JP6954877B2 - 小分子を用いた多能性幹細胞からの膵臓内胚葉の作製 - Google Patents

小分子を用いた多能性幹細胞からの膵臓内胚葉の作製 Download PDF

Info

Publication number
JP6954877B2
JP6954877B2 JP2018192572A JP2018192572A JP6954877B2 JP 6954877 B2 JP6954877 B2 JP 6954877B2 JP 2018192572 A JP2018192572 A JP 2018192572A JP 2018192572 A JP2018192572 A JP 2018192572A JP 6954877 B2 JP6954877 B2 JP 6954877B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
pancreatic
inhibitor
retinoic acid
ldn
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2018192572A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2019000126A (ja
Inventor
ジェニー・エクベリ
マティアス・ハンソン
ウルリク・ドゥーン
カーチャ・ヘス
ニナ・フナ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novo Nordisk AS
Original Assignee
Novo Nordisk AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novo Nordisk AS filed Critical Novo Nordisk AS
Publication of JP2019000126A publication Critical patent/JP2019000126A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6954877B2 publication Critical patent/JP6954877B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0676—Pancreatic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0676—Pancreatic cells
    • C12N5/0678—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/117—Keratinocyte growth factors (KGF-1, i.e. FGF-7; KGF-2, i.e. FGF-12)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/119—Other fibroblast growth factors, e.g. FGF-4, FGF-8, FGF-10
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/385—Hormones with nuclear receptors of the family of the retinoic acid recptor, e.g. RAR, RXR; Peroxisome proliferator-activated receptor [PPAR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/41—Hedgehog proteins; Cyclopamine (inhibitor)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

本発明は、ヒト胚体内胚葉(definitive endoderm)等の多能性幹(PS)細胞から膵臓内胚葉を作製する方法に関する。
ベータ細胞移植は、I型糖尿病の根本的な治癒をもたらす可能性がある。しかし、ドナーベータ細胞の限定された利用能は、この処置の臨床治療としての使用を制約する。多能性幹細胞は、無限に増殖し、多くの細胞型へと分化することができる。よって、PS細胞は、ベータ細胞の有望な供給源である。しかし、糖尿病の処置にPS細胞を用いる前に、PS細胞は、効率的にかつ再現性よく分化して膵臓細胞となる必要がある。
脊椎動物胚発生において、多能性細胞は、三胚葉;外胚葉、中胚葉および内胚葉を生じる。胚体内胚葉(DE)の誘導は、内胚葉由来組織の形成に向けた最初の工程である。DE細胞から膵臓内胚葉(PE)の作製は、インスリン産生ベータ細胞の作製に必要である。内分泌前駆細胞(EP)となる潜在性を有するPE細胞は、2種の重要な転写因子、PDX1およびNKX6.1の共発現を特徴とする。
PS細胞から膵臓細胞を作製するために、段階的in vitro分化プロトコールが確立された。このようなプロトコールは一般に、SOX17およびFOXA2を共発現するDEや、原腸、前腸後部、PE、EPならびに最終的には成熟したベータ細胞の形成等、いくつかのステージを含む膵発生の主要な事象を模倣する。現在までに、hES細胞の効率的なDE分化は、アクチビンA処理により達成された。膵臓ベータ細胞の作製における次の主要な工程は、PDX1およびNKX6.1を共発現するPEを作製することである。いくつかのグループが、PS細胞をDEおよびPEに分化させることのできるin vitroプロトコールを開発したが、これらはごく僅かな割合のNKX6.1/PDX1二重陽性(db+ve)細胞を作製することしかできず、重要なことに、in vitroで完全に成熟したベータ細胞を作製することはできなかった[Caiら(2010);D'Amourら(2006);Kunisadaら(2012);Schulzら(2012);Zhangら(2009);Ameriら(2010)]。
WO/2010/136583 WO03/055992 WO2007/042225
本発明は、少なくとも5%の細胞がPDX1およびNKX6.1を共発現する膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を産生する方法であって、胚体内胚葉(DE)細胞を、
a.BMP阻害剤LDN-193189[table 1(表1)に列挙されている]
b.キナーゼ阻害剤[table 1(表1)およびtable 2(表2)に列挙されている]
c.レチノイン酸受容体アゴニスト[table 2(表2)に列挙されている]
からなる群の少なくとも1種の化合物の有効量に曝露して、ヒトDE細胞を膵臓細胞または膵臓細胞前駆体に分化させる工程を含む方法に関する。
本発明は、少なくとも5%の細胞がPDX1およびNKX6.1を共発現する膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を産生するための方法であって、DE細胞を、
a.BMP阻害剤LDN-193189[table 1(表1)に列挙されている]
b.N-アルキル化された、またはN-アルキル化されていない1,9-ピラゾロアントロン(pyrazoloanthrone)の異性体[table 1(表1)およびtable 2(表2)に列挙されている]
c.レチノイン酸受容体アゴニスト[table 2(表2)に列挙されている]
からなる群の少なくとも1種の化合物の有効量に曝露して、ヒトDE細胞を膵臓または膵臓細胞前駆体に分化させる工程を含む方法にさらに関する。
本発明は、少なくとも5%の細胞がPDX1およびNKX6.1を共発現する膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を産生するための方法であって、胚体内胚葉細胞を、
a.BMP阻害剤LDN-193189
b.JNK阻害剤II
c.AM580
からなる群の少なくとも1種の化合物の有効量に曝露して、ヒトDE細胞を膵臓または膵臓細胞前駆体に分化させる工程を含む方法にさらに関する。
本発明は、少なくとも5%の細胞がPDX1およびNKX6.1を共発現する膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を作製するための方法であって、胚体内胚葉細胞を有効量のBMP阻害剤LDN-193189に曝露して、ヒトDE細胞を膵臓または膵臓細胞前駆体に分化させる工程を含む方法にさらに関する。
本発明は、少なくとも5%の細胞がPDX1およびNKX6.1を共発現する膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を作製するための方法であって、DE細胞を有効量のBMP阻害剤LDN-193189に曝露し、その後、次の分子:
a.Wnt阻害剤IWP2
b.ヘッジホッグ阻害剤シクロパミン(Cyc)
のうち1種に曝露して、ヒトDE細胞を膵臓または膵臓細胞前駆体に分化させる工程を含む方法にさらに関する。
本発明は、少なくとも5%の細胞がPDX1およびNKX6.1を共発現する膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を作製するための方法であって、DE細胞を有効量のBMP阻害剤LDN-193189に曝露し、その後、JNK阻害剤II、レチノイン酸またはレチノイン酸誘導体、bFGFおよび次の分子:
a.Wnt阻害剤IWP2
b.ヘッジホッグ阻害剤シクロパミン
のうち1種の組み合わせに曝露して、ヒトDE細胞を膵臓または膵臓細胞前駆体に分化させる工程を含む方法にさらに関する。
本発明は、少なくとも5%の細胞がPDX1およびNKX6.1を共発現する膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を作製するための方法であって、DE細胞を有効量のBMP阻害剤LDN-193189に曝露し、その後、レチノイン酸またはレチノイン酸誘導体、bFGFおよびLDN-193189と組み合わせたJNK阻害剤IIの組み合わせに曝露して、DE幹細胞を膵臓または膵臓細胞前駆体に分化させる工程を含む方法にさらに関する。
本発明の一実施形態において、レチノイン酸受容体アゴニストまたはキナーゼ阻害剤のうちいずれか1種は、bFGFと組み合わせることができる。
本発明は、本発明の方法により得ることができる膵臓細胞または膵臓細胞前駆体にさらに関する。
本発明は、ヒト多能性幹細胞をtable 1(表1)およびtable 2(表2)に列挙されている少なくとも1種の化合物に曝露することにより産生される、膵臓細胞または膵臓細胞前駆体に関する。
本発明は、幹細胞から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、table 1(表1)およびtable 2(表2)の化合物のうちいずれか1種の使用に関する。
本発明は、幹細胞から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するためのLDN-193189の使用に関する。
本発明は、幹細胞から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、LDN-193189と続くシクロパミンまたはIWP2の使用に関する。
本発明は、内分泌細胞運命にコミットしたPE細胞の顕著な特徴であるNKX6.1/PDX1二重陽性細胞の割合を増加させるための方法を提供することにより、ヒトPS細胞を成熟したベータ細胞へと分化させる効率を改善するための代替的なアプローチを採用する。
一態様において、本発明は、改善された膵臓細胞集団、即ち、NKX6.1/PDX1二重陽性細胞の割合が増加したPEを提供する。
さらに、本発明は、内分泌系列へとさらに発生するために重要となるより均質な膵臓細胞集団を提供する。
本発明はまた、次のステージに移行するためにより同調した膵臓集団を提供する。
本発明は、例示的な実施形態の開示から明らかとなる、さらに別の問題を解決することもできる。
小分子ライブラリーを用いた、ライブラリースクリーニングアプローチとも称されるPEスクリーニングアプローチを示す図である。DEプロトコール(一般方法を参照)に従って多能性幹(PS)細胞を胚体内胚葉(DE)に分化させ、スクリーニングのために96ウェルプレートに播種した。膵臓内胚葉(PE)スクリーニングを初期および後期相に分けた。初期相において、PE分化の最初の7日間に、公表されているbFGFに基づくプロトコール(Ameriら、2010、WO/2010/136583も参照されたい)に加えて化合物を添加し、次に、化合物なしでさらに6日間継続した。後期相において、最後の6日間のみに、bFGFに基づくプロトコールに加えて化合物を添加した。 ライブラリースクリーニングアプローチの初期相のヒットを示すグラフである。ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)(黒)またはhESC(白)由来の胚体内胚葉細胞を96ウェル光学プレートに播種し、bFGFに基づく14日間のプロトコールを用いて膵臓内胚葉に分化させた。14日間の最初の7日間に、bFGFに基づくプロトコールに加えて化合物を添加し、InCell analyzer 2000(GE Healthcare社)を用いてNKX6.1/PDX1二重陽性細胞を解析した。グラフは、ベンチマークプロトコールと比較した、NKX6.1/PDX1二重陽性細胞の割合の効果(％)を示す。 ライブラリースクリーニングアプローチの後期相のヒットを示すグラフである。hiPSC(黒)またはhESC(白)由来の胚体内胚葉細胞を96ウェル光学プレートに播種し、bFGFに基づく14日間のプロトコールを用いて膵臓内胚葉に分化させた。最後の6日間に、bFGFに基づくプロトコールに加えて化合物を添加し、InCell analyzer 2000(GE Healthcare社)を用いてNKX6.1/PDX1二重陽性細胞を解析した。グラフは、ベンチマークプロトコールと比較した、NKX6.1/PDX1二重陽性細胞の割合の効果%を示す。 第2の、候補に基づくPEスクリーニングアプローチを示すグラフである。DEプロトコール(一般方法を参照)に従って多能性幹(PS)細胞を胚体内胚葉に分化させ、スクリーニングのために96ウェルプレートに播種した。膵臓内胚葉スクリーニングを2個の部分に分けた。スクリーニング1において、PE分化の最初の8日間に、基本培地(RPMI1640+0.1%PEST+12%KOSR)に化合物を添加した。2日ずつ増加させた4つの異なる時間枠で化合物を検査し、次に、さらに6日間、bFGFに基づく公表されたプロトコール(Ameriら、2010)において細胞に分化を継続させた。スクリーニング2において、先ず4日間、スクリーニング1からのヒット化合物を用いて細胞を分化させ、次に、最後の10日間に、スクリーニング化合物を基本培地に添加した。 スクリーニング毎に並行して実験した、ベンチマークプロトコールとして用いたAmeriら、2010に従って分化させた細胞と比較した、候補スクリーニング1および2からのヒットを示すグラフである。スクリーニング1において、1種のヒット化合物を同定し(LDN-193189)、これは、最初の4日間に添加し、続いて4日間基本培地で培養した場合に最も有効であることが判明した。スクリーニング2に関して、先ずスクリーニング1からのヒット化合物に細胞を4日間曝露し、スクリーニング2からのヒット化合物を分化の最後の10日間添加した際に、2種のヒット化合物を同定した(シクロパミンおよびIWP-2)。グラフは、ベンチマークプロトコールと比較した、NKX6.1/PDX1二重陽性細胞の割合の効果(％)を示す(hiPSCのバーを黒、hESCのバーを白で示す)。 ベンチマークプロトコール[Ameriら(2010)]と比較した、2種の個々のスクリーニング(小分子ライブラリーおよび候補アプローチ)において見出されたヒット化合物の組み合わせによる、PDX1/NKX6.1二重陽性細胞の量における有利な効果を示すグラフである。hiPSCのバーを黒、hESCのバーを白で示す。
略語のリスト
+ve:陽性
bFGF:塩基性線維芽細胞増殖因子(FGF)(FGF2としても公知)
Cyc:シクロパミン
db:二重陽性
DE:胚体内胚葉
hBS:ヒト胚盤胞由来幹
hBSC;ヒト胚盤胞由来幹細胞
hES:ヒト胚性幹
hESC:ヒト胚性幹細胞
hiPSC:ヒト人工多能性幹細胞
hPSC:ヒト多能性幹細胞
KOSR:ノックアウト(Knock-out)血清代替物
NKX6.1:NK6ホメオボックス1
PDX1:膵臓および十二指腸ホメオボックス1
PEST:ペニシリンストレプトマイシン
PS:多能性幹
Rockout:Rhoキナーゼ阻害剤III
RT:室温
説明
本発明は、ヒト胚体内胚葉細胞および人工多能性幹細胞等、幹細胞から膵臓内胚葉を作製する方法に関する。本発明は、内分泌細胞集団に達するのに必要な細胞ステージの1つであるPE細胞集団のマーカーである、NKX6.1/PDX1二重陽性細胞のパーセンテージを改善するための方法を提供することにより、ヒトPS細胞を成熟したベータ細胞へと分化させる効率を改善するための代替的なアプローチを採用する。
さらに、本発明は、内分泌系列へとさらに発生するために重要となるより均質で同調した膵臓細胞集団を提供する。
本発明は、例示的な実施形態の開示から明らかとなる、さらに別の問題を解決することもできる。
一実施形態において、本発明に係る方法により得ることができる膵臓内分泌細胞は、インスリン産生細胞であり、必要に応じて、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチドおよび/またはグレリン産生細胞に分化した細胞と共に得られる。本明細書において、「インスリン産生細胞」は、検出可能な量のインスリンを産生および貯蔵または分泌する細胞を指す。「インスリン産生細胞」は、個々の細胞であっても細胞の集合体であってもよい。
別の一実施形態において、膵臓細胞を含む細胞集団は、体細胞集団から得られる。一部の態様において、体細胞集団は、胚性様幹(ES、例えば、多能性)細胞へと脱分化するように誘導された。斯かる脱分化した細胞は、人工多能性幹細胞(iPSC)とも命名される。
別の一実施形態において、膵臓細胞を含む細胞集団は、胚性幹(ES、例えば、多能性)細胞から得られる。一部の態様において、膵臓細胞を含む細胞集団は、ES様細胞等、多能性細胞である。
別の一実施形態において、膵臓細胞を含む細胞集団は、胚性分化幹(ESまたは多能性)細胞である。分化は、胚様体および/もしくは単層細胞培養またはこれらの組み合わせにおいて行われる。
別の一実施形態において、細胞集団は、幹細胞の集団である。一部の態様において、細胞集団は、膵臓内分泌系列へと分化した幹細胞の集団である。
幹細胞とは、自己再生前駆細胞、非再生前駆細胞および最終分化細胞を含む、単細胞レベルにおいて自己再生および分化して後代細胞を産生するその能力の両方により定義される未分化細胞である。幹細胞はさらに、in vitroで複数の胚葉(内胚葉、中胚葉および外胚葉)由来の様々な細胞系列の機能細胞へと分化する能力を特徴とし、加えて移植後に複数の胚葉の組織を生じ、胚盤胞に注入されると全てではないが大部分の組織に実質的に寄与する能力も特徴とする。
幹細胞は、その発生上の潜在性によって、(1)あらゆる胚性および胚体外細胞型を生じ得ることを意味する全能性幹細胞;(2)あらゆる胚性細胞型を生じ得ることを意味する多能性幹細胞;(3)細胞系列のサブセットを生じ得るが、全て特定の組織、器官または生理系内のものであることを意味する多能性幹細胞[例えば、造血幹細胞(HSC)は、HSC(自己再生)、血液細胞制限的少能性(oligopotent)前駆細胞ならびに正常な血液構成成分であるあらゆる細胞型および要素(例えば、血小板)を含む後代を産生することができる];(4)多能性幹細胞よりも限られた細胞系列サブセットを生じ得ることを意味する少能性幹細胞;ならびに(5)単一の細胞系列を生じ得ることを意味する単分化能幹細胞(例えば、精子形成幹細胞)に分類される。
幹細胞から膵臓細胞を得るためのプロトコールは、D'Amour, K. A.ら(2006);Jiang, J.ら(2007);Kroon, E.ら(2008)に記載されているプロトコールにより例証されるが、これらに限定されない。
体細胞から、またはES様細胞等の多能性細胞へと脱分化するよう誘導された体細胞から膵臓細胞を得るためのプロトコールは、Aoi, T.ら(2008);D'Amour, K. A.ら(2006);Jiang, J.ら(2007);Kroon, E.ら(2008);Takahashi, K.ら(2007);Takahashi, K.、およびYamanaka, S.(2006)およびWernig, M.ら(2007)に記載されているプロトコールにより例証されるが、これらに限定されない。
本明細書において、「分化する」または「分化」は、未分化状態から分化状態へと、未成熟状態からより成熟した状態へと、または未成熟状態から成熟状態へと細胞が進行する過程を指す。例えば、初期未分化胚性膵臓細胞は、増殖し、PDX1、NKX6.1およびPTF1a等の特徴的マーカーを発現することができる。成熟したまたは分化した膵臓細胞は、増殖せず、高レベルの膵臓内分泌ホルモンまたは消化酵素を分泌する。例えば、完全に分化したベータ細胞は、グルコースに応答して高レベルのインスリンを分泌する。細胞相互作用の変化および成熟化が起こると、細胞が未分化細胞のマーカーを喪失したり、または分化細胞のマーカーを獲得したりする。単一マーカーの喪失または獲得は、細胞が「成熟したまたは完全に分化した」ことを示し得る。用語「分化因子」は、インスリン産生ベータ細胞も含有する成熟した内分泌細胞へのその分化を増強するために膵臓細胞に添加される化合物を指す。例示的な分化因子としては、肝細胞増殖因子、ケラチノサイト増殖因子、エキセンディン-4、塩基性線維芽細胞増殖因子、インスリン様増殖因子-1、神経増殖因子、上皮増殖因子、血小板由来増殖因子およびグルカゴン様ペプチド1が挙げられる。一部の態様において、細胞の分化は、1種または複数の分化因子を含む培地における細胞の培養を含む。
本明細書において、「ヒト多能性幹細胞(hPSC)」は、いかなる供給源に由来してもよい細胞であって、適切な条件下で、全3胚葉(内胚葉、中胚葉および外胚葉)の派生体である様々な細胞型のヒト後代を産生することのできる細胞を指す。hPSCは、8〜12週齢SCIDマウスにおいてテラトーマを形成する能力および/または組織培養において全三胚葉の同定可能な細胞を形成する能力を有し得る。ヒト多能性幹細胞の定義には、30の文献中でヒト胚性幹(hES)細胞として表示されることが多いヒト胚盤胞由来幹(hBS)細胞を含む様々な種類の胚性細胞[例えば、Thomsonら(1998)、Heinsら(2004)を参照]と共に、人工多能性幹細胞[例えば、Yuら(2007);Takahashiら(2007)を参照]が含まれる。本明細書に記載されている様々な方法および他の実施形態は、種々の供給源由来のhPSCを必要とするかまたは利用する場合がある。例えば、使用に適したhPSCは、発生中の胚から得てもよい。それに加えてまたはそれに代えて、適したhPSCは、樹立細胞株および/またはヒト人工多能性幹(hiPS)細胞から得てもよい。
本明細書において、「hiPSC」は、ヒト人工多能性幹細胞を指す。
ES細胞株は、子宮外胚を破壊せず、臨床成績に影響を与えずに、単一卵割球から得てもよい[Chungら(2006)およびKlimanskayaら(2006)]。
本明細書において、用語「胚盤胞由来幹細胞」は、BS細胞と表示され、ヒト型は、「hBS細胞」と名付けられる。文献において、この細胞は多くの場合、胚性幹細胞、より具体的には、ヒト胚性幹細胞(hESC)と称される。よって、本発明において用いられる多能性幹細胞は、例えば、WO03/055992およびWO2007/042225に記載されている通り、胚盤胞から調製された胚性幹細胞、あるいは市販のhBS細胞または細胞株であり得る。しかし、例えば、Yuら(2007);Takahashiら(2007)およびYuら(2009)に開示されている通り、OCT4、SOX2、NANOGおよびLIN28等、特定の転写因子で成体細胞を処理することにより多能性細胞へと再プログラム化される分化した成体細胞を含む、任意のヒト多能性幹細胞を本発明において用いることができることがさらに想定される。
本明細書において、JNK阻害剤IIは、N-アルキル化された、またはN-アルキル化されていない1,9-ピラゾロアントロンの異性体または互変異性体を含む。1,9-ピラゾロアントロンは、「SMILES:c1ccc2c(c1)-c3c4c(cccc4[nH]n3)C2=O」または「1,6-ジヒドロジベンゾ[cd,g]インダゾール-6-オン」と定義することができる。
DEF培地またはDEF-CS培地/系は、ヒト多能性幹細胞の樹立および繁殖のための成分が明確な平衡培養培地であるDEF-CS培地/系である。
本発明の実施形態:
1.少なくとも5%の細胞がPDX1およびNKX6.1を共発現する膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を産生する方法であって、胚性幹細胞を、
a.BMP阻害剤
b.キナーゼ阻害剤
c.レチノイン酸受容体アゴニスト
からなる群の少なくとも1種の化合物の有効量に曝露して、ヒト胚性幹細胞を膵臓細胞または膵臓細胞前駆体に分化させる工程を含む方法。
2.前記化合物が、table 1(表1)またはtable 2(表2)に列挙されている、実施形態1に記載の方法。
3.キナーゼ阻害剤が、N-アルキル化された、またはN-アルキル化されていない1,9-ピラゾロアントロンの異性体である、実施形態1または2に記載の方法。
4.前記キナーゼ阻害剤が、JNK阻害剤IIである、実施形態1〜3に記載の方法。
5.前記レチノイン酸受容体アゴニストが、AM580である、実施形態1〜2に記載の方法。
6.前記JNK阻害剤IIが、AM580と組み合わされる、実施形態1〜5に記載の方法。
7.bFGFが存在する、実施形態3〜6に記載の方法。
8.前記bFGFが、FGF2、FGF7またはFGF10である、実施形態7に記載の方法。
9.前記bFGFが、FGF7である、実施形態8に記載の方法。
10.前記BMP阻害剤が、LDN-193189である、実施形態1に記載の方法。
11.前記LDN-193189に続いて、Wnt阻害剤またはヘッジホッグ阻害剤への曝露が行われる、実施形態10に記載の方法。
12.前記Wnt阻害剤が、IWP2である、実施形態11に記載の方法。
13.前記ヘッジホッグ阻害剤が、シクロパミンである、実施形態12に記載の方法。
14.前記膵臓細胞または膵臓細胞前駆体の10〜20%、10〜30%、10〜40%、5〜20%、5〜30%、5〜40%、5〜50%、5〜60%または5〜70%、5〜80%、40〜80%または5〜90%が、PDX1/NKX6.1二重陽性である、実施形態1〜13に記載の方法。
15.前記膵臓細胞または膵臓細胞前駆体の5〜50%が、PDX1/NKX6.1二重陽性である、実施形態14に記載の方法。
16.前記膵臓細胞または膵臓細胞前駆体の40〜80%が、PDX1/NKX6.1二重陽性である、実施形態1〜9のいずれか一実施形態に記載の方法。
17.実施形態1〜16に記載の方法により得ることができる膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。
18.ヒト多能性幹細胞をTable 1(表1)またはTable 2(表2)に列挙されている少なくとも1種の化合物に曝露することにより産生される、膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。
19.前記化合物が、LDN-193189である、実施形態18に記載の膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。
20.前記化合物が、JNK阻害剤IIである、実施形態18に記載の膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。
21.前記化合物が、AM580である、実施形態18に記載の膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。
22.膵臓細胞または膵臓細胞前駆体が、少なくとも1種の追加の薬剤と組み合わせた少なくとも1種の化合物に幹細胞を曝露することにより産生される、実施形態18に記載の膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。
23.前記LDN-193189が、JNK阻害剤IIおよびAM580と組み合わされる、実施形態22に記載の膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。
24.前記LDN-193189に続いて、シクロパミンへの曝露が行われる、実施形態22に記載の膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。
25.前記LDN-193189に続いて、IWP2への曝露が行われる、実施形態22に記載の膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。
26.前記化合物が、Table 2(表2)に列挙されているレチノイン酸受容体アゴニストと組み合わせたJNK阻害剤IIである、実施形態22に記載の膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。
27.JNK阻害剤IIが、AM580と組み合わされる、実施形態22に記載の膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。
28.JNK阻害剤IIが、AM580およびbFGFと組み合わされる、実施形態22に記載の膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。
29.bFGFが、FGF2、FGF7またはFGF10である、実施形態28に記載の膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。
30.bFGFが、FGF7である、実施形態29に記載の膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。
31.幹細胞から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、Table 1(表1)またはTable 2(表2)の化合物の使用。
32.幹細胞から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、JNK阻害剤IIの使用。
33.幹細胞から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、レチノイン酸受容体アゴニストと組み合わせたJNK阻害剤IIの使用。
34.幹細胞から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、AM580と組み合わせたJNK阻害剤IIの使用。
35.幹細胞から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、LDN-193189の使用。
36.幹細胞から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、LDN-193189と続くシクロパミンまたはIWP2の使用。
37.幹細胞から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、LDN-193189と続くシクロパミンの使用。
38.幹細胞から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、LDN-193189と続くIWP2の使用。
39.幹細胞から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、LDN-193189と続くJNK阻害剤II、AM580およびbFGFとの組み合わせの使用。
40.幹細胞から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、LDN-193189と続くJNK阻害剤II、AM580、LDN-193189およびbFGFの組み合わせの使用。
41.幹細胞から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、LDN-193189と続くJNK阻害剤II、AM580、LDN-193189、bFGFおよびシクロパミンまたはIWP2の組み合わせの使用。
42.幹細胞から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、LDN-193189と続くJNK阻害剤II、AM580、LDN-193189、bFGFおよびシクロパミンの組み合わせの使用。
43.幹細胞から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、LDN-193189と続くJNK阻害剤II、AM580、LDN-193189、bFGFおよびIWP2の組み合わせの使用。
44.少なくとも5%がPDX1/NKX6.1二重陽性を発現する膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を産生する方法であって、胚体内胚葉細胞を、次の群:
a.BMP阻害剤、および
b.キナーゼ阻害剤、および
c.レチノイン酸受容体アゴニスト
のそれぞれからの少なくとも1種の化合物の有効量に曝露して、胚体内胚葉細胞を膵臓細胞または膵臓細胞前駆体に分化させる工程を含む方法。
45.BMP阻害剤が、LDN-193189である、実施形態44に記載の方法。
46.レチノイン酸受容体アゴニストが、AM580である、実施形態44に記載の方法。
47.レチノイン酸受容体アゴニストが、レチノイン酸誘導体である、実施形態44に記載の方法。
48.キナーゼ阻害剤が、N-アルキル化された、またはN-アルキル化されていない1,9-ピラゾロアントロンの異性体である、実施形態44に記載の方法。
49.キナーゼ阻害剤が、JNK阻害剤IIであり、AM580と組み合わされる、実施形態44に記載の方法。
50.前記キナーゼ阻害剤およびレチノイン酸受容体アゴニストが、bFGFと組み合わされる、実施形態44に記載の方法。
51.前記キナーゼ阻害剤およびレチノイン酸受容体アゴニストが、FGF7またはFGF10と組み合わされる、実施形態44に記載の方法。
52.胚体内胚葉細胞をbFGFなしで有効量のLDN-193189に曝露する第1の工程と、bFGFの存在下でAM580と組み合わせたJNK阻害剤IIに曝露する第2の工程とを含む、実施形態44〜46に記載の方法。
53.IWP2などのwnt阻害剤および/または
シクロパミンなどのヘッジホッグ阻害剤
からなる群の少なくとも1種の化合物への曝露後に、胚体内胚葉細胞を有効量のLDN-193189に曝露する工程を含む、実施形態44〜46に記載の方法。
54.前記膵臓細胞または膵臓細胞前駆体の少なくとも5%、少なくとも10%、10〜30%、10〜40%、5〜70%、10〜80%または5〜100%が、PDX1/NKX6.1二重陽性である、実施形態44〜53のいずれか一実施形態に記載の方法。
55.実施形態44〜54に記載の方法をin vitroで使用することにより得ることができる膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。
56.JNK1、2もしくは3またはSycまたはSrcまたはGSK-3またはP38 MAPKまたはP38キナーゼまたはRhoキナーゼまたはMEKまたはChk2またはVEGFR1、2もしくは3またはPDGFRbまたはKDR/Flk-1を標的とするキナーゼ阻害剤に、胚体内胚葉細胞をin vitroで曝露することにより産生される、膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。
57.キナーゼ阻害剤が、JNK阻害剤IIであり、胚体内胚葉細胞が、次の化合物:
LDN-193189、
Wnt阻害剤、
ヘッジホッグ阻害剤、
レチノイン酸受容体アゴニスト
のうち少なくとも1種にも曝露される、実施形態56に規定の方法により産生される膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。
58.胚体内胚葉細胞が、Table 2(表2)に列挙されているレチノイン酸受容体アゴニストと組み合わせたJNK阻害剤IIに曝露される、実施形態56に記載の膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。
59.膵臓内胚葉前駆体から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、Table 1(表1)またはTable 2(表2)のキナーゼ阻害剤化合物の使用。
60.膵臓内胚葉前駆体から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、組み合わせたJNK阻害剤IIおよびLDN-193189の使用。
61.膵臓内胚葉前駆体から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、レチノイン酸受容体アゴニストと組み合わせたJNK阻害剤IIの使用。
一般方法
多能性幹細胞のin vitro培養
ヒト胚性幹(hES)細胞、系統SA121およびヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)chIPS4(Cellectis社)を、T75培養フラスコ内のDEF-CS培養培地(Cellectis社)において育成した。5μM Rock阻害剤Y-27632(Sigma社#Y0503)を用いて細胞を単細胞継代し、実験のために40000細胞/cm2の密度で播種した。加湿インキュベーター(ThermoScientific Model 371)において37℃、5%CO2で細胞を培養した。
多能性幹細胞から胚体内胚葉へのin vitro分化
hES細胞(系統SA121)およびhiPSC(chIPS4)のコンフルエント培養物をRPMI1640(Gibco社#61870)において1回洗浄し、RPMI1640における3μM CHIR99021(Axon社#1386)で処理した。24時間後に、細胞をRPMI1640で洗浄し、RPMI1640における100ng/mlアクチビンA(Peprotech社#120-14E)で処理した。24時間後、毎日培地交換しつつ、アクチビンA培地に2%B27(Invitrogen社#17504-044)を2日間添加した。分化の間中、加湿インキュベーターにおいて37℃、5%CO2で細胞を維持した。
hESおよびhiPS細胞由来胚体内胚葉の播種
ヒトES細胞由来のDEおよびヒトiPS細胞由来のDE細胞をPBS-/-で洗浄し、Tryple Select(Invitrogen社、12563-029)を用いて5分間トリプシン処理した。DE細胞をRPMI1640に注意深く懸濁し、1回洗浄し、その後、DE播種培地[アクチビンA 100ng/ml、2%B27、RPMI1640、0.1%PEST(Gibco社#15140)]に再懸濁した。96ウェル光学プレート(BD Bioscience社)において200000個/cm2でDE細胞を播種し、翌日、スクリーニング化合物を用いたPE分化を開始した。
解析
PE分化8または14日目に、培地を吸引し、続いて4%パラホルムアルデヒド(VWR社、97.131.000)により細胞を室温で30分間固定した。細胞をPBSで洗浄し、0.5%Triton X-100(Sigma社、9002-93-1)で10分間透過処理し、洗浄し、0.5%TNBバッファー(Perkin Elmer社)において30分間室温でブロッキングした。一次抗体、マウス抗NKX6.1(Abcore社#A55F12)およびヤギ抗PDX1(Abcam社#47383)をPBS中の0.1%Triton X-100でそれぞれ1:500および1:8000に希釈し、各ウェルに添加して、4℃で一晩インキュベートした。細胞をPBSで3回洗浄した。DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、Applichem社、A4099.0010)ならびに二次抗体、Alexa Fluor 488ロバ抗ヤギおよびAlexa Fluor 594ロバ抗マウス(両者共にInvitrogen社)をPBS中の0.1%Triton X-100で1:1000に希釈し、各ウェルに45分間添加した。細胞を5回洗浄し、イメージングのために200μLのPBS中に置いた。
InCell Analyzer 2000(GE Healthcare社)を用いてイメージングを行った。10×対物レンズを用いてウェル当たり4視野を捕捉した。DAPI対比染色に基づく総細胞数およびNKX6.1/PDX1二重陽性細胞数を、InCell Developer Toolbox 1.8(GE Healthcare社)を用いて決定した。NKX6.1/PDX1二重陽性細胞の割合を、各プレートにおけるベンチマークに対して標準化し、効果(％)を計算した。効果が200%を超える値をヒットと分類した。
膵臓内胚葉は、2種の転写因子、NKX6.1およびPDX1の共発現を特徴とする。PEを作製するための公表されたプロトコールの多くは、NKX6.1/PDX1二重陽性細胞成績が低く無効である。PEプロトコールの効力を増強することが、望ましい成績である。従って、本出願人らは、小分子のライブラリーをスクリーニングして、既存のPEプロトコールを改善し得る新規化合物を同定した。この実験は、阻害剤、アゴニストまたはアンタゴニストが、シグナル伝達経路または染色体到達性を調節し、これがNKX6.1/PDX1二重陽性細胞の割合を改善し得るという仮定に基づき行われた。
(実施例1)
NKX6.1/PDX1共発現を誘導する小分子のスクリーニング
小分子
スクリーニングには、4種の異なるライブラリー、すなわちキナーゼ阻害剤ライブラリー(Calbiochem社#539743)、生理活性脂質ライブラリー(Enzo Life Sciences社#BML-2800)、核内受容体リガンドライブラリー(Enzo Life Sciences社#BML-2802)およびホスファターゼ阻害剤ライブラリー(Enzo Life Sciences社#BML-2834) が含まれていた。生理活性ライブラリー内の化合物は、1uMおよび0.1uMで検査した。他のライブラリー由来の化合物は、10uMおよび1uMで検査した。第2の候補に基づくスクリーニングアプローチには、膵発生に関与する主要シグナル伝達経路を標的とする小分子が含まれていた。
NKX6.1/PDX1スクリーニング
PEを作製するためのbFGFに基づく培地製剤(Ameriら2010)(RPMI1640、Gibco社#61870;12%KOSR、Gibco社#10828;0.1% PEST、Gibco社#15140;64ng/mL bFGF、Peprotech社#100-18B)に加えてライブラリー化合物をスクリーニングした。
ライブラリーPEスクリーニングアプローチを、初期および後期相に分けた(図1)。
初期相において、PE分化の最初の7日間に、PE培地に加えて化合物を検査し、続いて化合物なしのPE培地を用いて分化をさらに6日間継続させた。
後期相において、最初の7日間にPE培地においてDE細胞を分化させた。続く6日間において、PE培地に加えて化合物を検査した。12個の陽性対照ウェル(PE培地)および12個の陰性対照ウェル(bFGFなしのPE培地)が、各96ウェルプレートに含まれた。培地交換を毎日行った。初期相スクリーニングにおいて同定されたヒットを図2に図解し、table 1(表1)に列挙する。後期相スクリーニングにおいて同定されたヒットを図3に図解し、table 2(表2)に列挙する。
bFGFを添加しない基本培地(RPMI1640、Gibco社#61870;12%KOSR、Gibco社#10828;0.1%PEST、Gibco社#15140)において、候補アプローチから得た化合物をスクリーニングした。この候補アプローチスクリーニングを2個の部分に分けた(図4)。第1の部分において、PE分化の最初の8日間に、2日間増分の時間間隔で化合物を検査した(2日間の化合物曝露と続く6日間の基本培地、または4日間の化合物曝露と続く4日間の基本培地、または6日間の化合物曝露と続く2日間の基本培地、または8日間の化合物曝露)。
これらの8日間の後に1枚のプレートを固定し、PDX1およびNKX6.1発現を解析した。第2のプレートは、公表されたPEプロトコール[Ameriら(2010)]を用いてさらに6日間さらに分化させた。
第2の部分において、第1の部分からのヒット化合物によってDE細胞を分化させ、続く6〜10日間、基本培地において化合物を検査した。
ベンチマークプロトコール[Ameriら(2010)]を対照とした。
第1および第2の部分の実験の両方において、培地交換を毎日行った。
候補スクリーニングアプローチにおいて同定されたヒットを図5に図解し、これはTable 1(表1)およびTable 2(表2)にも含まれている。
(実施例2)
NKX6.1/PDX1共発現を誘導する小分子ヒットの組み合わせ
ライブラリーアプローチからのヒットと候補スクリーニングアプローチからのヒットとの組み合わせ
DE細胞を4日間50nM LDN-193189に曝露し、続いて8日間AM580(AH Diagnostics社、BML GF104 0025)、JNK阻害剤II(Calbiochem社、420119)、50nM LDN-193189および64ng/ml FGF2、またはAM580、JNK阻害剤II、50nM LDN-193189、64ng/ml FGF2およびIWP2、またはAM580、JNK阻害剤II、50nM LDN-193189、64ng/ml FGF2およびシクロパミンに曝露した(図6)。培地交換を毎日行った。
(実施例3)
ヒト人工多能性幹細胞においてNKX6.1/PDX1共発現を誘導する小分子の確認
PEを作製するためのbFGFに基づく培地製剤(Ameriら2010)(RPMI1640、Gibco社#61870;12%KOSR、Gibco社#10828;0.1%PEST、Gibco社#15140;64ng/mL bFGF、Peprotech社#100-18B)上で、ヒット化合物[Table 1(表1)およびTable 2(表2)]をスクリーニングした。
スクリーニングを初期および後期相に分けた(図1)。初期相において、PE分化の最初の7日間に、PE培地に加えて化合物を検査し、続いて化合物なしのPE培地を用いてさらに6日間継続した。後期相において、最初の7日間にPE培地においてDE細胞を分化させた。続く6日間において、PE培地に加えて化合物を検査した。12個の陽性対照ウェル(PE培地)および12個の陰性対照ウェル(bFGFなしのPE培地)が、各96ウェルプレートに含まれた。培地交換を毎日行った。
効果が200%を超える値をヒットと分類した(図2および図3)。
Table 1(表1)は初期のヒット化合物を示す。
PE培地と比較して200%を超えてNKX6.1/PDX1二重陽性細胞の割合を増強する化合物。ライブラリー、ライブラリー内の化合物の位置、標的、化学構造、ヒット濃度およびPDX1/NKX6.1二重陽性細胞のパーセンテージを列挙する。
Figure 0006954877
Table 2(表2)は後期のヒット化合物を示す。PE培地と比較して200%を超えてNKX6.1/PDX1二重陽性細胞の割合を増強する化合物。ライブラリー、ライブラリー内の化合物の位置、標的、化学構造、ヒット濃度およびPDX1/NKX6.1二重陽性細胞のパーセンテージを列挙する。
Figure 0006954877
Figure 0006954877
本明細書において本発明の特定の特色を図解および説明してきたが、当業者であれば、多くの修正、代用物、変更および均等物を認識するであろう。従って、添付の特許請求の範囲は、このような修正および変更を、本発明の真の趣旨の範囲内に収まるものとして全て包含するよう企図されていることを理解されたい。
(参考文献)
Figure 0006954877

Claims (18)

  1. 少なくとも5%がPDX1/NKX6.1二重陽性を発現する膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を産生する方法であって、胚体内胚葉細胞を、次の群:
    a. BMP阻害剤、および
    b. JNK阻害剤II、および
    c.レチノイン酸受容体アゴニスト
    のそれぞれからの少なくとも1種の化合物の有効量に曝露して、胚体内胚葉細胞を膵臓細胞または膵臓細胞前駆体に分化させる工程を含む方法。
  2. BMP阻害剤が、LDN-193189である、請求項1に記載の方法。
  3. レチノイン酸受容体アゴニストが、AM580である、請求項1に記載の方法。
  4. レチノイン酸受容体アゴニストが、レチノイン酸誘導体である、請求項1に記載の方法。
  5. JNK阻害剤IIが、N-アルキル化された、またはN-アルキル化されていない1,9-ピラゾロアントロンである、請求項1に記載の方法。
  6. JNK阻害剤IIがAM580と組み合わされる、請求項1に記載の方法。
  7. 前記JNK阻害剤IIおよびレチノイン酸受容体アゴニストが、bFGFと組み合わされる、請求項1に記載の方法。
  8. 前記JNK阻害剤IIおよびレチノイン酸受容体アゴニストが、FGF7またはFGF10と組み合わされる、請求項1に記載の方法。
  9. 胚体内胚葉細胞をbFGFなしで有効量のLDN-193189に曝露する第1の工程と、bFGFの存在下でAM580と組み合わせたJNK阻害剤IIに曝露する第2の工程とを含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
  10. IWP2などのwnt阻害剤および/または
    シクロパミンなどのヘッジホッグ阻害剤
    からなる群の少なくとも1種の化合物への曝露後に、胚体内胚葉細胞を有効量のLDN-193189に曝露する工程を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記膵臓細胞または膵臓細胞前駆体の少なくとも5%、少なくとも10%、10〜30%、10〜40%、5〜70%、10〜80%または5〜100%が、PDX1/NKX6.1二重陽性である、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
  12. in vitroで使用される、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
  13. BMP阻害剤、JNK1、2もしくは3を標的とするJNK阻害剤II及びレチノイン酸受容体アゴニストに、胚体内胚葉細胞をin vitroで曝露することを含む、膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を産生する方法。
  14. BMP阻害剤が、LDN-193189であり、胚体内胚葉細胞が、次の化合物:
    Wnt阻害剤、
    ヘッジホッグ阻害剤、
    のうち少なくとも1種にも曝露される、請求項13に記載の方法。
  15. 胚体内胚葉細胞が、Table 2(表2)に列挙されているJNK阻害剤IIに曝露される、請求項13に記載の方法。
  16. 請求項1から15のいずれか一項に記載の方法において、膵臓内胚葉前駆体から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、BMP阻害剤、レチノイン酸受容体アゴニスト、及びTable 1(表1)またはTable 2(表2)のJNK阻害剤IIの使用。
  17. 請求項1から15のいずれか一項に記載の方法において、膵臓内胚葉前駆体から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、レチノイン酸受容体アゴニスト、JNK阻害剤IIおよびLDN-193189の組み合わせの使用。
  18. 請求項1から15のいずれか一項に記載の方法において、膵臓内胚葉前駆体から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、BMP阻害剤、レチノイン酸受容体アゴニストと組み合わせたJNK阻害剤IIの使用。
JP2018192572A 2012-09-03 2018-10-11 小分子を用いた多能性幹細胞からの膵臓内胚葉の作製 Active JP6954877B2 (ja)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP12182747 2012-09-03
EP12182747.1 2012-09-03
US201261697970P 2012-09-07 2012-09-07
US61/697,970 2012-09-07
EP12198820 2012-12-21
EP12198820.8 2012-12-21
JP2015529065A JP6470687B2 (ja) 2012-09-03 2013-09-03 小分子を用いた多能性幹細胞からの膵臓内胚葉の作製

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2015529065A Division JP6470687B2 (ja) 2012-09-03 2013-09-03 小分子を用いた多能性幹細胞からの膵臓内胚葉の作製

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2019000126A JP2019000126A (ja) 2019-01-10
JP6954877B2 true JP6954877B2 (ja) 2021-10-27

Family

ID=50182554

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2015529065A Active JP6470687B2 (ja) 2012-09-03 2013-09-03 小分子を用いた多能性幹細胞からの膵臓内胚葉の作製
JP2018192572A Active JP6954877B2 (ja) 2012-09-03 2018-10-11 小分子を用いた多能性幹細胞からの膵臓内胚葉の作製

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2015529065A Active JP6470687B2 (ja) 2012-09-03 2013-09-03 小分子を用いた多能性幹細胞からの膵臓内胚葉の作製

Country Status (5)

Country Link
US (3) US20150247123A1 (ja)
EP (1) EP2893000B1 (ja)
JP (2) JP6470687B2 (ja)
CN (1) CN104903440B (ja)
WO (1) WO2014033322A1 (ja)

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9080145B2 (en) 2007-07-01 2015-07-14 Lifescan Corporation Single pluripotent stem cell culture
US9096832B2 (en) 2007-07-31 2015-08-04 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
JP5733986B2 (ja) 2008-02-21 2015-06-10 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 細胞の付着、培養、及び剥離のための方法、表面改質されたプレート、並びに組成物
KR101829310B1 (ko) 2008-06-30 2018-02-14 얀센 바이오테크 인코포레이티드 만능 줄기 세포의 분화
ES2584053T3 (es) 2008-11-20 2016-09-23 Janssen Biotech, Inc. Métodos y composiciones para la unión de células y cultivo en sustratos planos
WO2010059775A1 (en) 2008-11-20 2010-05-27 Centocor Ortho Biotech Inc. Pluripotent stem cell culture on micro-carriers
CN102482643B (zh) 2009-07-20 2016-06-29 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞的分化
DK2516625T3 (da) 2009-12-23 2024-09-09 Janssen Biotech Inc Differentiering af humane embryonale stamceller
KR101928299B1 (ko) 2010-03-01 2018-12-12 얀센 바이오테크 인코포레이티드 만능 줄기 세포로부터 유래된 세포의 정제 방법
AU2011296381B2 (en) 2010-08-31 2016-03-31 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
KR102203056B1 (ko) 2011-12-22 2021-01-14 얀센 바이오테크 인코포레이티드 인간 배아 줄기 세포의 단일 인슐린 호르몬 양성 세포로의 분화
SG10201610313WA (en) 2012-06-08 2017-02-27 Janssen Biotech Inc Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endocrine cells
EP2893000B1 (en) * 2012-09-03 2019-04-10 Novo Nordisk A/S Generation of pancreatic endoderm from pluripotent stem cells using small molecules
DK2938723T3 (da) 2012-12-31 2023-02-20 Janssen Biotech Inc Differentiering af humane embryonale stamceller til pancreatiske endokrine celler under anvendelse af hb9-regulatorer
CN105705634A (zh) 2012-12-31 2016-06-22 詹森生物科技公司 用于分化成胰腺内分泌细胞的人多能细胞的悬浮和群集
KR102084561B1 (ko) 2012-12-31 2020-03-04 얀센 바이오테크 인코포레이티드 췌장 내분비 세포로의 분화를 위한 공기-액체 계면에서의 인간 배아 줄기세포의 배양
US10370644B2 (en) 2012-12-31 2019-08-06 Janssen Biotech, Inc. Method for making human pluripotent suspension cultures and cells derived therefrom
CN110551678B (zh) 2013-06-11 2024-02-20 哈佛学院校长同事会 SC-β细胞以及用于产生其的组合物和方法
DK3143127T3 (da) * 2014-05-16 2021-09-13 Janssen Biotech Inc Anvendelse af små molekyler til at forstærke mafa-ekspression i endokrine pankreasceller
US10253298B2 (en) 2014-12-18 2019-04-09 President And Fellows Of Harvard College Methods for generating stem cell-derived beta cells and methods of use thereof
EP3234110B1 (en) * 2014-12-18 2024-02-28 President and Fellows of Harvard College METHODS FOR GENERATING STEM CELL-DERIVED ß CELLS AND USES THEREOF
US10443042B2 (en) 2014-12-18 2019-10-15 President And Fellows Of Harvard College Serum-free in vitro directed differentiation protocol for generating stem cell-derived beta cells and uses thereof
US11000536B2 (en) * 2015-04-30 2021-05-11 Nant Holdings Ip, Llc Patient treatment via teratogenic pharmaceutical compounds
MA45747A (fr) * 2016-02-24 2019-01-02 Novo Nordisk As Génération de cellules bêta fonctionnelles à partir de progéniteurs endocrines dérivés de cellules souhes pluripotentes humaines
MA45479A (fr) 2016-04-14 2019-02-20 Janssen Biotech Inc Différenciation de cellules souches pluripotentes en cellules de l'endoderme de l'intestin moyen
MA45502A (fr) 2016-06-21 2019-04-24 Janssen Biotech Inc Génération de cellules bêta fonctionnelles dérivées de cellules souches pluripotentes humaines ayant une respiration mitochondriale glucose-dépendante et une réponse en sécrétion d'insuline en deux phases
CA3032972A1 (en) * 2016-08-19 2018-02-22 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Methods of differentiating stem cells into endoderm
EP3395942A1 (en) * 2017-04-25 2018-10-31 IMBA-Institut für Molekulare Biotechnologie GmbH Bi- or multi-differentiated organoid
KR20200051664A (ko) 2017-09-11 2020-05-13 노보 노르디스크 에이/에스 시험관 내 줄기 세포로부터 유래된 nkx6.1 및 c-펩티드 공발현 세포의 농축
WO2019099725A1 (en) 2017-11-15 2019-05-23 Semma Therapeutics, Inc. Islet cell manufacturing compositions and methods of use
CA3108275A1 (en) 2018-08-10 2020-02-13 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Stem cell derived islet differentiation
WO2020041608A1 (en) * 2018-08-22 2020-02-27 The Penn State Research Foundation Generation of pancreatic progenitor cells and beta cells from human pluripotent stem cells
WO2020043292A1 (en) 2018-08-30 2020-03-05 Novo Nordisk A/S Generation of functional beta cells from human pluripotent stem cell-derived endocrine progenitors
CN113728090B (zh) * 2019-04-08 2024-04-05 诺和诺德股份有限公司 从干细胞衍生的定形内胚层生成胰腺内胚层
EP4386081A3 (en) * 2019-05-21 2024-10-16 President and Fellows of Harvard College Endocrine differentiation-inducing molecule
WO2021099532A1 (en) 2019-11-22 2021-05-27 Novo Nordisk A/S Spin-aggregated neural microspheres and the application thereof
CN116018150A (zh) 2020-08-28 2023-04-25 诺和诺德股份有限公司 用于筛选干细胞衍生的β样细胞的体外群体的方法及其新型标志物
WO2024008810A1 (en) 2022-07-06 2024-01-11 Novo Nordisk A/S Differentiation of stem cells to pancreatic endocrine cells
WO2024151541A1 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Sana Biotechnology, Inc. Type-1 diabetes autoimmune mouse

Family Cites Families (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1298201A1 (en) 2001-09-27 2003-04-02 Cardion AG Process for the production of cells exhibiting an islet-beta-cell-like state
WO2003068357A2 (en) 2002-02-12 2003-08-21 Cornell Research Foundation, Inc. Identification and high-yield isolation of human pancreatic islet progenitor and stem cells
WO2005005608A2 (en) 2003-06-30 2005-01-20 Lifescan, Inc. Compositions and methods for differentiating adipose stromal cells into pancratic beta cells
EP1737944A4 (en) 2004-03-09 2010-03-24 Lifescan Inc METHOD FOR GENERATING INSULIN-PRODUCING CELLS
US20090053181A1 (en) 2005-06-13 2009-02-26 Novo Nordisk A/S Modulation of Cells
WO2008048671A1 (en) 2006-10-18 2008-04-24 University Of Illinois Embryonic-like stem cells derived from adult human peripheral blood and methods of use
WO2007103282A2 (en) 2006-03-02 2007-09-13 Cythera, Inc. Endocrine precursor cells, pancreatic hormone-expressing cells and methods of production
AU2007244675A1 (en) 2006-04-28 2007-11-08 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
JP5288209B6 (ja) 2006-05-02 2018-06-27 ウイスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション 幹細胞の内胚葉細胞および膵臓系列細胞への分化方法
PL2046946T3 (pl) 2006-06-26 2017-04-28 Lifescan, Inc. Hodowla pluripotencjalnych komórek macierzystych
US9080145B2 (en) 2007-07-01 2015-07-14 Lifescan Corporation Single pluripotent stem cell culture
MX2010000348A (es) 2007-07-01 2010-04-12 Lifescan Inc Cultivo de celulas madre pluripotentes individuales.
US20100255580A1 (en) 2007-07-18 2010-10-07 Lifesccan, Inc. Differentiation of Human Embryonic Stem Cells
PL2185691T3 (pl) 2007-07-31 2018-08-31 Lifescan, Inc. Różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez zastosowanie ludzkich komórek odżywczych
US9096832B2 (en) 2007-07-31 2015-08-04 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
SG154367A1 (en) 2008-01-31 2009-08-28 Es Cell Int Pte Ltd Method of differentiating stem cells
US8338170B2 (en) 2008-04-21 2012-12-25 Viacyte, Inc. Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells
EP2283117B1 (en) 2008-04-21 2013-10-23 Viacyte, Inc. Methods for purifying pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells
US8728812B2 (en) 2008-04-22 2014-05-20 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for promoting the generation of PDX1+ pancreatic cells
US7939322B2 (en) 2008-04-24 2011-05-10 Centocor Ortho Biotech Inc. Cells expressing pluripotency markers and expressing markers characteristic of the definitive endoderm
KR101829310B1 (ko) 2008-06-30 2018-02-14 얀센 바이오테크 인코포레이티드 만능 줄기 세포의 분화
US20100028307A1 (en) 2008-07-31 2010-02-04 O'neil John J Pluripotent stem cell differentiation
CN107904201B (zh) * 2008-10-31 2021-11-16 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞向胰腺内分泌谱系的分化
RU2528861C2 (ru) 2008-10-31 2014-09-20 Сентокор Орто Байотек Инк. Дифференцирование человеческих эмбриональных стволовых клеток в линию панкреатических эндокринных клеток
US8008075B2 (en) 2008-11-04 2011-08-30 Viacyte, Inc. Stem cell aggregate suspension compositions and methods of differentiation thereof
NZ592622A (en) 2008-11-04 2012-10-26 Viacyte Inc Stem cell aggregate suspension compositions and methods for differentiation thereof
ES2932850T3 (es) 2008-11-14 2023-01-27 Viacyte Inc Encapsulación de células pancreáticas derivadas de células madre pluripotentes humanas
WO2010059775A1 (en) 2008-11-20 2010-05-27 Centocor Ortho Biotech Inc. Pluripotent stem cell culture on micro-carriers
WO2010091241A2 (en) 2009-02-06 2010-08-12 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for promoting the generation of definitive endoderm
US8642334B2 (en) * 2009-02-17 2014-02-04 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Methods of neural conversion of human embryonic stem cells
EP2233566A1 (en) 2009-03-17 2010-09-29 Vrije Universiteit Brussel Generation of pancreatic progenitor cells
WO2010124142A2 (en) * 2009-04-22 2010-10-28 Cythera, Inc. Cell compositions derived from dedifferentiated reprogrammed cells
WO2010136583A2 (en) * 2009-05-29 2010-12-02 Novo Nordisk A/S INDUCED DERIVATION OF SPECIFIC ENDODERM FROM hPS CELL-DERIVED DEFINITIVE ENDODERM
RU2540021C2 (ru) 2009-07-20 2015-01-27 Янссен Байотек, Инк. Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека
RU2540016C2 (ru) 2009-07-20 2015-01-27 Янссен Байотек, Инк. Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека
DK2516625T3 (da) * 2009-12-23 2024-09-09 Janssen Biotech Inc Differentiering af humane embryonale stamceller
CA2784425A1 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Centocor Ortho Biotech Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
JP5762979B2 (ja) * 2009-12-29 2015-08-12 武田薬品工業株式会社 膵ホルモン産生細胞の製造法
WO2011100291A1 (en) 2010-02-09 2011-08-18 The Regents Of The University Of California Method for identifying pancreatic progenitor cells
CN102884176B (zh) * 2010-05-12 2017-09-05 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞的分化
SG187830A1 (en) 2010-08-22 2013-03-28 Univ Ramot Induced pluripotent stem cells derived from human pancreatic beta cells
RU2599420C2 (ru) * 2010-08-31 2016-10-10 Янссен Байотек, Инк. Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток
WO2012175633A1 (en) 2011-06-21 2012-12-27 Novo Nordisk A/S Efficient induction of definitive endoderm from pluripotent stem cells
EP2794860B1 (en) * 2011-12-19 2017-05-03 Kyoto University Method for inducing differentiation of human pluripotent stem cells into intermediate mesoderm cells
EP2893000B1 (en) * 2012-09-03 2019-04-10 Novo Nordisk A/S Generation of pancreatic endoderm from pluripotent stem cells using small molecules

Also Published As

Publication number Publication date
EP2893000B1 (en) 2019-04-10
JP2019000126A (ja) 2019-01-10
EP2893000A1 (en) 2015-07-15
CN104903440A (zh) 2015-09-09
JP2015528289A (ja) 2015-09-28
US20160326495A1 (en) 2016-11-10
US10221392B2 (en) 2019-03-05
JP6470687B2 (ja) 2019-02-13
US20150247123A1 (en) 2015-09-03
US20190153394A1 (en) 2019-05-23
WO2014033322A1 (en) 2014-03-06
CN104903440B (zh) 2018-04-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6954877B2 (ja) 小分子を用いた多能性幹細胞からの膵臓内胚葉の作製
JP7490035B2 (ja) 多能性幹細胞の膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）および内分泌細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化
JP7420860B2 (ja) 前駆細胞を指向性分化によって胃組織に変換するための方法及びシステム
JP6636427B2 (ja) 小分子を用いるヒト多能性幹細胞からの内分泌始原細胞の作製
RU2754089C2 (ru) Композиции клеток, полученные из дедифференцированных перепрограммированных клеток
US10457916B2 (en) Method for inducing differentiation of insulin-producing cells
CN113728090B (zh) 从干细胞衍生的定形内胚层生成胰腺内胚层
Bose et al. In vitro differentiation of pluripotent stem cells into functional β islets under 2D and 3D culture conditions and in vivo preclinical validation of 3D islets
ES2729776T3 (es) Generación de endodermo pancreático a partir de células madre pluripotentes mediante el uso de moléculas pequeñas

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20181015

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20181101

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A132

Effective date: 20190930

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20191125

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20200327

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20200907

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20201125

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210308

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20210906

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20210930

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6954877

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250