、その後にレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アゴニストおよびＲｏｃｋ阻害剤が添加される培養培地に関する。
別の実施形態では、本発明は、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニスト、ＢＭＰ阻害剤、およびＲｏｃｋ阻害剤を含み、その後にレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アゴニスト、Ｒｏｃｋ阻害剤、およびＦＧＦ２が添加される培養培地に関する。
一実施形態では、本発明は、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニスト（該ＲＡＲアンタゴニストは、ＡＧＮ １９３１０９である）を含み、その後にレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アゴニストが添加される（該ＲＡＲアゴニストは、ＡＭ５８０である）培養培地に関する。
一実施形態では、本発明は、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストを含む培養培地に関し、該ＲＡＲアンタゴニストは、ＡＧＮ １９３１０９である。
一実施形態では、本発明は、ＢＭＰ阻害剤ＬＤＮ１９３１８９をさらに含む培養培地に関する。
一実施形態では、本発明は、ＦＧＦ２をさらに含む培養培地に関する。
一実施形態では、本発明は、Ｒｏｃｋ阻害剤ＴｉｇｅｒまたはＹ２７６３２をさらに含む培養培地に関する。
一実施形態では、本発明は、以下を含む組成物に関する：
ａ）ＡＧＮ １９３１０９などのレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストを含む培養培地、
ｂ）ヒト多能性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞および／または膵臓内胚葉細胞。
プロトコル
本明細書で使用される場合、「ＬＤＮ段階」という用語は、ＰＥ０～３からの４日を意味し、ＬＤＮは、最初の２日間、すなわち、ＰＥ０～ＰＥ１で添加され、ＬＤＮおよびＲＡＲアンタゴニストは、最後の２日間、すなわち、ＰＥ２～ＰＥ３で添加される。
振盪フラスコまたはバイオリアクターにおける懸濁液培養中でＤＥ段階に分化した細胞は、ＰＥ分化に続く（ＷＯ２０１２／１７５６３３（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。ＡＧＮ１９３１０９は、２日間のＬＤＮ段階中に培養培地に添加される。ＰＥ分化プロトコルの第２の段階におけるＰＥ誘導は、標準プロトコル（ＷＯ２０１４／０３３３２２（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））に変更を加えずに実施される。
幹細胞から膵臓細胞を得るためのプロトコルは、Ｄ’Ａｍｏｕｒ，Ｋ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００６）、Ｊｉａｎｇ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００７）、Ｋｒｏｏｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２００８）に記載されるプロトコルによって例示されるが、これらに限定されない。
体細胞または、ＥＳ様細胞などの多能性細胞に脱分化するように誘導された体細胞から膵臓細胞を得るためのプロトコルは、Ａｏｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２００８）、Ｄ’Ａｍｏｕｒ，Ｋ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００６）、Ｊｉａｎｇ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００７）、Ｋｒｏｏｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２００８）、Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２００７）、Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．，ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．（２００６）、およびＷｅｒｎｉｇ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００７）に記載されるプロトコルによって例示されるが、これらに限定されない。
本明細書に別段示されない限り、単数形で提示される用語は、複数の状況も含む。
本発明は、以下の非限定的な実施形態によってさらに説明される：
１．ヒト多能性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞を膵臓内胚葉前駆体に分化する方法であって、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストを含む培養培地中で胚体内胚葉（ＤＥ）を培養するステップを含む、方法。
２．該方法が、ＲＡＲアゴニストを含む細胞培養培地中で膵臓内胚葉前駆体を培養し、それによって膵臓内胚葉（ＰＥ）を誘導するステップをさらに含み、該細胞が、ＮＫＸ６．１＋／ＰＤＸ１＋二重陽性である、実施形態１に記載の方法。
３．該培養培地が、任意選択的に、ＢＭＰ阻害剤、成長因子、および／またはＲｏｃｋ阻害剤をさらに含む、実施形態２に記載の方法。
４．該レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストが、ＡＧＮ １９３１０９である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
５．該ＲＡＲアゴニストが、ＡＭ５８０である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６．該任意選択的なＢＭＰ阻害剤が、ＬＤＮ１９３１８９である、実施形態３～５に記載の方法。
７．該任意選択的な成長因子が、ｂＦＧＦ２である、実施形態３～５に記載の方法。
８．該任意選択的なロック阻害剤が、ＴｉｇｅｒまたはＹ２７６３２である、実施形態３～５に記載の方法。
９．該ヒト多能性幹細胞が、胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１０．該レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストの濃度が、０，５～１００μＭ、１～５０μＭ、１～３００μＭ、１～２５０μＭ、１～２０μＭ、３～１７μＭ、５～１５μＭ、または７～１２μＭである、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１１．該レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストの濃度が、０，５～１００μＭである、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１２．該レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストの濃度が、０，５～５０μＭである、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１３．該レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストの濃度が、０，５～３０μＭである、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１４．該レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストの濃度が、０，５～２５μＭである、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１５．該レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストの濃度が、０，５～２０μＭである、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１６．該レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストの濃度が、１～２０μＭである、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１７．該レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストの濃度が、１０～２０μＭである、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１８．該レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストの濃度が、７～１２μＭである、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１９．該レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストの濃度が、１０μＭである、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２０．該レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストの濃度が、１５μＭである、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２１．該レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストの濃度が、２０μＭである、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２２．実施形態１に記載の該ステップが、１時間～６日間または１～４日間の継続時間を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２３．実施形態１に記載の該ステップが、２日間の継続時間を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２４．実施形態１に記載の該ステップが、２日間未満の継続時間を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２５．該膵臓内胚葉細胞の少なくとも５％が、ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１を共発現する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２６．該膵臓内胚葉細胞が、少なくとも５％、少なくとも１０％、１０～３０％、１０～４０％、５～７０％、１０～８０％、または５～１００％ ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋二重陽性である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２７．該膵臓内胚葉細胞が、少なくとも７０％ ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋二重陽性である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２８．該膵臓内胚葉細胞が、少なくとも８０％ ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋二重陽性である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２９．該膵臓内胚葉細胞が、少なくとも９０％ ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋二重陽性である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３０．該膵臓内胚葉細胞が、少なくとも９５％ ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋二重陽性である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３１．該膵臓内胚葉細胞が、少なくとも９８％ ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋二重陽性である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３２．該胚体内胚葉細胞が、ＳＯＸ１７＋／ＦＯＸＡ２＋／ＣＸＣＲ４＋三重陽性である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３３．該膵臓内胚葉細胞が、１％未満ＮＫＸ２．２陽性である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３４．該方法が、準最適なＰＥ分化を助けることができる、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３５．該方法が、ＬＤＮ段階を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３６．該方法が、標準方法よりも短く、ＬＤＮ段階が、２日間である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３７．インビトロでＤＥ細胞をインキュベートすることを含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３８．インビボでＤＥ細胞をインキュベートすることを含む、先行する実施形態１～３５のいずれか１つに記載の方法。
３９．分化細胞を単離することをさらに含む、先行する実施形態１～３５のいずれか１つに記載の方法。
４０．分化細胞を貯蔵することをさらに含む、先行する実施形態１～３５のいずれか１つに記載の方法。
４１．膵臓内胚葉細胞であって、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法の産物である、膵臓内胚葉細胞。
４２．実施形態４１に記載の複数の細胞を含む、膵臓内胚葉細胞培養または膵臓内胚葉細胞集団。
４３．実施形態１～４０に記載の方法によって得ることが可能な膵臓内胚葉細胞。
４４．Ｎｋｘ６．１＋／Ｐｄｘ１＋二重陽性の発現が増加した、実施形態４３に記載の膵臓内胚葉細胞。
４５．該膵臓内胚葉細胞が、少なくとも７０％ ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋二重陽性である、実施形態４３に記載の膵臓内胚葉細胞。
４６．該膵臓内胚葉細胞が、少なくとも８０％ ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋二重陽性である、実施形態４３に記載の膵臓内胚葉細胞。
４７．該膵臓内胚葉細胞が、少なくとも９０％ ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋二重陽性である、実施形態４３に記載の膵臓内胚葉細胞。
４８．該膵臓内胚葉細胞が、少なくとも９５％ ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋二重陽性である、実施形態４３に記載の膵臓内胚葉細胞。
４９．該膵臓内胚葉細胞が、少なくとも９８％ ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋二重陽性である、実施形態４３に記載の膵臓内胚葉細胞。
５０．該膵臓内胚葉細胞が、８０～１００％ ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋二重陽性である、実施形態４３に記載の膵臓内胚葉細胞。
５１．該膵臓内胚葉細胞が、９０～１００％ ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋二重陽性である、実施形態４３に記載の膵臓内胚葉細胞。
５２．該膵臓内胚葉細胞が、１％未満ＮＫＸ２．２陽性である、実施形態４３に記載の膵臓内胚葉細胞。
５３．ＮＧＮ３およびＮｅｕｒｏＤの発現が低減した、実施形態４３に記載の膵臓内胚葉細胞。
５４．ＮＧＮ３およびＮｅｕｒｏＤの発現が２倍低減した、実施形態４３に記載の膵臓内胚葉細胞。
５５．該ＰＥが、少なくとも４０％のＣ－ＰＥＰ＋／ＮＫＸ６．１＋を有するベータ細胞にさらに分化する、実施形態４３に記載の膵臓内胚葉細胞。
５６．該ＰＥが、ＥＰ細胞、さらにベータ細胞により選択的に、より均質に、かつより効率的に誘導される、実施形態４３に記載の膵臓内胚葉細胞。
５７．該ＰＥ細胞が、インビトロまたはインビボで誘導される、実施形態４３～５６に記載の膵臓内胚葉細胞。
５８．該ＰＥ細胞が、インビトロで誘導される、実施形態５７に記載の膵臓内胚葉細胞。
５９．該ＰＥ細胞が、インビボで誘導される、実施形態５７に記載の膵臓内胚葉細胞。
６０．薬剤として使用するための、ベータ細胞へのさらなる分化のための、実施形態４３～５９のいずれか１つに記載の膵臓内胚葉細胞。
６１．幹細胞または幹細胞由来の組織もしくは臓器を対象に投与することによる、あるいは幹細胞または幹細胞由来の組織もしくは臓器を対象にグラフトすることによる、あるいは幹細胞または幹細胞由来の組織もしくは臓器を対象に移植することによる、糖尿病の治療において薬剤として使用するための、ベータ細胞へのさらなる分化のための、実施形態４３～５９のいずれか１つに記載の膵臓内胚葉細胞。
６２．ヒト多能性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞から膵臓内胚葉前駆体を生成するための、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストを含む培養培地。
６３．膵臓内胚葉を生成するためのレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アゴニストをさらに含み、該膵臓内胚葉細胞が、少なくとも７０％ ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋二重陽性である、実施形態６２に記載の培養培地。
６４．ＢＭＰ阻害剤をさらに含む、実施形態６２に記載の培養培地。
６５．ロック阻害剤をさらに含む、実施形態６２に記載の培養培地。
６６．ＦＧＦ２をさらに含む、実施形態６３に記載の培養培地。
６７．該レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストが、ＡＧＮ １９３１０９である、実施形態６２に記載の培養培地。
６８．該レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アゴニストが、ＡＭ５８０である、実施形態６３に記載の培養培地。
６９．該さらなるＢＭＰ阻害剤が、ＬＤＮ１９３１８９である、実施形態６２に記載の培養培地。
７０．Ｒｏｃｋ阻害剤が、ＴｉｇｅｒまたはＹ２７６３２である、実施形態６２に記載の培養培地。
７１．ヒト多能性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞から膵臓内胚葉細胞を誘導するための、０，５～１００μΜの範囲の濃度のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストの使用。
７２．該レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストが、ヒト多能性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞から膵臓内胚葉細胞を誘導するために、０，５～５０μΜの範囲の濃度である、実施形態７１に記載の使用。
７３．該レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストが、ヒト多能性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞から膵臓内胚葉細胞を誘導するために、０，５～３０μΜの範囲の濃度である、実施形態７１に記載の使用。
７４．該レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストが、ヒト多能性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞から膵臓内胚葉細胞を誘導するために、０，５～２０μΜの範囲の濃度である、実施形態７１に記載の使用。
７５．レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニスト濃度が、１０～２０μΜの範囲である、実施形態７１に記載の使用。
７６．レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニスト濃度が、約１０μΜである、実施形態７１に記載の使用。
７７．レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニスト濃度が、約２０μΜである、実施形態７１に記載の使用。
７８．ヒト多能性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞から膵臓内胚葉前駆細胞を誘導するための、０，５～１００μΜの範囲の濃度のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストＡＧＮ１９３１０９の使用。
７９．レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストＡＧＮ１９３１０９が、０，５～５０μΜの濃度である、実施形態７８に記載の使用。
８０．レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストＡＧＮ１９３１０９が、０，５～３０μΜの濃度である、実施形態７８に記載の使用。
８１．レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストＡＧＮ１９３１０９が、０，５～２０μΜの濃度である、実施形態７８に記載の使用。
８２．レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストＡＧＮ１９３１０９が、約１０μΜの濃度である、実施形態７８に記載の使用。
８３．レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストＡＧＮ１９３１０９が、約２０μΜの濃度である、実施形態７８に記載の使用。
８４．ヒト多能性幹細胞から膵臓内胚葉細胞を誘導するための、ＢＭＰ阻害剤と組み合わせたレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストＡＧＮ１９３１０９、その後の、ＦＧＦ２および／またはＲｏｃｋ阻害剤と組み合わせたＡＭ５８０の使用。
８５．該ＢＭＰ阻害剤が、ＬＤＮ１９３１８９である、実施形態８４に記載の使用。
８６．該Ｒｏｃｋ阻害剤が、ＴｉｇｅｒまたはＹ２７６３２である、実施形態８４に記載の使用。
８７．ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋二重陽性を発現する少なくとも７０％の膵臓内胚葉細胞を示す、ヒト多能性幹細胞由来の同調した膵臓内胚葉細胞集団。
８８．該細胞集団が、ＰＴＦ１ａをさらに発現する、実施形態８７に記載の同調した膵臓内胚葉細胞集団。
８９．該細胞集団が、少なくとも３０％のＤＬＫ１をさらに発現する、実施形態８７に記載の同調した膵臓内胚葉細胞集団。
９０．該細胞集団が、２０～８０％のＤＬＫ１をさらに発現する、実施形態８７に記載の同調した膵臓内胚葉細胞集団。
９１．該細胞集団が、少なくとも３０～８０％のＤＬＫ１をさらに発現する、実施形態８７に記載の同調した膵臓内胚葉細胞集団。
９２．該細胞集団が、１％未満のＮＫＸ２．２を発現する、実施形態８７に記載の同調した膵臓内胚葉細胞集団。
９３．ＮＧＮ３およびＮｅｕｒｏＤの発現が低減した、実施形態８７に記載の同調した膵臓内胚葉細胞集団。
９４．ＮＧＮ３およびＮｅｕｒｏＤの発現が２倍低減した、実施形態８７に記載の同調した膵臓内胚葉細胞集団。
９５．該ＰＥが、少なくとも４０％のＣ－ＰＥＰ＋／ＮＫＸ６．１＋を有するベータ細胞にさらに分化する、実施形態８７に記載の同調した膵臓内胚葉細胞集団。
９６．該ＰＥが、ＥＰ細胞に、さらにベータ細胞により選択的に、より均質に、かつより効率的に誘導される、実施形態８７～９５に記載の同調した膵臓内胚葉細胞集団。
９７．該ＰＥ細胞が、インビトロまたはインビボで誘導される、実施形態８７～９５に記載の同調した膵臓内胚葉細胞集団。
９８．該ＰＥ細胞が、インビトロで誘導される、実施形態９７に記載の同調した膵臓内胚葉細胞集団。
９９．該ＰＥ細胞が、インビボで誘導される、実施形態９７に記載の同調した膵臓内胚葉細胞集団。
１００．薬剤として使用するための、ベータ細胞へのさらなる分化のための、実施形態８７～９９に記載の同調した膵臓内胚葉細胞集団。
１０１．幹細胞または幹細胞由来の組織もしくは臓器を対象に投与することによる、あるいは幹細胞または幹細胞由来の組織もしくは臓器を対象にグラフトすることによる、あるいは幹細胞または幹細胞由来の組織もしくは臓器を対象に移植することによる、糖尿病の治療において薬剤として使用するための、ベータ細胞へのさらなる分化のための、実施形態８７～１００に記載の同調した膵臓内胚葉細胞集団。
１０２．対象における組織または臓器の形成および／または再生および／または修復を刺激または強化するための薬剤の調製における、実施形態４１～６１に記載の膵臓内胚葉細胞または実施形態８７～１０１に記載の同調した細胞集団の使用。
１０３．
ａ．レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニスト（ＡＧＮ １９３１０９）を含む培養培地と、
ｂ．ヒト多能性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞および／または膵臓内胚葉細胞と、を含む、組成物。
１０４．実施形態４１～６１または８７～１０１のいずれか１つに記載のベータ細胞またはその細胞集団へのＰＥ細胞のさらなる分化のための膵臓内胚葉細胞と、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
１０５．実施形態４１～６１または８７～１０１のいずれか１つに記載のベータ細胞またはその細胞集団へのＰＥ細胞のさらなる分化のための膵臓内胚葉細胞と、生体適合性足場またはマトリックスと、を含む、組成物。
１０６．実施形態１～４０に記載の方法によって得られた膵臓内胚葉細胞を含む、バイオリアクター。
１０７．実施形態４１～６１もしくは８７～１０１に記載の細胞、実施形態１～４０に記載の方法に従って得られた細胞、またはベータ細胞へのさらなる分化のための実施形態１～４０に記載の細胞を投与するステップを含む、１型糖尿病患者を治療する方法。
１０８．ベータ細胞へのさらなる分化のためである実施形態４１～６１または８７～１０１に記載の細胞を投与するステップを含む、１型糖尿病患者を治療する方法。
１０９．糖尿病の予防または治療の方法であって、該対象に、ベータ細胞にさらに分化している実施形態４１～６１または８７～１０１のいずれか１つに記載の有効量の膵臓内胚葉細胞または膵臓内胚葉細胞集団を投与、移植、またはグラフトし、それによって対象における糖尿病を予防または治療することを含む、方法。
１１０．組織または臓器を再生および／または修復および／または構築するためのキットであって、
（ｉ）ベータ細胞へのさらなる分化のための、実施形態４１～６１または８７～１０１のいずれか１つに記載の膵臓内胚葉細胞または膵臓内胚葉細胞集団と、
（ｉｉ）生体適合性足場またはマトリックスと、
（ｉｉｉ）任意選択的に、少なくとも１つの成長因子またはその機能的断片と、
（ｉｖ）任意選択的に、ＢＭＰ阻害剤、成長因子、および／またはＲｏｃｋ阻害剤、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される薬剤と、
（ｉｖ）任意選択的に、任意の細胞培養またはそれに由来する組織もしくは臓器を含む、細胞を調製、維持、および／または使用するための指示書と、を含む、キット。
材料および方法
略語リスト
＋ｖｅ：陽性
ＢＣ： ベータ細胞（例えば、ＢＣ７：ベータ細胞分化の７日目）
ｂＦＧＦ：塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）（ＦＧＦ２としても既知）
Ｃｙｃ：シクロパミン
ｄｂ：二重陽性
ＤＥ： 胚体内胚葉
ＥＰ： 内分泌前駆細胞
ｈＢＳ：ヒト胚盤胞由来幹
ｈＢＳＣ；ヒト胚盤胞由来幹細胞
ｈＥＳ：ヒト胚性幹
ｈＥＳＣ：ヒト胚性幹細胞
ｈｉＰＳＣ：ヒト誘導多能性幹細胞
ｈＰＳＣ：ヒト多能性幹細胞
ＫＯＳＲ：ノックアウト血清代替物
ＮＫＸ６．１：ＮＫ６ホメオボックス１
ＰＤＸ１：膵臓および十二指腸ホメオボックス１
ＰＥ： 膵臓内胚葉（例えば、ＰＥ１０：膵臓内胚葉分化の１０日目）
ＰＥＳＴ：ペニシリンストレプトマイシン
ＰＳ： 多能性幹
Ｒｏｃｋｉ：Ｒｈｏキナーゼ阻害剤ＩＩＩ
ＲＴ： 室温
一般的な調製方法
多能性幹細胞の培養
３０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）および１０ｎｇ／ｍＬのノギン（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を有する、フィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）でコーティングされた培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）内のＤＥＦ－ＣＳ培養培地（Ｔａｋａｒａ ＢＩＯ Ｅｕｒｏｐｅ）中で、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞株ＳＡ１２１（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ）を増殖する。細胞は、１０μＭのＲｏｃｋ阻害剤Ｙ－２７６３２（Ｓｉｇｍａ ＃Ｙ０５０３）で継代され、０，５～１ｍｉｏ／ｍＬの密度で振盪フラスコまたはバイオリアクター（ＤＡＳＢＯＸ，ＤＡＳＧＩＰ，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）において播種され、一定の撹拌条件下でクラスターを形成することができる単一細胞である。
胚体内胚葉（ＤＥ）への多能性幹細胞の分化
毎日の培地交換を伴うＤＥＦ－ＣＳ培地中での１～３日間の後、ＷＯ２０１２／１７５６３３（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、クラスターをＤＥに分化する。細胞クラスターをＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ ＃６１８７０）中で１回洗浄し、ＲＰＭＩ１６４０中２～７μＭのＣＨＩＲ９９０２１（Ａｘｏｎ＃１３８６）で処置する。２４時間後、細胞をＲＰＭＩ１６４０で洗浄し、２４～４８時間毎に培地を交換しながら、ＲＰＭＩ１６４０中２５～１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃１２０－１４Ｅ）および２％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃１７５０４－０４４）で３日間処置した。ＤＥへの分化中加湿振盪インキュベーター（Ｉｎｆｏｒｓ）において、またはバイオリアクターシステム（ＤＡＳＢＯＸ，ＤＡＳＧＩＰ，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）において、細胞を３７℃および５％ ＣＯ２で維持する。ＤＥへの分化の終了時に、集団の９５％が、ＳＯＸ１７を発現し、１％未満が、多能性マーカーＯＣＴ４を発現する。
［実施例１］
［膵臓内胚葉への胚体内胚葉の分化は、ＬＤＮ段階にＡＧＮ１９３１０９を添加することで改善される］
膵臓内胚葉への分化のための標準プロトコルにおいて、ＷＯ２０１４／０３３３２２（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、ＤＥに分化されるクラスターをＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ ＃６１８７０）中で１回洗浄し、１２％ ＫＯＳＲ（Ｇｉｂｃｏ １０８２８－０２８）を有するＲＰＭＩ１６４０中のＬＤＮ１９３１８９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ ０４－００７４）およびＲｏｃｋ－Ｉ（Ｓｉｇｍａ Ｙ２７６３２－Ｙ０５０３）の存在下で４日間分化し、次いで、ＡＭ５８０（ＥＮＺＯ／Ｂｉｏｍｏｌ ＧＲ１０４－００２５）、ｂＦＧＦ（＃１００－１８Ｂ，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）ＪｎｋｉＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ４２０１１９）、およびＲｏｃｋ－Ｉを含有する培地に６～９日間供する。培地を毎日または隔日交換した。ＰＥ分化の終了時に、フローサイトメトリーまたは遺伝子発現分析（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ）によってクラスターを分析した。１０μＭのＡＧＮ１９３１０９（Ｔｏｃｒｉｓ ５７５８）をＰＥ分化のＬＤＮ段階に添加したが、プロトコルの残りの部分は変更しなかった。
ＬＤＮ段階（ＰＥ２～３）中の最後の２日間に１０μＭのＡＧＮ １９３１０９を添加することにより、ＰＥ分化の１０日目（ＰＥ１０）のＰｄｘ１／Ｎｋｘ６．１二重陽性の膵臓内胚葉の割合が著しく増加した（図１Ａ、Ｂ）。ＡＧＮ１９３１０９では、少なくとも７０％のＰｄｘ１／Ｎｋｘ６．１二重陽性が観察された一方で、これは、標準条件では約４０％であり、１０％未満Ｐｄｘ１／Ｎｋｘ６．１二重陰性細胞であった。
さらに、ＡＧＮ１９３１０９処置で、２０％から７５％へのＰｄｘ１／Ｎｋｘ６．１二重陽性細胞の増加が観察されるように、記載されるようなＡＧＮ１９３１０９の添加は、そうでなければ準最適なＰＥ分化を助けることができるように思われる（図１Ｃ）。
また、ＡＧＮ １９３１０９の添加で、ＰＴＦ１Ａ、ＣＰＡ１、およびＤＬＫ１などの膵臓内胚葉の他のマーカーの増加も観察される（図２Ａ）。代わりに、ＰＥ２～３にＡＭ５８０でＲＡＲシグナル伝達を活性化した場合、Ｎｋｘ６．１、ＰＴＦ１Ａ、およびＤＬＫ１の著しい下方制御が観察され、ＡＧＮ１９３１０９の効果が、特にＲＡＲシグナル伝達の阻害によって媒介されることを示す（図２Ａ）。
また、ＰＥ２～３にＡＧＮ １９３１０３を添加した場合、ＤＬＫ１が、より高い割合の膵臓内胚葉で発現されることがフローサイトメトリーによって確認される（３１％対１３％）。ＤＬＫ１は、主に高レベルのＮｋｘ６．１を発現する細胞において、膵臓内胚葉のマーカーとして特定される（図２Ｂ）
さらに、分化は、ＡＧＮ１９３１０９添加なしの条件と比較してＮｇｎ３およびＮｅｕｒｏＤのより低い発現を特徴する、ＰＥ段階におけるより低い程度の未成熟内分泌分化とより同調している（図３Ａ）。この場合もやはり、ＡＭ５８０によるＲＡＲシグナル伝達の活性化は、逆の効果を有し、ＰＥ１０にすでにＮｇｎ３およびＮｅｕｒｏＤ１の著しい増加をもたらすように思われる（図３Ａ）。
Ｎｋｘ２．２陽性細胞の割合は、内分泌運命に特定の細胞を示し、ＰＥ段階において、対照の２，９％と比較して、ＡＧＮ１９３１０９処置で１％未満に低減した（図３Ｂ）。
また、遺伝子発現で実証されるように、ＡＧＮ１９３１０９の効果が、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）阻害の特定の効果である可能性が高いことがフローサイトメトリーによって実証される。代わりにＲＡＲアゴニストであるＡＭ５８０を添加することによる反対の表現型、すなわち、ＰＥ１０のＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１二重＋膵臓内胚葉の割合の著しい低減が観察される（図４Ａ）。ＡＧＮ１９３１０９処置では、Ｐｄｘ１／Ｎｋｘ６．１二重陽性の数が５２％から７６，９％に増加した一方で、ＡＭ５８０処置では、約１４％に減少する。
ＡＧＮ１９３１０９のプラスの効果は、１Ｌバイオリアクター（ＤＡＳｇｉｐ，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で再現され得る。データは、ＡＧＮ０１９３１０９プロトコルの修正が、バイオリアクター形式に適合することを実証し、実験は並列で実行されなかったが、結果は、バイオリアクター形式におけるＡＧＮ １９３１０９が、標準プロトコルと比較してＰＥ誘導の利点をもたらすことを示唆する（図８Ａ）。標準プロトコルを使用して、５８，４％のＰｄｘ１／Ｎｋｘ６．１二重陽性を得た一方で、ＡＧＮ１９３１０９処置では、数値は８２，２であった。
ＡＧＮ１９３１０９の添加は、Ｐｄｘ１／Ｎｋｘ６．１二重陽性によって測定されるように、ＰＥ誘導にいかなる悪影響も及ぼすことなく、ＬＤＮ段階において２から４日間に延長され得る（図６Ａ）。
非常に驚くべきことに、ＬＤＮ段階の長さは、ＡＧＮ １９３１０９の存在下で２日間のみに低減され得、したがって、ＰＥの誘導のためのプロトコルの長さを２日間短縮する（図６Ｂ）。
ＡＧＮ１９３１０９の効果は、用量反応性であり、０．５μＭ～２０μＭの範囲で実証される。濃度の増加なしのＰｄｘ１／Ｎｋｘ６．１二重陽性細胞の数の増加、およびＰｄｘ１のみ陽性の細胞の減少が観察される（図５Ａ）濃度を１０μＭから２０μＭに増加させるさらなる効果は観察されない（図５Ｂ）。
実施例２
［ＬＤＮ段階中のＡＧＮ１９３１０９添加後のＣｐｅｐ／Ｎｋｘ６．１二重陽性ベータ様細胞への分化の改善］
ＷＯ２０１５／０２８６１４、ＷＯ２０１７／１４４６９５、およびＷＯ／２０１９／０４８６９０（すべて、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、内分泌およびベータ細胞誘導のためのプロトコルを使用して、ヒトＥＳ細胞またはヒトｉＰＳ細胞由来のＰＥクラスターを洗浄し、内分泌前駆細胞（ＥＰ）およびベータ細胞様細胞（ＢＣ）にさらに分化した。
ＢＣ分化の終了時に、クラスターをサンプリングし、ＴｒｙｐＬＥ－Ｓｅｌｅｃｔ（Ｇｉｂｃｏ １２５６３－０１１）で単一細胞に解離し、１０％ホルマリン中に固定し、Ｃｐｅｐ／Ｎｋｘ６．１およびグルカゴンで染色し、フローサイトメトリーによって分析した。
ＰＥプロトコルのＬＤＮ段階にＡＧＮ１９３１０９を含んだ後に、Ｃｐｅｐ／Ｎｋｘ６．１二重陽性ベータ様細胞の割合の明らかな増加が観察され、ＡＧＮ１９３１０９を使用した場合のＰＥ品質の改善を示す。Ｃｐｅｐ／Ｎｋｘ６．１二重陽性は、ＡＧＮ１９３１０９の添加で約３５％から約５０％に増加した（図７Ａ、Ｂ）。この増加は、グルカゴン陽性細胞の増加を伴っておらず、後の分化においてベータ様細胞を形成するＰＥの能力に対するＡＧＮ１９３１０９の特定の効果を示す（図７Ｂ）。
細胞療法の観点から、治療用細胞型の安定した表現型は、患者への移植前の細胞産物の輸送および貯蔵を可能にするため、大きな利点である。ＰＥ誘導中にＡＧＮ１９３１０９を添加すると、長期のインビトロ培養でベータ細胞表現型の安定性の改善が観察された。ＢＣ分化の６日目にほぼ同一の表現型を用いた実験では、標準プロトコルについて、１週間後のＢＣ１３日目に劇的な減少が観察された。ＢＣ６日目からＢＣ１３日目に、標準プロトコルが、Ｃｐｅｐ／Ｎｋｘ６．１二重陽性を５３％から２７％に減少させた一方で、ＡＧＮ１９３１０９プロトコルは、５９％から５７％への二重陽性のごくわずかな減少のみを有した（図９Ａ）。
本発明のある特定の特徴が本明細書に例示および記載されているが、ここで、多くの修正、置換、変更、および同等物が当業者に想到されるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲が、本発明の真の趣旨の範囲内にあるこうしたすべての修正および変更を網羅することを意図していることが理解されるべきである。

Claims (15)

  1. ヒト多能性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞を膵臓内胚葉前駆体に分化する方法であって、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストを含む培養培地中で、前記胚体内胚葉（ＤＥ）を培養するステップを含む、方法。
  2. 前記方法が、ＲＡＲアゴニストを含む細胞培養培地中で前記膵臓内胚葉前駆体を培養し、それによって膵臓内胚葉（ＰＥ）を誘導するステップをさらに含み、前記細胞が、ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋二重陽性である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストが、ＡＧＮ１９３１０９、ＡＧＮ １９４４３１、ＡＧＮ １９４３０１、ＳＲ １１３３５、ＢＭＳ ４５３、ＢＭＳ １９５６１４、ＬＥ １３５、ＬＧ １００８１５、ＭＭ１１２５３、ＣＤ ２６６５、およびＥＲ ５０８９１からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストが、ＡＧＮ １９３１０９である、請求項３に記載の方法。
  5. 前記レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストの濃度が、０，５～１００μＭ、１～５０μＭ、１～３００μＭ、１～２５０μＭ、１～２０μＭ、３～１７μＭ、５～１５μＭ、または７～１２μＭである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 請求項１に記載のステップが、１時間～６日間または１～４日間の継続時間を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 請求項６に記載のステップが、２日間まで短縮される、請求項６に記載の方法。
  8. ヒト多能性幹細胞由来の同調した膵臓内胚葉細胞集団であって、膵臓内胚葉細胞の少なくとも７０％が、ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋二重陽性である、同調した細胞集団。
  9. 前記細胞集団が、１％未満のＮＫＸ２．２を発現する、請求項８に記載の同調した細胞集団。
  10. 前記細胞集団が、少なくとも３０％のＤＬＫ１を発現する、請求項８に記載の同調した細胞集団。
  11. 前記細胞集団が、ＰＴＦ１ａをさらに発現する、請求項８に記載の同調した細胞集団。
  12. 医薬品として使用するための、ベータ細胞へのさらなる分化のための、請求項８～１１のいずれか一項に記載の同調した細胞集団。
  13. 幹細胞または幹細胞由来の組織もしくは臓器を対象に投与することによる、あるいは幹細胞または幹細胞由来の組織もしくは臓器を対象にグラフトすることによる、あるいは幹細胞または幹細胞由来の組織もしくは臓器を対象に移植することによる、糖尿病の治療において医薬品として使用するための、ベータ細胞へのさらなる分化のための、請求項８～１１のいずれか一項に記載の同調した細胞集団。
  14. 請求項１～７に記載の方法によって得られた膵臓内胚葉細胞もしくは細胞集団または請求項８～１３に記載の膵臓内胚葉細胞集団を含む、バイオリアクター。
  15. 組織または臓器を再生および／または修復および／または構築するためのキットであって、前記キットが、
    （ｉ）ベータ細胞へのさらなる分化のための、請求項１～７に記載の方法によって得られる膵臓内胚葉細胞もしくは細胞集団、または請求項８～１３のいずれか一項に記載の同調した細胞集団と、
    （ｉｉ）生体適合性足場またはマトリックスと、
    （ｉｉｉ）任意選択的に、少なくとも１つの成長因子またはその機能的断片と、
    （ｉｖ）任意選択的に、ＢＭＰ阻害剤、成長因子、および／またはＲｏｃｋ阻害剤、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される薬剤と、
    （ｉｖ）任意選択的に、任意の細胞培養またはそれに由来する組織もしくは臓器を含む、前記細胞を調製、維持、および／または使用するための指示書と、を含む、キット。
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