CN107429225B - 使用小分子从尿衍生细胞诱导β细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从尿衍生细胞产生诱导β细胞的方法，所述方法包括提供尿衍生细胞；通过在包含有效量的至少一种小分子重编程因子的初级诱导培养基中培养所述尿衍生细胞一第一时间段来诱导所述尿衍生细胞，以获得诱导内胚层细胞；通过在包含有效量的至少一种小分子重编程因子的二级诱导培养基中培养所述诱导内胚层细胞一第二时间段来诱导所述诱导内胚层细胞，以获得诱导胰腺前体细胞；并通过在包含有效量的至少一种小分子重编程因子的三级诱导培养基中培养所述胰腺前体细胞一第三时间段来诱导所述诱导胰腺前体细胞，以获得诱导β细胞。

Description

使用小分子从尿衍生细胞诱导β细胞的方法
技术领域
本发明涉及一种诱导细胞的方法和由该方法诱导的细胞。在具体形式中，本发明涉及诱导β细胞。
援引并入
本文引用了名称为“生产多能干细胞的方法(Method of producing multipotentstem cells)”的共同待审专利申请PCT/AU2012/001525，其公开号为WO 2013/086570。该申请的内容通过引用全部并入本文。
背景技术
术语糖尿病(Diabetes mellitus)(DM)或简称为糖尿病(diabetes)是指一组代谢疾病，其中受试者具有“高血糖”，这是因为胰腺未产生足够的胰岛素，或否则是因为受试者体内的细胞对胰岛素不敏感或产生“抵抗”(即，对产生的胰岛素反应不正确)。这些疾病的典型症状是多尿(即，尿频)、多饮(即，渴感增加)和多食(即，饥饿感增加)，并且主要有两种类型，即1型DM和2型DM。1型糖尿病是由于身体未能产生胰岛素而引起的，且目前的医疗干预要求受试者通常通过注射或通过胰岛素泵来服用胰岛素。另一方面，2型糖尿病由胰岛素抵抗引起的，其症状是细胞不能正确使用胰岛素，有时伴有绝对胰岛素缺陷。作为主要激素，胰岛素调节葡萄糖从血液至大多数细胞(主要是肌肉和脂肪细胞，而非中枢神经系统细胞)的摄入。因此，在胰岛素受体中的胰岛素缺陷或不敏感性在所有形式的DM中都起着关键作用。
DM是一个重大的医学问题，全球估计有2.85亿患者(其中约90％的患者患有2型DM)。令人担忧的是，DM的发病率正在快速增长，到2030年，预计当前的患者数量可能会增加一倍(Wild等人,2004)。因此，需要确定DM的替代疗法，理想的是这些替代疗法比当前的标准治疗方案的侵入性更低且更有效。在这方面，已经对干细胞疗法在患者中产生新的胰岛素分泌胰腺细胞(即，β胰岛细胞或β细胞)的潜在用途进行了大量研究。在最近的报告中，哈佛大学的一个小组已经从人胚胎干细胞(ESC)和人诱导多能干细胞(iPSC)中产生了完全成熟的葡萄糖响应性β细胞，并将这些细胞移植到糖尿病小鼠模型中以在几天内“治愈”患有该疾病的小鼠(Pagliuca等人,2014)。此外，Viacyte公司(圣地亚哥，认证机构，美国(SanDiego,CA,United States of America))的一个竞争小组很快就进行了一项关于移植免疫保护胶囊内包含的不太成熟的ES细胞源胰岛细胞的临床试验(DAmour等人,2006)。此外，已从其它干细胞类型，如大鼠和人神经干细胞产生了胰岛素分泌的β细胞(Hon等人,2005和Kuwabara等人,2011)，并且还使用小分子诱导剂(即5-氮杂胞苷(AzaC))从人纤维母细胞(成熟细胞类型)进行了诱导(Pennarossa等人,2013)。
本申请人对于从成熟细胞诱导干细胞和/或未成熟细胞类型是相当感兴趣的，因为其提供了从容易获得的相对非侵入性自体细胞来源产生具有治疗意义的细胞的可能性。然而，通常，将细胞重编程为iPSC的方案包括将编码多肽重编程因子的一个或多个多核苷酸分子引入到细胞或通过直接引入多肽重编程因子(例如，转录因子和与重编程相关的其它因子，例如Oct-3/4(Pou5fl)、Sox家族(例如，Sox1、Sox2、Sox3、Sox15、Sox18等)、Myc家族(例如，c-Myc、N-mvc、L-myc)、Klf家族(例如，Klfl、Klf2、Klf4、Kfl5等)，Nanog、Lin28等)。可使用病毒转染载体(例如，逆转录病毒)或质粒将这种多核苷酸分子或多肽重编程因子引入到细胞中作为遗传物质，或引入作为mRNA或miRNA或作为多肽(例如，重组多肽)。与这种病毒转染载体相关的风险和/或外源和潜在的致癌转录因子以及与重编程关联的相关因素(例如，诱发癌症的可能性)有关的风险已经引起了很大的关注，目前其已对在治疗中使用iPSC产生了一些限制。
最近，研究已阐明了一种可使用各种小分子替代某些多肽或多核苷酸重编程因子(使得在诱导中可使用较少的转录因子)以改进重编程中的干细胞诱导效率和多样性的方法(参见例如Shi等人,2008；Huangfu等人,2008；和Maherali&Hochedlinger,2009)。对这样的研究感兴趣，本申请人先前进行了实验以确定是否可能仅使用小分子来产生iPSC。虽然使用选择的一个或多个小分子未能成功地产生iPSC，但他们的工作实现了将体细胞如纤维母细胞诱导入多能细胞，如神经干细胞(表示为小分子诱导的神经干细胞(SMINS))。PCT/AU2012/001525(WO 2013/086570)中描述了用于生产SMINS的方案，其内容通过引用并入本文。
在实现本发明的工作中，本申请人试图确定是否可开发仅使用小分子(从而避免使用多肽重编程因子和编码多肽重编程因子的多核苷酸分子)的类似方案来产生细胞，例如能分泌胰岛素的β细胞。理想地，本申请人寻求避免使用其它毒性分子的方案，例如已知致突变的上述小分子诱导剂(即，AzaC)。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供了一种从尿衍生细胞产生诱导β细胞的方法，所述方法包括：
(a)提供尿衍生细胞；
(b)通过在初级诱导培养基中培养尿衍生细胞第一时间阶段来诱导步骤(a)中提供的尿衍生细胞，以获得诱导内胚层细胞，所述初级诱导培养基包含有效量的至少一种小分子重编程因子；
(c)通过在二级诱导培养基中培养所述诱导内胚层细胞第二时间段来诱导步骤(b)中获得的诱导内胚层细胞，以获得诱导胰腺前体细胞，所述二级诱导培养基中包含有效量的至少一种小分子重编程因子；和
(d)通过在三级诱导培养基中培养所述胰腺前体细胞第三时间段来诱导步骤(c)中获得的诱导胰腺前体细胞，以获得诱导β细胞，所述三级诱导培养基包含有效量的至少一种小分子重编程因子。
在一实施方案中，初级诱导培养基包含有效量的至少一种选自由定形内胚层诱导剂、糖原合成酶激酶3(GSK3)抑制剂和维生素C组成的组中的小分子重编程因子。
在一实施方案中，初级诱导培养基包含有效量的包含定形内胚层诱导剂、糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂和维生素C的小分子重编程因子的组合。
在一实施方案中，二级诱导培养基包含有效量的至少一种选自由PKC激活剂、音猬因子(SSH)抑制剂(sonic hedgehog inhibitor)、视黄酸受体(RAR)激动剂、维生素C、激活素受体样激酶(ALK)受体抑制剂和Pdx1诱导剂组成的组中的小分子重编程因子。
在一实施方案中，二级诱导培养基包含有效量的至少一种选自由PKC激活剂、音猬因子(SSH)抑制剂、视黄酸受体(RAR)激动剂、维生素C、激活素受体样激酶(ALK)受体抑制剂、Pdx1诱导剂和骨形态生成蛋白(BMP)抑制剂组成的组中的小分子重编程因子。
在一实施方案中，第二时间段由第一部分和第二部分组成，并且其中二级诱导培养基包含有效量的至少一种小分子重编程因子，所述小分子重编程因子选自：
用于第二时间段的第一部分的PKC激活剂、音猬因子(SSH)抑制剂、视黄酸受体(RAR)激动剂、维生素C、激活素受体样激酶(ALK)受体抑制剂和Pdx1诱导剂，和
用于第二时间段的第二部分的PKC激活剂、音猬因子(SSH)抑制剂、维生素C、激活素受体样激酶(ALK)受体抑制剂和Pdx1诱导剂。
在一实施方案中，第二时间段由第一部分、第二部分和第三部分组成，并且其中二级诱导培养基包含有效量的至少一种小分子重编程因子，所述小分子重编程因子选自：
用于第二时间段的第一部分的维生素C；
用于第二时间段的第二部分的维生素C、RAR激动剂、SSH抑制剂、PKC激活剂和BMP抑制剂；和
用于第二时间段的第三部分的维生素C、RAR激动剂和SSH抑制剂。
在一实施方案中，三级诱导培养基包含有效量的至少一种选自由促分裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)抑制剂、维生素C和切口抑制剂(notch inhibitor)组成的组中的小分子重编程因子。
在一实施方案中，三级诱导培养基包含有效量的至少一种选自由促分裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)抑制剂、维生素C、切口抑制剂、ALK受体抑制剂、三碘甲状腺原氨酸、RAR激动剂和SSH抑制剂组成的组中的小分子重编程因子。
在一实施方案中，定形内胚层诱导剂是IDE1。在一实施方案中，GSK抑制剂是氯化锂。在一实施方案中，PKC激活剂是吲哚内酰胺V(indolactam V)。在一实施方案中，SSH抑制剂是环巴胺-KAAD。在一实施方案中，RAR激动剂是视黄酸。在一实施方案中，ALK受体抑制剂是A83-01。在一实施方案中，Pdx-1诱导剂是BRD 7552。在一实施方案中，MEK抑制剂是SB2033580。在一实施方案中，切口抑制剂是DAPT。在一实施方案中，所述BMP抑制剂是dorsomorphin。
在一实施方案中：
初级诱导培养基包含有效量的IDE1、氯化锂和维生素C；
二级诱导培养基包含有效量的用于第二时间段的第一部分的吲哚内酰胺V、环巴胺-KA AD、维生素C、视黄酸、A83-01和BRD7552，和
用于第二时间段的第二部分的吲哚内酰胺V、环巴胺-KA AD、维生素C、A83-01和BRD7552；及
三级诱导培养基包含有效量的SB203580、维生素C和DAPT。
在一实施方案中：
初级诱导培养基包含有效量的IDE1、氯化锂和维生素C；
二级诱导培养基包含有效量的用于第二时间段的第一部分的维生素C；
用于第二时间段的第二部分的维生素C、RA、环巴胺-KAAD、吲哚内酰胺V和dorsomorphin；和
用于第二时间段的第三部分的维生素C、RA和环巴胺-KA AD；及
三级诱导培养基包含有效量的用于第三时间段的第一部分的维生素C、RA、环巴胺-KA AD、DAPT、A83-01和三碘甲状腺原氨酸，
用于第三时间段的第二部分的维生素C、RA、DAPT、A83-01和三碘甲状腺原氨酸，和
用于第三时间段的第三部分的维生素C和三碘甲状腺原氨酸。
在一实施方案中，尿衍生细胞从受试者的尿样获得。在一实施方案中，尿衍生细胞是人细胞。
在一实施方案中，步骤(a)还包括通过在合适的组织培养基中培养尿衍生细胞扩增尿衍生细胞。
在一实施方案中，该方法不包括使用非小分子的重编程因子。
在第二方面中，本发明提供了一种从尿衍生细胞产生诱导内胚层细胞的方法，所述方法包括：
(a)提供尿衍生细胞；和
(b)通过在初级诱导培养基中培养所述尿衍生细胞一第一时间段诱导步骤(a)中获得的尿衍生细胞，以获得诱导内胚层细胞，所述初级诱导培养基包含有效量的至少一种小分子重编程因子。
在第三方面中，本发明提供了一种从尿衍生细胞产生诱导胰腺前体细胞的方法，所述方法包括：
(a)提供尿衍生细胞；
(b)通过在初级诱导培养基中培养所述尿衍生细胞一第一时间段诱导步骤(a)中获得的尿衍生细胞，以获得诱导内胚层细胞，所述初级诱导培养基包含有效量的至少一种小分子重编程因子；和
(c)通过在二级诱导培养基中培养所述诱导内胚层细胞一第二时间段来诱导步骤(b)中获得的诱导内胚层细胞，以获得诱导胰腺前体细胞，所述二级诱导培养基包含有效量的至少一种小分子重编程因子。
在第四方面中，本发明提供了一种从内胚层细胞产生诱导胰腺前体细胞的方法，所述方法包括：
提供内胚层细胞；和
通过在诱导培养基中培养所述内胚层细胞一段时间来诱导获得的内胚层细胞以获得诱导胰腺前体细胞，所述诱导培养基包含有效量的至少一种选自由PC激活剂、音猬因子(SSH)抑制剂、视黄酸受体(RAR)激动剂、维生素C、激活素受体样激酶(ALK)受体抑制剂和Pdx1诱导剂组成的组中的小分子重编程因子。
在第五方面中，本发明提供了一种从胰腺前体细胞产生诱导β细胞的方法，所述方法包括：
提供胰腺前体细胞；和
通过在诱导培养基中培养所述胰腺前体细胞一段时间来诱导所获得的胰腺前体细胞以获得诱导的β细胞，所述诱导培养基包含有效量的至少一种选自由促分裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)抑制剂、维生素C和切口抑制剂组成的组中的小分子重编程因子。
在第六方面中，本发明提供了使用本发明的任何一个方面的方法获得的细胞。
附图说明
图1提供了将从35岁的人类男性供体(“M-35”)采集的人类尿细胞(HUC)染色用于：(a)CD13表达，(b)人类核抗原(HNA)表达，(c)DAPI和(d)融合图像的荧光显微照片图像，比例尺：100μm；
图2提供了将从35岁的人类男性供体(“M-35”)采集的人类尿细胞(HUC)染色用于：(a)波形蛋白和(b)E钙粘蛋白的荧光显微照片图像，比例尺＝100μm；
图3提供了在使用含有激活素A、LiCl和维生素C的初级诱导培养基进行初级诱导6天之前(a)和之后(b)从35岁的人类男性供体(“M-35”)的尿采集的细胞的显微照片图像，比例尺：100μm；
图4提供了在使用含有激活素A、LiCl和维生素C的初级诱导培养基进行初级诱导6天之前(第一列)和之后(第二列)从35岁的人类男性供体(“M-35”)的尿采集的细胞的百分比的图形结果(AI＝诱导后)；
图5提供了在使用含有激活素A、LiCl和维生素C的初级诱导培养基进行初级诱导6天和使用含有吲哚内酰胺V、L-谷氨酰胺和B27、视黄酸(RA)、维生素C(VC)和A83-01的二级诱导培养基进行二级诱导一天，然后使用维生素C和A83-01诱导七天之后从人尿中采集的细胞的显微照片图像，比例尺＝100μm；
图6提供了在使用含有激活素A、LiCl和维生素C的初级诱导培养基进行初级诱导6天和使用含有吲哚内酰胺V、L-谷氨酰胺、B27、视黄酸(RA)、维生素C(VC)和A83-01的二级诱导培养基进行二级诱导一天，然后使用维生素C和A83-01诱导七天之后从人尿中采集的细胞的相衬图像(a)和荧光显微照片图像(b)，比例尺＝100μm；
图7提供了在使用含有激活素A、LiCl和维生素C的初级诱导培养基进行初级诱导6天和使用含有吲哚内酰胺V、RA、维生素C和A83-01的二级诱导培养基进行二级诱导一天，然后使用吲哚内酰胺V、维生素C、A83-01诱导3天并使用含有SB203580和维生素C的三级诱导培养基进行三级诱导九天之后从人尿中采集的细胞的荧光显微照片图像，比例尺＝100μm；
图8提供了在使用含有定形内胚层诱导剂(IDE)1、氯化锂和维生素C的初级诱导培养基进行初级诱导6天、含有环巴胺-KAAD、吲哚内酰胺V、RA、维生素C、A83-01和BRD 7552(pH调整至7.4)的二级诱导培养基进行二级诱导一天，然后使用环巴胺-KAAD、吲哚内酰胺V、维生素C、A83-01和BRD 7552诱导6天(pH调整至7.4)，并使用含有SB203580、维生素C和DAPT的三级诱导培养基进行三级诱导九天之后从人尿中采集的细胞的相衬图像，比例尺＝100μm；
图9提供了在使用含有IDE1、氯化锂和维生素C的初级诱导培养基进行初级诱导6天、使用含有环巴胺-KAAD、吲哚内酰胺V、RA、维生素C、A83-01和BRD 7552(pH调整至7.4)的二级诱导培养基进行二级诱导一天，然后使用环巴胺-KAAD、吲哚内酰胺V、维生素C、A83-01和BRD 7552诱导6天(pH调整至7.4)，并使用含有SB203580和维生素C的三级诱导培养基进行三级诱导九天之后，将从人尿中采集的细胞染色用于：(a)C-肽，(b)胰岛素，(c)DAPI和(d)融合图像的荧光显微照片图像，比例尺＝50μm；
图10提供了在使用含有IDE1、氯化锂和维生素C的初级诱导培养基进行初级诱导6天、使用含有环巴胺-KAAD、吲哚内酰胺V、RA、维生素C、A83-01和BRD 7552(pH调整至7.4)的二级诱导培养基进行二级诱导一天，然后使用环巴胺-KAAD、吲哚内酰胺V、维生素C、A83-01和BRD 7552诱导6天(pH调整至7.4)，并使用含有SB203580和维生素C的三级诱导培养基进行三级诱导九天之后，将从人尿中采集的细胞染色用于：C-肽、胰岛素和DAPI的融合荧光显微照片图像，比例尺＝50μm；
图11提供了在使用含有IDE1、LiCl和维生素C的初级诱导培养基进行初级诱导6天、使用含有环巴胺-KAAD、吲哚内酰胺V、RA、VC、A83-01、BRD 7552的二级诱导培养基进行二级诱导一天，然后使用环巴胺-KAAD、吲哚内酰胺V、VC、A83-01和BRD 7552(pH调整至7.4)诱导6天，并使用含有SB203580、VC和DAPT的三级诱导培养基诱导九天之后，将从人尿中采集的细胞染色用于：(a)胰岛素，(b)C-肽，(c)DAPI和(d)融合的荧光显微照片图像，比例尺＝50μm；
图12提供了在诱导之前(白色列)和在使用含有IDE1、LiCl和维生素C的初级诱导培养基进行初级诱导6天、使用含有环巴胺-KAAD、吲哚内酰胺V、RA、VC、A83-01、BRD 7552的二级诱导培养基进行二级诱导一天(pH调整至7.4)，然后使用环巴胺-KAAD、吲哚内酰胺V、VC、A83-01和BRD 7552(pH调整至7.4)诱导6天；以及使用含有SB203580、VC和DAPT的三级诱导培养基诱导九天之后(黑色列)，从人尿采集的细胞的(a)PDX1，(b)胰岛(ISL)和(c)NGN3mRNA相对基因表达水平的图形表示；
图13提供了在(A)三级诱导后(称为“IBC”)的细胞、(B)人胰岛细胞和(C)尿细胞中以ng/ml/30000个细胞释放的C-肽的图形表示，其中“0”样品是指培养基上清液，“1-2”是指使用低(2mM)的葡萄糖在第一次刺激细胞后获得的样品，“1-20”是指使用高(20mM)的葡萄糖在第一次刺激细胞后获得的样品，“2-2”是指使用低(2mM)的葡萄糖在第二次刺激细胞后获得的样品，及“2-20”是指使用高(20mM)的葡萄糖在第二次刺激细胞后获得的样品；
图14提供了对于在初级诱导方案(称为“IBC阶段1”)之后的细胞的(A)sox17或(B)Foxa2表达、人胰岛细胞或尿细胞；在二级诱导方案(称为“IBC阶段2”)之后的细胞的(C)Pdx1或(D)NGN3表达、人胰岛细胞或尿细胞；或在三级诱导方案(称为“IBC阶段3”)之后的细胞的(E)胰岛素或(F)生长激素抑制素(SST)表达、人胰岛细胞或尿细胞的q-PCR之后的基因表达水平的图形表示；
图15提供了三级诱导之后的细胞的FACS柱状图，其中(A)显示活细胞的门控(gating)；(B)显示使用抗胰岛素抗体染色；及(C)显示使用抗C-肽抗体的染色；
图16提供了对(A)闭合蛋白(OCL)、(B)KRT7、(C)NR3C2、(D)LI CAM(E)SLC2A1和(F)波形蛋白(VIMENTIN)的三种不同尿细胞样品和纤维母细胞样品进行q-PCR之后的基因表达水平的图形表示。
具体实施方式
本申请人已经确定了一种使用三个诱导步骤从体细胞(例如尿衍生细胞)中有效诱导β细胞的新型且安全的方法，每一个步骤均利用至少一种包含至少一种小分子重编程分子的诱导培养基进行诱导。在一些实施方案中，该方法不包括使用非小分子重编程因子。有利地，该方法降低了整合潜在有害病毒转染载体和/或引入多核苷酸或多肽重编程因子(例如致癌转录因子)的担忧，并试图避免使用其它毒性分子，例如已知致突变的上述小分子诱导剂(即，AzaC)。此外，该方法特别有益，因为其利用容易获得的可通过非侵入性方法采集的细胞。因此，该方法可代表针对患有胰岛素缺陷或不敏感症(例如糖尿病(DM))的疾病的受试者定制基于细胞的个性化疗法迈出了重要一步。
根据本发明的第一方面，提供了一种从尿衍生细胞产生诱导β细胞的方法，所述方法包括：
(a)提供尿衍生细胞；
(b)通过在初级诱导培养基中培养所述尿衍生细胞一第一时间段来诱导步骤(a)中提供的尿衍生细胞，以获得诱导内胚层细胞，所述初级诱导培养基包含有效量的至少一种小分子重编程因子；
(c)通过在二级诱导培养基中培养所述诱导内胚层细胞一第二时间段来诱导步骤(b)中获得的诱导内胚层细胞，以获得诱导胰腺前体细胞，所述二级诱导培养基包含有效量的至少一种小分子重编程因子；和
(d)通过在三级诱导培养基中培养所述胰腺前体细胞一第三时间段来诱导步骤(c)中获得的诱导胰腺前体细胞，以获得诱导β细胞，所述三级诱导培养基包含有效量的至少一种小分子重编程因子。
如本文所用，术语“小分子”应理解为是指具有生物功能的低分子量化合物，如本领域技术人员所理解的。根据定义，小分子并非聚合物，除非其是非常小的低聚物(例如，由两个或可能的三个单体组成)。因此，小分子不是多核苷酸或多肽，例如基因、引物、转座子或其它DNA多核苷酸分子、编码蛋白质或多肽的RNA多核苷酸分子(例如，双链RNA、mRNA(即，有义RNA)，或mRNA互补物(即，RNA双链的反义链))、微小RNA(miRNA)分子或干扰RNA(RNAi)分子或其它RNA多核苷酸分子或多肽，或这些多核苷酸或多肽分子中的任何一个的片段，除非所述片段是单体或非常小的寡聚体，例如二核苷酸、二肽或三肽。本发明的小分子通常是有机化合物，然而，一些非有机化学品可以是本发明的小分子，例如氯化锂或丁酸钠。通常认为小分子的分子量上限为约800g/mol(即，约800道尔顿)。然而，本领域技术人员将理解的是，小分子可具有约900g/mol的分子量上限。小分子通常以特定方式结合生物聚合物如多肽或多核苷酸分子等，并改变该多肽或多核苷酸分子的活性或功能(例如，激活或抑制特定酶的功能等)。
如本文所用，术语“重编程因子”意指与细胞“重编程”相关的分子，即分化和/或去分化和/或转分化，使得细胞转化为不同细胞类型或表型。重编程因子通常影响与细胞分化、去分化和/或转分化相关的基因的表达。转录因子是重编程因子的实例。
本领域技术人员理解的是，如本文所用，“分化”是指较少的专能细胞(即，具有较高细胞效能的较多原初细胞(naivety cell))变成较多的专能细胞类型(即，具有较低细胞效能的较少原初细胞)的过程；并且术语“去分化”是指较多的专能细胞变成较少的专能细胞类型(即，具有较高细胞效能的较多原初细胞)的过程；而术语“转分化”是指特定细胞类型的细胞在不显著改变其“细胞效能”或“原初”水平的情况下转化为另一种细胞类型的过程。不希望受理论束缚，认为当细胞从一个谱系定型的细胞类型或终末分化的细胞类型转变为另一种谱系定型的细胞类型或终末分化的细胞类型时，细胞会“转分化”，但不显著改变其“细胞效能”或“原初”水平。如本文所用，术语“细胞效能”应理解为是指细胞分化成不同谱系的细胞的能力。例如，多能细胞(pluripotent cell)(例如，干细胞)具有分化成三个胚层中的任何一个的细胞的潜力，即内胚层(内部胃粘膜、胃肠道、肺)、中胚层(肌肉、骨、血液、泌尿生殖器)或外胚层(表皮组织和神经系统)，因此其具有高的细胞效能；专能细胞(multipotent cell)(例如，干细胞或某种类型的诱导干细胞)具有从多个但有限数量的谱系(例如，造血干细胞、心脏干细胞或神经干细胞等)产生细胞的能力，与多能细胞相比，其细胞效能较低。定型为特定谱系或终末分化的细胞仍具有较低的细胞效能。本领域已知的转分化的具体实例包括将纤维母细胞转化为肌细胞(Davis等人,1987)、神经元(Vierburchen等人,2010)、β细胞(Pennarossa等人,2013)或心肌细胞(Efe等人,2011)或从胰腺外分泌细胞到β细胞(Zhou等人,2008)；等。
因此，可使细胞分化成更多的原初细胞(例如，终末分化的细胞可被分化为专能细胞或多能细胞)；或者可使细胞去分化成较少的原初细胞(例如，专能或多能的细胞可分化为谱系定型细胞或终末分化的细胞)。然而，在一实施方案中，可使细胞从一种细胞类型(或表型)转化或转分化为另一种细胞类型(或表型)，例如具有相似的细胞效能水平。因此，在本发明的一实施方案中，本发明的诱导步骤可将本发明的细胞重新编程以分化、去分化和/或转分化。在本发明的一实施方案中，本发明的诱导步骤可重新编程细胞以转分化。
如本文所用，“多核苷酸或多肽重编程因子”应理解为是指与分化、去分化和/或转分化相关的多核苷酸或多肽分子。应当理解的是，多核苷酸或多肽重编程因子可以是例如，基因、引物、转座子或其它DNA多核苷酸分子、编码蛋白质或肽的RNA多核苷酸分子(例如，双链RNA、mRNA(即，有义RNA)，或mRNA互补物(即，RNA双链的反义链))、微小RNA(miRNA)分子或干扰RNA(RNAi)分子或其它RNA多核苷酸分子或多肽，或这些多核苷酸或多肽分子中的任何一个的片段，条件是所述片段不是单体或非常小的寡聚体，例如二核苷酸、二肽或三肽。
例如通过使用一种或多种外源多核苷酸或多肽重编程因子的分化、去分化和/或转分化重编程或诱导特定细胞类型成为另一种细胞类型的方法是本领域技术人员已知的。这种方法可依赖于引入编码与细胞重编程相关的一种或多种转录因子或其它多肽的遗传物质。例如，已知Pdx1、Ngn3和MafA或其功能片段都编码可诱导本发明的细胞的细胞分化、去分化和/或转分化的肽。在本领域技术人员已知的一些方法中，通过重编程基因(例如，上述基因)编码的外源多肽(例如，重组多肽)与细胞接触以诱导例如，本发明的细胞。本领域技术人员应该理解的是，其它基因可能与细胞的重编程相关，并且编码这种基因(或其功能片段)的外源分子和编码的多肽也被认为是多核苷酸或多肽重编程因子(例如，反过来影响与细胞重编程相关的另一基因的表达水平的多核苷酸或多肽)。例如，已证明引入减少p53失活的外源多核苷酸或多肽表观遗传基因沉默子(silencers)会提高诱导诱导多能干细胞(iPSC)的效率。因此，编码可能直接或间接参与细胞重编程或提高细胞编程效率的表观遗传沉默子和其它基因或蛋白质的外源多核苷酸或多肽可被认为构成了外源多核苷酸或多肽重编程因子。本领域技术人员应该理解的是，存在影响细胞重编程的其它方法，例如引入可敲除参与抑制细胞重编程的基因表达的RNAi分子(或编码RNAi分子的遗传物质)。因此，与细胞重编程或增强细胞重编程相关的任何外源多核苷酸分子或多肽分子均应被理解为是如本文所述的外源多核苷酸或多肽重编程因子。
应当理解，术语“小分子重编程因子”是指如本文定义的为小分子的重编程因子。本文其它部分会详细描述这种小分子。
在本发明的一些实施方案中，该方法不包括使用非小分子的重编程因子。然而，应当理解的是，该方法可利用诸如培养基、血清、血清替代品、增补物、抗生素等的“常规”组织培养组分，例如RPMI、肾上皮细胞基础培养基(REBM)、杜氏改良伊格尔培养基(DMEM)、MCDB131培养基、CMRL 1066培养基、F12、胎犊血清(FCS)、胎牛血清(FBS)、牛血清白蛋白(BSA)、D-葡萄糖、L-谷氨酰胺、GlutaMAXTM-I(二肽、L-丙氨酸-L-谷氨酰胺)、B27、肝素、孕酮、腐胺、层粘连蛋白、烟酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、硒、乙醇胺、人表皮生长因子(hEGF)、碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)、氢化可的松、肾上腺素、诺曼克(normacin)、青霉素、链霉素、庆大霉素和两性霉素等。应当理解的是，这些典型的组织培养组分(和组织培养中常规使用的其它类似组织培养组分)并非用于本发明的目的的小分子重编程分子。实际上，这些组分不是本文定义的小分子和/或不是如本文所定义的重编程因子。
因此，在一实施方案中，本发明不涉及使用一种或多种外源多核苷酸或多肽重编程因子培养细胞的步骤。因此，在一实施方案中，本发明的方法不涉及引入一种或多种外源多核苷酸或多肽重编程因子，例如通过引入转座子、病毒转基因载体(例如，逆转录病毒载体)、质粒、mRNA、miRNA、肽或参与产生诱导β细胞的任何这些分子的片段，或者以其它方式诱导本发明的细胞分化、去分化和/或转分化的任何这些分子的片段。
也就是说，在一实施方案中，该方法在不存在一种或多种外源多核苷酸或多肽重编程因子的情况下发生。因此，应当理解的是，在一实施方案中，本发明的方法仅使用小分子来重编程细胞，而不添加多肽转录因子；与诱导分化、去分化和/或转分化特异性相关的其它多肽因子；编码多肽转录因子的多核苷酸序列、编码与诱导分化、去分化和/或转分化特异性相关的其它多肽因子的多核苷酸序列；mRNA；干扰RNA；微小RNA及其片段。值得注意的是，在一实施方案中，本发明的方法不包括添加一种或多种选自pdx1、ngn3和/或MafA等的多核苷酸或多肽及其功能片段。相反，该方法可利用有效量的至少一种小分子重编程因子来诱导细胞的重编程。尽管如此，如本文其它地方所述，在一实施方案中，本发明可进一步包括利用多肽激活素A和/或结节(Nodal)(或其活性片段，或编码所述多肽或其活性片段的多核苷酸)作为重编程因子。在该实施方案中，本领域技术人员将理解的是，激活素A和结节不是小分子。
如本文所用，关于“诱导的细胞”的术语“诱导的”意指由于在组织培养中应用特定因子而在体外经历变化的细胞，并且应当理解的是，诱导的细胞具有与在体内或者在一些情况下，根据典型组织培养技术(即，不涉及重编程因子的应用)在体外发现的相同细胞类型相同或相似的表型特征(例如，细胞类型特异性标记物的形态学和/或表达)。也就是说，诱导的细胞已被重编程为不同的细胞类型或具有不同的表型。例如，诱导β细胞可具有相似的形态并且表达与体内发现的β细胞相同的肽或遗传细胞标记物；诱导内胚层细胞可具有相似的形态并且表达与体内发现的内胚层细胞相同的肽或遗传细胞标记物；和/或诱导胰腺前体细胞可具有相似的形态并且表达与体内发现的胰腺前体细胞相同的肽或遗传细胞标记物。
如本文所用，短语“本发明的细胞”意指如本文所述的尿衍生细胞、诱导内胚层细胞、诱导胰腺前体细胞和/或诱导β细胞。如本文所用，短语“本发明的诱导细胞”意指如本文所述的诱导内胚层细胞、诱导胰腺前体细胞和/或诱导β细胞。
如本文所用，术语“有效量”，例如就小分子重编程因子而言，是引起本发明的细胞中的效能的任何合适量的重编程因子。例如，如本文所述，有效量可以是促进或有助于细胞的重编程的足够的量。本文其它部分描述了构成小分子重编程因子的有效量的合适浓度范围的实例。然而，应当理解的是，本文所述的浓度可以变化并且仍落在本发明的范围内，只要在本发明的方法中使用的小分子重编程因子的量适于引起细胞中的效能便可。
本领域的技术人员已知了大量的小分子重编程因子。小分子重编程因子通常以特异性方式结合生物聚合物，例如参与细胞重编程等的多肽或多核苷酸分子，并改变该多肽或多核苷酸分子的活性或功能(例如，激活或抑制参与细胞重编程的特定酶的功能等)，并且以这种方式诱导细胞重编程。本发明的小分子重编程因子具有小于1000g/mol的分子量。在一实施方案中，本发明的小分子重编程因子具有小于900g/mol的分子量。在一实施方案中，小分子重编程因子具有小于800g/mol的分子量。在一实施方案中，小分子重编程因子具有小于700g/mol的分子量。在一实施方案中，小分子重编程因子具有600g/mol或更少的分子量。
已知小分子重编程因子包括G9a组蛋白甲基转移酶(G9a HMTase)抑制剂、DNA甲基转移酶抑制剂、ME抑制剂、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂、糖原合成酶激酶3(GSK3)抑制剂、维生素C、激活素受体样激酶(ALK)受体抑制剂、定形内胚层诱导剂(IDE)、蛋白激酶C(PKC)诱导剂、音猬因子(SSH)抑制剂、视黄酸受体激活剂、PDX1诱导剂、切口抑制剂、骨形态生成蛋白(BMP)抑制剂和三碘甲状腺原氨酸。上文描述的PCT/AU2012/001525中描述了许多这些小分子。
在本发明的一实施方案中，本发明的方法利用定形内胚层(IDE)诱导剂作为重编程因子。IDE包括肽激活素A和结节以及小分子IDE1和IDE2(Borowiak等人，2009)。IDEl和IDE2部分通过激活TGF-β信号起作用，如通过Smad2磷酸化所证明的(Borowiak等人，2009)。用于本发明的合适的IDE包括激活素A、结节、IDE1(1-[2-[(2-羧基苯基)亚甲基]酰肼]庚酸；分子量＝306.31g/mol)、IDE2(庚二酸-1-(2-环亚戊基酰肼)；分子量＝240.3g/mol)等。激活素A和结节不是小分子，但在本发明的实施方案中可用作IDE。然而，在替代实施方案中，本发明不包括使用非小分子的重新编程因子。在一实施方案中，IDE是激活素A。在一个实施方案中，IDE是IDEl。用于本发明的合适的IDE可以包括表1所示的那些。然而，本领域技术人员理解的是，表1中的列举并不详尽，并且其它小分子IDE可能适用于本发明。
表1小分子IDE
化学名称 同物异名 分子量(g/mol)
1-[<sub>2</sub>-[(<sub>2</sub>-羧基苯基)亚甲基]酰肼]庚酸 IDE1 306.31
庚二酸-1-(2-环亚戊基酰肼 IDE2 240.3
本领域技术人员将理解的是，有效量的IDE可根据，例如，具体选择的IDE或所使用的IDE的组合变化。在实施方案中，使用的IDE的浓度范围为5nM至50mM。在一些实施方案中，使用的IDE的浓度范围选自约5nM至50nM、50nM至500nM、0.5μM至5M、5μM至50μM、50μM至500μM和/或5mM至50mM、5nM至50mM、0.01μM至100μM、0.1mM至10mM或0.05mM至2mM。然而，一般而言，以5nM至50mM或0.01至10μΜ的浓度范围提供IDE。在一实施方案中，对于激活素A，浓度可在0.1ng/ml至100μg/ml的范围内，或者在1ng/ml至10μg/ml的范围内，或者约10ng/ml至1μg/ml。在另一个实施方案中，对于IDE1，浓度可以在5nM至5mM的范围内，或在1μM至1mM的范围内，或在10μM至1.0μM的范围内。通常，在适用于培养本发明的细胞的培养基中提供有效量的IDE，如本文其它部分所详述。
在本发明的一实施方案中，本发明的方法利用糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂作为小分子重编程因子。用于本发明的合适的GSK3抑制剂包括氯化锂(LiCl；分子量＝42.39)，CHIR98014(2,6-吡啶二胺,N6-[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(1H-咪唑-1-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]-3-硝基-；分子量＝486.31g/mol)、SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮；分子量＝371.22g/mol)、TWS119(3-[6-(3-氨基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基氧基]苯酚；分子量＝318.33g/mol)和双吲哚基马来酰亚胺I(BIM)。一种GSK3抑制剂的实例是氯化锂。已发现氯化锂会抑制GSK-3β，但尚未报道会抑制其它蛋白激酶。在一实施方案中，GSK3抑制剂可以是CHIR 99021。其它合适的GSK3抑制剂可包括表2所示的那些。然而，本领域技术人员理解的是，表2中的列举并不详尽，并且其它小分子GSK3抑制剂可能适用于本发明。
表2小分子GSK3抑制剂
Figure GDA0003172796610000141
Figure GDA0003172796610000151
本领域技术人员将理解的是，有效量的GSK3抑制剂可根据，例如，具体选择的GSK3抑制剂或所使用的GSK3抑制剂的组合变化。在实施方案中，使用的GSK3抑制剂的浓度范围为5nM至50mM。在一些实施方案中，使用的GSK3抑制剂的浓度范围可以选自约5nM至50nM、50nM至500nM、0.5μΜ至5μΜ、5μΜ至50μΜ、50μΜ至500μΜ和/或5mM至50mM、5nM至50mM、0.01μΜ至100μΜ、0.1mM至10mM或0.05mM至2mM。在一实施方案中，使用氯化锂的范围可以为0.01mM至100μΜ或0.1mM至10mM或约0.05mM至2mM。然而，一般而言，以0.01μM至100mM，或0.1μM至10mM，或约0.3μM至1.0mM的浓度范围提供GSK3抑制剂用于培养本发明的细胞。一般而言，在适用于培养本发明的细胞的培养基中提供有效量的GSK3抑制剂。
在本发明的一实施方案中，该方法利用小分子重编程因子维生素C(Vc；(R)-5-((S)-1,2-二羟乙基)-3,4-二羟基呋喃-2(5H)-酮；也称为抗坏血酸和L-抗坏血酸；分子量＝176.12g/mol)。Vc是由双加氧酶(包括胶原脯氨酰羟化酶、缺氧诱导因子(HIF)、脯氨酰羟化酶和组蛋白去甲基化酶)驱动的反应中的辅因子(Shi,2007)。本领域技术人员应该理解的是，有效量的Vc可根据，例如，所使用的小分子重编程因子抑制剂和经历重编程的具体细胞的具体组合变化。在实施方案中，使用的Vc的浓度范围可以为5nM至50mM。在一些实施方案中，使用的Vc的浓度范围可以选自约5nM至50nM、50nM至500nM、0.5μΜ至5μΜ、5μΜ至50μΜ、50μΜ至500μΜ和/或5mM至50mM。在一实施方案中，以1μM至10mM、或10μM至1mM，或约0.1mM至0.5mM的浓度范围提供Vc用于培养细胞。一般而言，在适用于培养本发明的细胞的培养基中提供有效量的Vc。
在本发明的一实施方案中，该方法利用音猬因子(SSH)抑制剂作为小分子重编程因子。用于本发明的合适的SSH抑制剂可以包括表3所示的那些。然而，本领域技术人员应该理解的是，表3中的列举并不详尽，并且其它小分子SSH抑制剂可能适用于本发明。SSH抑制剂的一实例是KAAD-环巴胺(N-[2-[(3’R,7’aR)-3’,6’,10,11b-四甲基-3-氧代螺[l,2,4,6,6a,6b,7,8,11,1la-十氢苯并[a]芴-9,2’-3,3a,5,6,7,7a-六氢呋喃并[3,2-b]吡啶]-4’-基]乙基]-6-(3-苯基丙酰基氨基)己酰胺((N-[2-[(3'R,7'aR)-3',6',10,l lb-tetramethyl-3-oxospiro[l,2,4,6,6a,6b,7,8,11,1]a-decahydrobenzo[a]fluorene-9,2'-3,3a,5,6,7,7a-hexahydrofuro[3,2-b]pyridine]-4'-yl]ethyl]-6-(3-phenylpropanoylamino)hexanamide)；分子量＝697.99)。KAAD-环巴胺是已知靶向平滑的(Smoothened)的音猬因子抑制剂(Pasca di Magliano&Hebrok,2003)。刺猬信号涉及胚胎形成以及癌症进展。
表3小分子SSH抑制剂
Figure GDA0003172796610000161
本领域技术人员应该理解的是，有效量的SSH抑制剂可根据，例如，具体选择的SSH抑制剂或所使用的SSH抑制剂的组合变化。在实施方案中，使用的SSH抑制剂的范围可以为5nM至50mM。在一些实施方案中，使用的SSH抑制剂的范围可以为约5nM至50nM、50nM至500nM、0.5μΜ至5μΜ、5μΜ至50μΜ、50μΜ至500μΜ和/或5mM至50mM的范围使用SSH抑制剂。在一实施方案中，以0.001μM至100μM，或约0.1μM至10μM的浓度范围提供KAAD-环巴胺用于培养本发明的细胞。一般而言，在适用于培养本发明的细胞的培养基中提供有效量的SSH抑制剂。
在本发明的一实施方案中，该方法利用蛋白激酶C(PKC)激活剂作为小分子重编程因子。用于本发明的合适的PKC激活剂可以包括表4所示的那些。然而，本领域技术人员应该理解的是，表4中的列举并不详尽，并且其它小分子PKC激活剂可能适用于本发明。PKC激活剂的一实例是吲哚内酰胺V((2S,5S)-1,2,4,5,6,8-六氢-5-(羟基甲基)-l-甲基-2-(l-甲基乙基)-3H-吡咯并[4,3,2-gh]-l,4-苯并二氮杂环壬四烯-3-酮(((2S,5S)-1,2,4,5,6,8-Hexahydro-5-(hydroxymethyl)-l-methyl-2-(l-methylethyl)-3H-pyrrolo[4,3,2-gh]-l,4-benzodiazonin-3-one)；分子量＝301.38g/mol)。
表4小分子PKC激活剂
Figure GDA0003172796610000171
Figure GDA0003172796610000181
本领域技术人员应该理解的是，有效量的PKC激活剂可根据，例如，具体选择的PKC激活剂或所使用的PKC激活剂的组合变化。在实施方案中，使用的PKC激活剂的浓度范围可以为5nM至50mM。在一些实施方案中，使用的PKC激活剂的浓度范围可以选自约5nM至50nM、50nM至500nM、0.5μΜ至5μΜ、5μΜ至50μΜ、50μΜ至500μΜ和/或5mM至50mM、5nM至50mM、0.01μΜ至100μΜ、0.1mM至10mM或0.05mM至2mM。在一实施方案中，以0.001μM至100μM，或约0.01μM至10μM或约0.1μΜ至1.0μΜ的浓度范围提供吲哚内酰胺V用于培养本发明的细胞。一般而言，在适用于培养本文发明的细胞的培养基中提供有效量的PKC激活剂。
在本发明的一实施方案中，该方法利用视黄酸受体(RAR)激动剂作为小分子重编程因子。用于本发明的合适的RAR激动剂可包括表5所示的那些。然而，本领域技术人员应该理解的是，表5中的列举并不详尽，并且其它小分子RAR激动剂可能适用于本发明。RAR激动剂的一实例是视黄酸((2E,4E,6E,8E)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己烯-l-基)壬-2,4,6,8-四烯酸；分子量＝300.44g/mol)。
表5小分子RAR激动剂
Figure GDA0003172796610000191
本领域技术人员应该理解的是，有效量的RAR激动剂可根据，例如，具体选择的RAR激动剂或所使用的RAR激动剂的组合变化。在实施方案中，使用的RAR激动剂的范围可以为5nM至50mM。在一些实施方案中，使用的RAR激动剂的范围可以为约5nM至50nM、50nM至500nM、0.5μΜ至5μΜ、5μΜ至50μΜ、50μΜ至500μΜ和/或5mM至50mM。在一实施方案中，以0.05μM至50μM，或约0.5μM至5μM的浓度范围提供视黄酸用于培养本发明的细胞。一般而言，在适用于培养本发明的细胞的培养基中提供有效量的RAR激动剂。
在本发明的一实施方案中，该方法利用激活素受体样激酶(ALK)受体抑制剂作为小分子重编程因子。合适的ALK受体抑制剂包括主要抑制TGF-βI型受体ALK5、激活素结节受体ALK4和结节受体ALK7的那些。该类型的抑制剂的实例是3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-lH-吡唑-l-硫代甲酰胺(又称为A83-01；分子量＝421.52g/mol)和4-(5-苯并[l,3]二氧杂环戊烯-5-基-4-吡啶-2-基-lH-咪唑-2-基)-苯甲酰胺水合物、4-[4-(l,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(2-吡啶基)-lH-咪唑-2-基]-苯甲酰胺水合物、4-[4-(3,4-亚甲基二氧基苯基)-5-(2-吡啶基)-lH-咪唑-2-基]-苯甲酰胺水合物(又称为SB431542；分子量＝384.4g/mol)。A83-01强烈地抑制ALK4、5和7(IC50值分别为12nM、45nM和7.5nM)，并且仅微弱地抑制ALK1、2、3和6，并且似乎通过抑制Smad2磷酸化抑制TGFβ诱导的EMT(Tojo等人,2004)。该小分子还用于产生朝向如自我更新状态的小鼠ES细胞的大鼠和人iPS细胞(Li等人，2009)。用于本发明的合适的ALK受体抑制剂可以包括表6所示的那些。然而，本领域技术人员应该理解的是，表6中的列举并不详尽，并且其它小分子ALK受体抑制剂可能适用于本发明。ALK受体抑制剂的一实例是A83-01(3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-lH-吡唑-l-硫代甲酰胺；分子量＝421.5)。
表6小分子ALK受体抑制剂
Figure GDA0003172796610000201
本领域技术人员应该理解的是，有效量的ALK受体抑制剂可根据，例如，具体选择的ALK受体抑制剂或所使用的ALK受体抑制剂的组合变化。在实施方案中，使用的ALK受体抑制剂的范围可以为5nM至50mM。在一些实施方案中，使用的ALK受体抑制剂的范围可以为约5nM至50nM、50nM至500nM、0.5μΜ至5μΜ、5μΜ至50μΜ、50μΜ至500μΜ和/或5mM至50mM。在一实施方案中，以1nM至1mM、或约0.1μM至100μM，或约1至10μM的浓度范围提供A83-01用于培养本发明的细胞。一般而言，在适用于培养本发明的细胞的培养基中提供有效量的ALK受体抑制剂。
在本发明的一实施方案中，该方法利用胰腺十二指肠同源盒1(Pdxl)诱导剂作为小分子重编程因子。Pdxl，也称为胰岛素启动子因子1，是胰腺发育和β细胞成熟所必需的转录因子。本发明中使用的合适的Pdx1诱导剂可包括表7所示的那些。然而，本领域技术人员应该理解的是，表7中的列举并不详尽，并且其它小分子Pdxl诱导剂可能适用于本发明。Pdx1诱导剂的一实例是BRD 7552(甲基[2,3-O-双(苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基-氨基甲酰基)]-4-O-(4-乙氧基羰基-苯基氨基甲酰基)-α-D-吡喃葡萄糖苷；分子量＝711.63g/mol)。
表7小分子Pdxl诱导剂
Figure GDA0003172796610000211
本领域技术人员应该理解的是，有效量的Pdxl诱导剂可根据，例如，具体选择的Pdxl诱导剂或所使用的Pdxl诱导剂的组合变化。在实施方案中，使用的Pdxl诱导剂范围可以为5nM至50mM。在一些实施方案中，使用的Pdxl诱导剂范围可以为约5nM至50nM、50nM至500nM、0.5μΜ至5μΜ、5μΜ至50μΜ、50μΜ至500μΜ和/或5mM至50mM。在一实施方案中，以0.01μM至100μM，或约1μM至10μM的浓度范围提供BRD 7552用于培养本发明的细胞。一般而言，在适用于培养本发明的细胞的培养基中提供有效量的Pdxl诱导剂。
在本发明的一实施方案中，该方法利用促分裂原活化蛋白激酶激酶(MAPK/ERK激酶或MEK)抑制剂作为小分子重编程因子。MEK抑制剂是靶向MEK以阻断MEK(ERKl/2)信号通路的化合物。用于本发明的合适的MEK抑制剂可以包括表8所示的那些。然而，本领域技术人员应该理解的是，表8中的列举并不详尽，并且其它小分子MEK抑制剂可能适用于本发明。MEK抑制剂的一实例是SB 203580(4-(4’-氟苯基)-2-(4’-甲基亚磺酰基苯基)-5-(4’-吡啶基)-咪唑；分子量＝377.44g/mol)。
表8小分子MEK抑制剂
Figure GDA0003172796610000221
Figure GDA0003172796610000231
Figure GDA0003172796610000241
本领域技术人员应该理解的是，有效量的MEK抑制剂可根据，例如，具体选择的MEK抑制剂或所使用的MEK抑制剂的组合变化。在实施方案中，使用的MEK抑制剂的范围可以为5nM至50mM。在一些实施方案中，使用的MEK抑制剂的范围可以为约5nM至50nM、50nM至500nM、0.5μΜ至5μΜ、5μΜ至50μΜ、50μΜ至500μΜ和/或5mM至50mM。在一实施方案中，以0.1μM至100μM，或约1μM至10μM的浓度范围提供SB 203580用于培养本发明的细胞。一般而言，在适用于培养本发明的细胞的培养基中提供有效量的MEK抑制剂。
在本发明的一实施方案中，该方法利用切口抑制剂作为小分子重编程因子。用于本发明的合适的切口抑制剂可以包括表9所示的那些。然而，本领域技术人员应该理解的是，表9中的列举并不详尽，并且其它小分子切口抑制剂可能适用于本发明。切口抑制剂的一实例是DAPT(N-[(3,5-二氟苯基)乙酰基]-L-丙氨酰-2-苯基]甘氨酸-l,1-二甲基乙基酯；分子量＝300.44g/mol)。DAPT还阻断切口信号。
表9小分子切口抑制剂
Figure GDA0003172796610000242
Figure GDA0003172796610000251
本领域技术人员应该理解的是，有效量的切口抑制剂可根据，例如，具体选择的切口抑制剂或所使用的切口抑制剂的组合变化。在实施方案中，使用的切口抑制剂的范围可以为5nM至50mM。在一些实施方案中，使用的切口抑制剂的范围可以为约5nM至50nM、50nM至500nM、0.5μΜ至5μΜ、5μΜ至50μΜ、50μΜ至500μΜ和/或5mM至50mM。在一实施方案中，以0.05μM至50μM，或约0.5μM至5μM的浓度范围提供DAPT用于培养本发明的细胞。一般而言，在适用于培养本发明的细胞的培养基中提供有效量的切口抑制剂。
在本发明的一实施方案中，该方法利用切口抑制剂作为小分子重编程因子。用于本发明的合适的切口抑制剂可以包括表9所示的那些。然而，本领域技术人员应该理解的是，表9中的列举并不详尽，并且其它小分子切口抑制剂可能适用于本发明。切口抑制剂的一实例是DAPT(N-[(3,5-二氟苯基)乙酰基]-L-丙氨酰-2-苯基]甘氨酸-l,1-二甲基乙基酯；分子量＝300.44g/mol)。DAPT还阻断切口信号。
在本发明的一实施方案中，该方法利用骨形态生成蛋白(BMP)抑制剂作为小分子重编程因子。用于本发明的合适的BMP抑制剂可以包括表10所示的那些。然而，本领域技术人员应该理解的是，表10中的列举并不详尽，并且其它小分子切口抑制剂可能适用于本公开。BMP抑制剂的一实例是Dorsomorphin(6-[4-(2-哌啶-l-基乙氧基)苯基]-3-吡啶-4-基吡唑并[l,5-a]嘧啶；分子量＝399.49)。
表10小分子骨形态生成蛋白(BMP)抑制剂
Figure GDA0003172796610000261
本领域技术人员应该理解的是，有效量的BMP抑制剂可根据，例如，具体选择的BMP抑制剂或所使用的BMP抑制剂的组合变化。在实施方案中，使用的BMP抑制剂的范围可以为5nM至50mM。在一些实施方案中，使用的切口抑制剂的范围可以为约5nM至50nM、50nM至500nM、0.5μΜ至5μΜ、5μΜ至50μΜ、50μΜ至500μΜ和/或5mM至50mM。在一实施方案中，以0.5μM至500μM，或约5μM至50μM的浓度范围内提供BMP抑制剂用于培养本发明的细胞。一般而言，在适用于培养本文公开的细胞的培养基中提供有效量的BMP抑制剂。
在本发明的一实施方案中，该方法利用小分子重编程因子三碘甲状腺原氨酸(T3)；化学名称为3,3’,5-三碘代-L-甲状腺原氨酸，O-(4-羟基-3-碘代苯基)-3,5-二碘代-L-酪氨酸，又称为3,3’,5三碘甲状腺原氨酸，3,3’,5-三碘代-L-甲状腺原氨酸钠盐和碘塞罗宁；分子量＝650.97g/mol)，并且其类似物包括和反向T3。T3是一种参与人体中的包括生长发育、新陈代谢、体温和心率的许多生理过程的甲状腺激素。T3与甲状腺激素核受体结合，其反过来结合反应元素，并且激活或抑制多种基因的转录。人们认为这与β细胞的成熟有关。本领域技术人员应该理解的是，有效量的T3可根据，例如，所使用的小分子重编程因子抑制剂和经历重编程的具体细胞的具体组合变化。在实施方案中，使用的T3的浓度范围可以为5nM至50mM。在一些实施方案中，使用的T3的浓度范围可以选自约5nM至50nM、50nM至500nM、0.5μΜ至5μΜ、5μΜ至50μΜ、50μΜ至500μΜ和/或5mM至50mM。在一实施方案中，以5nMμΜ至0.5mM、或0.05μM至50μΜ、或约0.5μΜ至5μΜ的浓度范围提供T3用于培养细胞。一般而言，在适用于培养本发明的细胞的培养基中提供有效量的T3。
因此，在一实施方案中，定形内胚层诱导剂是IDE1。在一实施方案中，GSK抑制剂是氯化锂。在一实施方案中，PKC激活剂是吲哚内酰胺V。在一实施方案中，SSH抑制剂是环巴胺-KAAD。在一实施方案中，RAR激动剂是视黄酸。在一实施方案中，ALK受体抑制剂是A83-01。在一实施方案中，Pdx-1诱导剂是BRD 7552。在一实施方案中，MEK抑制剂是SB2033580。在一实施方案中，切口抑制剂是DAPT。在一实施方案中，BMP抑制剂是Dorsomorphin。
在其它实施方案中，小分子重编程因子可以是任何其它合适的小分子重编程分子，包括，例如，DNA甲基化酶抑制剂(例如RG108)和/或HDAC抑制剂(例如丁酸钠)。PCT/AU2012/001525(WO 2013/086570)中详细描述了RG108和其它合适的DNA甲基化酶抑制剂，以及类似地，丁酸钠和其它HDAC抑制剂，其内容通过引用并入本文。
在本发明的一实施方案中，初级诱导培养基包含有效量的至少一种选自由定形内胚层诱导剂、糖原合成酶激酶3(GSK3)抑制剂和维生素C组成的组中的小分子重编程因子。在一实施方案中，初级诱导培养基包含定形内胚层诱导剂、糖原合成酶激酶3(GSK3)抑制剂和维生素C。在个实施方案中，初级诱导培养基包含定形内胚层诱导剂。在个实施方案中，初级诱导培养基包含糖原合成酶激酶3(GSK3)抑制剂。在一实施方案中，初级诱导培养基包含维生素C。在一实施方案中，初级诱导培养基包含定形内胚层诱导剂和糖原合成酶激酶3(GSK3)抑制剂。在一实施方案中，初级诱导培养基包含糖原合成酶激酶3(GSK3)抑制剂和维生素C。在一实施方案中，初级诱导培养基包含定形内胚层诱导剂和维生素C。在一实施方案中，定形内胚层诱导剂是IDE1。在一实施方案中，GSK抑制剂是氯化锂。
因此，在一实施方案中，初级诱导培养基包含IDE1、氯化锂和维生素C。然而，在一个实施方案中，定形内胚层诱导剂不是小分子。在一实施方案中，定形内胚层诱导剂是激活素A或结节。因此，在一实施方案中，初级诱导培养基包含选自氯化锂和维生素C的小分子重编程因子，并且初级诱导培养基还包含激活素A或结节。在一实施方案中，初级诱导培养基还可包含GSK抑制剂，例如CH1R99021。
在本发明的个实施方案中，二级诱导培养基包含有效量的至少一种选自由PKC激活剂、音猬因子(SSH)抑制剂、视黄酸受体(RAR)激动剂、维生素C、激活素受体样激酶(ALK)受体抑制剂和Pdx1诱导剂组成的组中的小分子重编程因子。在一实施方案中，二级诱导培养基包含PKC激活剂、音猬因子(SSH)抑制剂、视黄酸受体(RAR)激动剂、维生素C、激活素受体样激酶(ALK)受体抑制剂、Pdx1诱导剂和骨形态生成蛋白(BMP)抑制剂。在一实施方案中，二级诱导培养基包含PKC激活剂。在一实施方案中，二级诱导培养基包含视黄酸受体(RAR)激动剂、维生素C和激活素受体样激酶(ALK)受体抑制剂。在一实施方案中，二级诱导培养基包含维生素C和激活素受体样激酶(ALK)受体抑制剂。在一实施方案中，二级诱导培养基包含PKC激活剂、音猬因子(SSH)抑制剂、视黄酸受体(RAR)激动剂、维生素C、激活素受体样激酶(ALK)受体抑制剂。在一实施方案中，二级诱导培养基包含PKC激活剂、音猬因子(SSH)拮抗剂、维生素C、激活素受体样激酶(ALK)受体抑制剂。在一实施方案中，二级诱导培养基包含维生素C。在一实施方案中，二级诱导培养基包含维生素C、RAR激动剂、SSH抑制剂、PKC激活剂和BMP抑制剂。在一实施方案中，二级诱导培养基包含维生素C、RAR激动剂和SSH抑制剂。
因此，在一实施方案中，二级诱导培养基包含吲哚内酰胺V。在一实施方案中，二级诱导培养基包含视黄酸、维生素C和A83-01。在一实施方案中，二级诱导培养基包含维生素C和A83-01。在一实施方案中，二级诱导培养基包含吲哚内酰胺V、环巴胺-KAAD、视黄酸、维生素C和A83-01。在一实施方案中，二级诱导培养基包含吲哚内酰胺V、环巴胺-KAAD、维生素C和A83-01。在一实施方案中，二级诱导培养基包含吲哚内酰胺V、环巴胺-KAAD、视黄酸、维生素C、A83-01和BRD7552。在一实施方案中，二级诱导培养基包含吲哚内酰胺V、环巴胺-KAAD、维生素C、A83-01和BRD7552。在一实施方案中，二级诱导培养基包含维生素C。在一实施方案中，二级诱导培养基包含维生素C、RA、环巴胺-KAAD、吲哚内酰胺V和dorsomorphin。在一实施方案中，二级诱导培养基包含维生素C、RA和环巴胺-KAAD。
在本发明的一实施方案中，三级诱导培养基包含有效量的至少一种选自由促分裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)抑制剂、维生素C和切口抑制剂组成的组中的小分子重编程因子。在一实施方案中，三级诱导培养基包含促分裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)抑制剂、维生素C和切口抑制剂。在一实施方案中，三级诱导培养基包含促分裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)抑制剂和维生素C。在一实施方案中，三级诱导培养基包含促分裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)抑制剂。在一实施方案中，三级诱导培养基包含维生素C。在一实施方案中，三级诱导培养基包含切口抑制剂。在一实施方案中，三级诱导培养基包含维生素C、RAR激动剂、SSH抑制剂、切口抑制剂、ALK受体抑制剂和三碘甲状腺原氨酸。在一实施方案中，三级诱导培养基包含维生素C、RAR激动剂、切口抑制剂、ALK受体抑制剂和三碘甲状腺原氨酸。在一实施方案中，三级诱导培养基包含维生素C、ALK受体抑制剂和三碘甲状腺原氨酸。在一实施方案中，三级诱导培养基包含维生素C和三碘甲状腺原氨酸。
因此，在一实施方案中，三级诱导培养基包含SB203580和维生素C。在一实施方案中，三级诱导培养基包含SB203580、维生素C和DAPT。在一实施方案中，三级诱导培养基包含维生素C、RA、环巴胺-KAAD、DAPT、A83-01和三碘甲状腺原氨酸。在一实施方案中，三级诱导培养基包含维生素C、RA、DAPT、A83-01和三碘甲状腺原氨酸。在一实施方案中，三级诱导培养基包含维生素C、A83-01和三碘甲状腺原氨酸。在一实施方案中，三级诱导培养基包含维生素C和三碘甲状腺原氨酸。
然而，应当理解的是，任何一种诱导培养基可包含本文所描述的或如PCT/AU2012/001525(WO 2013/086570)中所描述的任何其它小分子。
在一实施方案中，本发明的尿衍生细胞是从正常健康受试者的尿样获得的细胞。虽然不希望被理论束缚，但人们认为，尿衍生细胞可能来源于尿路系统，例如肾脏、输尿管、膀胱和/或尿道，并且通常是上皮细胞和/或纤维母细胞。尿衍生细胞在本文中也称为“尿细胞”。人尿衍生细胞，在本文称为HUC，可通过人细胞标记物人核抗原(HNA)的表达来表征，一些细胞表达CD13(肾细胞标记物)，和波形蛋白(纤维母细胞标记物)和/或E-钙粘蛋白(上皮细胞标记物)。这表明人尿衍生细胞可能是细胞的不均匀混合物。然而，本发明的尿衍生细胞可以是人或其它动物来源(例如，小鼠、大鼠、兔、猫、狗、马和非人灵长类动物)。在一实施方案中，虽然本领域技术人员将理解并非所有的HUC均将共表达所有这些细胞标记物，但HUC是对于细胞标记物物HNA、CD13、波形蛋白和E-钙粘蛋白呈阳性的异质细胞制剂。
与尿衍生细胞相比，本发明的诱导内胚层细胞可显示变化的形态，其中大多数细胞在初级诱导步骤之后呈现更圆的形态。此外，本发明的诱导内胚层细胞可表达细胞标记物Foxa2和Sox17，二者均为内胚层标记物。
本发明的诱导胰腺前体细胞可表达胰腺前体标记物Pdx1和NKX6.1，其中一些细胞具有胰岛细胞样形态。在一实施方案中，诱导胰腺前体细胞还表达NGN3和/或NKX2.2。Pdx1、NKX6.1、NGN3和NKX2.2是胰腺前体细胞标记物。
本发明的诱导β细胞具有上调水平的β细胞标志物胰岛素和/或C-肽，其中一些细胞具有胰岛细胞样形态。C-肽和胰岛素都是β细胞标记物。在一实施方案中，诱导β细胞分泌胰岛素。
可使用本领域技术人员已知的方法，例如在无菌PBS中分离尿液或任何诱导步骤后洗涤本发明的细胞；然而，本领域技术人员应理解的是，各种其它溶液或培养基将适用于洗涤细胞。
在一实施方案中，尿衍生细胞，例如在尿样离心后，从尿样的细胞团块中获得。在一实施方案中，然后，洗涤细胞并使其重新悬浮于合适的细胞培养基中，并任选地在诱导前扩增步骤中培养。因此，如本领域技术人员所熟知的，可使细胞重新悬浮并培养在适于培养原代细胞的任何组织培养基中。
在一实施方案中，在培养基中扩增尿衍生细胞，例如在包含杜氏改良伊格尔培养基(DMEM)/F-12、10％胎牛血清(FBS)、青霉素/链霉素(p/s)、诺曼克和50μl的来自REGM添加剂(REGM Singlequot kit)(hEGF、氢化可的松、肾上腺素、胰岛素、三碘甲状腺原氨酸、转铁蛋白、GA-1000(庆大霉素/两性霉素))的各种试剂的“HUCl培养基”中扩增。在一实施方案中，将尿衍生细胞在HUC1培养基中培养适当的时间段，例如两天；然而，本领域技术人员应该理解的是，其它时间段将是适合的，例如一天、三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、十天等。在一实施方案中，每日更换HUC1培养基。在一实施方案中，使尿衍生细胞重新悬浮并培养在如本文其它部分详述的包含肾上皮细胞基础培养基(REBM)、0.5％的FBS、p/s、50μl的来自REGM添加剂(hEGF、氢化可的松、肾上腺素、胰岛素、三碘甲状腺原氨酸、转铁蛋白、GA-1000(庆大霉素/两性霉素))的各种试剂的“HUC2培养基”中。然而，本领域技术人员应该理解的是，各种其它培养基可容易地替代用于培养尿衍生细胞的HUC2培养基。在一实施方案中，将尿衍生细胞在HUC2培养基中培养适当的时间段，例如一天、两天、三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、十天、十一天、十二天、十三天、十四天、三周、四周等。在一实施方案中，将尿衍生细胞在HUC2培养基中培养至出现细胞集落，例如一天至十四天，或四至八天。在一实施方案中，每日更换HUC2培养基。在一实施方案中，将尿衍生细胞最初在HUCl培养基中培养，然后在HUC2培养基中培养。在一实施方案中，将尿衍生细胞在HUC1培养基中培养2天，然后在HUC2培养基中培养至出现细胞集落，例如4至8天。然而，如本领域技术人员容易理解的，其它培养时间可能是合适的。此外，可在其它合适的细胞培养基中培养尿衍生细胞，如肾上皮细胞生长培养基(Lonza)或角质形成细胞无血清培养基(生命科技(LifeTechnologies))、小鼠胚胎纤维母细胞(MEF)培养基(含有1:1比例的10％胎牛血清(FBS)的杜氏改良伊格尔培养基(DMEM))。
在一实施方案中，在每个诱导步骤和任选的诱导前扩增步骤中培养细胞适当的时间段以促进如本文其它部分所述的本发明的细胞的扩增或诱导或重编程。如本领域技术人员所理解的，培养的时间段可根据被培养的细胞类型变化，并且在一实施方案中，在诱导步骤期间，将其重新编程因子用于该方法。本发明的第一、第二或第三时间段中的每一个，或者任选地，任选的诱导前扩增步骤的时间段可独立地选自例如，一天、二天、三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、十天、十一天、十二天、十三天、十四天、十五天、十六天、十七天、十八天、十九天或二十天。然而，在某些情况下，如本领域技术人员所理解的，时间段可以更长，例如约两周、三周、四周等。具体而言，本领域技术人员应该理解的是，在某些情况下，如不显著影响培养时间的结果，可在一定程度上改变培养时间的长短，例如改变一天，或两天，或三天，这取决于培养时间的长短。在一实施方案中，可根据要求或本领域技术人员所认为的最佳情况经常更换培养基。例如，可每天或每两天、每三天、每四天、每五天、每六天、每七天、每八天、每九天、每十天、每十一天、每十二天、每十三天、每十四天等更换培养基，或者可大约每三周、每四周等更换培养基。然而，在一实施方案中，在所述时间段不更换培养基。
应当理解的是，本文描述的第一、第二或第三时间段中的每一个可任选地被分成两个或多个时间部分，并且不同的诱导培养基可应用于给定时间的不同部分。
在一实施方案中，第一时间段是六天。在个实施方案中，第一时间段是七天。在一实施方案中，第一时间段是五天。
在一实施方案中，第二时间段是四天。在一实施方案中，第二时间段是七天。在一实施方案中，第二时间段是八天。在一实施方案中，第二时间段是九天。在一实施方案中，第二时间段是十天。在一实施方案中，第二时间段是十一天。在一实施方案中，第二时间段是十二天。
在一实施方案中，第二时间段由第一部分和第二部分组成。在一实施方案中，第二时间段的第一部分包括一天。然而，本领域技术人员应该理解的是，第一部分可包括两天、三天、四天、五天、六天等。因此，第二时间段的第二部分可包括第二段时间的剩余部分。在一实施方案中，第二时间段由第一部分、第二部分和第三部分组成。在个实施方案中，第二时间段的第一部分包括两天。然而，本领域技术人员应该理解的是，第一部分可包括一天、三天、四天、五天、六天等。在一实施方案中，第二时间段的第二部分包括两天。然而，本领域技术人员应该理解的是，第二部分可包括一天、三天、四天、五天、六天等。在一实施方案中，第二时间段的第三部分包括五天。然而，本领域技术人员应该理解的是，第一部分可包括一天、两天、三天、四天、六天、七天、八天、九天、十天、十一天、十二天等。
在一实施方案中，与第二时间段的第二部分相比，第二诱导步骤可在第二时间段的第一部分使用不同的二级诱导培养基，并且在相关的情况下，与第二时间段的第一或第二部分相比，第二时间段的第三部分可使用不同的二级诱导培养基。例如，在一实施方案中，于第二时间段的第一部分的二级诱导培养基可包含有效量的至少一种选自由PKC激活剂、音猬因子(SSH)抑制剂、视黄酸受体(RAR)激动剂、维生素C、激活素受体样激酶(ALK)受体抑制剂和Pdx1诱导剂组成的组中的小分子重编程因子。在一实施方案中，用于第二时间段的第二部分的二级诱导培养基可包含有效量的至少一种选自由PKC激活剂、音猬因子(SSH)抑制剂、维生素C、激活素受体样激酶(ALK)受体抑制剂和Pdx1诱导剂组成的组中的小分子重编程因子。在替代实例中，用于第二时间段的第一部分的二级诱导培养基可包含有效量的维生素C。在一实施方案中，用于第二时间段的第二部分的二级诱导培养基可包含有效量的至少一种选自由维生素C、RAR激动剂、SSH抑制剂、PKC激活剂和BMP抑制剂组成的组中的小分子重编程因子。在一实施方案中，用于第二时间段的第三部分的二级诱导培养基可包含有效量的至少一种选自和/或维生素C、RAR激动剂和SSH抑制剂的小分子重编程因子。然而，包含其它小分子重编程因子的二级诱导培养基可用于如本文其它部分所述的第二时间段的第一部分、第二部分或第三部分。
在一实施方案中，第三时间段是八天。在一实施方案中，第三时间段是九天。在一实施方案中，第三时间段是十天。在一实施方案中，第三时间段是十二天。在一实施方案中，第三时间段是十四天。在一实施方案中，第三时间段是21天。在一实施方案中，第三时间段是28天。然而，本领域技术人员应该理解的是，第三时间段可包括两天、三天、四天、五天、六天、七天、十一天、十三天、十五天、十六天、十七天、十八天、十九天、20天、22、23天、24天、25天、26天、27天、29天、30天、五周等。
在一实施方案中，第三时间段由第一部分和第二部分组成。在一实施方案中，第三时间段由第一部分、第二部分和第三部分组成。在一实施方案中，第三时间段的第一部分包括一天。在一实施方案中，第三时间段的第一部分包括两天。在一实施方案中，第三时间段的第一部分包括四天。然而，本领域技术人员应该理解的是，第一部分可包括三天、五天、六天等。因此，第三时间段的第二部分和/或第三部分可包括第三段时间的剩余时间。在一实施方案中，第三时间段的第二部分包括一天。在一实施方案中，第三时间段的第二部分包括两天。在一实施方案中，第三时间段的第二部分包括三天。在一实施方案中，第三时间段的第二部分包括四天。在一实施方案中，第三时间段的第二部分包括五天。然而，本领域技术人员应该理解的是，第三时间段的第二部分可包括六天、七天、八天等。在一实施方案中，第三时间段的第三部分包括14天。然而，本领域技术人员应该理解的是，第三时间段的第三部分可包括一天、两天、三天、四天、六天、七天、八天、九天、十天、十一天、十二天，十三天、十五天、十六天、十七天、十八天、十九天、20、22天、23天、24天、25天、26天、27天、29天、30天、五周等。
在一实施方案中，与第三时间段的第二部分相比，第三诱导步骤可在第三时间段的第一部分使用不同的三级诱导培养基，并且在相关的情况下，与第三时间段的第一或第二部分相比，第三时间段的第三部分使用不同的三级诱导培养基。例如，在一实施方案中，用于第三时间段的第一部分的三级诱导培养基可包含有效量的至少一种选自由维生素C、RAR激动剂、SSH抑制剂、切口抑制剂、ALK受体抑制剂和三碘甲状腺原氨酸组成的组中的小分子重编程因子。在一实施方案中，用于第三时间段的第二部分的三级诱导培养基可包含有效量的至少一种选自由维生素C、RAR激动剂、切口抑制剂、ALK受体抑制剂和三碘甲状腺原氨酸组成的组中的小分子重编程因子。在一实施方案中，用于第三时间段的第三部分的三级诱导培养基可包含有效量的至少一种选自由维生素C、ALK受体抑制剂和三碘甲状腺原氨酸组成的组中的小分子重编程因子。在一实施方案中，用于第三时间段的第三部分的三级诱导培养基可包含有效量的至少一种选自由维生素C和三碘甲状腺原氨酸组成的组中的小分子重编程因子。然而，包含其它小分子重编程因子的三级诱导培养基可用于如本文其它部分所述的第三时间段的第一部分、第二部分或第三部分。
应当理解的是，在不脱离本发明的范围的情况下，本发明的任何(或全部)诱导步骤的时间段均可变化。此外，应当理解的是，在不脱离本发明的范围的情况下，诱导步骤的时间段中的任何一个(或全部)可被分成多个部分，其中与时间段的第二部分相比，并且任选地，与时间段的第三部分等相比，用于时间段的第一部分的不同的诱导培养基包含如本文所述的不同的至少一种小分子重编程因子(或其组合)。
在本发明中，可将有效量的至少一种小分子重编程因子中的每一种加入到“基础”培养基中以形成如本文所述的诱导培养基。在诱导步骤中以及任何进一步地传代或培养悬浮液中的本发明的诱导细胞时使用的基础培养基可以是支持特定细胞类型生长的任何合适的培养基，例如本领域技术人员熟知的那些。在一实施方案中，基础培养基包含补充有2％FBS的RPMI。在一实施方案中，基础培养基包含补充有L-谷氨酰胺和B27的DMEM。在一实施方案中，基础培养基包括补充有孕酮、腐胺、层粘连蛋白、烟酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠和B27的DMEM。在一实施方案中，基础培养基包括补充有bFGF、D-葡萄糖、NaHCO3、BSA、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺(ITS-X)和谷氨酰胺(Glutamax)(L-丙氨酸-L-谷氨酰胺二肽)的MCDB131培养基。在一实施方案中，基础培养基包括MCDB131培养基、EGF、D-葡萄糖、NaHCO3、BSA、ITS-X 1:200，谷氨酰胺和肝素。在一实施方案中，基础培养基包括补充有10％FBS的CMRL 1066。所有这些介质和补充剂均可购得，并且是本领域技术人员所熟知的。然而，本领域技术人员应理解的是，各种其它培养基将适用于培养本发明的细胞，并且如本领域技术人员所理解的，在不脱离本发明的范围的情况下，还可向基础培养基添加各种其它补充剂以优化细胞的生长。
在一实施方案中，在初级诱导培养基中使用的基础培养基是补充有2％FBS的RPMI。然而，如本领域技术人员所理解的，其它培养基可能适合作为用于诱导尿衍生细胞成为内胚层样细胞的基础培养基。在一实施方案中，在二级诱导培养基中使用的基础培养基是补充有L-谷氨酰胺和B27的DMEM。在一实施方案中，在二级诱导培养基中使用的基础培养基是补充有bFGF、D-葡萄糖、NaHCO3、BSA、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺(ITS-X)和谷氨酰胺(L-丙氨酸-L-谷氨酰胺二肽)的MCDB131培养基。然而，如本领域技术人员所理解的，其它培养基可能适合作为用于诱导内胚层样细胞成为胰腺前体样细胞的基础培养基。在一实施方案中，在三级诱导培养基中使用的基础培养基是补充有孕酮、腐胺、层粘连蛋白、烟酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠和B27的DMEM。在一实施方案中，在三级诱导培养基中使用的基础培养基是MCDB131培养基、EGF、D-葡萄糖、NaHCO3、BSA、ITS-X 1:200，谷氨酰胺和肝素。在一实施方案中，在三级诱导培养基中使用的基础培养基是补充有10％FBS的CMRL 1066。然而，如本领域技术人员所理解的，例如，其它培养基可能适合于将胰腺前体样细胞诱导成β样细胞。
在本发明的一实施方案中，将获得的诱导β细胞在如本文所述的三级诱导培养基中培养。然而，如本领域技术人员所理解额，其它培养基可适合于培养诱导β细胞。
在一实施方案中，在存在至少一种小分子重编程因子的情况下诱导本发明的细胞的各个步骤可任选地在单个诱导培养周期中独立地进行，包括，例如，在包含至少一种小分子重编程因子或其组合的培养基中进行第一次培养细胞，然后在不含至少一种小分子重编程因子或其组合的相同或不同的合适培养基中进行至少第二次培养。在一实施方案中，诱导周期包括在存在至少一种如上所述的小分子重编程因子的情况下进行的第一次培养，然后是在不含小分子重编程因子的培养基中进行的第二次和第三次培养。应当理解的是，可根据需要任意地重复这些诱导周期中的每一个。
本发明的诱导β细胞可有利地用于产生胰岛素。实际上，最终可以将本发明的诱导β细胞用于个性化细胞疗法的方法中以治疗与胰岛素缺陷相关的疾病，如糖尿病。或者，本发明的诱导β细胞可有利地用于筛选用于治疗糖尿病的候选药物。本领域技术人员将理解的是，本发明的诱导β细胞也可具有其它用途。
在第二方面中，本发明提供了一种从尿衍生细胞产生诱导内胚层细胞的方法，所述方法包括：
(a)从受试者的尿样中获得尿衍生细胞；和
(b)通过在初级诱导培养基中培养所述尿衍生细胞一第一时间段来诱导步骤(a)中获得的尿衍生细胞，以获得诱导内胚层细胞，所述初级诱导培养基包含有效量的至少一种小分子重编程因子。
本发明的诱导内胚层细胞可有利地被转分化为胰腺、肝、肠和/或肺细胞谱系。
在一实施方案中，该方法包括使用本领域技术人员已知的任何方法将获得的诱导内胚层细胞诱导为胰腺前体细胞的另外步骤。例如，可使用D’Amour等人(2006)、Li等人(2014)或Pagliuca等人(2014)中描述的方法诱导内胚层细胞成为诱导胰腺前体细胞。
在一实施方案中，该方法包括使用本领域技术人员已知的任何方法将获得的诱导内胚层细胞诱导成为诱导胰腺前体细胞的其它步骤，并且还包括使用本领域技术人员已知的任何方法将诱导胰腺前体细胞诱导成为诱导β细胞的其它步骤。例如，可使用本领域技术人员已知的任何方法，采用在β细胞中描述的方法将内胚层细胞诱导成为诱导胰腺前体细胞。例如，可使用D’Amour等人(2006)、Li等人(2014)或Pagliuca等人(2014)中描述的方法将诱导内胚层细胞诱导成为诱导β细胞。
在第三方面中，本发明提供了一种从尿衍生细胞产生诱导胰腺前体细胞的方法，所述方法包括：
(a)从受试者的尿样中获得尿衍生细胞；
(b)通过在本文所述的初级诱导培养基中培养所述尿衍生细胞来诱导步骤(a)中获得的尿衍生细胞，以获得诱导的内胚层细胞；和
(c)通过在本文所述的二级诱导培养基中培养所述诱导内胚层细胞来诱导步骤(b)中获得的诱导内胚层细胞，以获得诱导胰腺前体细胞。
本发明的诱导胰腺前体细胞可有利地用于，例如，产生功能性胰岛细胞簇或潜在地人工胰以治疗疾病(如I型或II型糖尿病)或基因治疗应用。本发明的诱导胰腺前体细胞可替代地用于促进胰腺前体细胞生物学和/或分化和/或用于药物开发和发现的研究。
在一实施方案中，该方法包括使用本领域技术人员已知的任何方法将获得的诱导胰腺前体细胞诱导成为诱导β细胞的其它步骤。例如，可使用D’Amour等人(2006)、Li等人(2014)或Pagliuca等人(2014)中描述的方法将诱导内胚层细胞诱导成为诱导β细胞。
在第四方面中，本发明提供了一种从内胚层细胞产生诱导胰腺前体细胞的方法，所述方法包括：
获得内胚层细胞；和
通过在本文所述的二级诱导培养基中培养所述内胚层细胞来诱导获得的诱导内胚层细胞，以获得诱导胰腺前体细胞。
在一实施方案中，可在从受试者中分离之后获得内胚层细胞，或者可通过本领域技术人员已知的任何手段诱导它们。
在第五方面中，本发明提供了一种从胰腺前体细胞产生诱导β细胞的方法，所述方法包括：
获得胰腺前体细胞；和
通过在本文所述的三级诱导培养基中培养所述胰腺前体细胞一段时间来诱导获得的胰腺前体细胞，以获得诱导β细胞。
在一实施方案中，可在从受试者中分离之后获得胰腺前体细胞，或者可通过本领域技术人员已知的任何手段诱导它们。
根据情况，可使用本文针对本发明的第一方面所述的实施方案来进行第二、第三、第四和第五方面的方法。
在第六方面中，本发明提供了使用本公开发明的第一、第二、第三、第四或第五方面的方法获得的细胞。
下文将参考以下非限制性实施例和附图描述本发明。
实施例
实施例1人尿细胞(HUC)的分离和表征
材料和方法
培养基
HUC1培养基-50ml的HUC1，所述HUC1包含44.15ml的杜氏改良伊格尔培养基(DMEM)/F-12(英杰公司目录号15140-122(Invitrogen Cat No 15140-122))、5ml的胎牛血清(FBS；生命技术公司)、0.5ml的青霉素/链霉素(p/s；50单位/ml的青霉素，50μg/ml的链霉素、100μl的50μg/ml的诺曼克(normacin)(英杰公司目录号ant-nr-2)和50μl的来自REGM添加剂(龙沙公司目录号CC-4127(Lonza CatNo CC-4127)；即，hEGF、氢化可的松、肾上腺素、胰岛素、三碘甲状腺原氨酸、转铁蛋白，GA-1000(其包含30mg/ml庆大霉素和15μg/ml的两性霉素)和FBS)的各种试剂。
HUC2培养基-50ml的HUC2培养基，所述HUC2培养基包含48.95ml的肾上皮细胞基础培养基(REBM；无生长因子)(龙沙公司目录号CC-3191)、0.25ml的FBS、0.5ml的p/s、10μl的50μg/ml的诺曼克和50μ1的如上所述的七种添加剂试剂中的每一种。
人尿细胞的分离和初始诱导前培养
从35岁的人类男性供体(“M-35”)和37岁的人类女性供体(“F-37”)采集尿样，样品体积通常为150-200ml。然后将样品转移到50ml的管中，并在室温下以400g离心10分钟。然后小心弃去上清液，在管中留下约1ml或更少的尿液。使含有人尿细胞(HUC)的团块单独地重新悬浮，并将来自相同样品采集的所有重悬浮团块汇集到单个50ml的管中。接下来，如上所述，加入约10ml的含有诺曼克和青霉素/链霉素的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，以防止存在于尿道中的污染物真菌或兼性细菌生长。然后，将样品再次以400g离心10分钟，并小心地弃去上清液，从而仅留下约0.2ml的样品。向剩余样品中加入约1ml的HUCl培养基以重悬浮细胞团块。然后，将约0.25ml的细胞等分接种到预先用0.1％明胶(西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich))涂覆的4孔板(培养皿(Nunc))的各个孔中；在37℃下温育30分钟)，并在37℃下培养第1天(D1)和第2天(D2)。在第3天(D3)，将HUC1培养基替换为HUC2培养基，然后每天更换(使用HUC2培养基)直至出现细胞集落(通常为4至8天)。
免疫细胞化学(ICC)
用PBS洗涤来自集落的细胞并用4％多聚甲醛固定10min。在用PBS进一步洗涤2次(2X)后，然后用0.1％的曲拉通100(Triton X-100)将固定的细胞透化20min。然后将透化的细胞用PBS洗涤两次，并在含有1％FBS和4％牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液中封闭1小时。将一级抗体(primary antibodies)(如表11所示)在封闭缓冲液中稀释并在室温下施用1小时或在4℃下过夜。然后用PBS将细胞洗涤三次，并在室温下将10μg/ml的4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)荧光染料涂覆于合适的荧光二级抗体(secondary antibodies)(1:1000，Cy3或Alexa-488，参见表12)1小时。
表11免疫细胞化学中使用的一级抗体
Figure GDA0003172796610000371
Figure GDA0003172796610000372
表12免疫细胞化学中使用的二级抗体
名称 目录号 来源
驴抗小鼠IgG488 715-225-150 杰克逊(Jackson)免疫研究实验室
驴抗小鼠IgGcy3 715-225-152 杰克逊免疫研究实验室
驴抗兔IgG488 711-225-152 杰克逊免疫研究实验室
驴抗兔IgGcy3 711-165-152 杰克逊免疫研究实验室
驴抗羊IgG488 713-225-147 杰克逊免疫研究实验室
驴抗羊IgGcy3 713-225-147 杰克逊免疫研究实验室
HUC的表征
如上文所述，通过ICC检验人类核抗原(HNA；人类细胞标记物)、CD13(肾小管细胞标记物)、波形蛋白(纤维母细胞标记物)和E-钙粘蛋白(上皮细胞标记物)的细胞表达。
结果和讨论
从人尿样中分离细胞并进行表征。结果如图1所示。具体而言，图1显示HUC-M-35细胞是HNA阳性的(确认细胞是人源的)，并且一些细胞对于CD13是阳性的(表明至少一些细胞是肾细胞)。还发现许多HUC-M-35细胞表达纤维母细胞标记物波形蛋白，且一些细胞表达上皮细胞标记物E-钙粘蛋白(图2)；这表明HUC-M-35培养物包含混合物细胞。类似地，P6处的HUC-F-37细胞为CD13阳性、HNA阳性、E-钙粘蛋白阳性和波形蛋白阳性。
实施例2采用激活素A、氯化锂和维生素C进行初级诱导后的细胞的表征
材料和方法
初级诱导
根据实施例1所述制备HUC-M-35P5细胞，然后在含有RPMI 1640培养基(生命技术公司，目录号1875-085(LifeTechnologies，Cat No.1 1875-085))、0.2％FBS、100ng/ml的激活素A(重组人/小鼠/大鼠激活素A，338-AC-010)，R&D系统)、1mM的LiCl(西格玛奥德里奇有限责任公司，目录号L4408(Sigma-Aldrich Pty.Ltd，Cat No.L4408))、0.2mM的维生素C(西格玛奥德里奇有限责任公司，目录号A4403)和p/s(如上文所述)的初级诱导培养基中在基质凝胶涂覆的孔(GeltrexTM LDEV-Free，hESC-认证，A1413302，生命技术公司)上以5x104/cm2的密度培养六天(每两天更换一次)。然后，表征培养的细胞；具体地，通过相衬显微技术检查细胞形态，并且在初级诱导之前和之后，通过ICC比较Foxa2(内胚层细胞标记物)和Sox17(内胚层细胞标记物)的表达。
结果和讨论
如上文所述在初级诱导培养基中培养HUC-M-35P5细胞。发现细胞形态发生明显变化(参见图3，图中对P6处的HUC-M-35衍生细胞与初级诱导后的相同细胞的形态进行了对比)，表明该细胞不再是尿细胞。具体地，在诱导之前，尿细胞包含细胞混合物，一些细胞具有圆形形态，一些具有多角形形态，一些具有梭状形态。在初级诱导步骤后，大多数细胞的形态是圆形的。根据初级诱导之前和之后的HUC-M-35衍生细胞的荧光显微照片，发现两种类型的细胞对于内胚层标记物Sox17和Foxa2是阳性的。然而，Soxl7/Foxa2阳性细胞数量在初级诱导后显著增加，表明初级诱导方案上调了这些标记物。图4显示初级诱导方案有助于将Sox17的表达从约75％的细胞增加到约95％的细胞，并且将Foxa2的表达从约12％增加到约89％。结果表明，初级诱导步骤将人尿细胞诱导成为内胚层细胞。
实施例3采用激活素A、氯化锂、维生素C、ChIR99201、毛喉素、丁酸钠和RG108进行初级诱导后的细胞的表征
材料和方法
初级诱导
如实施例1所述制备HUC-M-35P5细胞，然后使用实施例2中所描述的初级诱导方法诱导，除了该实施例中描述的初级诱导培养基的内容物外，初级诱导培养基在该情况下包括小分子ChIR99201(CH；3μM)、毛喉素(F；10μM)、丁酸钠(NaB；0.2mM)和RG108(RG；0.04μM)(全部来自Stemgent股份有限公司)。此外，将初级诱导步骤进行七天而非六天。还进行了不含小分子的初级诱导培养基的比较诱导。如实施例2所述，在初级诱导步骤之前和之后，检验细胞的Foxa2表达。
结果和讨论
如实施例2中所描述的在含有激活素A、氯化锂和维生素C的初级诱导培养基中七天后，91.8％的细胞对Foxa2是阳性的。当初级诱导培养基包括小分子CH、F、NaB和RG时，88.5％的细胞是Fox2a阳性的。该结果表明，在测试的组合中，额外的小分子ChIR99201、毛喉素、丁酸钠和RG 108抑制从尿细胞诱导内胚层细胞。
实施例4用吲哚内酰胺V的二级诱导后细胞的表征
材料和方法
二级诱导
使用实施例2所描述的初级诱导方案制备HUC-M-35P5细胞。然后，如上文所述，将细胞在含有DMEM、330nm的吲哚内酰胺V、1x2mM的L-谷氨酰胺(生命科学公司，目录号25030-081(Life Technologies，Cat No.25030-081))和1xB27(生命科学公司，目录号17504044)和p/s的二级诱导培养基中培养四天。通过相衬显微技术检验所得细胞的形态。
结果和讨论
在二级诱导后，观察到大多数细胞具有圆形形态，并且一些细胞似乎具有胰岛细胞形态。
实施例5使用吲哚内酰胺V、视黄酸、维生素C和A83-01进行二级诱导后的细胞的表征
材料和方法
二级诱导
使用实施例2中描述的初级诱导方案诱导HUC-M-35P5细胞。然后，将细胞在实施例4中所述的二级诱导培养基中培养，此外，在2μM的视黄酸(RA)、0.2mM的维生素C(VC)和2.5mM的A83-01中培养一(1)天，然后在0.2mM的维生素C和2.5μM的A83-01中培养7天。通过相衬显微技术评价所得细胞的形态。
结果和讨论
典型的所得细胞的形态如图5A和5B所示。在二级诱导方案之后，清楚地观察到具有胰岛样形态的细胞，其中可见不同类型的胰岛形态。
实施例6二级诱导后，用pdx1-cy3-胰岛素-488慢病毒感染的细胞的表征
材料和方法
慢病毒感染
在Pdx1启动子的控制下，Pdx1-cy3-胰岛素-488慢病毒(Szabat等人，2009)编码与荧光标记物(Cy3)融合的胰岛素。根据实施例5所描述的，诱导HUC，然后在含有10mg/ml的聚凝胺的DMEM中，通过在存在50μl的Pdx1-cy3-胰岛素-488慢病毒的情况下培养细胞24小时，对其进行感染。
结果和讨论
Pdx1是胰腺转录因子，因此是胰腺细胞标记物。如图6所示，在该实施例中诱导的细胞具有胰岛细胞形态。此外，图6B显示强荧光染色，表明Pdx启动子在细胞中是有活性的并且驱动慢病毒表达的胰岛素-488融合基因的表达。这表明细胞是胰腺样(pancreatic-like)的。
实施例7采用吲哚内酰胺V进行二级诱导后的细胞的表征
材料和方法
初级和二级诱导
如实施例1所述制备细胞，然后如实施例2所述进行初级诱导，然后如实施例5所述进行二级诱导。然后，如实施例1所述表征细胞。具体地，通过相衬显微技术检验细胞形态，并检验NKX6.1(胰腺前体细胞标记物)和PDX1(胰腺前体细胞标记物)的表达。
结果和讨论
观察所得细胞以表达胰腺前体标记物PDX1和NKX6.1。这再次表明细胞是胰腺样的。
实施例8采用SB203580和维生素C进行三级诱导后的细胞的表征
材料和方法
三级诱导
如实施例1所述制备细胞，然后如实施例2所述进行初级诱导，然后如实施例5所述进行二级诱导。然后，将细胞在含有DMEM、20nm的孕酮、100μM的腐胺(西格玛奥德里奇有限责任公司，目录号P-5780(Sigma-Aldrich Pty Ltd，Cat No.P-5780))、1μg/ml的层粘连蛋白(西格玛奥德里奇有限责任公司，目录号L2020-1MG)、10mm的烟酰胺(西格玛奥德里奇有限责任公司，目录号N-3376)、25μg/ml的胰岛素(西格玛奥德里奇有限责任公司，目录号1-1882)、50μg/ml的转铁蛋白(西格玛奥德里奇有限责任公司，目录号T1147)、30nM的亚硒酸钠(西格玛奥德里奇有限责任公司，目录号S-5261)、1x B27、5μm的SB203580(西格玛奥德里奇有限责任公司，目录号S8307)和0.2mM的维生素C和p/s(如上详述)的三级诱导培养基中培养九天。通过检验胰岛素(β细胞标记物)和C-肽(β细胞标记物)的表达来表征细胞。
结果和讨论
在所得细胞中，一些细胞清楚地表达β细胞标记物胰岛素(41％的细胞)，而一些细胞表达C-肽(36.5％的细胞)(图7)。这些结果表明细胞现在是β样的。
实施例9采用IDEl替代激活素A的进行替代初级诱导后的细胞的表征
材料和方法
初级诱导
如实施例2所述分离和培养HUC-M-35和HUC-F-35细胞并进行初级诱导，除了初级诱导培养基替代为诱导剂定形内胚层IDE1(Borowiak等人，2009)用于激活素A之外。即，初级诱导培养基含有RPMI 1640培养基、0.2％FBS、100μM的IDE1(乔马生物科学有限责任公司目录号4015(Jomar Bioscience Pty Ltd，Cat No 4015))、1mM的LiCl和0.2mM的维生素C。将细胞在该培养基中培养6天。评价诱导的细胞的内胚层细胞标记物Foxa2和Sox 17的表达。
结果和讨论
发现100％的来自HUC1-M-35和HUC-F-35细胞的细胞分别表达Foxa2和Sox17。这表明使用IDE1代替激活素A的初级诱导方案成功地将细胞诱导成为内胚层样。
实施例10首先使用环巴胺-KAAD、吲哚内酰胺V、视黄酸、维生素C、A83-01和BRD7552，再使用环巴胺-KAAD、吲哚内酰胺V、维生素C、A83-01和BRD 7552进行替代二级诱导后的细胞的表征
材料和方法
二级诱导A
使用实施例9中描述的初级诱导方案诱导HUC-M-35细胞。然后，将细胞在含有DMEM、0.25μM的环巴胺-KAAD(乔马生物科学有限责任公司，目录号ab 142146(SapphireBioscience Pty Ltd，Cat No ab 142146))、330nm的吲哚内酰胺V、1x2mM的L-谷氨酰胺、1xB27、2μM的视黄酸(RA)、0.2mM的维生素C(VC)、2.5μM的A83-01和5μM的BRD 7552的二级诱导培养基中(pH调节至7.4)培养一天。随后，将细胞在含有DMEM、0.25μM的环巴胺-KAAD、330nm的吲哚内酰胺V、1x L-谷氨酰胺、1x B27、0.2mM的维生素C、2.5μM的A83-01和5μM的BRD7552的另一二级诱导培养基中(pH调节至7.4)培养3天。利用ICC通过Nkx6.1和PDx1的表达来表征细胞。
二级诱导B
在替代实验中，使用实施例9中描述的初级诱导方案诱导细胞。然后，将细胞在含有DMEM、0.25μM的环巴胺-KAAD、330nm的吲哚内酰胺V、1x 2mM的L-谷氨酰胺、1x B27、2μM的视黄酸(RA)、0.2mM的维生素C(VC)、2.5μM的A83-01和5μM的BRD 7552的二级诱导培养基中(pH调节至7.4)培养一天。然后，将细胞在含有DMEM、0.25μM的环巴胺-KAAD、330nm的吲哚内酰胺V、1x L-谷氨酰胺、1xB27、0.2mM的维生素C、2.5μM的A83-01和5μM的BRD 7552的另一二级诱导培养基中(pH调节至7.4)培养六天。
结果和讨论
来自二级诱导方案的所得细胞表达胰腺前体标记物NKx6.1和Pdx1。这表明，当二级诱导方案包括环巴胺-KAAD时，衍生自人尿细胞的细胞在所述的初级诱导和二级诱导后是胰腺样的。
实施例11采用SB203580、维生素C和DAPT的进行替代三级诱导后的细胞的表征
材料和方法
三级诱导
如实施例1所述，将HUC-F-37和HUC-M-35细胞(独立地)分离并培养，并如实施例9所述进行初级诱导，然后如实施例10所述进行二级诱导。然后，将细胞在由DMEM、20nm的孕酮、100μl的腐胺、1μg/ml的层粘连蛋白，10mm的烟酰胺、25μg/ml的胰岛素、50μg/ml的转铁蛋白、30nM的亚硒酸钠、1xB27、5μm的SB203580、0.2mM的维生素C和1μM的DAPT(也称为GSI-IX、LY-374973、N-[2S-(3,5-二氟苯基)乙酰基]-L-丙氨酰-2-苯基-l,l-二甲基乙基酯-甘氨酸；指示试剂(Reagents Direct))组成的三级诱导培养基(具有的pH为7.4)中培养9天。如实施例1所述表征细胞。具体地，通过相衬显微技术检验细胞形态，通过ICC比较C-肽(β细胞标记物)、胰岛素(β细胞标记物)和DAPI的表达。
结果和讨论
如图8所示，来自HUC-F-37的一些细胞在三次诱导期间死亡，其它细胞呈现胰岛样形态，其与呈β样的细胞一致。图9A显示约100％的细胞表达β细胞标记物c-肽，图9B显示约100％的细胞表达胰岛素。因此，这些细胞是β样。然而，图10是图9中的相同培养皿的不同区域的显微照片。从图10可以显然看出，结果在整个培养皿中不一致，其中一些细胞是C-肽和胰岛素阴性的。这表明可能存在混合群体的细胞。当检验源至HUC-M-35的细胞时，观察到类似的结果。具体地，可看到一些胰岛样细胞，观察到C-肽阳性和胰岛素阳性细胞。
实施例12替代方案和来自上述实施例的结论
材料和方法
确定来自上述实施例的优化方案如下。如实施例1所述，获得HUC细胞并进行培养，并以5xl04/cm2的密度接种在基质凝胶涂覆的培养皿上，然后使用下面的诱导方案培养：
初级诱导(6天)：
·培养基：RPMI+0.2％FBS；
·小分子重编程因子：100μΜIDE1、1mM LiCl、0.2mM维生素C(VC)；
二级诱导(步骤1，1天)
·培养基-DMEM+lxL-谷氨酰胺+lxB27；
·小分子重编程因子：0.25μΜ的环巴胺-KAAD、330nm的吲哚内酰胺V、2μΜ的RA、0.2mM的VC、2.5μΜ的A83-01、5μΜ的BRD 7552；然后二级诱导(步骤2，6天)
·培养基：DMEM+1xL-谷氨酰胺+1xB27(pH7.4)；
·小分子重编程因子：0.25μΜ环巴胺-KAAD、330nM吲哚内酰胺V、0.2mM VC、2.5μΜA83-01、5μΜBRD 7552；
三级诱导(9天)：
·培养基：DMEM+20nM孕酮+100μK腐胺+1μg/ml层粘连蛋白+10mM烟酰胺+25μg/ml胰岛素+50ug/ml转铁蛋白+30nM亚硒酸钠+1xB27，pH7.4；
·小分子重编程因子：5μΜ的SB203580+0.2mM VC+1μΜDAPT。
结果和讨论
在初级诱导后，所得诱导的细胞表达非常高水平的Sox17和Foxa2，高达100％的细胞是Sox17和Fox2a阳性。激活素A可在初级诱导培养基中被IEDl替代。
在二级诱导后，大多数细胞表达NKX6.1和Pdx1，而不表达NGN3。因此，可能需要较长的诱导时间以进一步优化结果。
三级诱导后，诱导细胞形成胰岛样形态，且一些细胞为胰岛素和C-肽阳性。预计这些细胞是胰岛素分泌的。
实施例13替代方案的独立验证
材料和方法
由另一机构的不同研究人员重复实施例中描述的方法，除了在明胶涂覆的板上培养细胞之外，具体使用实施例12中描述的诱导方案。HUC细胞获自35岁的人类女性(F35)和32岁的人类女性(F32)。当细胞密度达到5xl04细胞/cm2时，开始初级诱导。培养中的HUC细胞(即，未诱导的)用作阴性对照。如实施例1所述，利用ICC检验的细胞特性。
定量RT-PCR
使用具有柱上DNA消化(on-column DNA digestion)的RNA提取试剂盒(RNeasyMini Kit)(凯杰(Qiagen))提取全部的RNA。通过上标III指导cDNA合成系统(SuperscriptIII Direct cDNA Synthesis System)(生命技术公司)将全部的RNA(500ng)转化为cDNA。使用表13和标准方法中所述的引物进行PCR。使用小鼠神经形成和NSC PCR阵列(凯杰)进行RT分析器PCR阵列。
表13 PCR引物
Figure GDA0003172796610000441
Figure GDA0003172796610000451
结果和讨论
尿衍生细胞系的产生
在p0处观察到两种类型的细胞，但当细胞集落混合时(从p1)，类型II的细胞变得占优势。在早期的传代，大多数细胞具有小圆形或三角形形态，而大圆形形式的细胞在较高的传代(大于p5至p20)处产生。因此，通常使用从p5到p10的细胞。所获得的HUC的特征与上述尿衍生细胞系相似。
初级诱导
如通过相衬显微技术可见，初级诱导后，一些细胞聚集。这些聚集体一直维持至三步诱导过程。此外，在整个三步诱导方案中，细胞生长良好。检验初级诱导后的细胞用于具有抗-FOXA2和抗-SOX17抗体的定形内胚层细胞标记物。在处理的细胞中，FOXA2和SOX17都被强烈表达，但是这些标记物在对照细胞中还被弱表达。因此，将对初级诱导之前和之后的细胞的mRNA样品进行检验，以证实上调(upregulation)。
二级诱导
在二级诱导的第六天，细胞聚集体的大小明显大于二级诱导的第二天。细胞生长良好。对于使用PDX1和NKX6.1的特异性抗体，诱导和主要聚集的细胞被强烈染色。对于细胞标记物PDX1、NKX6.1和NGN3，细胞聚集体强烈染色。阴性对照细胞对于PDX1是阴性的，并且对于NKX6.1和NGN3呈弱阳性，并且没有细胞聚集。
三级诱导
存在大量聚集的细胞组，其在三级诱导过程之后仍保持聚集。一些聚集的细胞倾向于在第三步中分离，这与Pennarossa等人，2013中所示的那些细胞类似。当用4％的PFA固定它们时，大量细胞分离。这可能是因为明胶被用作涂覆材料，尽管也在基质凝胶涂覆的培养皿上进行了诱导。在三级诱导步骤后，检验胰岛素表达和C-肽。一些细胞(36.6±5％)表达胰岛素和C-肽(图11)。还使用替代的抗胰岛素抗体(H-86，圣克鲁兹，目录号sc-9168(H-86,Santa Cruz,Cat No.sc-9168))检验胰岛素表达。因此，在三级诱导后，通过不同类型的人胰岛素特异性抗体检测细胞中的胰岛素表达。定量RT-PCR结果还表明，与阴性对照细胞相比，三级诱导后的细胞进入胰腺谱系(图12)。诱导细胞中的PDX1、Ngn3和ISL(另一种β细胞标记物)的mRNA表达水平上调，表明诱导细胞进入了胰腺谱系。
实施例14C-肽释放测试
材料和方法
如实施例12所述诱导HUC细胞。除去培养基，并用PBS冲洗细胞3次，然后用补充有10％(vol/vol)的FBS和2mM的L-谷氨酰胺(生命技术公司)的20mM D-葡萄糖的MCDB131(生命技术公司)刺激1小时和24小时。按照制造商的说明书，用人C-肽ELISA试剂盒(EIAab，E0447h)评价葡萄糖依赖性C-肽释放。
结果和讨论
诱导细胞以约145ng/ml的浓度释放C-肽。用20mM的D-葡萄糖刺激1小时和刺激24小时之间无差异。因此，用葡萄糖温育1小时足以确定诱导β细胞可分泌c-肽。
实施例15在具有三步二级诱导(第一步：维生素C；第二步：维生素C、RA、环巴胺-KAAD、吲哚内酰胺V和Dorsomorphin；第三步：维生素C、RA和环巴胺-KAAD)和替代的三步三级诱导(第一步：维生素C、RA、环巴胺-KAAD、DAPT、A83-01和三碘甲状腺原氨酸；第二步：维生素C、RA、DAPT、A83-01和三碘甲状腺原氨酸；第三步：维生素C、A83-01和三碘甲腺原氨酸)的进一步替代方案之后温育细胞
材料和方法
S2培养基含有MCDB131培养基(生命技术公司)+8mM D-葡萄糖+1.23g/LNaHCO3+2％BSA、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺(ITS-X)1:50+2mM谷氨酸(L-丙氨酸-L-谷氨酰胺二肽；生命技术公司)+0.25mM维生素C+1％p/s；S3培养基含有MCDB131培养基+8mM D-葡萄糖+1.23g/L NaHCO3+2％BSA+1TS-X 1:200+2mM谷氨酸+0.25mM维生素C+1％p/s；S5培养基含有MCDB131培养基+20mM D-葡萄糖+1.754g/L NaHCO3+2％BSA+ITS-X 1:200+2mM谷氨酰胺+0.25mM维生素C+1％p/s+肝素10μg/ml(西格玛；H3149；l mg＝100单位)；且S6培养基含有补充有10％FBS(克隆(HyClone)，VWR；16777)+1％p/s的CMRL 1066(联发科技(Mediatech)；99-603-CV)。注意，CMRL1066培养基含有0.28mM的抗坏血酸、一种形式的维生素C。在加入10％FBS和1％p/s后，维生素C的浓度为约0.25mM。
初级和二级诱导
如实施例1所述分离和培养HUC细胞，并如实施例9所述进行初级诱导(即，初级诱导培养基含有RPMI 1640培养基、0.2％FBS、100μM IDE1、1mM LiCl和0.2mM维生素C，并将细胞在该培养基中培养6天)。然后，对细胞进行二级诱导，如下所述：将细胞在S2培养基(包括维生素C)和100ng/ml的碱性纤维母细胞因子(bFGF)中温育两天；然后在含有100ng/ml的bFGF、200nM的RA、0.25μM环巴胺-KAAD和30nm吲哚内酰胺V和10μM的dorsomorphin(指示试剂(Reagents Direct))的S2培养基(包括维生素C)中温育2天；然后在含有100ng/ml的bFGF、100nM的RA和0.25μM环巴胺-KAAD的S3培养基(包括维生素C)温育5天。
三级诱导
在二级诱导后，然后对细胞进行三级诱导，如下所述。将细胞在含有100mM的RA、0.25μM的环巴胺-KAAD、1μM的DAPT、2.5μM的A83-01、1μM的三碘甲状腺原氨酸(T3；西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)；3,3’,5-三碘-L-甲状腺原氨酸钠盐，目录号T6397)和20ng/ml的EGF的S5培养基中温育4天；然后在含有25mM的RA、1μM的DAPT、2.5μM的A83-01、1μM的T3和20ng/ml的EGF的S5培养基(包括维生素C)中温育3天；然后在含有2.5μM的A83-01和1μM的T3的S6培养基(包括维生素C)中温育14天。
结果和讨论
观察到在三级诱导方案的最后14天温育步骤中，细胞不生长。因此，决定在最后14天温育步骤中在无A83-01的情况下重新测试该方案。
实施例16三步二级诱导(第一步：维生素C；第二步：维生素C、RA、环巴胺-KAAD、吲哚内酰胺V和Dorsomorphin；第三步：维生素C、RA和环巴胺-KAAD)和三步三级诱导(第一步：维生素C、RA、环巴胺-KAAD、DAPT、A83-01和三碘甲状腺原氨酸；第二步：维生素C、RA、DAPT、A83-01和三碘甲状腺原氨酸；第三步：维生素C和三碘甲腺原氨酸)后的细胞的表征
材料和方法
除了从三级诱导方案的最终温育步骤中省略A83-01之外，如实施例15描述的那样诱导细胞。
细胞表征
在初级、二级和三级诱导方案的每一个诱导方案之后取细胞的等分，并使用上述免疫细胞化学方案进行表征，特别是在初级诱导方案之后，测定细胞是否存在定形内胚层标记物Sox17和Foxa2；按照二级诱导方案，测试细胞是否存在胰腺标记物PDX1、NKX6.1和NGN3；并按照三级诱导方案，测试细胞是否存在胰岛素和C-肽。在诱导方案的每个步骤之后，还对细胞进行上述定性RT-PCT(q-PCR)，其中500ng的去不RNA用于合成cDNA。如上所述，还测试由三级诱导方案产生的细胞的C-肽表达。还使用标准技术和上述抗体通过FACS分析检验细胞的胰岛素和C肽表达。
C-肽释放
在三级诱导后，收集培养基(样品“0”)，然后用Kreb氏缓冲液(0.126M的NaCl、2.5mM的KCl、25mM的NaHCO3、1.2mM的NaH2PO4、1.2mM的MgCl2、2.5mM的CaCl2，pH调节至7.2)将细胞洗涤两次，然后在含有低(2mM)的葡萄糖的Kreb氏缓冲液中温育2小时以除去残留的c-肽。然后，将细胞用Kreb氏缓冲液洗涤两次，然后在含有低(2mM)的葡萄糖的Kreb氏缓冲液中温育30分钟。30分钟后，收集上清液(样品“1-2”)。如上所述将细胞洗涤两次，并在含有高(20mM)的葡萄糖的Kreb氏缓冲液中温育30分钟，并收集上清液(样品“1-20”)。如上所述将细胞洗涤两次，并在含有低(20mM)的葡萄糖的Kreb氏缓冲液中温育30分钟，并收集上清液(样品“2-2”)。如上所述将细胞洗涤两次，并在含有高(20mM)的葡萄糖的Kreb氏缓冲液中温育30分钟，并收集上清液(样品“2-20”)。最后，通过TC-20自动细胞计数器(Bio-Rad)计数细胞数。按照制造商的说明书，使用C-肽在各个样品中测量C-肽水平，通过来自EIAAB的人C-肽ELISA试剂盒进行测试。连续检验未经历诱导方案的尿衍生细胞和人胰岛细胞(普拉多实验室，股份有限公司(Prodo Laboratories,Inc))作为对照。对于各个高的和低的葡萄糖样品，结果显示为第一和第二样品的平均值±SD。
结果和讨论
在二级诱导方案后，免疫细胞化学实验显示，细胞对于NKX6.1呈100％阳性，对于NGN3呈33.8％阳性，而对于PDX1呈23.1％阳性(数据未示出)。这证实了存在胰腺前体样细胞，并且表明已诱导了胰腺前体细胞。
三级诱导后，免疫细胞化学实验显示，85±2.5％的细胞对于C-肽和胰岛素呈双阳性。该结果证实了存在β样细胞，并且表明已诱导了β细胞。
如图13A所示，在三级诱导方案(称为诱导β细胞(IBC))之后从细胞培养基样品释放的C-肽为3.86ng/ml/30,000个细胞，在2mM的葡萄糖样品中为1.39±0.05ng/ml/30,000个细胞，而在20mM的葡萄糖样品中为3.04±1.04ng/ml/30,000个细胞。相比之下，来自人胰岛培养基的C-肽为1.8lng/ml/30000个细胞，而在2mM的葡萄糖样品中为1.84±0.01ng/ml/30,000个细胞，并且在20mM的葡萄糖样品中为2.01±0.01ng/ml/30000个细胞，如图13B所示。从尿细胞培养液样品中释放的C-肽为0.04ng/ml/30000个细胞，而在2mM的葡萄糖样品中未检测到C-肽，并且在20mM的葡萄糖样品为0.13±0.02ng/ml/30000个细胞。该数据表明，在三级诱导方案之后的诱导β细胞能够释放与人胰岛细胞同样多或更多的C-肽，而尿衍生细胞(即，在无诱导方案的情况下)释放的C-肽的水平非常低或无法检测到。该数据证实，三级诱导方案产生β细胞样的细胞，并提供了细胞是诱导β细胞的进一步的证据。
如图14A和14B所示，与通过q-PCR确定的尿细胞相比，初级诱导方案产生的细胞(称为“IBC阶段1”)，分别使Sox17和Foxa2基因的表达提高了6倍和21倍，这证实细胞是定形内胚层样的，因此表明细胞是诱导定形内胚层细胞。在二级诱导方案后，细胞(称为“IBC阶段2”)表达的Pdx1和NGN3分别比尿细胞高2倍和8倍，这证实细胞是胰腺前体样的，因此表明细胞是诱导胰腺前体细胞，分别如图14C和14D所示。在三级诱导方案之后，细胞(称为“IBC阶段3”)表达的胰岛素和生长激素抑制素(SST)分别比尿细胞多1751倍和26倍(图14E和14F)。此外，三级诱导方案后的细胞表达的胰岛素水平与人胰岛细胞相似，而其表达的生长激素抑制素大约是人胰岛细胞表达的两倍。该数据表明，三级诱导方案后的细胞是β细胞样的，因此表明细胞是诱导β细胞。
图15B显示，在三级诱导后，12.14％的细胞对于胰岛素表达是阳性的，而图15C显示8.43％的细胞对于C-肽表达是阳性的。图15A示出根据标准方法应用的活细胞的门控。
因此，该另外的替代方案最终也成功地将尿衍生细胞诱导为β样细胞。诱导方案如下：
初级诱导(6天)：
·培养基：RPMI+0.2％FBS；
·小分子重编程因子：100μΜ的IDEl，1mM的LiCl，0.2mM维生素C(VC)；二级诱导(步骤1，2天)
·培养基：MCDB131培养基+bFGF+8mM D-葡萄糖+1.23g/L NaHCO3+2％BSA，胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺(ITS-X)1:50+2mM谷氨酰胺(L-丙氨酸-L-谷氨酰胺二肽+1％p/s；
·小分子重编程因子：0.25mM维生素C；
二级诱导(步骤2，2天)
·培养基：MCDB 131培养基+bFGF+8mMD-葡萄糖+1.23g/L NaHCO3+2％BSA，胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺(ITS-X)1:50+2mM谷氨酰胺(L-丙氨酸-L-谷氨酰胺二肽+1％p/s；
·小分子重编程因子：0.25mM维生素C，200nM的RA，0.25μΜ的环巴胺-KAAD和30nm的吲哚内酰胺V和10μΜ的dorsomorphin；
二级诱导(步骤3，5天)
·培养基：MCDB131培养基+bFGF+8mM的D-葡萄糖+1.23g/L NaHCO3+2％BSA+ITS-X1:200+2mM的谷氨酰胺+0.25mM的维生素C+1％p/s；
·小分子重编程因子：0.25mM维生素C，100nM的RA和0.25μΜ环巴胺-KAAD；
三级诱导(步骤1，4天)
·培养基：MCDB131培养基+20ng/ml的EGF+20mM D-葡萄糖+1.754g/L的NaHCO3+2％BSA+ITS-X 1:200+2mM的谷氨酰胺+1％p/s+10ng/ml的肝素；
·小分子重编程因子：100mM的RA，0.25μΜ的环巴胺-KAAD，1μΜ的DAPT，2.5μΜ的A83-01，1μΜ三碘甲状腺原氨酸；
三级诱导(步骤2，3天)
·培养基：MCDB131培养基+20ng/ml的EGF+20mM D-葡萄糖+1.754g/L NaHCO3+2％BSA+ITS-X 1:200+2mM谷氨酰胺+1％p/s+10ng/ml肝素；
·小分子重编程因子：25mM的RA，1μΜ的DAPT，2.5μΜ的A83-01，1μΜ的T3；
三级诱导(步骤3，14天)
·培养基：补充有10％的FBS(包括维生素C)的CMRL1066；
·小分子重编程因子：1μΜ的T3
实施例17表征尿细胞
材料和方法
通过如上所述的q-PCR(使用定量引物)表征使用标准技术分离的三种不同的人尿细胞样品和原代纤维母细胞，其中500ng的全部RNA用于合成cDNA。
结果和讨论
只有一个尿细胞系表达上皮细胞标记物KRT7(图16A)，而所有三种尿细胞系均表达上皮细胞标记物闭合蛋白(OCL；图16B)。所有尿细胞系均表达肾小管标记物NR3C2(图16C)和L1 CAM(图16D)以及可变水平的肾小管标记物SLC2A 1(图16E)。所有尿细胞系均表达低水平的纤维母细胞标记物波形蛋白(图16F)。这表明从不同个体获得的尿细胞存在差异，并且还表明尿细胞为混合来源。
综上所述，在各个实施例中，本文描述的方案能够使用初级诱导方案将细胞从尿衍生细胞转分化为诱导定形内胚层细胞，使用二级方案转分化为诱导胰腺前体，并使用本文所述的三级方案转分化为诱导β细胞。
在以下的整个说明书和权利要求中，除非上下文另有要求，词语“包括(comprise)”和“包括(include)”以及诸如“包括(comprising)”和“包括(including)”的变型应理解为暗示包含所述整数或整数组，但不排除任何其它整数或整数组。
对本说明书中的任何现有技术的引用并非且也不应该被认为是承认任何形式的建议，这种现有技术形成公知常识的一部分。
本领域技术人员应该理解的是，本发明的使用不受限于上述特定应用。就本文描述或描绘的特定元素和/或特征而言，本发明也不局限于其优选实施方案。应当理解的是，本发明不限于所公开的实施方案例或各个实施方案，且在不脱离由以下权利要求所阐述和限定的本发明的范围的情况下能够进行许多重新布置、修改和替换。
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<213> 人工
<400> 33
tggagaacta ctgcaactag acgcagcc 28
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<400> 34
ccaaccagac ggagaatgat 20
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<213> 人工
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tagccgggtt tgagttagca 20
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atgaaatgag gcttgagctg cagagatc 28
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<213> 人工
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ggacctgcaa tttcattg 18
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ctccagcaaa gaggaaaa 18
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taaggtccac agaagtccgc aat 23
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cacgatgaat ttgagaga 18
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cagagaaaga accatcag 18
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cttcaacaat ggcgacctct tctg 24
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cccgtttgga taaagaattg 20
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ccttcacttg cttcagtc 18
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attgtattca tcagcagcag ccat 24
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ctccttgctg aatctgag 18
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ccacaaagat tgctatcac 19
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caaccaccat caaggcacgg 20
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ctcccagaca tctttgag 18
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gcggtggtta atttcatc 18
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agtcctccac cacatcctgc 20
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gctcaaaacc agatacag 18
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gacacatcca agaatactg 19
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tctccacgct caaccgctta 20
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acctctactt tgccaatg 18
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ctgtcaatca tgctgttg 18
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acctccgaca accactcaga c 21
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cgtcttcatc atcttcac 18
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tgggatagaa gctttgta 18
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tgctcctggt tctgttcttc atct 24
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cagagcaact ggaagaag 18
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ctcgttgtcc ttcttgaa 18
<210> 63
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tggtggctcg ttctccttct c 21
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gacctgctca atgttaag 18
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caaccgtctt aatcagaag 19
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cttgacattg agattgccac ctacag 26
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gtgctaaagg tgccaatg 18
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gtccttgaac accaacag 18
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tcctggtatt gctggtgctc c 21
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gggaatggag caaaacagtc tt 22
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ccaacgtcca caccaaattc t 21
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tcgaacacgc aaggctgtga gactacc 27
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accacagtcc atgccatcac 20
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tccaccaccc tgttgctgta 20
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ctgcaccacc aactgcttag c 21

Claims (15)

1.一种从尿衍生细胞产生诱导β细胞的方法，所述方法包括：
(a)提供尿衍生细胞；
(b)通过由在初级诱导培养基中培养所述尿衍生细胞一第一时间段组成的诱导过程来诱导步骤(a)中提供的尿衍生细胞，以获得诱导内胚层细胞，所述初级诱导培养基包含有效量的包含定形内胚层诱导剂、糖原合成酶激酶3抑制剂和维生素C的小分子重编程因子的组合；
(c)通过在二级诱导培养基中培养所述诱导内胚层细胞一第二时间段来诱导步骤(b)中获得的诱导内胚层细胞，以获得诱导胰腺前体细胞；和
(d)通过在三级诱导培养基中培养所述胰腺前体细胞一第三时间段来诱导步骤(c)中获得的所述诱导胰腺前体细胞，以获得诱导β细胞；
其中所述方法不包括使用非小分子的重编程因子；
其中，
(1)所述二级诱导培养基包含有效量的:
用于所述第二时间段的第一部分的吲哚内酰胺V、环巴胺-KAAD、维生素C、视黄酸、A83-01和BRD7552，和
用于所述第二时间段的第二部分的吲哚内酰胺V、环巴胺-KAAD、维生素C、A83-01和BRD7552；且
所述三级诱导培养基包含有效量的SB203580、维生素C和DAPT；或
(2)所述二级诱导培养基包含有效量的:
用于所述第二时间段的第一部分的维生素C；
用于所述第二时间段的第二部分的维生素C、RA、环巴胺-KAAD、吲哚内酰胺V和dorsomorphin；和
用于所述第二时间段的第三部分的维生素C、RA和环巴胺-KAAD；且所述三级诱导培养基包含有效量的:
用于所述第三时间段的第一部分的维生素C、RA、环巴胺-KAAD、DAPT、A83-01和三碘甲状腺原氨酸，
用于所述第三时间段的第二部分的维生素C、RA、DAPT、A83-01和三碘甲状腺原氨酸，和
用于所述第三时间段的第三部分的维生素C和三碘甲状腺原氨酸。
2.如权利要求1所述的方法，其中：
在所述初级诱导培养基中，定形内胚层诱导剂是IDE1，糖原合成酶激酶3抑制剂是氯化锂。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述尿衍生细胞从受试者的尿样获得。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中步骤(a)还包括通过在合适的组织培养基中培养所述尿衍生细胞来扩增所述尿衍生细胞。
5.如权利要求1或2所述的方法，其中所述尿衍生细胞为人细胞。
6.一种从尿衍生细胞产生诱导内胚层细胞的方法，所述方法包括：
(a)提供尿衍生细胞；和
(b)通过由在初级诱导培养基中培养所述尿衍生细胞一第一时间段组成的诱导过程来诱导步骤(a)中提供的尿衍生细胞，以获得诱导内胚层细胞，所述初级诱导培养基包含有效量的包含定形内胚层诱导剂、糖原合成酶激酶3抑制剂和维生素C的小分子重编程因子的组合；且
其中所述方法不包括使用非小分子的重编程因子。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述尿衍生细胞从受试者的尿样获得。
8.如权利要求6所述的方法，其中步骤(a)还包括通过在合适的组织培养基中培养所述尿衍生细胞来扩增所述尿衍生细胞。
9.如权利要求6所述的方法，其中所述尿衍生细胞为人细胞。
10.如权利要求6-9中任一项所述的方法，其中在所述初级诱导培养基中，定形内胚层诱导剂是IDE1，糖原合成酶激酶3抑制剂是氯化锂。
11.一种从尿衍生细胞产生诱导胰腺前体细胞的方法，所述方法包括：
(a)提供尿衍生细胞；
(b)通过由在初级诱导培养基中培养所述尿衍生细胞一第一时间段组成的诱导过程来诱导步骤(a)中提供的尿衍生细胞，以获得诱导内胚层细胞，所述初级诱导培养基包含有效量的包含定形内胚层诱导剂、糖原合成酶激酶3抑制剂和维生素C的小分子重编程因子的组合；和
(c)通过在二级诱导培养基中培养所述诱导内胚层细胞一第二时间段来诱导步骤(b)中获得的诱导内胚层细胞，以获得诱导胰腺前体细胞；
其中所述方法不包括使用非小分子的重编程因子；
其中，
(1)所述二级诱导培养基包含有效量的:
用于所述第二时间段的第一部分的吲哚内酰胺V、环巴胺-KAAD、维生素C、视黄酸、A83-01和BRD7552，和
用于所述第二时间段的第二部分的吲哚内酰胺V、环巴胺-KAAD、维生素C、A83-01和BRD7552；或
(2)所述二级诱导培养基包含有效量的:
用于所述第二时间段的第一部分的维生素C；
用于所述第二时间段的第二部分的维生素C、RA、环巴胺-KAAD、吲哚内酰胺V和dorsomorphin；和
用于所述第二时间段的第三部分的维生素C、RA和环巴胺-KAAD。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述尿衍生细胞从受试者的尿样获得。
13.如权利要求11所述的方法，其中步骤(a)还包括通过在合适的组织培养基中培养所述尿衍生细胞来扩增所述尿衍生细胞。
14.如权利要求11所述的方法，其中所述尿衍生细胞为人细胞。
15.如权利要求11-14中任一项所述的方法，其中在所述初级诱导培养基中，定形内胚层诱导剂是IDE1，糖原合成酶激酶3抑制剂是氯化锂。
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