JP2019000126A - 小分子を用いた多能性幹細胞からの膵臓内胚葉の作製 - Google Patents
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Abstract
Description
a.BMP阻害剤LDN-193189[table 1(表1)に列挙されている]
b.キナーゼ阻害剤[table 1(表1)およびtable 2(表2)に列挙されている]
c.レチノイン酸受容体アゴニスト[table 2(表2)に列挙されている]
からなる群の少なくとも1種の化合物の有効量に曝露して、ヒトDE細胞を膵臓細胞または膵臓細胞前駆体に分化させる工程を含む方法に関する。
a.BMP阻害剤LDN-193189[table 1(表1)に列挙されている]
b.N-アルキル化された、またはN-アルキル化されていない1,9-ピラゾロアントロン(pyrazoloanthrone)の異性体[table 1(表1)およびtable 2(表2)に列挙されている]
c.レチノイン酸受容体アゴニスト[table 2(表2)に列挙されている]
からなる群の少なくとも1種の化合物の有効量に曝露して、ヒトDE細胞を膵臓または膵臓細胞前駆体に分化させる工程を含む方法にさらに関する。
a.BMP阻害剤LDN-193189
b.JNK阻害剤II
c.AM580
からなる群の少なくとも1種の化合物の有効量に曝露して、ヒトDE細胞を膵臓または膵臓細胞前駆体に分化させる工程を含む方法にさらに関する。
a.Wnt阻害剤IWP2
b.ヘッジホッグ阻害剤シクロパミン(Cyc)
のうち1種に曝露して、ヒトDE細胞を膵臓または膵臓細胞前駆体に分化させる工程を含む方法にさらに関する。
a.Wnt阻害剤IWP2
b.ヘッジホッグ阻害剤シクロパミン
のうち1種の組み合わせに曝露して、ヒトDE細胞を膵臓または膵臓細胞前駆体に分化させる工程を含む方法にさらに関する。
+ve:陽性
bFGF:塩基性線維芽細胞増殖因子(FGF)(FGF2としても公知)
Cyc:シクロパミン
db:二重陽性
DE:胚体内胚葉
hBS:ヒト胚盤胞由来幹
hBSC;ヒト胚盤胞由来幹細胞
hES:ヒト胚性幹
hESC:ヒト胚性幹細胞
hiPSC:ヒト人工多能性幹細胞
hPSC:ヒト多能性幹細胞
KOSR:ノックアウト(Knock-out)血清代替物
NKX6.1:NK6ホメオボックス1
PDX1:膵臓および十二指腸ホメオボックス1
PEST:ペニシリンストレプトマイシン
PS:多能性幹
Rockout:Rhoキナーゼ阻害剤III
RT:室温
本発明は、ヒト胚体内胚葉細胞および人工多能性幹細胞等、幹細胞から膵臓内胚葉を作製する方法に関する。本発明は、内分泌細胞集団に達するのに必要な細胞ステージの1つであるPE細胞集団のマーカーである、NKX6.1/PDX1二重陽性細胞のパーセンテージを改善するための方法を提供することにより、ヒトPS細胞を成熟したベータ細胞へと分化させる効率を改善するための代替的なアプローチを採用する。
1.少なくとも5%の細胞がPDX1およびNKX6.1を共発現する膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を産生する方法であって、胚性幹細胞を、
a.BMP阻害剤
b.キナーゼ阻害剤
c.レチノイン酸受容体アゴニスト
からなる群の少なくとも1種の化合物の有効量に曝露して、ヒト胚性幹細胞を膵臓細胞または膵臓細胞前駆体に分化させる工程を含む方法。
a.BMP阻害剤、および
b.キナーゼ阻害剤、および
c.レチノイン酸受容体アゴニスト
のそれぞれからの少なくとも1種の化合物の有効量に曝露して、胚体内胚葉細胞を膵臓細胞または膵臓細胞前駆体に分化させる工程を含む方法。
シクロパミンなどのヘッジホッグ阻害剤
からなる群の少なくとも1種の化合物への曝露後に、胚体内胚葉細胞を有効量のLDN-193189に曝露する工程を含む、実施形態44〜46に記載の方法。
LDN-193189、
Wnt阻害剤、
ヘッジホッグ阻害剤、
レチノイン酸受容体アゴニスト
のうち少なくとも1種にも曝露される、実施形態56に規定の方法により産生される膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。
多能性幹細胞のin vitro培養
ヒト胚性幹(hES)細胞、系統SA121およびヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)chIPS4(Cellectis社)を、T75培養フラスコ内のDEF-CS培養培地(Cellectis社)において育成した。5μM Rock阻害剤Y-27632(Sigma社#Y0503)を用いて細胞を単細胞継代し、実験のために40000細胞/cm2の密度で播種した。加湿インキュベーター(ThermoScientific Model 371)において37℃、5%CO2で細胞を培養した。
hES細胞(系統SA121)およびhiPSC(chIPS4)のコンフルエント培養物をRPMI1640(Gibco社#61870)において1回洗浄し、RPMI1640における3μM CHIR99021(Axon社#1386)で処理した。24時間後に、細胞をRPMI1640で洗浄し、RPMI1640における100ng/mlアクチビンA(Peprotech社#120-14E)で処理した。24時間後、毎日培地交換しつつ、アクチビンA培地に2%B27(Invitrogen社#17504-044)を2日間添加した。分化の間中、加湿インキュベーターにおいて37℃、5%CO2で細胞を維持した。
ヒトES細胞由来のDEおよびヒトiPS細胞由来のDE細胞をPBS-/-で洗浄し、Tryple Select(Invitrogen社、12563-029)を用いて5分間トリプシン処理した。DE細胞をRPMI1640に注意深く懸濁し、1回洗浄し、その後、DE播種培地[アクチビンA 100ng/ml、2%B27、RPMI1640、0.1%PEST(Gibco社#15140)]に再懸濁した。96ウェル光学プレート(BD Bioscience社)において200000個/cm2でDE細胞を播種し、翌日、スクリーニング化合物を用いたPE分化を開始した。
PE分化8または14日目に、培地を吸引し、続いて4%パラホルムアルデヒド(VWR社、97.131.000)により細胞を室温で30分間固定した。細胞をPBSで洗浄し、0.5%Triton X-100(Sigma社、9002-93-1)で10分間透過処理し、洗浄し、0.5%TNBバッファー(Perkin Elmer社)において30分間室温でブロッキングした。一次抗体、マウス抗NKX6.1(Abcore社#A55F12)およびヤギ抗PDX1(Abcam社#47383)をPBS中の0.1%Triton X-100でそれぞれ1:500および1:8000に希釈し、各ウェルに添加して、4℃で一晩インキュベートした。細胞をPBSで3回洗浄した。DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、Applichem社、A4099.0010)ならびに二次抗体、Alexa Fluor 488ロバ抗ヤギおよびAlexa Fluor 594ロバ抗マウス(両者共にInvitrogen社)をPBS中の0.1%Triton X-100で1:1000に希釈し、各ウェルに45分間添加した。細胞を5回洗浄し、イメージングのために200μLのPBS中に置いた。
NKX6.1/PDX1共発現を誘導する小分子のスクリーニング
小分子
スクリーニングには、4種の異なるライブラリー、すなわちキナーゼ阻害剤ライブラリー(Calbiochem社#539743)、生理活性脂質ライブラリー(Enzo Life Sciences社#BML-2800)、核内受容体リガンドライブラリー(Enzo Life Sciences社#BML-2802)およびホスファターゼ阻害剤ライブラリー(Enzo Life Sciences社#BML-2834) が含まれていた。生理活性ライブラリー内の化合物は、1uMおよび0.1uMで検査した。他のライブラリー由来の化合物は、10uMおよび1uMで検査した。第2の候補に基づくスクリーニングアプローチには、膵発生に関与する主要シグナル伝達経路を標的とする小分子が含まれていた。
PEを作製するためのbFGFに基づく培地製剤(Ameriら2010)(RPMI1640、Gibco社#61870;12%KOSR、Gibco社#10828;0.1% PEST、Gibco社#15140;64ng/mL bFGF、Peprotech社#100-18B)に加えてライブラリー化合物をスクリーニングした。
NKX6.1/PDX1共発現を誘導する小分子ヒットの組み合わせ
ライブラリーアプローチからのヒットと候補スクリーニングアプローチからのヒットとの組み合わせ
DE細胞を4日間50nM LDN-193189に曝露し、続いて8日間AM580(AH Diagnostics社、BML GF104 0025)、JNK阻害剤II(Calbiochem社、420119)、50nM LDN-193189および64ng/ml FGF2、またはAM580、JNK阻害剤II、50nM LDN-193189、64ng/ml FGF2およびIWP2、またはAM580、JNK阻害剤II、50nM LDN-193189、64ng/ml FGF2およびシクロパミンに曝露した(図6)。培地交換を毎日行った。
ヒト人工多能性幹細胞においてNKX6.1/PDX1共発現を誘導する小分子の確認
PEを作製するためのbFGFに基づく培地製剤(Ameriら2010)(RPMI1640、Gibco社#61870;12%KOSR、Gibco社#10828;0.1%PEST、Gibco社#15140;64ng/mL bFGF、Peprotech社#100-18B)上で、ヒット化合物[Table 1(表1)およびTable 2(表2)]をスクリーニングした。
PE培地と比較して200%を超えてNKX6.1/PDX1二重陽性細胞の割合を増強する化合物。ライブラリー、ライブラリー内の化合物の位置、標的、化学構造、ヒット濃度およびPDX1/NKX6.1二重陽性細胞のパーセンテージを列挙する。
Claims (18)
- 少なくとも5%がPDX1/NKX6.1二重陽性を発現する膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を産生する方法であって、胚体内胚葉細胞を、次の群:
a.BMP阻害剤、および
b.キナーゼ阻害剤、および
c.レチノイン酸受容体アゴニスト
のそれぞれからの少なくとも1種の化合物の有効量に曝露して、胚体内胚葉細胞を膵臓細胞または膵臓細胞前駆体に分化させる工程を含む方法。 - BMP阻害剤が、LDN-193189である、請求項1に記載の方法。
- レチノイン酸受容体アゴニストが、AM580である、請求項1に記載の方法。
- レチノイン酸受容体アゴニストが、レチノイン酸誘導体である、請求項1に記載の方法。
- キナーゼ阻害剤が、N-アルキル化された、またはN-アルキル化されていない1,9-ピラゾロアントロンの異性体である、請求項1に記載の方法。
- キナーゼ阻害剤が、JNK阻害剤IIであり、AM580と組み合わされる、請求項1に記載の方法。
- 前記キナーゼ阻害剤およびレチノイン酸受容体アゴニストが、bFGFと組み合わされる、請求項1に記載の方法。
- 前記キナーゼ阻害剤およびレチノイン酸受容体アゴニストが、FGF7またはFGF10と組み合わされる、請求項1に記載の方法。
- 胚体内胚葉細胞をbFGFなしで有効量のLDN-193189に曝露する第1の工程と、bFGFの存在下でAM580と組み合わせたJNK阻害剤IIに曝露する第2の工程とを含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- IWP2などのwnt阻害剤および/または
シクロパミンなどのヘッジホッグ阻害剤
からなる群の少なくとも1種の化合物への曝露後に、胚体内胚葉細胞を有効量のLDN-193189に曝露する工程を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。 - 前記膵臓細胞または膵臓細胞前駆体の少なくとも5%、少なくとも10%、10〜30%、10〜40%、5〜70%、10〜80%または5〜100%が、PDX1/NKX6.1二重陽性である、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1から11のいずれか一項に記載の方法をin vitroで使用することにより得ることができる膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。
- JNK1、2もしくは3またはSycまたはSrcまたはGSK-3またはP38 MAPKまたはP38キナーゼまたはRhoキナーゼまたはMEKまたはChk2またはVEGFR1、2もしくは3またはPDGFRbまたはKDR/Flk-1を標的とするキナーゼ阻害剤に、胚体内胚葉細胞をin vitroで曝露することにより産生される、膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。
- キナーゼ阻害剤が、JNK阻害剤IIであり、胚体内胚葉細胞が、次の化合物:
LDN-193189、
Wnt阻害剤、
ヘッジホッグ阻害剤、
レチノイン酸受容体アゴニスト
のうち少なくとも1種にも曝露される、請求項13に記載の方法により産生される膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。 - 胚体内胚葉細胞が、Table 2(表2)に列挙されているレチノイン酸受容体アゴニストと組み合わせたJNK阻害剤IIに曝露される、請求項13に記載の膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。
- 膵臓内胚葉前駆体から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、Table 1(表1)またはTable 2(表2)のキナーゼ阻害剤化合物の使用。
- 膵臓内胚葉前駆体から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、JNK阻害剤IIおよびLDN-193189の組み合わせの使用。
- 膵臓内胚葉前駆体から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、レチノイン酸受容体アゴニストと組み合わせたJNK阻害剤IIの使用。
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