TW201536799A - 新穎之胜肽及其用途 - Google Patents

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Hideo Toyoshima
Yasushi Okazaki
Tomotaka Yokoo
Izumi Sugawara
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Univ Saitama Medical
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Abstract

本發明係提供一種新穎之胜肽、接合有編碼該胜肽之DNA之載體、經以該載體進行形質轉換之形質轉換體以及該等之用途。 與本發明有關之胜肽，係由序列編號1之胺基酸序列，或序列編號1之胺基酸序列中，具有1個或數個胺基酸被取代、缺失及/或附加之胺基酸序列構成者。該胜肽或接合有編碼該胜肽之DNA之載體，係適合使用於促進胰臟荷爾蒙產生細胞增殖之胰臟荷爾蒙產生細胞增殖促進劑，或誘導朝向胰臟荷爾蒙產生細胞分化之誘導分化促進劑。

Description

新穎之胜肽及其用途
本發明係提供一種新穎之胜肽、接合有編碼該胜肽之DNA之載體、經以該載體進行形質轉換之形質轉換體以及該等之用途。
胰臟係具有內分泌細胞與外分泌細胞，在內分泌與外分泌兩方面係擔任重要任務的器官。內分泌細胞係可達成產生、分泌胰臟荷爾蒙的任務，已知α細胞分泌昇糖素，β細胞係分泌胰島素，δ細胞係分泌體抑素，PP細胞則分泌胰臟多肽。特別胰島素係具有降低血糖值作用，可達成維持正常血糖濃度之重要任務。
近年來，報告有人類TM4SF20此一周知的多肽或其片段，具有增加促進胰臟β細胞之作用(參照專利文件1)。編碼人類TM4SF20之DNA序列示於序列編號2，人類TM4SF20之胺基酸序列示於序列編號3。目前正期待該多肽或其片段，可使用於胰臟β細胞減少或死亡所伴隨之疾病，特別係第一型糖尿病之治療。
然而，專利文件1記載之多肽(人類TM4SF20)係由 229個胺基酸殘基所構成者，為了實用化，正期盼鏈長更短的胜肽。專利文件1中亦記載有鏈長較短的胜肽之由19個胺基酸殘基構成之3種片段(胜肽A、B、C)，但並非具有很高的增加促進胰臟β細胞作用。胜肽A、B、C之胺基酸序列係分別示於序列編號4~6。且，胜肽A、B、C之胺基酸序列，分別對應人類TM4SF20之第98至第116個之胺基酸序列、第78至第96個之胺基酸序列、第161至第179個之胺基酸序列。
另外近年來，已報告了許多可將細胞誘導分化為誘導多能性幹細胞(以下亦稱作「iPS細胞」)與胚胎幹細胞(以下亦稱作「ES細胞」)等多能幹細胞，或自胰臟組織之幹/前驅細胞誘導分化為產生胰臟荷爾蒙細胞之方法(參照非專利文件1~4，專利文件2~7等)。利用該等分化誘導方法若可獲得有效率地產生胰臟荷爾蒙之細胞，被期待可連結至成為代替胰臟移植之第一型糖尿病之治療方法。進而，藉由獲得來自病患本人的多能性幹細胞，或自胰臟組織之幹/前驅細胞之產生胰臟荷爾蒙細胞，認為亦可解決排斥反應之問題。
然而，至今為止已報告之分化誘導方法，均不具有充分的效率以誘導分化為產生胰臟荷爾蒙細胞。因此，目前正期盼可以高效率將細胞誘導分化為產生胰臟荷爾蒙細胞之可行的分化誘導方法。特別自安全性之觀點，以未伴隨基因導入之分化誘導方法為佳。
先前技術文件 專利文件
專利文件1：國際公開第2009/013794號公報
專利文件2：國際公開第2007/103282號公報
專利文件3：國際公開第2005/063971號公報
專利文件4：國際公開第2009/048675號公報
專利文件5：國際公開第2007/051038號公報
專利文件6：國際公開第2006/108361號公報
專利文件7：國際公開第2008/066199號公報
非專利文件
非專利文件1：D’Amour K. A. et al., Nature Biotechnology, 24,pp.1392-1401(2006)
非專利文件2：Wei Jiang et al., Cell Research, 17,pp.333-344(2007)
非專利文件3：Miyazaki, S. et al., Diabetes, 53,pp.1030-1037(2004)
非專利文件4：Yuya Kunisada et al., Stem Cell Research, 8,pp.274-284(2012)
本發明係提供一種新穎之胜肽、接合有編碼該胜肽之DNA之載體、經以該載體進行形質轉換之形質轉換體以 及該等之用途為目的。
本發明團隊，有鑑於上述問題點重複專心研究。其結果，發現人類TM4SF20之片段，即由序列編號1記載之胺基酸序列構成之胜肽(以下亦稱作「貝達及寧(betagenin)」)，具有高產生胰臟荷爾蒙細胞之增殖促進作用，且，具有使細胞分化為產生胰臟荷爾蒙細胞之分化誘導促進作用。本發明係以該等知識為基礎而完成者，更具體說明係如下所述。
[1]一種胜肽，其係由序列編號1之胺基酸序列，或序列編號1之胺基酸序列中，具有1個或數個胺基酸被取代、缺失及/或附加之胺基酸序列構成。
[2]一種載體，其係接合有編碼如[1]之胜肽之DNA。
[3]一種研究用試藥，其係含有如[1]之胜肽或[2]之載體。
[4]如[3]之研究用試藥，其係促進胰臟荷爾蒙產生細胞增殖之胰臟荷爾蒙產生細胞增殖促進劑，及/或誘導朝向胰臟荷爾蒙產生細胞分化之誘導分化促進劑。
[5]如[4]之研究用試藥，其中前述胰臟荷爾蒙產生細胞，係包含選自α細胞、β細胞以及δ細胞所成之群之至少1種。
[6]一種醫藥組成物，其係含有如[1]之胜肽或[2]之 載體。
[7]一種形質轉換體，其係經以如[2]之載體進行形質轉換者。
[8]一種胜肽之產生方法，其係包含培養如[7]之形質轉換體之後，使如[1]之胜肽產生之步驟。
[9]一種促進胰臟荷爾蒙產生細胞增殖之胰臟荷爾蒙產生細胞增殖促進劑，其係包含下述(a)~(c)之至少1種：(a)由序列編號1之胺基酸序列構成之胜肽，(b)由序列編號1之胺基酸序列中，具有1個或數個胺基酸被取代、缺失及/或附加之胺基酸序列構成，且具有胰臟荷爾蒙產生細胞之增殖促進作用之胜肽，(c)接合有編碼前述(a)或(b)之胜肽之DNA之載體。
[10]一種誘導朝向胰臟荷爾蒙產生細胞分化之誘導分化促進劑，其係包含下述(d)~(f)之至少1種：(d)由序列編號1之胺基酸序列構成之胜肽，(e)由序列編號1之胺基酸序列中，具有1個或數個胺基酸被取代、缺失及/或附加之胺基酸序列構成，且具有朝向胰臟荷爾蒙產生細胞之誘導分化促進作用之胜肽，(f)接合有編碼前述(d)或(e)之胜肽之DNA之載體。
[11]一種胰臟荷爾蒙產生細胞之增殖方法，其係包含於培養胰臟荷爾蒙產生細胞之培養基中，添加下述(a)或(b)之胜肽之步驟：(a)由序列編號1之胺基酸序列構成之胜肽， (b)由序列編號1之胺基酸序列中，具有1個或數個胺基酸被取代、缺失及/或附加之胺基酸序列構成，且具有胰臟荷爾蒙產生細胞之增殖促進作用之胜肽。
[12]一種胰臟荷爾蒙產生細胞之分化形成方法，其係包含於自多功能幹細胞或胰臟組織幹/前驅細胞，朝向胰臟荷爾蒙產生細胞的誘導分化過程中，於培養基中添加下述(d)或(e)之胜肽之步驟：(d)由序列編號1之胺基酸序列構成之胜肽，(e)由序列編號1之胺基酸序列中，具有1個或數個胺基酸被取代、缺失及/或附加之胺基酸序列構成，且具有朝向胰臟荷爾蒙產生細胞之誘導分化促進作用之胜肽。
[13]一種再生醫療型胰臟荷爾蒙產生細胞群之形成方法，其係包含如[11]之增殖方法以及/或[12]之分化形成方法。
[14]如[13]之形成方法，其中前述胰臟荷爾蒙產生細胞群係包含α細胞或β細胞。
利用本發明，可提供一種新穎之胜肽、接合有編碼該胜肽之DNA之載體、經以該載體進行形質轉換之形質轉換體以及該等之用途。
《胜肽》
與本發明相關之胜肽係序列編號1之胺基酸序列，或 於序列編號1之胺基酸序列中，具有1個或數個胺基酸被取代、缺失及/或附加之胺基酸序列構成者。
序列編號1之胺基酸序列，係對應人類TM4SF20的第170個至第229個之胺基酸序列。如後所述，由序列編號1記載之胺基酸序列構成之胜肽，係具有很高的胰臟荷爾蒙產生細胞之增殖促進作用，且為具有分化誘導為胰臟荷爾蒙產生細胞之促進作用者。且，於胰臟荷爾蒙產生細胞中，一般係含有至少一種選自α細胞、β細胞以及δ細胞所成群者。
與本發明相關之胜肽中亦包含由於序列編號1之胺基酸序列中，具有1個或數個胺基酸被取代、缺失及/或附加之胺基酸序列所構成之胜肽(以下亦稱作「改變胜肽」)。一胺基酸序列中，由具有1個或數個胺基酸被取代、缺失及/或附加之胺基酸序列所構成之胜肽，可維持原始胜肽之生物學上之活性，乃相關業者已廣知之事實(參照Mark,D.F.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81,pp.5662-5666(1984)；Zoller,M.J.et al.,Nucleic Acids Research,10,pp.6487-6500(1982)；Wang,A.et al.,Sciences,224,pp.1431-1433；Dalbadie-McFarland,G.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,pp.6409-6413(1982)等)。
此處，有1個或數個胺基酸被其他胺基酸取代時，期盼取代前後仍可保存胺基酸支鏈之性質。胺基酸支鏈之性質可舉出疏水性胺基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、 V)、親水性胺基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、具有脂肪族支鏈之胺基酸(G、A、V、L、I、P)、含有氫氧基支鏈之胺基酸(S、T、Y)、具有含硫原子支鏈之胺基酸(C、M)、含有含羧酸以及醯胺支鏈之胺基酸(D、N、E、Q)、含有鹼基支鏈之胺基酸(R、K、H)、含有芳香族支鏈之胺基酸(H、F、Y、W)(括弧中之英文字母均係為胺基酸之單字母符號)。
有1個或數個胺基酸被取代、缺失及/或附加之情況時，其個數係例如可為1~12個，亦可為1~6個，1~4個亦可，1~2個亦可。
另外，改變之胜肽與原本胜肽之相同性，以80%以上為佳，90%以上更佳，93%以上為佳，95%以上特佳，98%以上最佳。
《載體》
與本發明有關之載體，係接合有編碼與本發明相關之胜肽之DNA之載體。載體可使用質體載體、嗜菌體載體、反轉錄病毒載體、腺病毒載體、伴隨腺病毒載體等，可因應使用目的適當選擇。
《研究用試藥、醫藥組成物》
與本發明有關的研究用試藥，係包含與本發明有關之胜肽或與本發明相關之載體者。該研究用試藥係可作為後述胰臟荷爾蒙產生細胞增殖促進劑，亦可作為分化誘導促 進劑，亦可為兼有二者者。該研究用試藥可利用在胰臟荷爾蒙產生細胞之研究，以及可使用於對胰臟荷爾蒙產生細胞之分化機轉之研究等。
另外，與本發明有關的醫藥組成物，係包含與本發明有關之胜肽或與本發明相關之載體者。如後所述，由記載於序列編號1之胺基酸序列構成之胜肽，顯示可獲得具有優異之胰臟荷爾蒙產生細胞增殖促進作用，以及胰臟荷爾蒙產生細胞之分化誘導促進作用。因此，該醫藥組成物，可用於胰臟β細胞死亡或減少所伴隨之疾病，特別係第一型糖尿病之治療。例如，利用周知之方法將與本發明有關之胜肽製劑化調製為醫藥組成物，再投予給患者。另外，利用周知之方法將與本發明有關之載體製劑化調製為醫藥組成物，再投予給患者。
《形質轉換體、胜肽產生方法》
與本發明有關之形質轉換體，係以與本發明有關之載體經形質轉換者。另外，與本發明有關之胜肽產生方法，係包含培養與本發明相關之形質轉換體之後，使其產生與本發明有關之胜肽之步驟者。
宿主細胞，若為適合用於形質轉換用之載體並可進行形質轉換者即可，其具體例可舉出細菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞等。
藉由培養該形質轉換體使基因表現，再自其培養上清液可獲得與本發明有關之胜肽。胜肽之分離、純化係可利 用於例如離子交換樹脂、分配層析法、凝膠層析法、逆相層析法等胜肽化學領域中一般常被使用之方法而進行。
且，亦當然可能利用化學合成而獲得與本發明有關之胜肽。
《胰臟荷爾蒙產生細胞增殖促進劑》
與本發明有關的胰臟荷爾蒙產生細胞增殖促進劑，係至少含有下述(a)~(c)之至少1種，係可促進胰臟荷爾蒙產生細胞之增殖。
(a)由序列編號1之胺基酸序列構成之胜肽，(b)由序列編號1之胺基酸序列中，具有1個或數個胺基酸被取代、缺失及/或附加之胺基酸序列構成，且具有胰臟荷爾蒙產生細胞之增殖促進作用之胜肽，(c)接合有編碼前述(a)或(b)之胜肽之DNA之載體。
由序列編號1之胺基酸序列構成之胜肽，係具有高的胰臟荷爾蒙產生細胞增殖促進作用。因此，可將該胜肽用於胰臟荷爾蒙產生細胞增殖促進劑。
另外，只要能夠維持胰臟荷爾蒙產生細胞之增殖促進作用，可使用由序列編號1之胺基酸序列中，具有1個或數個胺基酸被取代、缺失及/或附加之胺基酸序列構成之改變胜肽。取代、缺失及/或附加之胺基酸之數，針對改變胜肽與原本胜肽之相同性，與本發明有關之胜肽之記載內容相同者即可。
進而，亦可將接合有編碼上述(a)以及(b)之胜肽之 DNA之載體，使用為胰臟荷爾蒙產生細胞增殖促進劑。
成為有效成分之胜肽與載體，可單獨使用經高度純化後之純化品，亦可混合數種類使用。
與本發明有關之胰臟荷爾蒙產生細胞增殖促進劑，係顯示可獲得優異的胰臟荷爾蒙產生細胞之增殖促進作用。因此，該增殖促進劑，可用於例如胰臟β細胞死亡或減少所伴隨之疾病，特別係第一型糖尿病之治療。
例如，利用周知之方法將上述(a)以及(b)之胜肽製劑化調製為醫藥組成物，再投予予患者。
另外，利用周知之方法將接合有編碼上述(a)以及(b)之胜肽之DNA之適當的載體(反轉錄病毒載體、腺病毒載體、伴隨腺病毒載體等)，製劑化調製為醫藥組成物，再投予給患者。
《胰臟荷爾蒙產生細胞之增殖方法》
與本發明有關之增殖方法，係包含於培養胰臟荷爾蒙產生細胞之培養基中，添加上述(a)或(b)之胜肽之步驟。藉由添加如上述(a)或(b)，可促進胰臟荷爾蒙產生細胞之增殖。於培養基中胜肽濃度係以0.03~10nM為佳，0.3~1nM更佳。
《分化誘導促進劑》
與本發明有關之分化誘導促進劑，係包含下述(d)~(f)之至少1種，且可誘導分化至胰臟荷爾蒙產生細胞者。
(d)由序列編號1之胺基酸序列構成之胜肽，(e)由序列編號1之胺基酸序列中，具有1個或數個胺基酸被取代、缺失及/或附加之胺基酸序列構成，且具有朝向胰臟荷爾蒙產生細胞分化之誘導分化促進作用之胜肽，(f)接合有編碼前述(d)或(e)之胜肽之DNA之載體。
由序列編號1之胺基酸序列構成之胜肽，係具有自多功能幹細胞或胰臟組織幹/前驅細胞等之組織幹/前驅細胞，朝向胰臟荷爾蒙產生細胞的誘導分化促進作用者。因此，該胜肽可使用為分化誘導促進劑。
另外，只要可維持朝向胰臟荷爾蒙產生細胞的誘導分化促進作用，亦可使用由序列編號1之胺基酸序列中，具有1個或數個胺基酸被取代、缺失及/或附加之胺基酸序列構成之改變胜肽。取代、缺失及/或附加之胺基酸之數，針對改變胜肽與原本胜肽之相同性等，與本發明有關之胜肽之記載內容相同者即可。
進而，亦可將接合有編碼上述(d)或(e)之胜肽之DNA之載體，使用為分化誘導促進劑。
成為有效成分之胜肽與載體，可單獨使用經高度純化後之純化品，亦可混合數種類使用。
且多能性幹細胞係指具有可分化為至少一種類屬於三胚葉(外胚葉、中胚葉、內胚葉)之分化細胞之能力(多分化能力)，且可自我複製之幹細胞，例如包含誘導多能性幹細胞(iPS細胞)、胚胎幹細胞(ES細胞)、胚胎生殖細胞(EG 細胞)、胚胎癌細胞(EC細胞)、成體多能性幹細胞(APS細胞)等。
另外，組織幹/前驅細胞係指存在於生體內，具有多分化能力，及自我複製能力之幹/前驅細胞。
與本發明有關之分化誘導促進劑，係可獲得顯示具有朝向胰臟荷爾蒙產生細胞之分化誘導促進作用。因此，該分化誘導促進劑，可用於例如胰臟β細胞死亡或減少所伴隨之疾病，特別係第一型糖尿病之治療。
例如，利用周知之方法將上述(d)以及(e)之胜肽製劑化，再投予給患者。
另外，利用周知之方法將接合有編碼上述(d)以及(e)之胜肽之DNA之適當的載體(反轉錄病毒載體、腺病毒載體、伴隨腺病毒載體等)，製劑化之後，再投予給患者。
另外，與本發明有關之分化誘導促進劑，亦可用於誘導自多功能幹細胞或胰臟組織幹/前驅細胞，朝向胰臟荷爾蒙產生細胞分化時。
例如，藉由於培養基中添加上述(d)或(e)之胜肽，可誘導自多功能幹細胞或胰臟組織幹/前驅細胞，朝向胰臟荷爾蒙產生細胞之分化。
《胰臟荷爾蒙產生細胞之分化形成方法》
與本發明有關之分化形成方法，係包含於自多功能幹細胞或胰臟組織幹/前驅細胞，朝向胰臟荷爾蒙產生細胞之分化誘導過程中，於培養基中添加上述(d)或(e)之胜肽 之步驟。以下，針對該分化形成方法更進而說明。
<自多功能幹細胞朝向胰臟荷爾蒙產生細胞之分化誘導>
誘導自多功能幹細胞朝向胰臟荷爾蒙產生細胞之分化，可於其分化誘導過程中，於培養基中添加上述(d)或(e)之胜肽。自多功能幹細胞朝向胰臟荷爾蒙產生細胞之分化誘導方法，可採用任一種先前已知之方法，並無特別限制。培養基中上述(d)或(e)之胜肽濃度係以10~200ng/mL為佳，50~180ng/mL更佳，60~150ng/mL最佳。
以下，舉出自多功能幹細胞朝向胰臟荷爾蒙產生細胞之分化誘導方法之例之2種方法，但並非限定於該等例示。
[第1個分化誘導方法]
第1個分化誘導方法係以非專利文件1中記載之方法為準者。該文獻係來自參照資料援用於本申請案中。
第1個分化誘導方法係包含下述步驟(A1)~(E1)。於其中至少1個步驟中，於培養基中添加上述(d)或(e)之胜肽。且，於某步驟中添加分化誘導促進劑時，可於該步驟的最初進行添加，亦可於該步驟之途中進行添加。特別以於步驟(A1)~(E1)全部之步驟中，添加上述(d)或(e)之胜肽為佳。
(A1)於屬於TGF-β超家族(TGF-β superfamily)(轉型生長因子β)之生長因子存在情況下培養多功能幹細胞 之步驟。
(B1)於FGF(纖維母細胞生長因子)之存在下培養上述步驟(A1)所得細胞之步驟。
(C1)於類視色素之存在下培養上述步驟(B1)所得細胞之步驟。
(D1)於乙型分泌酶阻礙劑之存在下培養上述步驟(C1)所得細胞之步驟。
(E1)於由Exendin-4(促胰島素分泌素)、HGF(肝細胞生長因子)、IGF-1(類胰島素生長因子-1)、以及菸鹼醯胺所成群中選擇至少1種之因子之存在下培養上述步驟(D1)所得細胞之步驟。
(步驟(A1))
步驟(A1)係於存在屬於TGF-β超家族(TGF-β superfamily)之生長因子之情況下，培養多功能幹細胞。
屬於TGF-β超家族之生長因子係可舉出活化素、nodal、BMP(骨形成蛋白質)等，其中以活化素為佳。該等屬於TGF-β超家族之生長因子，已知可促進自多功能幹細胞分化為胚胎內胚葉細胞(參照非專利文件1，專利文件2~4等)。活化素可舉出活化素A、活化素B、活化素AB等，其中以活化素A為佳。
屬於TGF-β超家族之生長因子的濃度，以5~250ng/mL為佳，10~200ng/mL更佳，50~150ng/mL最佳。
另外，於步驟(A1)，於培養基中添加屬於Wnt(無翅型MMTV插入部位)家族之生長因子更佳。藉由與屬於TGF-β超家族之生長因子一同添加屬於Wnt家族生長因子，可提高朝向胚胎內胚葉細胞之分化效率。
屬於Wnt家族生長因子係可舉出Wnt1、Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a等，以Wnt1、Wnt3a為佳，Wnt3a更佳。
屬於Wnt家族生長因子的濃度，以1~1000ng/mL為佳，10~100ng/mL更佳，10~50ng/mL最佳。
尚且，已知於步驟(A1)中，亦可添加GSK-3(肝醣合成酶激酶-3)阻礙劑(例如CHIR)來取代屬於Wnt家族生長因子。已知GSK-3阻礙劑(例如CHIR)係可活化Wnt訊息傳導路徑(J.Biol.Chem.277(34),pp.30998-31004(2002))。
另外，步驟(A1)中，亦可將為獲得提高朝向胚胎內胚葉細胞之分化效率之追加的因子，添加於培養基中。例如可舉出PDGF(來自血小板之生長因子)、EGF(上皮生長因子)、VEGF(血管內皮細胞生長因子)、KGF(角質細胞生長因子)、HGF、NGF(神經生長因子)、GDF(生長分化因子)、GLP(類昇糖素胜肽)、菸鹼醯胺、促胰島素分泌素(Exendin-4)、維生素A酸、乙醇胺、副甲狀腺荷爾蒙、黃體素、抑肽酶、氫羥腎上腺皮質素、胃泌激素、類固醇生物鹼、銅螯合劑(三乙烯基五胺等)、毛喉素、酪酸鈉、頭蛋白、丙基戊酸、曲古抑菌素A、印度刺蝟因子、音蝟因子、蛋白酶體阻礙劑、刻痕傳遞路徑阻礙劑、刺蝟因子傳 遞路徑阻礙劑等。
用於培養之容器，自分化誘導能力、功能表現能力、生存能力等之觀點，以使用適合生體材料之舖設有台架之培養盤為佳。台架係可舉出基膜素、纖維黏連蛋白、膠原蛋白、硫酸肝素蛋白多醣、明膠、內動素、聚鳥胺酸等。市售品可購入Becton Dickinson製之MATRIGELTM、減少生長因子之MATRIGELTM等。特別以使用舖設有MATRIGELTM之培養盤為佳。
用於培養之培養基，可於可使用於培養動物細胞之基本培養基中，添加維持細胞生長所必須的各種營養來源與其他成分而製作。
基本培養基可舉出RPMI1640培養基、DMEM培養基、CMRL1066培養基、漢斯F12(Ham's F12)培養基、醫格爾(Eagle's)MEM培養基、格勞(Glasgow)MEM培養基、IMEM Zinc Option培養基、IMDM培養基、威廉(William's)E培養基、費雪(Fisher)培養基、麥考(McCoy)培養基、BME培養基、α MEM培養基、BGJb培養基、培養基199培養基或該等之混合培養基等。
營養來源可舉出例如甘油、葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、澱粉、糊精等碳素源；脂肪酸、油脂、卵磷脂、醇類等烴類；硫酸銨、硝酸銨、氯化銨、尿素、硝酸鈉等氮源；鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、磷酸鹽等無機鹽類；各種維他命類；各種胺基酸類等。
其他成分可舉出盤尼西林、鏈霉素等抗生素；霍亂毒 素；胰島素；運鐵蛋白；亞硒酸；白蛋白；2-巰基乙醇；血清或血清代替物等。其中胰島素、運鐵蛋白以及亞硒酸，可購自市售之Invitrogen製之ITS-X、ITS-A、ITS-G等。另外血清替代物，可購自市售之Invitrogen製之B-27TM營養補充品、N-2營養補充品、KnockoutTM血清替代物等。
步驟(A1)中，為了提高分化效率已知非常重要的是充分降低培養基中的胰島素、IGF等含量(參照國際公開第2006/020919號)。因此，步驟(A1)中，以使用無血清培養基或低血清培養基為佳(參照非專利文件1，專利文件2~4等)。血清濃度以0~2%(v/v)為佳，0~1%(v/v)更佳，0~0.5%(v/v)最佳。
較合適之實施方式係使用經添加活化素A、Wnt3a、盤尼西林或鏈霉素等抗生素、含有L-麩醯胺酸或L-麩胺酸之二胜肽之無血清或低血清之RPMI1640培養基。
步驟(A1)的培養期間係例如1~6天，以2~4天為佳。
朝向胚胎內胚葉細胞之分化誘導之進行，除了依據形態學上之觀察，亦可利用RT-PCR確認基因表現而評價。隨著自多功能幹細胞朝向胚胎內胚葉細胞分化之進行，幹細胞之標誌基因之OCT4、NANOG、SOX2、ECAD等表現量減少，胚胎內胚葉細胞之標誌基因之SOX17、CER、FOXA2、CXCR4等表現量亢進。
且，為了提高朝向胚胎內胚葉細胞之分化效率，必須 降低培養基中的血清濃度，但為了提高細胞之生存率，以提高培養基中之血清濃度為佳。
因此，以將步驟(A1)分為以無血清之第1培養基進行培養之步驟(A1-1)，與以低血清之第2培養基進行培養之步驟(A1-2)為佳。
步驟(A1-1)中使用之第1培養基，除無血清之外以與上述相同為佳。亦即，第1培養基係含有屬於TGF-β超家族之生長因子，其他，亦可含有屬於Wnt家族之生長因子。該第1培養基以含有屬於Wnt家族之生長因子為佳。
步驟(A1-1)的培養期間係例如1~3天，以1~2天為佳。藉由該培養，可使多功能性幹細胞朝向中內胚葉細胞之分化進行。
朝向中內胚葉細胞之分化誘導之進行，除了依據形態學上之觀察，亦可利用RT-PCR確認基因表現而評價。隨著自多功能幹細胞朝向中內胚葉細胞分化之進行，幹細胞之標誌基因之OCT4、NANOG、SOX2、ECAD等表現量減少，中內胚葉細胞之標誌基因之BRA、FGF4、WNT3、NCAD等表現量亢進。
步驟(A1-2)中使用之第2培養基，除低血清之外以與上述相同為佳。亦即，第2培養基係含有屬於TGF-β超家族之生長因子，其他，亦可含有屬於Wnt家族之生長因子。血清濃度以0.05~2%(v/v)為佳，0.05~1%(v/v)更佳，0.1~0.5%(v/v)最佳。
步驟(A1-2)的培養期間係例如1~3天，以1~2天為 佳。藉由該培養，可使中內胚葉細胞朝向胚胎內胚葉細胞之分化進行。
如上所述，朝向胚胎內胚葉細胞之分化誘導之進行，除了依據形態學上之觀察，亦可利用RT-PCR確認基因表現而評價。
且，所得之細胞亦可於進行下一個步驟(B1)之前，利用周知之方法進行濃縮、分離及/或純化。
(步驟(B1))
步驟(B1)中係將步驟(A1)中所得之細胞於FGF存在下進行培養。
FGF係可舉出FGF-1、FGF-2(bFGF)、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、FGF-10、FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14、FGF-15、FGF-16、FGF-17、FGF-18、FGF-19、FGF-20、FGF-21、FGF-22、FGF-23等，以FGF-2(bFGF)、FGF-5、FGF-7、FGF-10為佳。
FGF之濃度以5~150ng/mL為佳，以10~100ng/mL更佳，以20~80ng/mL最佳。
另外步驟(B1)中以於培養基中添加刺蝟因子傳遞路徑阻礙劑為佳。藉由與FGF一同添加刺蝟因子傳遞路徑阻礙劑，可提高分化效率。
刺蝟因子傳遞路徑阻礙劑係可舉出、KAAD-環巴胺(28-[2-[[6-[(3-苯丙醯基)胺]己醯基]胺]乙基]-17 β,23 β-環 氧藜芦烷-3-酮)、KAAD-環巴胺之類似體、蒜藜蘆鹼(17,23 β-環氧-3 β-羥基藜芦烷-11-酮)、蒜藜蘆鹼之類似體、刺蝟因子傳遞路徑阻礙抗體等，其中以KAAD-環巴胺為佳。
刺蝟因子傳遞路徑阻礙劑之濃度係以0.01~5μM為佳，0.02~2μM更佳，0.1~0.5μM最佳。
培養使用之容器，與步驟(A1)相同為佳。培養基除上述各因子與血清濃度之外以與步驟(A1)相同為佳。培養基血清濃度以0.1~5%(v/v)為佳，0.5~5%(v/v)更佳，1~5%(v/v)最佳。
且於步驟(A1)中使用低血清培養基時，步驟(B1)以使用較步驟(A1)為高血清濃度之培養基為佳。
較合適之實施方式係使用經添加FGF-10、KAAD-環巴胺、盤尼西林或鏈霉素等抗生素、含有L-麩醯胺酸或L-麩胺酸之二胜肽之低血清RPMI1640培養基。
步驟(B1)的培養期間係例如1~6天，以2~4天為佳。
分化誘導之進行，除了依據形態學上之觀察，亦可利用RT-PCR確認基因表現而評價。隨著分化之進行，HNF1B、HNF4A等基因表現量亢進。
且，所得之細胞亦可於進行下一個步驟(C1)之前，利用周知之方法進行濃縮、分離及/或純化。
(步驟(C1))
步驟(C1)係將步驟(B1)中所得之細胞於類視色素存在下進行培養。
類視色素係可舉出視黃醇、視黃醛、維生素A酸等，其中以維生素A酸為佳。
類視色素之濃度以0.2~10μM為佳，0.4~8μM更佳，1~4μM最佳。
另外步驟(C1)中，以於培養基中添加刺蝟因子傳遞路徑阻礙劑為佳。藉由與類視色素一同添加刺蝟因子傳遞路徑阻礙劑，可提高分化效率。
刺蝟因子傳遞路徑阻礙劑係可舉出、KAAD-環巴胺、KADD-環巴胺之類似體、蒜藜蘆鹼、蒜藜蘆鹼之類似體、刺蝟因子傳遞路徑阻礙抗體等，其中以KAAD-環巴胺為佳。
刺蝟因子傳遞路徑阻礙劑之濃度係以0.01~5μM為佳，0.02~2μM更佳，0.1~0.5μM最佳。
另外步驟(C1)中，以於培養基中添加FGF為佳。藉由與類視色素一同添加FGF，可提高分化效率。
FGF係可舉出FGF-1、FGF-2(bFGF)、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、FGF-10、FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14、FGF-15、FGF-16、FGF-17、FGF-18、FGF-19、FGF-20、FGF-21、FGF-22、FGF-23等，以FGF-2(bFGF)、FGF-5、FGF-7、FGF-10為佳。
FGF之濃度以0.5~50ng/mL為佳，以1~25ng/mL更 佳，以2~10ng/mL最佳。
另外步驟(C1)中，亦可於培養基中添加屬於TGF-β超家族之生長因子。
屬於TGF-β超家族之生長因子之濃度以5~250ng/mL為佳，以10~200ng/mL更佳，以20~150ng/mL最佳。
培養使用之容器，係與步驟(B1)相同為佳。培養基除上述各因子之外，與基本的步驟(B1)相同為佳。但是，培養基中以添加取代血清之血清替代物為佳。血清替代物可購自市售之Invitrogen製之B-27TM營養補充品、N-2營養補充品、KnockoutTM血清替代物等。其中以B-27TM營養補充品為佳。
B-27TM營養補充品之濃度，以0.1~10%(v/v)為佳，0.2~5%(v/v)更佳，0.4~2.5%(v/v)最佳。且由於該B-27TM營養補充品係以50倍濃縮溶液於市面販售，欲將B-27TM營養補充品使用為濃度0.1~10%(v/v)時，以稀釋5~500倍再添加於培養基中為佳。
較合適之實施方式係使用經添加維生素A酸、KAAD-環巴胺、FGF-10、盤尼西林或鏈霉素等抗生素、B-27TM營養補充品之無血清的DMEM/漢斯F12培養基。
步驟(C1)的培養期間係例如1~6天，以2~4天為佳。
分化誘導之進行，除了依據形態學上之觀察，亦可利用RT-PCR確認基因表現而評價。隨著分化之進行， PDX1、HNF6、HLXB9等基因表現量亢進。
且，所得之細胞亦可於進行下一個步驟(D1)之前，利用周知之方法進行濃縮、分離及/或純化。
(步驟(D1))
步驟(D1)係將於步驟(C1)所得之細胞於丙型分泌素(γ-secretase)阻礙劑存在下進行培養。
丙型分泌素阻礙劑係可舉出DAPT(N-[N-(3,5-二氟苯乙醯)-L-丙氨基]-S-苯基甘氨酸三丁基酯)、L-685458(1S-卞基-4R-[1-(1S-胺甲醯-2-苯乙基胺甲醯)-1S-3-甲基丁基胺甲醯]-2R-羥基-5-苯基戊基)羧酸三丁基酯)等，其中以DAPT為佳。
丙型分泌素阻礙劑之濃度係以1~50μM為佳，2~40μM更佳，5~20μM最佳。
另外步驟(D1)中，以於培養基中添加Exendin-4為佳。藉由與丙型分泌素阻礙劑一同添加Exendin-4，可提高分化效率。
Exendin-4之濃度以5~150ng/mL為佳，以10~100ng/mL更佳，以20~80ng/mL最佳。
培養使用之容器或培養基，係與步驟(C1)相同為佳。亦即，於培養基中添加血清替代物為佳。
較合適之實施方式係使用經添加DAPT、Exendin-4、盤尼西林或鏈霉素等抗生素、B-27TM營養補充品之無血清的DMEM/漢斯F12培養基。
步驟(D1)的培養期間係例如1~6天，以2~3天為佳。
分化誘導之進行，除了依據形態學上之觀察，亦可利用RT-PCR確認基因表現而評價。隨著分化之進行，NKX6-1、NGN3、PAX4、NKX2-2等基因表現量亢進。
且，所得之細胞亦可於進行下一個步驟(E1)之前，利用周知之方法進行濃縮、分離及/或純化。
(步驟(E1))
步驟(E1)係將於步驟(D1)所得之細胞於選自促胰島素分泌素(Exendin-4)、HGF、IGF-1以及菸鹼醯胺所成之群中至少1種之因子存在下進行培養。
Exendin-4、HGF、IGF-1以及菸鹼醯胺，係以添加其中之2種以上為佳，添加3種以上更佳。
Exendin-4之濃度係以5~150nM為佳，10~100nM更佳，20~80nM最佳。
HGF之濃度以5~150ng/mL為佳，以10~100ng/mL更佳，以20~80ng/mL最佳。
IGF-1之濃度以5~150ng/mL為佳，以10~100ng/mL更佳，以20~80ng/mL最佳。
菸鹼醯胺之濃度係以1~30mM為佳，3~20mM更佳，5~15mM最佳。
培養使用之容器，係與步驟(D1)相同為佳。亦即，於培養基中添加血清替代物為佳。
較合適之實施方式係使用經添加Exendin-4、HGF、IGF-1、盤尼西林、鏈霉素等抗生素、B-27TM營養補充品之無血清的CMRL1066培養基。
步驟(E1)的培養期間係例如3~20天，以3~10天為佳。
藉由步驟(E1)可獲得胰臟荷爾蒙產生細胞。
朝向胰臟荷爾蒙產生細胞之分化誘導之進行，除了確認胰島素、昇糖素、體抑素等胰臟荷爾蒙之產生之外，亦可利用RT-PCR確認基因表現而評價。隨著分化之進行，INS、GCG、GHRL、SST、PPY等之中至少1個基因表現量亢進。
[第2個分化誘導方法]
第2個分化誘導方法係以非專利文件4中記載之方法為準者。該文獻係來自參照資料援用於本申請案中。
第2個分化誘導方法係包含下述步驟(A2)~(D2)。於其中至少1個步驟中，於培養基中添加上述(d)或(e)之胜肽。且，於某步驟中添加分化誘導促進劑時，可於該步驟的最初進行添加，亦可於該步驟之途中進行添加。添加上述(d)或(e)之胜肽之步驟可為步驟(C2)~(D2)之至少1個之步驟，以於步驟(A2)~(D2)全部的步驟中添加上述(d)或(e)之胜肽為佳。
(A2)係於存在至少1種選自屬於TGF-β超家族(TGF-β superfamily)生長因子、屬於Wnt家族生長因子以及 GSK-3(肝醣合成酶激酶-3)阻礙劑所成群之至少1種因子之情況下培養多功能幹細胞之步驟。
(B2)於屬於TGF-β超家族生長因子之存在下培養上述步驟(A2)所得細胞之步驟。
(C2)於類視色素之存在下培養上述步驟(B2)所得細胞之步驟。
(D2)於cAMP(環磷酸腺苷)增加劑、地塞米松(dexamethasone)、TGF-β 1型受體阻礙劑、以及菸鹼醯胺所成群中選擇至少1種之因子之存在下培養上述步驟(C2)所得細胞之步驟。
(步驟(A2))
步驟(A2)係於存在至少1種選自屬於TGF-β超家族生長因子、屬於Wnt家族生長因子以及GSK-3阻礙劑所成群之至少1種因子之情況下培養多功能幹細胞之步驟。
屬於TGF-β超家族之生長因子係可舉出活化素、nodal、BMP等，其中以活化素為佳。活化素可舉出活化素A、活化素B、活化素AB等，其中以活化素A為佳。
屬於TGF-β超家族之生長因子的濃度，以5~250ng/mL為佳，10~200ng/mL更佳，50~150ng/mL最佳。
另外，屬於Wnt家族生長因子係可舉出Wnt1、Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a等，以Wnt1、Wnt3a為佳，Wnt3a更佳。
屬於Wnt家族生長因子的濃度，以1~1000ng/mL為佳，10~100ng/mL更佳，10~50ng/mL最佳。
GSK-3阻礙劑可使用GSK-3 α阻礙劑以及GSK-3 β阻礙劑之任一種，但以使用GSK-3 β阻礙劑為佳。具體例可舉出CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]胺基]乙基]胺基]-3-氰基吡啶)、SB415286(3-[(3-氯-4-羥苯基)胺基]-4-(2-硝基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮)、SB216763(3-[(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮]、靛紅-3'-一肟(3-[(3E)-3-(肟基)-2,3-二氫-1H-吲哚-2-亞基]-2,3-二氫-1H-吲哚-2-酮)、Kenpaullone(7,8-二氫-9-溴吲哚[3,2-d][1]苯並氮雜卓-6(5H)-酮)等，其中以CHIR99021為佳。
GSK-3阻礙劑之濃度係以0.01~20μM為佳，0.1~20μM更佳，1~5μM最佳。
另外步驟(A2)中，亦可為獲得提高分化效率而於培養基中添加追加之因子。例如可舉出PDGF、EGF、VEGF、KGF、HGF、NGF、GDF、GLP、菸鹼醯胺、促胰島素分泌素(Exendin-4)、維生素A酸、乙醇胺、副甲狀腺荷爾蒙、黃體素、抑肽酶、氫羥腎上腺皮質素、胃泌激素、類固醇生物鹼、銅螯合劑(三乙烯基五胺等)、毛喉素、酪酸鈉、頭蛋白、丙基戊酸、曲古抑菌素A、印度刺蝟因子、音蝟因子、蛋白酶體阻礙劑、刻痕傳遞路徑阻礙劑、刺蝟因子傳遞路徑阻礙劑等。
用於培養之容器，自分化誘導能力、功能表現能力、 生存能力之觀點，以使用適合生體材料之舖設有台架之培養盤為佳。台架係可舉出基膜素、纖維黏連蛋白、膠原蛋白、硫酸肝素蛋白多醣、明膠、內動素、聚鳥胺酸等。市售品可購入Becton Dickinson製之MATRIGELTM、減少生長因子之MATRIGELTM等。特別以使用舖設有MATRIGELTM之培養盤為佳。
用於培養之培養基，可於可使用於培養動物細胞之基本培養基中，添加維持細胞生長所必須的各種營養來源與其他成分而製作。
基本培養基可舉出RPMI1640培養基、DMEM培養基、CMRL1066培養基、漢斯F12培養基、醫格爾MEM培養基、格勞MEM培養基、IMEM Zinc Option培養基、IMDM培養基、威廉E培養基、費雪培養基、麥考培養基、BME培養基、α MEM培養基、BGJb培養基、培養基199培養基或該等之混合培養基等。
營養來源可舉出例如甘油、葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、澱粉、糊精等碳素源；脂肪酸、油脂、卵磷脂、醇類等烴類；硫酸銨、硝酸銨、氯化銨、尿素、硝酸鈉等氮源；鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、磷酸鹽等無機鹽類；各種維他命類；各種胺基酸類等。
其他成分可舉出盤尼西林、鏈霉素等抗生素；霍亂毒素；胰島素；運鐵蛋白；亞硒酸；白蛋白；2-巰基乙醇；血清或血清代替物等。其中胰島素、運鐵蛋白以及亞硒酸，可購自市售之Invitrogen製之ITS-X、ITS-A、ITS-G 等。另外血清替代物，可購自市售之Invitrogen製之B-27TM營養補充品、N-2營養補充品、KnockoutTM血清替代物等。
步驟(A2)中，為了提高分化效率已知非常重要的是充分降低培養基中的胰島素、IGF等含量。因此，步驟(A2)中，以使用無血清培養基或低血清培養基為佳。血清濃度以0~3%(v/v)為佳，0~2%(v/v)更佳。
較合適之實施方式係使用經添加活化素A、CHIR99021之低血清RPMI1640培養基。
步驟(A2)的培養期間係例如1~3天，以1~2天為佳。
(步驟(B2))
步驟(B2)係於TGF-β超家族生長因子存在之情況下培養步驟(A2)所得之細胞。
屬於TGF-β超家族之生長因子係可舉出活化素、nodal、BMP等，其中以活化素為佳。活化素可舉出活化素A、活化素B、活化素AB等，其中以活化素A為佳。
屬於TGF-β超家族之生長因子的濃度，以5~250ng/mL為佳，10~200ng/mL更佳，50~150ng/mL最佳。
用於培養之容器或培養基可與步驟(A2)相同。亦即，較合適之實施方式係使用經添加活化素A之低血清RPMI1640培養基。
步驟(B2)的培養期間係例如1~4天，以1~3天為佳。
(步驟(C2))
步驟(C2)係於類視色素存在下培養步驟(B2)所得細胞。
類視色素係可舉出視黃醇、視黃醛、維生素A酸等，其中以維生素A酸為佳。
類視色素之濃度以0.2~10μM為佳，0.4~8μM更佳，1~4μM最佳。
另外步驟(C2)中，以於培養基中添加BMP受體阻礙劑為佳。
BMP受體阻礙劑可舉出Dorsomorphin(6-[4-2-(1-吡啶基)乙氧基]苯基)-3-(4-吡啶)吡唑[1,5-a]嘧啶)、LDN-193189(4-(6-(4-(呱-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)喹啉)等，其中以Dorsomorphin為佳。
BMP受體阻礙劑之濃度以0.2~5μM為佳，0.3~3μM更佳，0.5~2μM最佳。
另外步驟(C2)中，以於培養基中添加TGF-β 1型受體阻礙劑為佳。
TGF-β 1型受體阻礙劑可舉出SB431542(4-[4-(1,3-苯并二唑-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]-苯醯胺)、SB525334(6-[2-(1,1-二甲基乙基)-5-(6-甲基-1,2-吡啶基)-1H-咪唑-4-基]喹喔啉)、LY364947(4-3-(2-吡啶)-1H-吡唑- 4-基-喹喔啉)等，其中以SB431542為佳。另外，TGF-β 1型受體阻礙劑亦可使用Calbiochem製之Alk5抑制劑II。
TGF-β 1型受體阻礙劑之濃度以1~50μM為佳，2~30μM更佳，5~20μM最佳。
培養使用之容器，係與步驟(B2)相同為佳。培養基除上述各因子之外，與基本的步驟(B2)相同為佳。但是，培養基中以添加取代血清之血清替代物為佳。血清替代物可購自市售之Invitrogen製之B-27TM營養補充品、N-2營養補充品、KnockoutTM血清替代物等。其中以B-27TM營養補充品為佳。
B-27TM營養補充品之濃度，以0.1~10%(v/v)為佳，0.2~5%(v/v)更佳，0.4~2.5%(v/v)最佳。且由於該B-27TM營養補充品係以50倍濃縮溶液於市面販售，欲將B-27TM營養補充品使用為濃度0.1~10%(v/v)時，以稀釋5~500倍再添加於培養基中為佳。
較合適之實施方式係使用經添加維生素A酸、Dorsomorphin、SB431542、B-27TM營養補充品之無血清的IMEM Zinc Option培養基。
步驟(C2)的培養期間係例如5~9天，以6~8天為佳。
(步驟(D2))
步驟(D2)係於存在至少1種選自cAMP增加劑、地塞米松(dexamethasone)、TGF-β 1型受體阻礙劑以及菸鹼醯 胺所成群之至少1種因子之情況下培養步驟(C2)所得之細胞。
cAMP增加劑、地塞米松(dexamethasone)、TGF-β 1型受體阻礙劑以及菸鹼醯胺，係以添加其中之2種以上為佳，添加3種以上更佳。
cAMP增加劑係可舉出毛喉素等腺苷酸環化酶活化劑；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤等磷酸二酯酶阻礙劑；雙丁醯cAMP等cAMP類似物；等，其中以毛喉素為佳。
cAMP增加劑之濃度係以1~50μM為佳，2~30μM更佳，5~20μM最佳。
地塞米松(dexamethasone)之濃度以1~50μM為佳，2~30μM更佳，5~20μM最佳。
TGF-β 1型受體阻礙劑可舉出SB431542、SB525334、LY364947等，其中以SB431542為佳。另外，TGF-β 1型受體阻礙劑亦可使用Calbiochem製之Alk5抑制劑II。
TGF-β 1型受體阻礙劑之濃度以1~50μM為佳，2~30μM更佳，5~20μM最佳。
菸鹼醯胺之濃度係以1~30mM為佳，3~20mM更佳，5~15mM最佳。
培養使用之容器，係與步驟(C2)相同為佳。亦即，於培養基中添加血清替代物為佳。
較合適之實施方式係使用經添加毛喉素、地塞米松、Alk5抑制劑II、菸鹼醯胺、B-27TM營養補充品之無血清 的IMEM Zinc Option培養基。
步驟(D2)的培養期間係例如9~13天，以10~12天為佳。
藉由步驟(D2)可獲得胰臟荷爾蒙產生細胞。
朝向胰臟荷爾蒙產生細胞之分化誘導之進行，除了確認胰島素、昇糖素、體抑素等胰臟荷爾蒙之產生之外，亦可利用RT-PCR確認基因表現而評價。隨著自多功能幹細胞朝向胰臟荷爾蒙產生細胞分化之進行，胰臟荷爾蒙產生細胞的標誌基因之INS、GCG、GHRL、SST、PPY等之中至少1個基因表現量亢進。
<自胰臟組織幹/前驅細胞朝向胰臟荷爾蒙產生細胞之分化誘導>
自胰臟組織幹/前驅細胞朝向胰臟荷爾蒙產生細胞之分化誘導過程中，可於培養基中添加上述(d)或(e)之胜肽。自胰臟組織幹/前驅細胞朝向胰臟荷爾蒙產生細胞之分化誘導方法，可採用任一種先前已知之方法，並無特別限制。培養基中上述(d)或(e)之胜肽濃度係以10~200ng/mL為佳，50~150ng/mL更佳，60~120ng/mL最佳。
以下，舉出自胰臟組織幹/前驅細胞朝向胰臟荷爾蒙產生細胞之分化誘導方法之1例，但並非限定於該例示。
以下之分化誘導方法係以非專利文件2中記載之方法為準者。該文獻係來自參照資料援用於本申請案中。
該分化誘導方法係包含下述步驟(A3)~(E3)。於其中至少1個步驟中，於培養基中添加上述(d)或(e)之胜肽。且，於某步驟中添加分化誘導促進劑時，可於該步驟的最初進行添加，亦可於該步驟之途中進行添加。添加上述(d)或(e)之胜肽之步驟，可於步驟(D3)~(E3)之至少1個步驟，亦可於步驟(A3)~(E3)全部之步驟中，添加上述(d)或(e)之胜肽為佳。
(A3)係於非存在屬於TGF-β超家族生長因子、類視色素、FGF以及菸鹼醯胺之情況下培養胰臟組織幹/前驅細胞之步驟。
(B3)於屬於TGF-β超家族生長因子之存在下培養上述步驟(A3)所得細胞之步驟。
(C3)於類視色素之存在下培養上述步驟(B3)所得細胞之步驟。
(D3)於FGF之存在下培養上述步驟(C3)所得細胞之步驟。
(E3)於菸鹼醯胺之存在下培養上述步驟(D3)所得細胞之步驟。
(步驟(A3))
步驟(A3)係於非存在屬於TGF-β超家族生長因子、類視色素、FGF以及菸鹼醯胺之情況下培養胰臟組織幹/前驅細胞。
用於培養之容器，自分化誘導能力、功能表現能力、 生存能力之觀點，以使用適合生體材料之舖設有台架之培養盤為佳。台架係可舉出基膜素、纖維黏連蛋白、膠原蛋白、硫酸肝素蛋白多醣、明膠、內動素、聚鳥胺酸等。市售品可購入Becton Dickinson製之MATRIGELTM、減少生長因子之MATRIGELTM等。特別以使用舖設有MATRIGELTM之培養盤為佳。
用於培養之培養基，可於可使用於培養動物細胞之基本培養基中，添加維持細胞生長所必須的各種營養來源與其他成分而製作。
基本培養基可舉出RPMI1640培養基、DMEM培養基、CMRL1066培養基、漢斯F12培養基、醫格爾MEM培養基、格勞MEM培養基、IMEM Zinc Option培養基、IMDM培養基、威廉E培養基、費雪培養基、麥考培養基、BME培養基、α MEM培養基、BGJb培養基、培養基199培養基或該等之混合培養基等。
營養來源可舉出例如甘油、葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、澱粉、糊精等碳素源；脂肪酸、油脂、卵磷脂、醇類等烴類；硫酸銨、硝酸銨、氯化銨、尿素、硝酸鈉等氮源；鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、磷酸鹽等無機鹽類；各種維他命類；各種胺基酸類等。
其他成分可舉出盤尼西林、鏈霉素等抗生素；霍亂毒素；胰島素；運鐵蛋白；亞硒酸；白蛋白；2-巰基乙醇；血清或血清代替物等。其中胰島素、運鐵蛋白以及亞硒酸，可購自市售之Invitrogen製之ITS-X、ITS-A、ITS-G 等。另外血清替代物，可購自市售之Invitrogen製之B-27TM營養補充品、N-2營養補充品、KnockoutTM血清替代物等。
較合適之實施方式係使用經添加盤尼西林、鏈霉素等抗生素、胰島素、轉鐵蛋白、亞硒酸、2-巰基乙醇、白蛋白之無血清的DMEM/漢斯F12培養基。
胰島素的濃度，以2~30μg/mL為佳，5~20μg/mL更佳。轉鐵蛋白的濃度，以1~20μg/mL為佳，3~10μg/mL更佳。亞硒酸的濃度，以1~20ng/mL為佳，5~20ng/mL更佳。2-巰基乙醇的濃度，以50~200μM為佳，50~100μM更佳。白蛋白的濃度，以1~10ng/mL為佳，2~5ng/mL更佳。
步驟(A3)的培養期間係例如1~3天，以1~2天為佳。
(步驟(B3))
步驟(B3)係於TGF-β超家族生長因子存在之情況下培養步驟(A3)所得之細胞。
屬於TGF-β超家族之生長因子係可舉出活化素、nodal、BMP等，其中以活化素為佳。活化素可舉出活化素A、活化素B、活化素AB等，其中以活化素A為佳。
屬於TGF-β超家族之生長因子的濃度，以5~250ng/mL為佳，10~200ng/mL更佳，50~150ng/mL最佳。
用於培養之容器或培養基可與步驟(A3)相同。培養基除添加屬於TGF-β超家族之生長因子，與步驟(A3)相同為佳。亦即，較合適之實施方式係使用經添加盤尼西林、鏈霉素等抗生素、胰島素、轉鐵蛋白、亞硒酸、2-巰基乙醇、白蛋白之無血清的DMEM/漢斯F12培養基。
步驟(B3)的培養期間係例如2~6天，以3~5天為佳。
(步驟(C3))
步驟(C3)係於類視色素存在下培養步驟(B3)所得細胞。
類視色素係可舉出視黃醇、視黃醛、維生素A酸等，其中以全反式維生素A酸為佳。
類視色素之濃度以0.2~10μM為佳，0.4~8μM更佳，1~4μM最佳。
培養使用之容器，係與步驟(A3)相同為佳。培養基除添加屬於TGF-β超家族之生長因子，與步驟(A3)相同為佳。
較合適之實施方式係使用經添加全反式維生素A酸、盤尼西林、鏈霉素等抗生素、胰島素、轉鐵蛋白、亞硒酸、2-巰基乙醇、白蛋白之無血清的DMEM/漢斯F12培養基。
步驟(C3)的培養期間係例如2~6天，以3~5天為佳。
(步驟(D3))
步驟(D3)係於FGF之存在下培養步驟(C3)所得細胞之步驟。
FGF係可舉出FGF-1、FGF-2(bFGF)、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、FGF-10、FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14、FGF-15、FGF-16、FGF-17、FGF-18、FGF-19、FGF-20、FGF-21、FGF-22、FGF-23等，以FGF-2(bFGF)、FGF-5、FGF-7、FGF-10為佳。
FGF之濃度以1~30ng/mL為佳，以2~20ng/mL更佳，以5~15ng/mL最佳。
培養使用之容器，係與步驟(A3)相同為佳。培養基除添加FGF外，基本上與步驟(C3)相同為佳。
較合適之實施方式係使用經添加FGF-2(bFGF)、盤尼西林、鏈霉素等抗生素、胰島素、轉鐵蛋白、亞硒酸、白蛋白之無血清的DMEM/漢斯F12培養基。
步驟(D3)的培養期間係例如1~5天，以2~4天為佳。
(步驟(E3))
步驟(E3)係於菸鹼醯胺之存在下培養步驟(D3)所得細胞之步驟。
菸鹼醯胺之濃度係以1~30mM為佳，3~20mM更佳，5~15mM最佳。
於步驟(E3)中，以於培養基中添加FGF為佳。
FGF係可舉出FGF-1、FGF-2(bFGF)、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、FGF-10、FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14、FGF-15、FGF-16、FGF-17、FGF-18、FGF-19、FGF-20、FGF-21、FGF-22、FGF-23等，以FGF-2(bFGF)、FGF-5、FGF-7、FGF-10為佳。
FGF之濃度以1~30ng/mL為佳，以2~20ng/mL更佳，以5~15ng/mL最佳。
培養使用之容器，係與步驟(A3)相同為佳。培養基除添加菸鹼醯胺外，基本上與步驟(D3)相同為佳。
較合適之實施方式係使用經添加菸鹼醯胺、FGF-2(bFGF)、盤尼西林、鏈霉素等抗生素、胰島素、轉鐵蛋白、亞硒酸、白蛋白之無血清的DMEM/漢斯F12培養基。
步驟(E3)的培養期間係例如3~20天，以3~10天為佳。
藉由步驟(E3)可獲得胰臟荷爾蒙產生細胞。
朝向胰臟荷爾蒙產生細胞之分化誘導之進行，除了確認胰島素、昇糖素、體抑素等胰臟荷爾蒙之產生之外，亦可利用RT-PCR確認基因表現而評價。隨著自胰臟組織幹/前驅細胞朝向胰臟荷爾蒙產生細胞分化之進行，胰臟荷爾蒙產生細胞的標誌基因之INS、GCG、GHRL、SST、PPY等之中至少1個基因表現量亢進。
《再生醫療型胰臟荷爾蒙產生細胞之形成方法》
與本發明有關之再生醫療型胰臟荷爾蒙產生細胞之形成方法，係包含與本發明有關之增殖方法及/或與本發明有關之分化形成方法。
如上所述，根據與本發明有關之分化形成方法，可有效率地自多功能幹細胞或胰臟組織幹/前驅細胞，朝向胰臟荷爾蒙產生細胞分化誘導。另外，與本發明有關之增殖方法，可促進胰臟荷爾蒙產生細胞之增殖。因此，可藉由將該等方法單獨或組合使用，形成適合再生醫療之胰臟荷爾蒙產生細胞群。該胰臟荷爾蒙產生細胞群係可為胰島狀細胞塊，亦可為胰島狀細胞薄膜。另外，胰臟荷爾蒙產生細胞群以含有α細胞或β細胞為佳。
[圖1]顯示於培養基中添加由序列編號1記載之胺基酸序列構成之胜肽(貝達及寧(betagenin))後，對胰臟β細胞株之增殖促進作用之圖。
[圖2]表示自人類iPS細胞(253G1細胞)誘導分化為產生胰臟荷爾蒙細胞之過程中，於培養基中添加由序列編號1記載之胺基酸序列構成之胜肽(貝達及寧)時，藉由分化誘導所得之細胞中胰島素的相對表現量之圖。
[圖3]表示自人類iPS細胞(200-9細胞、TIG3/KOSM細胞、或253G1細胞)誘導分化為產生胰臟荷爾蒙 細胞之過程中，於培養基中添加由序列編號1記載之胺基酸序列構成之胜肽(貝達及寧)時，藉由分化誘導所得之細胞中C胜肽陽性細胞或胰島素陽性細胞之比例之圖。
[圖4]表示將經轉殖編碼由序列編號1記載之胺基酸序列構成之胜肽(貝達及寧)、由序列編號2記載之胺基酸序列構成之DNA之多肽(IBCAP)之表現載體之HEK293T細胞的培養上清液(IBCAP培養上清液)、或經轉殖空載體之HEK293T細胞的培養上清液(Mock培養上清液)，添加至培養基後，對胰臟β細胞株之增殖促進作用之圖。
[圖5]表示將由序列編號1記載之胺基酸序列構成之胜肽(貝達及寧)、或由序列編號4~6記載之胺基酸序列構成之胜肽(胜肽A、B、C)，添加至培養基後，對胰臟β細胞株之增殖促進作用之圖。
[圖6]表示自人類iPS細胞(253G1細胞)誘導分化為產生胰臟荷爾蒙細胞之過程中，於培養基中添加由序列編號1記載之胺基酸序列構成之胜肽(貝達及寧)時，藉由分化誘導所得之細胞中胰島素的相對表現量之圖。
[圖7]表示自人類iPS細胞(253G1細胞)誘導分化為產生胰臟荷爾蒙細胞之過程中，於培養基中添加由序列編號1記載之胺基酸序列構成之胜肽(貝達及寧)時，藉由分化誘導所得之細胞中升糖素的相對表現量之圖。
[圖8]表示自人類iPS細胞(253G1細胞)誘導分化為產生胰臟荷爾蒙細胞之過程中，於培養基中添加由序列編號1記載之胺基酸序列構成之胜肽(貝達及寧)時，藉由分化 誘導所得之細胞中體抑素的相對表現量之圖。
[實施例]
以下利用實施例詳細說明本發明，但本發明不應被解釋為因下述記載而有任何限制者。
<實施例1：胰臟β細胞的增殖促進(1)>
使用提供自大阪大學Dr.Miyazaki之MIN6細胞，作為胰臟β細胞株。將MIN6細胞維持於經添加15%(v/v)FBS之DMEM培養基中。
首先，於舖設有膠原蛋白之8孔細胞培養盤(BD Falcon，製造編號354630)，使MIN6細胞以1×104個/孔之細胞密度進行播種。24小時後，更換添加0.5%(v/v)FBS之DMEM培養基，進行72小時之缺乏血清(血清飢餓)培養。且，自缺乏血清(血清飢餓)培養開始之48小時後，更換新的培養基。之後，於進行缺乏血清(血清飢餓)培養開始72小時後之培養基中，添加化學合成之由記載於序列編號1之胺基酸序列所構成之胜肽(貝達及寧(betagenin))，使其最終濃度成為0.3nM或1nM。控制組係添加等量的貝達及寧之溶媒之二甲基亞碸(DMSO)。
添加貝達及寧或DMSO後24小時，添加5-乙炔基2’-脫氧尿苷(EdU)使其最終濃度成為10μM，並培養2小時。之後，使用Click-iTTM EdU Alexa FlourTM 594 Imaging Kit(Invitrogen，製造編號C10339)，依據所附說明書進行細胞增殖分析。
將攝取入細胞之EdU，利用Alexa FlourTM 594可視化為紅色螢光，使用螢光顯微鏡(Carl Zeiss)觀察。控制組中將螢光強度定為1.0時，相對應的螢光強度示於圖1。
如圖1所示般，藉由添加貝達及寧，可使相對EdU螢光強度增大為2.7~2.8倍。
自該結果，可得知藉由於培養基中添加貝達及寧，可促進MIN6細胞增殖。
<實施例2：自人類iPS細胞向胰臟荷爾蒙產生細胞之分化誘導(1)>
人類iPS細胞係購自理化學研究所細胞銀行之253G1細胞、及提供自埼玉醫科大學Dr.Mitani之TIG3/KOSM細胞、以及經於TIG3/KOSM細胞導入報導基因(Reporter gene)轉殖後之200-9細胞。TIG3/KOSM細胞係藉由使用仙台病毒於TIG3細胞中導入4個因子(OCT基因、KLF基因、SOX基因、MYC基因)，由產業技術綜合研究所建立之細胞株(Nishimura,K.et al.,J.Biol.Chem.,286,pp.4760-4771(2011))。
該等細胞係於經添加4ng/mL FGF-2(Global Stem)以及盤尼西林/鏈霉素(Nakaraifutekrsu)之ES細胞用培養基(DMEM/漢斯F12，20%之KSR，非必須胺基酸，2mM之L-麩醯胺酸，0.1mM之2-巰基乙醇，5.2mM之NaOH) 內，與經絲裂黴素C處理之SNL76/7細胞(DS Pharma Biomedical)一同進行培養、維持。剝離細胞時係使用CTK(於PBS中含0.25%之胰蛋白酶，Img/mL之膠原蛋白酶IV，20%之KSR，1mM之CaCl2)，以1：3~1：4之比例稀釋後進行繼代培養。
於開始進行分化誘導的3天前，使用胰蛋白酶-EDTA剝離細胞，以6.3×104個/cm2之細胞密度進行播種，再於經添加10μM之Y-27632(Wako)、4ng/mL之FGF-2以及盤尼西林/鏈霉素之ES細胞用培養基中，與經絲裂黴素C處理之STO細胞一同進行培養1天。之後，再於經添加4ng/mL之FGF-2以及盤尼西林/鏈霉素之ES細胞用培養基中再培養2天。
進行分化誘導的第一天，以添加了2%(v/v)之FBS、100ng/mL之活化素A(SBI)、以及3μM之CHIR99021(Axon Medchem)之RPMI1640培養基(Nakaraitekusu)更換掉舊培養基，並進行培養1天(步驟(A2))。
其次，以添加了2%(v/v)之FBS以及100ng/mL之活化素A之RPMI1640培養基更換掉舊的培養基，並進行培養2天(步驟(B2))。
其次，以添加了1%(v/v)之B-27TM營養補充品(Invitrogen)製、1μM之Dorsomorphin(Calbiiochem)、2μM之維生素A酸(Sigma)以及10μM之SB431542(Sigma)之IMEM Zinc Option培養基(Gibco)更換掉舊的培養基，並進行培養7天(步驟(C2))。
最後，以添加了1%(v/v)之B-27TM營養補充品、10μM之毛喉素(Wako)、10μM之地塞米松(Wako)、5μM之Alk5抑制劑II(Calbiiochem)、10μM之菸鹼醯胺(Wako)、以及3nM的貝達及寧之IMEM Zinc Option培養基更換掉舊的培養基，並進行培養11天(步驟(D2))。控制組係使用添加等量的貝達及寧之溶媒之DMSO。
(定量RT-PCR分析)
針對經過上述步驟(A2)~(D2)由253G1細胞所得之細胞(添加貝達及寧群、控制組群分別為n=2)，以定量RT-PCR確認胰島素的基因表現。具體而言，首先使用SV Total RNA Isolation System(Promega)，自細胞萃取total RNA，再利用BioScriptTM transcriptase(Bioline)進行逆轉錄反應後，再使用SYBRTM Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)進行定量PCR分析。引子序列如下所示。
HsINS_31F：GCCATCAAGCAGATCACTGT(序列編號7)
HsINS_149R：CAGGTGTTGGTTCACAAAGG(序列編號8)
以3%瓊膠電泳分離所得PCR產物，再利用溴乙烯、BioDoc-It Imaging System(BMbio)使其可視化。
經過步驟(D2)所得之細胞中，胰島素之表現量分別示於圖2。該圖2係顯示將分化誘導開始第10天的細胞，胰島素表現量定為1時，所表現的相對表現量。
如圖2所示般，藉由添加貝達及寧，可增大胰島素之表現量。
自該結果，可得知藉由於培養基中添加貝達及寧，可提高自人類iPS細胞向胰臟荷爾蒙產生細胞之分化誘導效率。
(免疫染色)
針對經過上述步驟(A2)~(D2)之200-9細胞、TIG3/KOSM細胞或253G1細胞所得之細胞，使用4%之對甲醛進行固定5分鐘，以PBS洗淨後再以0.2%之Triton-X/PBS洗淨15分鐘。洗淨後，再使用4%之羊血清/PBS進行20分鐘的包埋處理。1級抗體係使用以1%之BSA/PBS(抗體稀釋液)稀釋100倍後之兔子抗C胜肽抗體(CST日本)，以及以抗體稀釋液稀釋400倍之天竺鼠抗胰島素抗體(Dako)，於37℃下進行2小時反應或於4℃下進行一整晚處理。以1級抗體處理後，使用PBS進行洗淨5分鐘並重複3次。2級抗體係將Alexa FlourTM 488，以及Alexa FlourTM 568，以抗體稀釋液稀釋200~500倍再使用，於室溫下反應1小時。以2級抗體處理後，使用PBS進行洗淨5分鐘並重複3次。之後，使用1~2μg/mL的DAPI(Sigma)進行處理10分鐘，再以PBS洗淨。
使用影像分析軟體之CellInsight(Thermo Fisher Scientific)，求出C胜肽陽性細胞或胰島素陽性細胞之比例(%)。結果示於圖3。
如圖3所示般，於使用人類iPS細胞之200-9細胞、TIG3/KOSM細胞或253G1細胞之任一種時，藉由添加貝 達及寧，增加了C胜肽陽性細胞或胰島素陽性細胞之比例。
自該結果可得知，藉由於培養基中添加貝達及寧，可提高自人類iPS細胞向胰臟荷爾蒙產生細胞(β細胞)之分化誘導效率。
<實施例3：胰臟β細胞的增殖促進(2)>
使用提供自大阪大學Dr.Miyazaki之MIN6細胞，作為胰臟β細胞株。將MIN6細胞維持於經添加15%(v/v)FBS之DMEM培養基中。
胰臟荷爾蒙產生細胞增殖促進劑，係準備將化學合成之貝達及寧(betagenin))溶解於DMSO使其濃度成為97%之DMSO溶液。
另外，為進行比較，如下所述般，準備IBCAP培養上清液以及Mock培養上清液。
首先，將於經添加5%之FCS以及抗生素(盤尼西林100U/mL、鏈霉素10mg/mL)之DMEM培養基進行繼代培養之HEK293T細胞，以1×106個之密度播種於10cm培養盤中。第二天，使用FuGENE6(Roche)，將由記載於序列編號2之序列所構成之DNA所編碼之多肽(相當人類TM4SF20。以下稱作「IBCAP」)的表現載體(pCAGGS-IBCAP)，轉殖入HEK293T細胞中，強制IBCAP表現。24小時後，以Opti-MEM培養基替換舊的培養基，再回收進而培養24小時後之上清液，作為IBCAP培養上清液使用 於之後的實驗。
另外，使用空載體(pCAGGS)，轉殖入HEK293T細胞中，再進行如同上述之實驗步驟並回收培養上清液，作為Mock培養上清液使用於之後的實驗。
確認胰臟β細胞的增殖促進時，首先，於舖設有膠原蛋白之8孔細胞培養盤(BD Falcon，製造編號354630)，使MIN6細胞以1×104個/孔之細胞密度進行播種。24小時後，更換添加0.5%(v/v)FBS之DMEM培養基，進行72小時之缺乏血清(血清飢餓)培養。且，自缺乏血清(血清飢餓)培養開始之48小時後，更換新的培養基。之後，於進行缺乏血清(血清飢餓)培養開始72小時後之培養基中，添加貝達及寧之DMSO溶液，使貝達及寧最終濃度成為1nM。
控制組係取代貝達及寧之DMSO溶液，僅以DMSO以添加等量之方式進行添加。
另外，為進行比較，取代貝達及寧之DMSO溶液，以IBCAP培養上清液或Mock培養上清液，於各孔中添加0.5μL。
添加貝達及寧之DMSO溶液等24小時後，添加5-乙炔基2’-脫氧尿苷(EdU)使其最終濃度成為10μM，並培養2小時。之後，使用Click-iTTM EdU Alexa FlourTM 594 Imaging Kit(Invitrogen，製造編號C10339)，依據所附說明書進行細胞增殖分析。
將攝取入細胞之EdU，利用Alexa FlourTM 594可視 化為紅色螢光，使用螢光顯微鏡(Carl Zeiss)觀察。將添加貝達及寧之DMSO溶液，IBCAP培養上清液或Mock培養上清液之情況時之螢光強度，減去控制組之螢光強度，且將添加Mock培養上清液時之螢光強度定為1.0時，相對的EdU螢光強度示於圖4。
如圖4所示般，添加貝達及寧之情況，與添加IBCAP培養上清液或Mock培養上清液之情況相比較，相對EdU螢光強度顯著地增大。
自該結果，可得知於培養基中添加貝達及寧，較添加IBCAP培養上清液或Mock培養上清液之情況，可更促進MIN6細胞增殖之顯著亢進。
<實施例4：胰臟β細胞的增殖促進(3)>
使用提供自大阪大學Dr.Miyazaki之MIN6細胞，作為胰臟β細胞株。將MIN6細胞維持於經添加15%(v/v)FBS之DMEM培養基中。
胰臟荷爾蒙產生細胞增殖促進劑，係準備將化學合成之貝達及寧(betagenin))溶解於DMSO使其濃度成為97%之DMSO溶液。
另外，為進行比較，準備化學合成由記載於序列編號4~6之胺基酸序列所構成之胜肽A、B、C。
確認胰臟β細胞的增殖促進時，首先，於舖設有膠原蛋白之8孔細胞培養盤(BD Falcon，製造編號354630)，使MIN6細胞以1×104個/孔之細胞密度進行播種。24小 時後，更換添加0.5%(v/v)FBS之DMEM培養基，進行72小時之缺乏血清(血清飢餓)培養。且，自缺乏血清(血清飢餓)培養開始之48小時後，更換新的培養基。之後，於進行缺乏血清(血清飢餓)培養開始72小時後之培養基中，添加化學合成之貝達及寧之DMSO溶液，使其最終濃度成為1nM。
控制組係取代貝達及寧之DMSO溶液，僅以DMSO以添加等量之方式進行添加。
另外，為進行比較，取代貝達及寧之DMSO溶液，以胜肽A、B、C，使其最終濃度成為3nM或5nM而添加。
添加貝達及寧之DMSO溶液或胜肽A、B、C等24小時後，添加5-乙炔基2’-脫氧尿苷(EdU)使其最終濃度成為10μM，並培養2小時。之後，使用Click-iTTM EdU Alexa FlourTM 594 Imaging Kit(Invitrogen，製造編號C10339)，依據所附說明書進行細胞增殖分析。
將攝取入細胞之EdU，利用Alexa FlourTM 594可視化為紅色螢光，使用螢光顯微鏡(Carl Zeiss)觀察。將其影像黑白化，再進而使其黑白反轉後之螢光顯微鏡像示於圖5。且，藉由黑白化以及黑白反轉之操作，可確認攝取EdU紅色螢光的部份為濃黑色部分。
如圖5所示般，添加貝達及寧之情況，與添加胜肽A、B、C之情況相比較，可觀察到濃黑色部分顯著變多。
自該結果，可得知無關乎貝達及寧與胜肽A、B、C均為人類TM4SF20之片段，添加貝達及寧之情況，較添 加胜肽A、B、C之情況，可更促進MIN6細胞增殖之顯著亢進。
<實施例5：自人類iPS細胞向胰臟荷爾蒙產生細胞之分化誘導(2)>
人類iPS細胞係購自理化學研究所細胞銀行之253G1細胞，該細胞係於經添加4ng/mL FGF-2(Global Stem)以及盤尼西林/鏈霉素(Nakaraifutekrsu)之ES細胞用培養基(DMEM/漢斯F12，20%之KSR，非必須胺基酸，2mM之L-麩醯胺酸，0.1mM之2-巰基乙醇，5.2mM之NaOH)內，與經絲裂黴素C處理之SNL76/7細胞(DS Pharma Biomedical)一同進行培養、維持。剝離細胞時係使用CTK(於PBS中含0.25%之胰蛋白酶，1mg/mL之膠原蛋白酶IV，20%之KSR，1mM之CaCl2)，以1：3~1：4之比例稀釋後進行繼代培養。
於開始進行分化誘導的3天前，使用胰蛋白酶-EDTA剝離細胞，以6.3×104個/cm2之細胞密度進行播種，再於經添加10μM之Y-27632(Wako)、4ng/mL之FGF-2以及盤尼西林/鏈霉素之ES細胞用培養基中，與經絲裂黴素C處理之STO細胞一同進行培養1天。之後，再於經添加4ng/mL之FGF-2以及盤尼西林/鏈霉素之ES細胞用培養基中再培養2天。
進行分化誘導的第一天，以添加了2%(v/v)之FBS、100ng/mL之活化素A(SBI)、3μM之CHIR99021(Axon Medchem)以及1nM貝達及寧之RPMI1640培養基(Nakaraitekusu)更換掉舊培養基，並進行培養1天(步驟(A2))。
其次，以添加了2%(v/v)之FBS 100ng/mL之活化素A以及1nM貝達及寧之RPMI1640培養基更換掉舊的培養基，並進行培養2天(步驟(B2))。
其次，以添加了1%(v/v)之B-27TM營養補充品(Invitrogen)製、1μM之Dorsomorphin(Calbiiochem)、2μM之維生素A酸(Sigma)10μM之SB431542(Sigma)以及1nM貝達及寧之IMEM Zinc Option培養基(Gibco)更換掉舊的培養基，並進行培養7天(步驟(C2))。
最後，以添加了1%(v/v)之B-27TM營養補充品、10μM之毛喉素(Wako)、10μM之地塞米松(Wako)、5μM之Alk5抑制劑II(Calbiochem)、10μM之菸鹼醯胺(Wako)、以及1nM的貝達及寧之IMEM Zinc Option培養基更換掉舊的培養基，並進行培養11天(步驟(D2))。控制組係使用添加等量的貝達及寧之溶媒之乙腈(ACN)。
(定量RT-PCR分析)
針對經過上述步驟(A2)~(D2)由253G1細胞所得之細胞(添加貝達及寧群、控制組群分別為n=3)，以定量RT-PCR確認胰島素、昇糖素、體抑素的基因表現。具體而言，首先使用SV Total RNA Isolation System(Promega)，自細胞萃取total RNA，再利用BioScriptTM transcriptase(Bioline)進行逆轉錄反應後，再使用SYBRTM Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)，利用LightCyclerTM(Roche)進行定量PCR分析。且內部品質控制係以定量RT-PCR確認GAPDH之基因表現量。引子序列如下所示。
HsINS_31F：GCCATCAAGCAGATCACTGT(序列編號7)
HsINS_149R：CAGGTGTTGGTTCACAAAGG(序列編號8)
HsGCG_264F：GCATTTACTTTGTGGCTGGA(序列編號9)
HsGCG_368R：CCTGGGAAGCTGAGAATGAT(序列編號10)
HsSST_206F：CCCCAGACTCCGTCAGTTTC(序列編號11)
HsSST_313R：TCCGTCTGGTTGGGTTCAG(序列編號12)
hGAPDH-F：ATGTTCGTCATGGGTGTGAA(序列編號13)
hGAPDH-R：TGTGGTCATGAGTCCTTCCA(序列編號14)
以3%瓊膠電泳分離所得PCR產物，再利用溴乙烯、BioDoc-It Imaging System(BMbio)使其可視化。
經過步驟(D2)所得之細胞中，胰島素、昇糖素、體抑素之表現量分別示於圖6~圖8。該圖6~圖8係顯示以GAPDH基因校正後，將分化誘導開始第1天的細胞，胰島素、昇糖素、體抑素之表現量定為1時，所表現的相對表現量。
如圖6~圖8所示般，藉由添加貝達及寧，可增大胰島素、昇糖素、體抑素之表現量。
自該結果，可得知藉由於培養基中添加貝達及寧，可提高自人類iPS細胞向胰臟荷爾蒙產生細胞(α細胞、β細胞、δ細胞)之分化誘導效率。
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<160> 14
<210> 1
<211> 60
<212> PRT
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<223> Synthesized oligonucleotide
<400> 14

Claims (14)

  1. 一種胜肽，其係由序列編號1之胺基酸序列，或序列編號1之胺基酸序列中，1個或數個胺基酸被取代、缺失及/或附加之胺基酸序列構成。
  2. 一種載體，其係接合有編碼如請求項1之胜肽之DNA。
  3. 一種研究用試藥，其係含有如請求項1之胜肽或請求項2之載體。
  4. 如請求項3之研究用試藥，其係促進胰臟荷爾蒙產生細胞增殖之胰臟荷爾蒙產生細胞增殖促進劑，及/或誘導朝向胰臟荷爾蒙產生細胞分化之誘導分化促進劑。
  5. 如請求項4之研究用試藥，其中前述胰臟荷爾蒙產生細胞，係包含選自α細胞、β細胞以及δ細胞所成之群之至少1種。
  6. 一種醫藥組成物，其係含有如請求項1之胜肽或請求項2之載體。
  7. 一種形質轉換體，其係以如請求項2之載體進行形質轉換者。
  8. 一種胜肽產生方法，其係包含培養如請求項7之形質轉換體，而使如請求項1之胜肽產生之步驟。
  9. 一種促進胰臟荷爾蒙產生細胞增殖之胰臟荷爾蒙產生細胞增殖促進劑，其係包含下述(a)~(c)之至少1種：(a)由序列編號1之胺基酸序列構成之胜肽， (b)由序列編號1之胺基酸序列中，1個或數個胺基酸被取代、缺失及/或附加之胺基酸序列構成，且具有胰臟荷爾蒙產生細胞之增殖促進作用之胜肽，(c)接合有編碼前述(a)或(b)之胜肽之DNA之載體。
  10. 一種誘導朝向胰臟荷爾蒙產生細胞分化之誘導分化促進劑，其係包含下述(d)~(f)之至少1種：(d)由序列編號1之胺基酸序列構成之胜肽，(e)由序列編號1之胺基酸序列中，1個或數個胺基酸被取代、缺失及/或附加之胺基酸序列構成，且具有朝向胰臟荷爾蒙產生細胞之誘導分化促進作用之胜肽，(f)接合有編碼前述(d)或(e)之胜肽之DNA之載體。
  11. 一種胰臟荷爾蒙產生細胞之增殖方法，其係包含於培養胰臟荷爾蒙產生細胞之培養基中，添加下述(a)或(b)之胜肽之步驟：(a)由序列編號1之胺基酸序列構成之胜肽，(b)由序列編號1之胺基酸序列中，1個或數個胺基酸被取代、缺失及/或附加之胺基酸序列構成，且具有胰臟荷爾蒙產生細胞之增殖促進作用之胜肽。
  12. 一種胰臟荷爾蒙產生細胞之分化形成方法，其係包含自多功能幹細胞或胰臟組織幹/前驅細胞，朝向胰臟荷爾蒙產生細胞的誘導分化過程中，於培養基中添加下述(d)或(e)之胜肽之步驟：(d)由序列編號1之胺基酸序列構成之胜肽，(e)由序列編號1之胺基酸序列中，1個或數個胺基酸 被取代、缺失及/或附加之胺基酸序列構成，且具有朝向胰臟荷爾蒙產生細胞之誘導分化促進作用之胜肽。
  13. 一種再生醫療型胰臟荷爾蒙產生細胞群之形成方法，其係包含如請求項11之增殖方法以及/或請求項12之分化形成方法。
  14. 如請求項13之形成方法，其中前述胰臟荷爾蒙產生細胞群係包含α細胞或β細胞。
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