JPWO2014189127A1 - 新規ペプチド及びその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
(b)配列番号1に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓ホルモン産生細胞の増殖促進作用を持つペプチド、
(c)上記(a)又は(b)のペプチドをコードするDNAが組み込まれたベクター。
(d)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
(e)配列番号1に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を持つペプチド、
(f)上記(d)又は(e)のペプチドをコードするDNAが組み込まれたベクター。
(a)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
(b)配列番号1に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓ホルモン産生細胞の増殖促進作用を持つペプチド。
(d)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
(e)配列番号1に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を持つペプチド。
本発明に係るペプチドは、配列番号1に記載のアミノ酸配列、又は配列番号1に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなるものである。
また、改変ペプチドと元のペプチドとの相同性は、80%以上が好ましく、90%以上がより好ましく、93%以上がさらに好ましく、95%以上が特に好ましく、98%以上が最も好ましい。
本発明に係るベクターは、本発明に係るペプチドをコードするDNAが組み込まれたものである。ベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等が用いられ、使用の目的に応じて適宜選択される。
本発明に係る研究用試薬は、本発明に係るペプチド又は本発明に係るベクターを含むものである。この研究用試薬は、後述する膵臓ホルモン産生細胞増殖促進剤であってもよく、後述する分化誘導促進剤であってもよく、その両方であってもよい。この研究用試薬は、膵臓ホルモン産生細胞を利用する研究や、膵臓ホルモン産生細胞への分化機構の研究等に好適に用いることができる。
本発明に係る形質転換体は、本発明に係るベクターで形質転換されたものである。また、本発明に係るペプチド産生方法は、本発明に係る形質転換体を培養して本発明に係るペプチドを産生させる工程を含むものである。
宿主細胞としては、形質転換用のベクターに適合し形質転換され得るものであればよく、その具体例としては、細菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等が挙げられる。
なお、化学合成によって本発明に係るペプチドを得ることも当然可能である。
本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞増殖促進剤は、次の(a)〜(c)の少なくとも1種を含み、膵臓ホルモン産生細胞の増殖を促進することが可能なものである。
(a)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
(b)配列番号1に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓ホルモン産生細胞の増殖促進作用を持つペプチド、
(c)上記(a)又は(b)のペプチドをコードするDNAが組み込まれたベクター。
また、膵臓ホルモン産生細胞の増殖促進作用が維持されている限り、配列番号1に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなる改変ペプチドを用いることもできる。置換、欠失、及び/又は付加されるアミノ酸の数、改変ペプチドと元のペプチドとの相同性等については、本発明に係るペプチドについて記載した内容と同様でよい。
さらに、上記(a)又は(b)のペプチドをコードするDNAが組み込まれたベクターを膵臓ホルモン産生細胞増殖促進剤に用いることもできる。
例えば、上記(a)や(b)のペプチドを公知の方法により製剤化した医薬組成物を、患者に投与することができる。
また、上記(a)又は(b)のペプチドをコードするDNAを適切なベクター(レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等)に組み込んだ後、公知の方法により製剤化した医薬組成物を、患者に投与することができる。
本発明に係る増殖方法は、膵臓ホルモン産生細胞を培養する培地中に上記(a)又は(b)のペプチドを添加する工程を含むものである。このように上記(a)又は(b)を添加することにより、膵臓ホルモン産生細胞の増殖が促進する。培地中におけるペプチドの濃度は、0.03〜10nMが好ましく、0.3〜1nMがより好ましい。
本発明に係る分化誘導促進剤は、次の(d)〜(f)の少なくとも1種を含み、膵臓ホルモン産生細胞への分化を誘導することが可能なものである。
(d)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
(e)配列番号1に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を持つペプチド、
(f)上記(d)又は(e)のペプチドをコードするDNAが組み込まれたベクター。
また、膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用が維持されている限り、配列番号1に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなる改変ペプチドを用いることもできる。置換、欠失、及び/又は付加されるアミノ酸の数、改変ペプチドと元のペプチドとの相同性等については、本発明に係るペプチドについて記載した内容と同様でよい。
さらに、上記(d)又は(e)のペプチドをコードするDNAが組み込まれたベクターを分化誘導促進剤に用いることもできる。
また、組織幹/前駆細胞とは、生体内に存在する、多分化能、自己複製能を有する幹/前駆細胞である。
例えば、上記(d)や(e)のペプチドを公知の方法により製剤化し、患者に投与することができる。
また、上記(d)又は(e)のペプチドをコードするDNAを適切なベクター(レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等)に組み込んだ後、公知の方法により製剤化し、患者に投与することができる。
例えば、上記(d)や(e)のペプチドを培地に添加することにより、多能性幹細胞又は膵臓組織幹/前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化を誘導することができる。
本発明に係る分化形成方法は、多能性幹細胞又は膵臓組織幹/前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導過程で、上記(d)又は(e)のペプチドを培地中に添加する工程を含むものである。以下、当該分化形成方法についてさらに説明する。
多能性幹細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化を誘導するには、その分化誘導過程で上記(d)又は(e)のペプチドを培地中に添加すればよい。多能性幹細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導方法としては、従来公知の方法を任意に採用することができ、特に限定されない。培地中における上記(d)又は(e)のペプチドの濃度は、10〜200ng/mLが好ましく、50〜180ng/mLがより好ましく、60〜150ng/mLがさらに好ましい。
第1の分化誘導方法は、非特許文献1に記載の方法に準じたものである。この文献は参照により本願に援用する。
第1の分化誘導方法は、下記の工程(A1)〜(E1)を含む。このうち少なくとも1つの工程で、上記(d)又は(e)のペプチドが培地中に添加される。なお、ある工程に分化誘導促進剤を添加する場合、その工程の最初から添加してもよく、工程の途中から添加してもよい。特に、工程(A1)〜(E1)の全ての工程で上記(d)又は(e)のペプチドを添加することが好ましい。
(A1)TGF−βスーパーファミリー(トランスフォーミング増殖因子β)に属する増殖因子の存在下で多能性幹細胞を培養する工程。
(B1)上記工程(A1)で得られた細胞をFGF(線維芽細胞増殖因子)の存在下で培養する工程。
(C1)上記工程(B1)で得られた細胞をレチノイドの存在下で培養する工程。
(D1)上記工程(C1)で得られた細胞をγ−セクレターゼ阻害剤の存在下で培養する工程。
(E1)上記工程(D1)で得られた細胞を、エキセンジン−4、HGF(肝細胞増殖因子)、IGF−1(インスリン様増殖因子−1)、及びニコチンアミドからなる群から選択される少なくとも1種の因子の存在下で培養する工程。
工程(A1)では、TGF−βスーパーファミリーに属する増殖因子の存在下で多能性幹細胞を培養する。
TGF−βスーパーファミリーに属する増殖因子の濃度は、5〜250ng/mLが好ましく、10〜200ng/mLがより好ましく、50〜150ng/mLがさらに好ましい。
Wntファミリーに属する増殖因子としては、Wnt1、Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a等が挙げられ、Wnt1、Wnt3aが好ましく、Wnt3aがより好ましい。
Wntファミリーに属する増殖因子の濃度は、1〜1000ng/mLが好ましく、10〜100ng/mLがより好ましく、10〜50ng/mLがさらに好ましい。
胚体内胚葉細胞への分化誘導の進行は、形態学的観察によるほか、RT−PCRにより遺伝子発現を確認することによっても評価することができる。多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞への分化が進行するに従って、幹細胞のマーカー遺伝子であるOCT4、NANOG、SOX2、ECAD等の発現が減少し、胚体内胚葉細胞のマーカー遺伝子であるSOX17、CER、FOXA2、CXCR4等の発現が亢進する。
そこで、工程(A1)を、無血清の第1の培地で培養する工程(A1−1)と、低血清の第2の培地で培養する工程(A1−2)とに分けることが好ましい。
中内胚葉細胞への分化誘導の進行は、形態学的観察によるほか、RT−PCRにより遺伝子発現を確認することによっても評価することができる。多能性幹細胞から中内胚葉細胞への分化が進行するに従って、幹細胞のマーカー遺伝子であるOCT4、NANOG、SOX2、ECAD等の発現が減少し、中内胚葉細胞のマーカー遺伝子であるBRA、FGF4、WNT3、NCAD等の発現が亢進する。
上述したとおり、胚体内胚葉細胞への分化誘導の進行は、形態学的観察によるほか、RT−PCRにより遺伝子発現を確認することによっても評価することができる。
工程(B1)では、工程(A1)で得られた細胞をFGFの存在下で培養する。
FGFの濃度は、5〜150ng/mLが好ましく、10〜100ng/mLがより好ましく、20〜80ng/mLがさらに好ましい。
ヘッジホッグ経路阻害剤としては、KAAD−シクロパミン(28−[2−[[6−[(3−フェニルプロパノイル)アミノ]ヘキサノイル]アミノ]エチル]−17β,23β−エポキシベラトラマン−3−オン)、KAAD−シクロパミンの類似体、ジェルビン(17,23β−エポキシ−3β−ヒドロキシベラトラマン−11−オン)、ジェルビンの類似体、ヘッジホッグ経路遮断抗体等が挙げられ、その中でもKAAD−シクロパミンが好ましい。
ヘッジホッグ経路阻害剤の濃度は、0.01〜5μMが好ましく、0.02〜2μMがより好ましく、0.1〜0.5μmがさらに好ましい。
なお、工程(A1)で低血清培地が用いられる場合、工程(B1)では、工程(A1)よりも高い血清濃度の培地を用いることが好ましい。
分化誘導の進行は、形態学的観察によるほか、RT−PCRにより遺伝子発現を確認することによっても評価することができる。分化が進行するに従って、HNF1B、HNF4A等の遺伝子の発現が亢進する。
工程(C1)では、工程(B1)で得られた細胞をレチノイドの存在下で培養する。
レチノイドの濃度は、0.2〜10μMが好ましく、0.4〜8μMがより好ましく、1〜4μMがさらに好ましい。
ヘッジホッグ経路阻害剤としては、KAAD−シクロパミン、KAAD−シクロパミンの類似体、ジェルビン、ジェルビンの類似体、ヘッジホッグ経路遮断抗体等が挙げられ、その中でもKAAD−シクロパミンが好ましい。
ヘッジホッグ経路阻害剤の濃度は、0.01〜5μMが好ましく、0.02〜2μMがより好ましく、0.1〜0.5μMがさらに好ましい。
FGFとしては、FGF−1、FGF−2(bFGF)、FGF−3、FGF−4、FGF−5、FGF−6、FGF−7、FGF−8、FGF−9、FGF−10、FGF−11、FGF−12、FGF−13、FGF−14、FGF−15、FGF−16、FGF−17、FGF−18、FGF−19、FGF−20、FGF−21、FGF−22、FGF−23等が挙げられ、FGF−2(bFGF)、FGF−5、FGF−7、FGF−10が好ましい。
FGFの濃度は、0.5〜50ng/mLが好ましく、1〜25ng/mLがより好ましく、2〜10ng/mLがさらに好ましい。
TGF−βスーパーファミリーに属する増殖因子の濃度は、5〜250ng/mLが好ましく、10〜200ng/mLがより好ましく、20〜150ng/mLがさらに好ましい。
B−27TMサプリメントの濃度は、0.1〜10%(v/v)が好ましく、0.2〜5%(v/v)がより好ましく、0.4〜2.5%(v/v)がさらに好ましい。なお、このB−27TMサプリメントは、50倍ストック溶液として市販されているため、B−27TMサプリメントの濃度を0.1〜10%(v/v)とするには、5〜500倍希釈されるように培地中に添加すればよい。
分化誘導の進行は、形態学的観察によるほか、RT−PCRにより遺伝子発現を確認することによっても評価することができる。分化が進行するに従って、PDX1、HNF6、HLXB9等の遺伝子の発現が亢進する。
工程(D1)では、工程(C1)で得られた細胞をγ−セクレターゼ阻害剤の存在下で培養する。
γ−セクレターゼ阻害剤の濃度は、1〜50μMが好ましく、2〜40μMがより好ましく、5〜20μMがさらに好ましい。
エキセンジン−4の濃度は、5〜150ng/mLが好ましく、10〜100ng/mLがより好ましく、20〜80ng/mLがさらに好ましい。
分化誘導の進行は、形態学的観察によるほか、RT−PCRにより遺伝子発現を確認することによっても評価することができる。分化が進行するに従って、NKX6−1、NGN3、PAX4、NKX2−2等の遺伝子の発現が亢進する。
工程(E1)では、工程(D1)で得られた細胞を、エキセンジン−4、HGF、IGF−1、及びニコチンアミドからなる群から選択される少なくとも1種の因子の存在下で培養する。
エキセンジン−4の濃度は、5〜150nMが好ましく、10〜100nMがより好ましく、20〜80nMがさらに好ましい。
HGFの濃度は、5〜150ng/mLが好ましく、10〜100ng/mLがより好ましく、20〜80ng/mLがさらに好ましい。
IGF−1の濃度は、5〜150ng/mLが好ましく、10〜100ng/mLがより好ましく、20〜80ng/mLがさらに好ましい。
ニコチンアミドの濃度は、1〜30mMが好ましく、3〜20mMがより好ましく、5〜15mMがさらに好ましい。
この工程(E1)により、膵臓ホルモン産生細胞が得られる。
膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導の進行は、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン等の膵臓ホルモンの産生を確認するほか、RT−PCRにより遺伝子発現を確認することによっても評価することができる。分化が進行するに従って、INS、GCG、GHRL、SST、PPY等のうち、少なくとも1つの遺伝子の発現が亢進する。
第2の分化誘導方法は、非特許文献4に記載の方法に準じたものである。この文献は参照により本願に援用する。
第2の分化誘導方法は、下記の工程(A2)〜(D2)を含む。このうち少なくとも1つの工程で、上記(d)又は(e)のペプチドが培地中に添加される。なお、ある工程に分化誘導促進剤を添加する場合、その工程の最初から添加してもよく、工程の途中から添加してもよい。上記(d)又は(e)のペプチドを添加する工程は、工程(C2)〜(D2)の少なくとも1つの工程であってもよいが、工程(A2)〜(D2)の全ての工程で上記(d)又は(e)のペプチドを添加することが好ましい。
(A2)TGF−βスーパーファミリーに属する増殖因子と、Wntファミリーに属する増殖因子及びGSK−3(グリコーゲン合成酵素キナーゼ−3)阻害剤からなる群から選択される少なくとも1種の因子との存在下で多能性幹細胞を培養する工程。
(B2)上記工程(A2)で得られた細胞をTGF−βスーパーファミリーに属する増殖因子の存在下で培養する工程。
(C2)上記工程(B2)で得られた細胞をレチノイドの存在下で培養する工程。
(D2)上記工程(C2)で得られた細胞を、cAMP(環状アデノシン一リン酸)増加剤、デキサメタゾン、TGF−β1型受容体阻害剤、及びニコチンアミドからなる群から選択される少なくとも1種の因子の存在下で培養する工程。
工程(A2)では、TGF−βスーパーファミリーに属する増殖因子と、Wntファミリーに属する増殖因子及びGSK−3阻害剤からなる群から選択される少なくとも1種の因子との存在下で多能性幹細胞を培養する。
TGF−βスーパーファミリーに属する増殖因子の濃度は、5〜250ng/mLが好ましく、10〜200ng/mLがより好ましく、50〜150ng/mLがさらに好ましい。
Wntファミリーに属する増殖因子の濃度は、1〜1000ng/mLが好ましく、10〜100ng/mLがより好ましく、10〜50ng/mLがさらに好ましい。
GSK−3阻害剤の濃度は、0.01〜20μMが好ましく、0.1〜20μMがより好ましく、1〜5μMがさらに好ましい。
工程(A2)の培養期間は例えば1〜3日であり、1〜2日が好ましい。
工程(B2)では、工程(A2)で得られた細胞をTGF−βスーパーファミリーに属する増殖因子の存在下で培養する。
TGF−βスーパーファミリーに属する増殖因子の濃度は、5〜250ng/mLが好ましく、10〜200ng/mLがより好ましく、50〜150ng/mLがさらに好ましい。
工程(B2)の培養期間は例えば1〜4日であり、1〜3日が好ましい。
工程(C2)では、工程(B2)で得られた細胞をレチノイドの存在下で培養する。
レチノイドの濃度は、0.2〜10μMが好ましく、0.4〜8μMがより好ましく、1〜4μMがさらに好ましい。
BMP受容体阻害剤としては、ドルソモルフィン(6−[4−[2−(1−ピペリジニル)エトキシ]フェニル]−3−(4−ピリジル)ピラゾロ[1,5−a]ピリミジン)、LDN−193189(4−(6−(4−(ピペラジン−1−イル)フェニル)ピラゾロ[1,5−a]ピリミジン−3−イル)キノリン)等が挙げられ、その中でもドルソモルフィンが好ましい。
BMP受容体阻害剤の濃度は、0.2〜5μMが好ましく、0.3〜3μMがより好ましく、0.5〜2μMがさらに好ましい。
TGF−β1型受容体阻害剤としては、SB431542(4−[4−(1,3−ベンゾジオキソル−5−イル)−5−(2−ピリジニル)−1H−イミダゾール−2−イル]ベンズアミド)、SB525334(6−[2−(1,1−ジメチルエチル)−5−(6−メチル−1,2−ピリジニル)−1H−イミダゾール−4−イル]キノキサリン)、LY364947(4−[3−(2−ピリジニル)−1H−ピラゾール−4−イル]キノリン)等が挙げられ、その中でもSB431542が好ましい。また、TGF−β1型受容体阻害剤としては、Calbiochem製のAlk5インヒビターIIを用いることも可能である。
TGF−β1型受容体阻害剤の濃度は、1〜50μMが好ましく、2〜30μMがより好ましく、5〜20μMがさらに好ましい。
B−27TMサプリメントの濃度は、0.1〜10%(v/v)が好ましく、0.2〜5%(v/v)がより好ましく、0.4〜2.5%(v/v)がさらに好ましい。なお、このB−27TMサプリメントは、50倍ストック溶液として市販されているため、B−27TMサプリメントの濃度を0.1〜10%(v/v)とするには、5〜500倍希釈されるように培地中に添加すればよい。
工程(C2)の培養期間は例えば5〜9日であり、6〜8日が好ましい。
工程(D2)では、工程(C2)で得られた細胞を、cAMP増加剤、デキサメタゾン、TGF−β1型受容体阻害剤、及びニコチンアミドからなる群から選択される少なくとも1種の因子の存在下で培養する。
cAMP増加剤の濃度は、1〜50μMが好ましく、2〜30μMがより好ましく、5〜20μMがさらに好ましい。
TGF−β1型受容体阻害剤の濃度は、1〜50μMが好ましく、2〜30μMがより好ましく、5〜20μMがさらに好ましい。
工程(D2)の培養期間は例えば9〜13日であり、10〜12日が好ましい。
膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導の進行は、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン等の膵臓ホルモンの産生を確認するほか、RT−PCRにより遺伝子発現を確認することによっても評価することができる。多能性幹細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化が進行するに従って、膵臓ホルモン産生細胞のマーカー遺伝子であるINS、GCG、GHRL、SST、PPY等のうち、少なくとも1つの遺伝子の発現が亢進する。
膵臓組織幹/前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化を誘導するには、その分化誘導過程で上記(d)又は(e)のペプチドを培地中に添加すればよい。膵臓組織幹/前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導方法としては、従来公知の方法を任意に採用することができ、特に限定されない。培地中における上記(d)又は(e)のペプチドの濃度は、10〜200ng/mLが好ましく、50〜150ng/mLがより好ましく、60〜120ng/mLがさらに好ましい。
この分化誘導方法は、下記の工程(A3)〜(E3)を含む。このうち少なくとも1つの工程で、上記(d)又は(e)のペプチドが培地中に添加される。なお、ある工程に分化誘導促進剤を添加する場合、その工程の最初から添加してもよく、工程の途中から添加してもよい。上記(d)又は(e)のペプチドを添加する工程は、工程(D3)〜(E3)の少なくとも1つの工程であってもよいが、工程(A3)〜(E3)の全ての工程で上記(d)又は(e)のペプチドを添加することが好ましい。
(A3)TGF−βスーパーファミリーに属する増殖因子、レチノイド、FGF、及びニコチンアミドの非存在下で膵臓組織幹/前駆細胞を培養する工程。
(B3)上記工程(A3)で得られた細胞をTGF−βスーパーファミリーに属する増殖因子の存在下で培養する工程。
(C3)上記工程(B3)で得られた細胞をレチノイドの存在下で培養する工程。
(D3)上記工程(C3)で得られた細胞をFGFの存在下で培養する工程。
(E3)上記工程(D3)で得られた細胞をニコチンアミドの存在下で培養する工程。
工程(A3)では、TGF−βスーパーファミリーに属する増殖因子、レチノイド、FGF、ニコチンアミドの非存在下で膵臓組織幹/前駆細胞を培養する。
インスリンの濃度は、2〜30μg/mLが好ましく、5〜20μg/mLがより好ましい。トランスフェリンの濃度は、1〜20μg/mLが好ましく、3〜10μg/mLがより好ましい。亜セレン酸の濃度は、1〜20ng/mLが好ましく、5〜20ng/mLがより好ましい。2−メルカプトエタノールの濃度は、50〜200μMが好ましく、50〜100μMがより好ましい。アルブミンの濃度は、1〜10ng/mLが好ましく、2〜5ng/mLがより好ましい。
工程(A3)の培養期間は例えば1〜3日であり、1〜2日が好ましい。
工程(B3)では、工程(A3)で得られた細胞をTGF−βスーパーファミリーに属する増殖因子の存在下で培養する。
TGF−βスーパーファミリーに属する増殖因子の濃度は、5〜250ng/mLが好ましく、10〜200ng/mLがより好ましく、50〜150ng/mLがさらに好ましい。
工程(B3)の培養期間は例えば2〜6日であり、3〜5日が好ましい。
工程(C3)では、工程(B3)で得られた細胞をレチノイドの存在下で培養する。
レチノイドの濃度は、0.2〜10μMが好ましく、0.4〜8μMがより好ましく、1〜4μMがさらに好ましい。
好適な実施形態では、全トランス型レチノイン酸、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸、2−メルカプトエタノール、アルブミンを添加した、無血清のDMEM/ハムF12が用いられる。
工程(C3)の培養期間は例えば2〜6日であり、3〜5日が好ましい。
工程(D3)では、工程(C3)で得られた細胞をFGFの存在下で培養する。
FGFの濃度は、1〜30ng/mLが好ましく、2〜20ng/mLがより好ましく、5〜15ng/mLがさらに好ましい。
好適な実施形態では、FGF−2(bFGF)、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸、アルブミンを添加した、無血清のDMEM/ハムF12が用いられる。
工程(D3)の培養期間は例えば1〜5日であり、2〜4日が好ましい。
工程(E3)では、工程(D3)で得られた細胞をニコチンアミドの存在下で培養する。
ニコチンアミドの濃度は、1〜30mMが好ましく、3〜20mMがより好ましく、5〜15mMがさらに好ましい。
FGFとしては、FGF−1、FGF−2(bFGF)、FGF−3、FGF−4、FGF−5、FGF−6、FGF−7、FGF−8、FGF−9、FGF−10、FGF−11、FGF−12、FGF−13、FGF−14、FGF−15、FGF−16、FGF−17、FGF−18、FGF−19、FGF−20、FGF−21、FGF−22、FGF−23等が挙げられ、FGF−2(bFGF)、FGF−5、FGF−7、FGF−10が好ましい。
FGFの濃度は、1〜30ng/mLが好ましく、2〜20ng/mLがより好ましく、5〜15ng/mLがさらに好ましい。
好適な実施形態では、ニコチンアミド、FGF−2(bFGF)、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸、アルブミンを添加した、無血清のDMEM/ハムF12が用いられる。
工程(E3)の培養期間は例えば3〜20日であり、3〜10日が好ましい。
膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導の進行は、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン等の膵臓ホルモンの産生を確認するほか、RT−PCRにより遺伝子発現を確認することによっても評価することができる。膵臓組織幹/前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化が進行するに従って、膵臓ホルモン産生細胞のマーカー遺伝子であるINS、GCG、GHRL、SST、PPY等のうち、少なくとも1つの遺伝子の発現が亢進する。
本発明に係る再生医療型膵臓ホルモン産生細胞群の形成方法は、本発明に係る増殖方法及び/又は本発明に係る分化形成方法を含むものである。
上記のとおり、本発明に係る分化形成方法によれば、多能性幹細胞又は膵臓組織幹/前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞へと効率的に分化誘導することができる。また、本発明に係る増殖方法によれば、膵臓ホルモン産生細胞の増殖を促進することができる。したがって、これらを単独又は組み合わせることにより、再生医療に好適な膵臓ホルモン産生細胞群を形成することができる。この膵臓ホルモン産生細胞群は、膵島様細胞塊であってもよく、膵島様細胞シートであってもよい。また、膵臓ホルモン産生細胞群は、α細胞又はβ細胞を含むことが好ましい。
膵臓β細胞株としては、大阪大学のDr.Miyazakiから供与されたMIN6細胞を用いた。MIN6細胞は、15%(v/v) FBSを添加したDMEM培地中で維持した。
細胞に取り込まれたEdUをAlexa FlourTM 594を用いて赤色の蛍光として可視化し、蛍光顕微鏡(Carl Zeiss)を用いて観察した。コントロールにおける蛍光強度を1.0とした場合の相対EdU蛍光強度を図1に示す。
この結果から、ベータジェニンを培地中に添加することにより、MIN6細胞の増殖が促進することが分かる。
ヒトiPS細胞としては、理化学研究所のセルバンクから購入した253G1細胞、埼玉医科大学のDr.Mitaniから供与されたTIG3/KOSM細胞、及びTIG3/KOSM細胞にレポーター遺伝子を導入したクローンである200−9細胞を用いた。TIG3/KOSM細胞は、センダイウイルスを用いてTIG−3細胞に4因子(OCT遺伝子、KLF遺伝子、SOX遺伝子、MYC遺伝子)を導入することにより、産業技術総合研究所にて樹立されたものである(Nishimura,K. et al., J. Biol. Chem., 286, pp.4760−4771(2011))。
これらの細胞は、4ng/mL FGF−2(Global Stem)及びペニシリン/ストレプトマイシン(ナカライテスク)を添加したES細胞用培地(DMEM/ハムF12、20% KSR、非必須アミノ酸、2mM L−グルタミン、0.1mM 2−メルカプトエタノール、5.2mM NaOH)中で、マイトマイシンCで処理されたSNL76/7細胞(DS Pharma Biomedical)とともに培養・維持した。細胞の剥離にはCTK(0.25% トリプシン、1mg/mL Collagenase IV、20% KSR、1mM CaCl2 in PBS)を用い、1:3〜1:4の割合で希釈して継代培養した。
上記の工程(A2)〜(D2)を経て253G1細胞から得られた細胞(ベータジェニン添加群、コントロール群のそれぞれについてn=2)について、インスリンの遺伝子発現を定量的RT−PCRで確認した。具体的には、まず、SV Total RNA Isolation System(Promega)を用いて細胞からtotal RNAを抽出し、BioScriptTM transcriptase(Bioline)により逆転写反応を行った後、SYBRTM Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)を用いて定量的PCR分析を行った。プライマー配列を以下に示す。
HsINS_31F:GCCATCAAGCAGATCACTGT(配列番号7)
HsINS_149R:CAGGTGTTGGTTCACAAAGG(配列番号8)
この結果から、ベータジェニンを培地中に添加することにより、ヒトiPS細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導効率が向上することが分かる。
上記の工程(A2)〜(D2)を経て200−9細胞、TIG3/KOSM細胞、又は253G1細胞から得られた細胞について、4% パラホルムアルデヒドを用いて5分間固定し、PBSで洗浄後、0.2% Triton−X/PBSでさらに15分間洗浄した。洗浄後、4% ヤギ血清/PBSを用いて20分間ブロッキング処理を行った。1次抗体としては、1% BSA/PBS(抗体希釈液)で100倍希釈したラビット抗Cペプチド抗体(CSTジャパン)、及び抗体希釈液で400倍希釈したモルモット抗インスリン抗体(Dako)を用い、37℃で2時間又は4℃で一晩処理した。1次抗体で処理した後、PBSを用いた5分間の洗浄を3回繰り返した。2次抗体としては、Alexa FlourTM 488及びAlexa FlourTM 568を抗体希釈液で200〜500倍に希釈して用い、室温にて1時間反応させた。2次抗体で処理した後、PBSを用いた5分間の洗浄を3回繰り返した。その後、1〜2μg/mLのDAPI(Sigma)で10分間処理し、PBSで洗浄した。
この結果から、ベータジェニンを培地中に添加することにより、ヒトiPS細胞から膵臓ホルモン産生細胞(β細胞)への分化誘導効率が向上することが分かる。
膵臓β細胞株としては、大阪大学のDr.Miyazakiから供与されたMIN6細胞を用いた。MIN6細胞は、15%(v/v) FBSを添加したDMEM培地中で維持した。
まず、5%FCS及び抗生物質(ペニシリン100U/mL、ストレプトマイシン10mg/mL)を添加したDMEM培地で継代培養したHEK293T細胞を10cmディッシュに1×106個プレーティングした。その翌日、FuGENE6(Roche)を使用して、配列番号2に記載の塩基配列からなるDNAによりコードされるポリペプチド(ヒトTM4SF20に相当。以下、「IBCAP」という。)の発現ベクター(pCAGGS−IBCAP)をHEK293T細胞にトランスフェクトし、IBCAPを強制発現させた。その24時間後に培地をOpti−MEM培地に交換し、さらにその24時間後に培養上清を回収し、IBCAP培養上清として以後の実験に用いた。
また、空ベクター(pCAGGS)をHEK293T細胞にトランスフェクトし、上記と同様にして培養上清を回収し、Mock培養上清として以後の実験に用いた。
コントロールとしては、ベータジェニンのDMSO溶液の代わりにDMSOのみを、添加量が等量になるように添加した。
また、比較のため、ベータジェニンのDMSO溶液の代わりにIBCAP培養上清又はMock培養上清を、各ウェルあたり0.5μL添加した。
細胞に取り込まれたEdUをAlexa FlourTM 594を用いて赤色の蛍光として可視化し、蛍光顕微鏡(Carl Zeiss)を用いて観察した。ベータジェニンのDMSO溶液、IBCAP培養上清、Mock培養上清を添加した場合の蛍光強度からコントロールにおける蛍光強度を減じ、かつ、Mock培養上清を添加した場合の蛍光強度を1.0としたときの相対EdU蛍光強度を図4に示す。
この結果から、ベータジェニンを培地中に添加した場合の方がIBCAP培養上清、Mock培養上清を添加した場合よりもMIN6細胞の増殖が顕著に亢進することが分かる。
膵臓β細胞株としては、大阪大学のDr.Miyazakiから供与されたMIN6細胞を用いた。MIN6細胞は、15%(v/v) FBSを添加したDMEM培地中で維持した。
また、比較のため、配列番号4〜6に記載のアミノ酸配列からなるペプチドA,B,Cを化学合成して準備した。
コントロールとしては、ベータジェニンのDMSO溶液の代わりにDMSOのみを、添加量が等量になるように添加した。
また、比較のため、ベータジェニンのDMSO溶液の代わりにペプチドA,B,Cを、最終濃度が3nM又は5nMとなるように添加した。
細胞に取り込まれたEdUをAlexa FlourTM 594を用いて赤色の蛍光として可視化し、蛍光顕微鏡(Carl Zeiss)を用いて観察した。白黒化し、さらに白黒反転させた蛍光顕微鏡像を図5に示す。なお、白黒化及び白黒反転の操作により、EdUが取り込まれた赤色の蛍光部分は濃い黒色部分として確認できるようになる。
この結果から、ベータジェニンとペプチドA,B,CとはいずれもヒトTM4SF20のフラグメントであるにも関わらず、ベータジェニンを添加した場合の方がペプチドA,B,Cを添加した場合よりもMIN6細胞の増殖が顕著に亢進することが分かる。
ヒトiPS細胞としては、理化学研究所のセルバンクから購入した253G1細胞を用いた。この細胞は、4ng/mL FGF−2(Global Stem)及びペニシリン/ストレプトマイシン(ナカライテスク)を添加したES細胞用培地(DMEM/ハムF12、20% KSR、非必須アミノ酸、2mM L−グルタミン、0.1mM 2−メルカプトエタノール、5.2mM NaOH)中で、マイトマイシンCで処理されたSNL76/7細胞(DS Pharma Biomedical)とともに培養・維持した。細胞の剥離にはCTK(0.25% トリプシン、1mg/mL Collagenase IV、20% KSR、1mM CaCl2 in PBS)を用い、1:3〜1:4の割合で希釈して継代培養した。
上記の工程(A2)〜(D2)を経て253G1細胞から得られた細胞(ベータジェニン添加群、コントロール群のそれぞれについてn=3)について、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチンの遺伝子発現を定量的RT−PCRで確認した。具体的には、まず、SV Total RNA Isolation System(Promega)を用いて細胞からtotal RNAを抽出し、BioScriptTM transcriptase(Bioline)により逆転写反応を行った後、SYBRTM Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)を用いて、LightCyclerTM(Roche)により定量的PCR分析を行った。なお、内在性コントロールとして、GAPDHの遺伝子発現を定量的RT−PCRで確認した。プライマー配列を以下に示す。
HsINS_31F:GCCATCAAGCAGATCACTGT(配列番号7)
HsINS_149R:CAGGTGTTGGTTCACAAAGG(配列番号8)
HsGCG_264F:GCATTTACTTTGTGGCTGGA(配列番号9)
HsGCG_368R:CCTGGGAAGCTGAGAATGAT(配列番号10)
HsSST_206F:CCCCAGACTCCGTCAGTTTC(配列番号11)
HsSST_313R:TCCGTCTGGTTGGGTTCAG(配列番号12)
hGAPDH−F:ATGTTCGTCATGGGTGTGAA(配列番号13)
hGAPDH−R:TGTGGTCATGAGTCCTTCCA(配列番号14)
この結果から、ベータジェニンを培地中に添加することにより、ヒトiPS細胞から膵臓ホルモン産生細胞(α細胞、β細胞、δ細胞)への分化誘導効率が向上することが分かる。
Claims (14)
- 配列番号1に記載のアミノ酸配列、又は配列番号1に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。
- 請求項1に記載のペプチドをコードするDNAが組み込まれたベクター。
- 請求項1記載のペプチド又は請求項2記載のベクターを含む研究用試薬。
- 膵臓ホルモン産生細胞の増殖を促進する膵臓ホルモン産生細胞増殖促進剤及び/又は膵臓ホルモン産生細胞への分化を誘導する分化誘導促進剤である請求項3記載の研究用試薬。
- 前記膵臓ホルモン産生細胞がα細胞、β細胞、及びδ細胞よりなる群から選択される少なくとも1種を含む請求項4記載の研究用試薬。
- 請求項1記載のペプチド又は請求項2記載のベクターを含む医薬組成物。
- 請求項2に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
- 請求項7記載の形質転換体を培養して請求項1記載のペプチドを産生させる工程を含むペプチド産生方法。
- 次の(a)〜(c)の少なくとも1種を含み、膵臓ホルモン産生細胞の増殖を促進する膵臓ホルモン産生細胞増殖促進剤;
(a)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
(b)配列番号1に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓ホルモン産生細胞の増殖促進作用を持つペプチド、
(c)前記(a)又は(b)のペプチドをコードするDNAが組み込まれたベクター。 - 次の(d)〜(f)の少なくとも1種を含み、膵臓ホルモン産生細胞への分化を誘導する分化誘導促進剤;
(d)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
(e)配列番号1に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を持つペプチド、
(f)前記(d)又は(e)のペプチドをコードするDNAが組み込まれたベクター。 - 膵臓ホルモン産生細胞を培養する培地中に下記(a)又は(b)のペプチドを添加する工程を含む膵臓ホルモン産生細胞の増殖方法;
(a)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
(b)配列番号1に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓ホルモン産生細胞の増殖促進作用を持つペプチド。 - 多能性幹細胞又は膵臓組織幹/前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導過程で、下記(d)又は(e)のペプチドを培地中に添加する工程を含む膵臓ホルモン産生細胞の分化形成方法;
(d)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
(e)配列番号1に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を持つペプチド。 - 請求項11記載の増殖方法及び/又は請求項12記載の分化形成方法を含む再生医療型膵臓ホルモン産生細胞群の形成方法。
- 前記膵臓ホルモン産生細胞群がα細胞又はβ細胞を含む請求項13記載の形成方法。
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