CN101351547A - 表达pdx1的背侧和腹侧前肠内胚层 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了包含背侧和/或腹侧PDX1－阳性前肠内胚层细胞的细胞培养物及产生此细胞培养物的方法。本发明还公开了包含基本上纯的背侧和/或腹侧PDX1－阳性前肠内胚层细胞的细胞群以及从其它细胞类型富集、分离和纯化背侧和/或腹侧PDX1－阳性前肠内胚层细胞的方法。本发明还公开了鉴定能促进背侧和/或腹侧PDX1－阳性前肠内胚层细胞分化的分化因子的方法。
Description
相关申请
本申请是2005年10月27日提交的标题为“表达PDX1的背侧和腹侧前肠内胚层”的美国临时专利申请60/730,917的非临时申请，并要求其优先权，在此通过参考将其公开内容整体并入本文。
技术领域
本发明涉及医学和细胞生物学领域。具体地，本发明涉及包含哺乳动物前肠内胚层细胞的组合物和包含背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞的组合物及产生、分离和使用此类细胞的方法。
发明背景
人多能性干细胞(pluripotent stem cell)，如胚胎干细胞(ES)和胚胎生殖细胞(EG)，于1994年首先从无成纤维细胞饲养层的培养物中分离(Bongso et al.，1994)，1997年从含成纤维细胞饲养层的培养物中分离(Hogan，1997)。随后Thomson、Reubinoff和Shamblott建立了采用有丝分裂失活的小鼠饲养层连续培养人ES和EG细胞的方法(Reubinoffet al.，2000；Shamblott et al.，1998；Thomson et al.，1998)。
人ES和EG细胞(hESC)为研究人类发育早期阶段和为治疗性干预一些疾病状态(如糖尿病和帕金森氏症)提供了极难得的机会。例如，使用衍生自hSEC的产生胰岛素的β细胞会比目前利用来自供者胰腺的细胞治疗糖尿病有很大进步。但目前还不知道如何从hSEC得到产生胰岛素的β细胞。因此，目前利用来自供者胰腺的胰岛细胞治疗糖尿病的细胞疗法受限于缺乏移植所需的高质量胰岛细胞。对一例I型糖尿患者的细胞治疗需要移植大约8×108胰岛细胞(Shapiro et al.，2000；Shapiro et al.，2001a；Shapiro et al.，2001b)。一次成功移植所需的胰岛细胞至少需要两个健康供者的器官提供。而人胚胎干细胞为开发用于人类细胞治疗的大量的高质量分化细胞提供了起始材料的来源。
多能性和能够在培养中维持hSEC细胞较长时间这两个性质使其特别适合用于细胞治疗。多能性是指hESC能够分化为所有3种主要胚层(内胚层，中胚层和外胚层)的衍生物，进而在除胚胎外组织(如胎盘)和生殖细胞外还形成成熟器官的所有体细胞类型的能力。尽管多能性赋予了hSEC特殊的用途，但这个性质也给这些细胞及其衍生物的研究和控制带来挑战。由于在分化hSEC培养中会产生大量不同细胞类型，所以大部分细胞类型产生效率很低。而且，成功评价任一指定细胞类型的产生关键取决于定义合适的标志物。高效、定向的分化对hESCs的治疗应用非常重要。
解决上述问题对利用hSEC作为起始材料产生用于细胞治疗的细胞非常有利。例如，为获得胰岛细胞移植治疗所需的细胞材料的水平，有利的是在分化的最早期高效地使hESC定向为胰岛/β细胞系。
除了分化过程的高效定向，另外还有利的是在向胰岛/β细胞系分化过程中分离和鉴定中间细胞类型，并利用这些细胞作为进一步分化的合适的细胞系前体。
发明概要
本发明的实施方案涉及PDX1-阴性前肠内胚层细胞(前肠内胚层细胞)的细胞培养物。在一些实施方案中，前肠内胚层表达HNF1b和FOXA1标志物，但不大量表达PDX1。本发明的其它实施方案涉及PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞(背侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞)的细胞培养物。在一些实施方案中，PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞表达一种或多种选自表3的标志物和/或一种或多种选自表4的标志物。其它的实施方案涉及PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞(腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞)的细胞培养物。在一些实施方案中，PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞表达一种或多种选自表3的标志物，但是与在PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞中的相同标志物表达相比，其不大量表达选自表4的标志物。
本发明其它实施方案涉及包含PDX1-阴性前肠内胚层细胞的富集的、分离的和/或纯化的细胞群。本发明的其它实施方案涉及PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞。其它实施方案涉及包含PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞的富集的、分离的和/或纯化的细胞群。
本发明的一些方面涉及从定形内胚层细胞产生PDX1-阴性前肠内胚层细胞的细胞培养物的方法或过程。这些方法包括在定形内胚层细胞的细胞培养物或细胞群中减少或消除TGFβ超家族生长因子信号传递。在一些实施方案中，通过从定形内胚层的细胞培养物或细胞群中稀释或除去外源添加的诸如活化素A的TGFβ超家族生长因子来介导。在一些实施方案中，定形内胚层细胞向前肠内胚层细胞的分化通过向定形内胚层细胞培养物或细胞群提供FGF家族生长因子和/或hedgehog途径抑制剂来增强。在一些实施方案中，定形内胚层细胞衍生自干细胞。优选地，该干细胞为胚胎干细胞。甚至更优选地，该干细胞为人胚胎干细胞(hESC)。在一些实施方案中，通过添加诸如视黄酸的类视黄醇，使PDX1-阴性定形内胚层细胞分化为PDX1-阳性内胚层细胞(胰内胚层细胞)。其它的方面涉及产生PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞的细胞培养物的方法或过程。这类方法包括向定形内胚层细胞提供视黄酸。在一些实施方案中，该定形内胚层细胞衍生自干细胞。优选地，该干细胞为胚胎干细胞。甚至更优选地，该干细胞为人胚胎干细胞(hESC)。本发明的其它方面涉及产生PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞的细胞培养物的方法或过程。这类方法包括向定形内胚层细胞提供FGF家族生长因子。在一些实施方案中，该定形内胚层细胞衍生自干细胞。优选地，该干细胞为胚胎干细胞。甚至更优选地，该干细胞为hESC。
本发明的其它实施方案涉及富集、分离和/或纯化PDX1-阴性前肠内胚层细胞的方法。在这类实施方案中，通过使用结合在PDX1-阴性前肠内胚层细胞的细胞表面上表达的分子(如细胞表面分子)的抗体、配体或其它分子，将PDX1-阴性前肠内胚层细胞与细胞群中的其它细胞分离。本发明的其它实施方案涉及富集、分离和/或纯化PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞的方法。在这类实施方案中，通过使用结合在PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞的细胞表面上表达的分子(如选自表3的细胞表面分子或选自表4的细胞表面分子)的抗体、配体或其它分子，将PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞与细胞群中的其它细胞分离。本发明的其它实施方案涉及富集、分离和/或纯化PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞的方法。在这类实施方案中，通过使用结合在PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞的细胞表面上表达的分子(如选自表3的细胞表面分子)的抗体、配体或其它分子，将PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞与细胞群中的其它细胞分离。
本发明的实施方案涉及富集、分离和/或纯化PDX1-阴性前肠内胚层细胞的其它方法。在这类实施方案中，将PDX1-阴性前肠内胚层细胞前体-多能性或多潜能细胞改造成含有荧光报告基因，使该基因处于内源控制如HNF1b或FOXA1的标志物基因的表达的启动子的控制之下。然后通过荧光激活细胞分选术(FACS)将该荧光标记的PDX1-阴性前肠内胚层细胞与细胞群中的其它细胞分离。本发明的其它实施方案涉及富集、分离和/或纯化PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞的其它方法。在这类实施方案中，将PDX1-阳性细胞前体-多能性或多潜能PDX1-阴性细胞改造成含有荧光报告基因，使该基因处于内源控制选自表3或表4的标志物基因的启动子的控制之下。然后，通过荧光激活细胞分选术(FACS)将该荧光标记的PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞与细胞群中的其它细胞分离。本发明的其它实施方案涉及富集、分离和/或纯化PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞的其它方法。在这类实施方案中，将PDX1-阳性细胞前体-多能性或多潜能PDX1-阴性细胞改造成含有荧光报告基因，使该基因处于内源控制选自表3的标志物基因的启动子的控制之下。然后，通过荧光激活细胞分选术(FACS)将该荧光标记的PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞与细胞群中的其它细胞分离。
本发明的其它实施方案涉及鉴定能够促进包含人细胞的细胞群中人PDX1-阴性前肠内胚层细胞分化的分化因子的方法。该方法包括以下步骤：获得包含人PDX1-阴性前肠内胚层细胞的细胞群，向该细胞群提供候选分化因子，在第一时间点确定所述细胞群中诸如HNF1b、FOXA1或PDX1的标志物的表达和在第二时间点确定所述细胞群中该相同标志物的表达。在这类实施方案中，第二时间点在第一时间点之后并且第二时间点在向所述细胞群提供候选分化因子之后。如果与第一时间点时所述细胞群中标志物的表达相比，第二时间点时所述细胞群中该相同标志物的表达增加或减少，则所述候选分化因子能够促进人PDX1-阴性前肠内胚层细胞的分化。本发明的其它实施方案涉及鉴定能够促进包含人细胞的细胞群中人PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞分化的分化因子的方法。该方法包括以下步骤：获得包含人PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞的细胞群，向该细胞群提供候选分化因子，在第一时间点确定所述细胞群中标志物，例如选自表3的标志物或选自表4的标志物的表达和在第二时间点确定所述细胞群中该相同标志物的表达。在这类实施方案中，第二时间点在第一时间点之后并且第二时间点在向细胞群提供候选分化因子之后。如果与第一时间点时所述细胞群中标志物的表达相比，第二时间点时所述细胞群中该相同标志物的表达增加或减少，则所述候选分化因子能够促进人PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞的分化。本发明的其它实施方案涉及鉴定能够促进包含人细胞的细胞群中人PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞分化的分化因子的方法。该方法包括以下步骤：获得包含人PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞的细胞群，向该细胞群提供候选分化因子，在第一时间点确定所述细胞群中标志物，例如选自表3的标志物的表达和在第二时间点确定所述细胞群中该相同标志物的表达。在这类实施方案中，第二时间点在第一时间点之后并且第二时间点在向所述细胞群提供候选分化因子之后。如果与第一时间点时所述细胞群中标志物的表达相比，第二时间点时所述细胞群中该相同标志物的表达增加或减少，则所述候选分化因子能够促进人PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞的分化。
一些权限中，术语“包含(comprising)”可以不具有任何通常所接受的定义。此处使用的术语“包含”是开放式的，可以包括任何其它元素。考虑到这一点，本发明的其它他实施方案参考以下编号的段落进行描述：
1.包含人细胞的细胞培养物，其中至少约26％的所述人细胞是表达至少一种选自表3的标志物的胰-十二指肠同源框因子-1(PDX1)阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞，所述PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞是能够分化为背胰芽细胞的多潜能细胞。
2.段落1的细胞培养物，其中所述选自表3的标志物为在所述细胞表面表达的标志物。
3.段落2的细胞培养物，其中所述在细胞表面表达的标志物选自CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2和SLC27A2。
4.段落1的细胞培养物，其中所述PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞表达至少一种选自表4的标志物。
5.段落4的细胞培养物，其中所述选自表4的标志物为在所述细胞表面表达的标志物。
6.段落5的细胞培养物，其中所述在细胞表面表达的标志物选自ADORA2A、CD47、EPB41L1、MAG、SFRP5、SLC16A10、SLC16A2、SLC1A3、SLC30A4、SLICK、SLITRK4和XPR1。
7.段落1的细胞培养物，其中所述人细胞的至少约30％为PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞。
8.段落1的细胞培养物，其中所述人细胞的至少约40％为PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞。
9.段落1的细胞培养物，其中所述人细胞的至少约50％为PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞。
10.段落1的细胞培养物，其中所述人细胞的至少约60％为PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞。
11.段落1的细胞培养物，其中所述人细胞的至少约75％为PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞。
12.段落1的细胞培养物，其中在所述培养物中存在人饲养细胞，并且除了所述人饲养细胞外至少约2％的人细胞为PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞。
13.段落1的细胞培养物，其中在所述PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞中PDX1的表达高于选自α-胎蛋白(AFP)、SOX7、SOX1、ZIC1和NFM的标志物的表达。
14.段落1的细胞培养物，其中所述细胞培养物基本不含选自内脏内胚层细胞、体壁内胚层细胞和神经细胞的细胞。
15.段落1的细胞培养物，还包含类视黄醇。
16.段落15的细胞培养物，其中所述类视黄醇为视黄酸(RA)。
17.段落16的细胞培养物，还包含B27。
18.包含人细胞的细胞培养物，其中至少约2％的所述人细胞是表达至少一种选自表3的标志物的胰-十二指肠同源框因子-1(PDX1)阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞，所述PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞是能够分化为腹胰芽细胞的多潜能细胞。
19.段落18的细胞培养物，其中所述选自表3的标志物为在所述细胞表面表达的标志物。
20.段落19的细胞培养物，其中所述在细胞表面表达的标志物选自CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2和SLC27A2。
21.段落18的细胞培养物，其中所述PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞不大量表达一种或多种选自表4的标志物。
22.段落18的细胞培养物，其中所述人细胞的至少约5％为PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞。
23.段落18的细胞培养物，其中所述人细胞的至少约10％为PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞。
24.段落18的细胞培养物，其中所述人细胞的至少约25％为PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞。
25.段落18的细胞培养物，其中所述人细胞的至少约50％为PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞。
26.段落18的细胞培养物，其中所述人细胞的至少约75％为PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞。
27.段落18的细胞培养物，其中在所述培养物中存在人饲养细胞，并且除了所述人饲养细胞外至少约2％的人细胞为PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞。
28.段落18的细胞培养物，其中在所述PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞中PDX1的表达高于选自α-胎蛋白(AFP)、SOX7、SOX1、ZIC1和NFM的标志物的表达。
29.段落18的细胞培养物，其中所述细胞培养物基本不含选自内脏内胚层细胞、体壁内胚层细胞和神经细胞的细胞。
30.段落18的细胞培养物，还包含类视黄醇。
31.段落30的细胞培养物，其中所述类视黄醇为视黄酸(RA)。
32.段落31的细胞培养物，还包含B27。
33.包含细胞的细胞群，其中所述细胞的至少约90％为表达至少一种选自表3的标志物的人PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞，所述PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞是能够分化为背胰芽细胞的多潜能细胞。
34.段落33的细胞群，其中所述选自表3的标志物为在所述细胞表面表达的标志物。
35.段落34的细胞群，其中所述在细胞表面表达的标志物选自CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2和SLC27A2。
36.段落33的细胞群，其中所述PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞表达至少一种选自表4的标志物。
37.段落36的细胞群，其中所述选自表4的标志物为在所述细胞表面表达的标志物。
38.段落37的细胞群，其中所述在细胞表面表达的标志物选自ADORA2A、CD47、EPB41L1、MAG、SFRP5、SLC16A10、SLC16A2、SLC1A3、SLC30A4、SLICK、SLITRK4和XPR1。
39.段落33的细胞群，其中所述细胞的至少约95％为PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞。
40.段落33的细胞群，其中所述细胞的至少约98％为PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞。
41.段落33的细胞群，其中所述PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞中PDX1的表达高于选自AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和NFM的标志物的表达。
42.包含细胞的细胞群，其中所述细胞的至少约90％为表达至少一种选自表3的标志物的人PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞，所述PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞是能够分化为腹胰芽细胞的多潜能细胞。
43.段落42的细胞群，其中所述选自表3的标志物为在所述细胞表面表达的标志物。
44.段落43的细胞群，其中所述在细胞表面表达的标志物选自CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2和SLC27A2。
45.段落42的细胞群，其中所述PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞不大量表达一种或多种选自表4的标志物。
46.段落42的细胞群，其中所述细胞的至少约95％为PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞。
47.段落42的细胞群，其中所述细胞的至少约98％为PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞。
48.段落42的细胞群，其中所述PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞中PDX1的表达高于选自AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和NFM的标志物的表达。
49.产生PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞的方法，所述方法包括以下步骤：获得包含PDX1-阴性定形内胚层细胞的细胞群，并向所述细胞群提供足够量的类视黄醇以促进所述PDX1-阴性定形内胚层细胞群的至少约26％分化为表达至少一种选自表3的标志物的PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞，其中所述PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞为能够分化为背胰芽细胞的多潜能细胞。
50.段落49的方法，其中所述PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞还表达至少一种选自表4的标志物。
51.段落50的方法，还包括允许足够时间让PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞形成的步骤，其中所述用于PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞形成的足够时间通过检测所述细胞群中偏背侧前肠内胚层细胞中选自表4的标志物的存在来确定。
52.段落50的方法，其中所述选自表3或表4的标志物的表达通过定量聚合酶链式反应(Q-PCR)测定。
53.段落50的方法，其中所述选自表3或表4的标志物的表达通过细胞免疫化学测定。
54.段落49的方法，其中所述PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞中PDX1的表达高于选自α-胎蛋白(AFP)、SOX7、SOX1、ZIC1和NFM的标志物的表达。
55.段落49的方法，其中所述类视黄醇为RA。
56.段落55的方法，其中RA以约0.5μM至约50μM的浓度提供。
57.段落56的方法，其中RA以约1μM至约20μM的浓度提供。
58.段落57的方法，其中RA以约2μM的浓度提供。
59.段落55的方法，其中RA在所述培养物约5天龄时提供。
60.段落49的方法，还包括向所述培养物提供B27。
61.段落60的方法，其中所述B27以总培养基的约0.1％至约20％的浓度提供。
62.段落61的方法，其中B27以总培养基的约0.5％至约2％的浓度提供。
63.段落62的方法，其中B27以总培养基的约0.5％的浓度提供。
64.段落60的方法，其中B27在与所述类视黄醇大概相同的时间提供。
65.段落49的方法，还包括向所述培养物提供活化素A。
66.段落65的方法，其中活化素A以约10ng/ml至约200ng/ml的浓度提供。
67.段落66的方法，其中活化素A以约20ng/ml至约100ng/ml的浓度提供。
68.段落67的方法，其中活化素A以约25ng/ml的浓度提供。
69.段落49的方法，其中所述PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞在CMRL培养基中生长。
70.段落69的方法，其中所述CMRL培养基包含约2μM的RA，约25ng/ml的活化素A和总培养基的约0.5％的B27。
71.段落49的方法，其中所述获得包含PDX1-阴性定形内胚层细胞的细胞群的步骤包括获得包含多能性人细胞的细胞群、向所述细胞群提供足够量的至少一种TGFβ超家族生长因子以促进所述多能性细胞向定形内胚层细胞的分化、并允许足够时间来让定形内胚层细胞形成，其中所述用于定形内胚层细胞形成的足够时间通过检测所述细胞群中定形内胚层细胞的存在来确定。
72.通过段落49的方法产生的PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞。
73.产生PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞的方法，所述方法包括以下步骤：获得包含PDX1-阴性定形内胚层细胞的细胞群，并向所述细胞群提供足够量的FGF家族生长因子以促进所述PDX1-阴性定形内胚层细胞群的至少一部分分化为表达至少一种选自表3的标志物的PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞，其中所述PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞为能够分化为腹胰芽细胞的多潜能细胞。
74.段落73的方法，其中所述细胞群在不存在RA下分化。
75.段落73的方法，其中所述PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞不表达一种或多种选自表4的标志物。
76.段落73的方法，还包括允许足够时间让PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞形成的步骤，其中所述用于PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞形成的足够时间通过检测所述细胞群中偏腹侧的前肠内胚层细胞中选自表3的标志物的存在来确定。
77.段落76的方法，其中所述选自表3的标志物的表达通过定量聚合酶链式反应(Q-PCR)测定。
78.段落76的方法，其中所述选自表3的标志物的表达通过细胞免疫化学测定。
79.段落73的方法，其中所述PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞中PDX1的表达高于选自α-胎蛋白(AFP)、SOX7、SOX1、ZIC1和NFM的标志物的表达。
80.段落73的方法，其中所述FGF家族生长因子为FGF-10，所述FGF-10以约5ng/ml至约500ng/ml的浓度提供。
81.段落80的方法，其中FGF-10以约10ng/ml至约100ng/ml的浓度提供。
82.段落81的方法，其中FGF-10以约50ng/ml的浓度提供。
83.段落73的方法，其中所述FGF家族生长因子在所述培养物约3天龄时提供。
84.段落73的方法，还包括向所述培养物提供B27。
85.段落84的方法，其中所述B27以总培养基的约0.1％至约20％的浓度提供。
86.段落85的方法，其中B27以总培养基的约0.5％至约2％的浓度提供。
87.段落86的方法，其中B27以总培养基的约0.5％的浓度提供。
88.段落84的方法，其中B27在与所述FGF家族生长因子大概相同的时间提供。
89.段落73的方法，还包括向所述培养物提供hedgehog抑制剂。
90.段落89的方法，其中所述hedgehog抑制剂为KAAD-环杷明，所述KAAD-环杷明以约0.1μM至约50μM的浓度提供。
91.段落90的方法，其中KAAD-环杷明以约0.5μM至约10μM的浓度提供。
92.段落91的方法，其中KAAD-环杷明以约0.5μM的浓度提供。
93.段落73的方法，其中所述PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞在CMRL培养基中生长。
94.段落93的方法，其中所述CMRL培养基包含约50ng/ml的FGF-10，约0.5μM的KAAD-环杷明和总培养基的约0.5％的B27。
95.段落94的方法，其中所述CMRL培养基不含RA。
96.段落73的方法，所述获得包含PDX1-阴性定形内胚层细胞的细胞群的步骤包括获得包含多能性人细胞的细胞群、向所述细胞群提供足够量的至少一种TGFβ超家族生长因子以促进所述多能性细胞向定形内胚层细胞的分化、并允许足够时间来让定形内胚层细胞形成，其中所述用于定形内胚层细胞形成的足够时间通过检测所述细胞群中定形内胚层细胞的存在来确定。
97.通过段落73的方法产生的PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞。
98.产生富集PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞的细胞群的方法，所述方法包括以下步骤：分化PDX1-阴性定形内胚层细胞群中的细胞以便产生PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞，向所述细胞群提供结合在所述PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞中表达但不在所述细胞群中存在的其它细胞类型中大量表达的标志物的试剂，并将结合至所述试剂的所述PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞与所述细胞群中存在的所述其它细胞类型分开，由此产生富集PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞的细胞群，其中所述PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞为能够分化为背胰芽细胞的多潜能细胞。
99.段落98的方法，其中所述标志物选自ADORA2A、CD47、EPB41L1、MAG、SFRP5、SLC16A10、SLC16A2、SLC1A3、SLC30A4、SLICK、SLITRK4和XPR1。
100.段落98的方法，其中所述标志物选自CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2和SLC27A2。
101.段落98的方法，其中所述分化步骤进一步包括获得包含PDX1-阴性定形内胚层细胞的细胞群，向所述细胞群提供足够量的类视黄醇以促进所述PDX1-阴性定形内胚层细胞向PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞分化，并允许足够时间让PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞形成，其中所述用于PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞形成的足够时间通过检测所述细胞群中PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞的存在来确定，所述PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞为能够分化为背胰芽细胞的多潜能细胞。
102.段落101的方法，其中提供步骤还包括提供B27。
103.段落101的方法，其中检测包括检测至少一种选自表4的标志物的表达。
104.段落98的方法，其中所述细胞的至少约95％为PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞。
105.段落98的方法，其中所述细胞的至少约98％为PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞。
106.段落98的方法，其中所述试剂为抗体。
107.段落106的方法，其中所述抗体对选自ADORA2A、CD47、EPB41L1、MAG，SFRP5、SLC16A10、SLC16A2、SLC1A3、SLC30A4、SLICK、SLITRK4、XPR1、CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2和SLC27A2的细胞表面标志物有亲和力。
108.通过段落98的方法产生的PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞的富集群。
109.产生富集PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞的细胞群的方法，所述方法包括以下步骤：分化PDX1-阴性定形内胚层细胞群中的细胞以便产生PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞，向所述细胞群提供结合在所述PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞中表达但不在所述细胞群中存在的其它细胞类型中大量表达的标志物的试剂，并将结合至所述试剂的所述PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞与所述细胞群中存在的所述其它细胞类型分开，由此产生富集PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞的细胞群，其中所述PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞为能够分化为腹胰芽细胞的多潜能细胞。
110.段落109的方法，其中所述标志物选自CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2和SLC27A2。
111.段落109的方法，其中所述分化步骤进一步包括获得包含PDX1-阴性定形内胚层细胞的细胞群，向所述细胞群提供足够量的FGF家族生长因子以促进所述PDX1-阴性定形内胚层细胞向PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞分化，并允许足够时间让PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞形成，其中所述用于PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞形成的足够时间通过检测所述细胞群中PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞的存在来确定，所述PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞为能够分化为腹胰芽细胞的多潜能细胞。
112.段落111的方法，其中所述提供步骤还包括提供B27。
113.段落111的方法，其中所述检测包括检测至少一种选自表3的标志物的表达。
114.段落109的方法，其中所述细胞的至少约95％为PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞。
115.段落109的方法，其中所述细胞的至少约98％为PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞。
116.段落109的方法，其中所述试剂为抗体。
117.段落116的方法，其中所述抗体对选自CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2和SLC27A2的细胞表面多肽有亲和力。
118.通过段落109的方法产生的PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞的富集群。
119.产生富集PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞的细胞群的方法，所述方法包括以下步骤：获得多能性细胞群，其中至少一个所述多能性细胞群的细胞包含至少一个拷贝的由选自表4的任一标志物基因的启动子控制的核酸，所述核酸包含编码荧光蛋白或其生物学活性片段的序列，分化所述多能性细胞以产生PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞，所述PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞为能够分化为背胰芽细胞的多潜能细胞，以及将所述PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞与所述细胞群中存在的其它细胞类型分开。
120.段落119的方法，其中所述富集的细胞群包含至少约95％的PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞。
121.段落119的方法，其中所述富集的细胞群包含至少约98％的PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞。
122.段落119的方法，其中所述分化步骤进一步包括，向所述多能性细胞群提供足够量的至少一种TGFβ超家族生长因子以促进所述多能性细胞向PDX1-阴性定形内胚层细胞分化，并且向所述PDX1-阴性定形内胚层细胞提供足够量的类视黄醇以促进所述PDX1-阴性定形内胚层细胞向PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞分化。
123.段落122的方法，其中所述类视黄醇为RA。
124.段落123的方法，其中所述提供步骤还包括提供B27。
125.段落119的方法，其中所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白(GFP)。
126.段落119的方法，其中通过荧光激活的细胞分选术(FACS)将所述PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞与所述细胞群中的其它细胞类型分开。
127.通过段落119的方法产生的PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞的富集群。
128.产生富集PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞的细胞群的方法，所述方法包括以下步骤：获得多能性细胞群，其中至少一个所述多能性细胞群的细胞包含至少一个拷贝的由选自表3的任一标志物基因的启动子控制的核酸，所述核酸包含编码荧光蛋白或其生物学活性片段的序列，分化所述多能性细胞以产生PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞，所述PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞为能够分化为腹胰芽细胞的多潜能细胞，以及将所述PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞与非偏腹侧的前肠内胚层细胞分开。
129.段落128的方法，其中所述富集的细胞群包含至少约95％的PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞。
130.段落128的方法，其中所述富集的细胞群包含至少约98％的PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞。
131.段落128的方法，其中所述分化步骤进一步包括，向所述多能性细胞群提供足够量的至少一种TGFβ超家族生长因子以促进所述多能性细胞向PDX1-阴性定形内胚层细胞分化，并且向所述PDX1-阴性定形内胚层细胞提供足够量的FGF家族生长因子以促进所述PDX1-阴性定形内胚层细胞向PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞分化。
132.段落128的方法，其中所述提供步骤还包括提供B27。
133.段落128的方法，其中所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白(GFP)。
134.段落128的方法，其中通过荧光激活的细胞分选术(FACS)将所述PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞与所述细胞群中存在的其它细胞类型分开。
135.通过段落128的方法产生的PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞的富集群。
136.鉴定能够促进包含人细胞的细胞群中人PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞分化的分化因子的方法，所述方法包括以下步骤：获得包含人PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞的细胞群，向所述细胞群提供候选分化因子，在第一时间点确定所述细胞群中标志物的表达，在第二时间点确定所述细胞群中相同标志物的表达，其中所述第二时间点在所述第一时间点之后并且所述第二时间点在向所述细胞群提供所述候选分化因子之后，以及确定与所述第一时间点时所述细胞群中标志物的表达相比，所述第二时间点时所述细胞群中所述标志物的表达是否增加或减少，其中所述第二时间点时所述细胞群中所述标志物的表达增加或减少表明所述候选分化因子能够促进所述人PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞的分化。
137.段落136的方法，其中所述标志物选自表4。
138.段落136的方法，其中所述人PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞包含至少约10％的所述细胞群中的人细胞。
139.段落136的方法，其中在所述细胞群中存在人饲养细胞，并且除了所述饲养细胞外至少约10％的人细胞为PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞。
140.段落136的方法，其中所述人PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞包含至少约90％的所述细胞群中的人细胞。
141.段落136的方法，其中在所述细胞群中存在人饲养细胞，并且除了所述饲养细胞外至少约90％的人细胞为PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞。
142.段落136的方法，其中所述人PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞能够分化为背胰芽细胞。
143.段落136的方法，其中所述人定形内胚层细胞应答所述候选分化因子而分化为胰前体细胞。
144.段落136的方法，其中所述第一时间点在向所述细胞群提供所述候选分化因子之前。
145.段落136的方法，其中所述第一时间点在向所述细胞群提供所述候选分化因子大概同时。
146.段落136的方法，其中所述第一时间点在向所述细胞群提供所述候选分化因子之后。
147.段落136的方法，其中所述标志物的表达增加。
148.段落136的方法，其中所述标志物的表达减少。
149.段落136的方法，其中所述标志物的表达通过定量聚合酶链式反应(Q-PCR)来测定。
150.段落136的方法，其中所述标志物的表达通过细胞免疫化学来测定。
151.段落136的方法，其中所述分化因子包括小分子。
152.段落136的方法，其中所述分化因子包括多肽。
153.段落136的方法，其中所述分化因子包括生长因子。
154.鉴定能够促进包含人细胞的细胞群中人PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞分化的分化因子的方法，所述方法包括以下步骤：获得包含人PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞的细胞群，向所述细胞群提供候选分化因子，在第一时间点确定所述细胞群中标志物的表达，在第二时间点确定所述细胞群中相同标志物的表达，其中所述第二时间点在所述第一时间点之后并且所述第二时间点在向所述细胞群提供所述候选分化因子之后，以及确定与所述第一时间点时所述细胞群中标志物的表达相比，所述第二时间点时所述细胞群中所述标志物的表达是否增加或减少，其中所述第二时间点时所述细胞群中所述标志物的表达增加或减少表明所述候选分化因子能够促进所述人PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞的分化。
155.段落154的方法，其中所述标志物选自表3。
156.段落154的方法，其中所述人PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞包含至少约10％的所述细胞群中的人细胞。
157.段落154的方法，其中在所述细胞群中存在人饲养细胞，并且除了所述饲养细胞外至少约10％的人细胞为PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞。
158.段落154的方法，其中所述人PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞包含至少约90％的所述细胞群中的人细胞。
159.段落154的方法，其中在所述细胞群中存在人饲养细胞，并且除了所述饲养细胞外至少约90％的人细胞为PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞。
160.段落154的方法，其中所述人PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞能够分化为腹胰芽细胞。
161.段落154的方法，其中所述人定形内胚层细胞应答所述候选分化因子而分化为胰前体细胞。
162.段落154的方法，其中所述第一时间点在向所述细胞群提供所述候选分化因子之前。
163.段落154的方法，其中所述第一时间点大概在向所述细胞群提供所述候选分化因子的同时。
164.段落154的方法，其中所述第一时间点在向所述细胞群提供所述候选分化因子之后。
165.段落154的方法，其中所述标志物的表达增加。
166.段落154的方法，其中所述标志物的表达减少。
167.段落154的方法，其中所述标志物的表达通过定量聚合酶链式反应(Q-PCR)来测定。
168.段落154的方法，其中所述标志物的表达通过细胞免疫化学来测定。
169.段落154的方法，其中所述分化因子包括小分子。
170.段落154的方法，其中所述分化因子包括多肽。
171.段落154的方法，其中所述分化因子包括生长因子。
应了解上述的方法和组合物与体外培养的细胞有关。但是，上述体外分化的细胞组合物可用于体内用途。
本发明的其它实施方案可参见以下专利申请：2003年12月23日提交的第60/532,004号美国临时专利申请，标题为“定形内胚层”；2004年4月27日提交的第60/566,293号美国临时专利申请，标题为“表达PDX1的内胚层”；2004年7月9日提交的第60/586,566号美国临时专利申请，标题为“用于分离定形内胚层的趋化因子细胞表面受体”；2004年7月14日提交的第60/587,942号美国临时专利申请，标题为“用于分离定形内胚层的趋化因子细胞表面受体”；2004年12月23日提交的第11/021,618号美国专利申请，标题为“定形内胚层”；2005年4月26日提交的第11/115,868号美国专利申请，标题为“表达PDX1的内胚层”；2005年6月23日提交的第11/165,305号美国专利申请，标题为“鉴定分化定形内胚层的因子的方法”，在此通过引用的方式将它们的公开内容整体并入本文。
附图简要说明
图1是从hESC产生β-细胞的提议的分化途径示意图。途径的第一步负责ES细胞至定形内胚层系，也代表向胰内胚层、内分泌内胚层或胰岛/β-细胞的进一步分化事件前的第一步。途径的第二步显示SOX17-阳性/PDX1-阴性的定形内胚层向PDX1-阳性前肠内胚层的转化。在介导这些转化中起作用的因子用斜体字表示。定义靶细胞的相关标志物用下划线表示。
图2是人SOX17cDNA的示意图，显示了保守区的位置并突出显示了用于通过GENOVAC的免疫步骤的区域。
图3是关系树状图，显示SOX17与SOX7关系最近，与SOX18关系稍远。在同源物种中SOX17蛋白质比相同物种中的SOX群F亚族的其它成员的相关性强得多
图4是用兔抗SOX17抗体作探针的Western印迹，该印迹证明这个抗体对成纤维细胞(1道)中过表达的SOX17有特异性，而缺乏与EGFP(2道)或最接近的SOX家族成员SOX7(3道)的免疫反应性。
图5A-5B是显示大量AFP+共标记细胞的SOX17+细胞簇的显微照片。这与其他SOX17+簇(B)形成显著对比，因为在其他SOX17+簇中只能观察到很少或者就根本没有AFP+细胞。
图6A-6C是显示体壁内胚层和SOX17的显微照片。图A显示随机分化的hES细胞培养物中体壁内胚层细胞表面的人血栓调节蛋白(TM)的免疫细胞化学检测。图B显示与图A相同的区域，对TM和SOX17双标记。图C是用DAPI标记核的相同区域的相差成像。注意：DAPI标记的核和SOX17标记的完全对应。
图7A-7B是显示定量PCR(Q-PCR)检测的SOX17基因表达和SOX17-特异性抗体检测的抗SOX17阳性细胞的条形图。图A显示相对于未分化的对照培养基(SR20)，活化素A增加SOX17基因表达，而视黄酸(RA)强烈抑制SOX17表达。图B显示在SOX17+细胞数量上反映了相似的模式以及这些变化的相似倍数，表明SOX17基因表达的Q-PCR检测可以在单个细胞水平反映出变化。
图8A是条形图，显示活化素A存在下正在分化的hESC培养物保持低水平的AFP基因表达，而在10％小牛血清(FBS)中随机分化的细胞显示AFP的强烈上调。表达水平的差异大约是7倍。
图8B-8C是两张显微图片，显示活化素A对AFP表达的抑制在单个细胞水平也很显著，这由相对于单用10％FBS(顶部)，在活化素A处理的条件(底部)下只能观察到非常少和小的AFP+细胞簇来表明。
图9A-9B是显示使用流式细胞仪定量的AFP+细胞数的对比图片。这个图证明在活化素A存在(左图)或缺失(右图)的条件下，AFP基因表达(图8A)的改变倍数完全对应于AFP+细胞的数量，进一步支持了使用Q-PCR分析来指示单个细胞水平上发生的变化。
图10A-10F是显示使hESC暴露于nodal蛋白、活化素A和活化素B(NAA)5天后SOX17+细胞数目显著增加(A-C)的显微图片。通过比较每个区域SOX17+细胞占全部细胞数目(如DAPI染色的核(D-F)所示)的相对丰度，可以看出在用NAA处理5天后约30-50％的细胞对SOX17显示免疫反应性。
图11是证明活化素A(0，10，30或100ng/ml)剂量依赖的增加正在分化的hESC中SOX17基因表达的条形图。在粘附培养时处理3天后增加的表达已经很高，并一直持续到随后悬浮培养的1、3和5天。
图12A-12C是证明活化素A对MIXL1(图A)、GATA4(图B)和HNF3b(图C)的表达的影响的条形图。也观察到活化素A剂量依赖的增加定形内胚层3种其他标志物：MIXL1、GATA4和HNF3b。与活化素剂量对应的表达增加的倍数与对SOX17所观察到的非常相似，强烈表明活化素A特异化共表达所有4种基因(SOX17+、MIXL1+、GATA4+和HNF3b+)的细胞群。
图13A-13C是证明活化素A对AFP(图A)、SOX7(图B)和SPARC(图C)的表达的影响的条形图。内脏内胚层标志物AFP的表达对活化素A显示剂量依赖性的降低。原始内胚层标志物(SOX7)和体壁内胚层标志物(SPARC)保持不变或在一些时间点显示抑制，表明活化素A不起特异化这些胚外内胚层细胞类型的作用。这进一步支持了以下事实：SOX17、MIXL1、GATA4和HNF3b表达的增加归因于响应活化素A的定形内胚层细胞数目的增加。
图14A-14B是显示活化素A对ZIC1(图A)和Brachyury(图B)的表达的影响的条形图。神经标志物ZIC1稳定的表达证明活化素A对神经分化没有剂量依赖效应。Brachyury的表达降低显示100ng/ml活化素A处理显著抑制了中胚层分化。这可能是从中内胚层前体向定形内胚层特异化增加的结果。相对于未处理的对照培养物，低水平的活化素A(10和30ng/ml)处理在分化的较后期保持brachyury的表达。
图15A-15B是显示响应活化素处理的体壁内胚层分化降低的显微图片。在只有血清的条件下分化时，体壁内胚层Tmhi区域存在于所有培养物中(A)，而包含活化素A时，向TM+细胞的分化非常少，TM免疫反应性的总强度较低。
图16A-16D是显示响应活化素A和活化素B处理的标志物表达的显微图片。hESC用活化素A和活化素B连续处理4天，用SOX17、AFP和TM抗体三重标记。图16A-SOX17；图16B-AFP；图16C-TM；图16D 相差(Phase)/DAPI。注意到许多SOX17阳性细胞伴随着AFP(B)和TM(C)免疫反应性的完全缺失。
图17是显示在体外从hESC出现定形内胚层和内脏内胚层的显微图片。通过AFPhi/SOX17lo/-鉴定内脏内胚层区域，而定形内胚层显示完全相反的模式SOX17hi/AFPlo/-。因为这两个区域互相靠近，所以选择了这个区域。但是，在从AFPhi细胞的任意区域的完全分离物中经常会观察到SOX17hi/AFPlo/-区域，表明来自内脏内胚层的定形内胚层的单独起源。
图18是描述TGFβ家族的配体和受体的图表。激活AR Smads和BR Smads的因子可以在从人胚胎干细胞产生定形内胚层的过程中起作用(参见：J Cell Physiol.187：265-76)。
图19是显示作为经单一或组合的TGFβ因子处理结果的SOX17表达的诱导随时间变化的条形图。
图20是显示作为经组合的TGFβ因子处理结果的SOX17+细胞数目随时间变化的条形图。
图21是显示作为经组合的TGFβ因子处理结果的SOX17表达的诱导随时间变化的条形图。
图22是显示活化素A剂量依赖性地诱导SOX17+细胞数目增加的条形图。
图23是条形图，显示向活化素A和活化素B处理的培养物中添加Wnt3a促使SOX17的表达水平高于只用活化素A和活化素B诱导的表达水平。
图24A-24C是显示低FBS条件增强向定形内胚层分化的条形图。在含2％FBS的培养基中用活化素A和活化素B处理(2AA)hESC，可导致SOX17的表达水平比在含10％FBS的培养基中经相同处理(10AA)的SOX17的表达水平高2至3倍(图A)。定形内胚层标志物MIXL1(图B)的诱导也以相同方式受影响，在2％FBS中对AFP(内脏内胚层)的抑制比在10％FBS条件下更强(图C)。
图25A-25D是显示培养物中SOX17+细胞分裂的显微图片。SOX17免疫反应性细胞存在于hESC克隆的分化边缘(C、D)，被增殖细胞核抗原(PCNA)标记(图B)，但不被OCT4共标记(图C)。此外，在SOX17+细胞(箭头)以及OCT4+细胞，未分化的hESCs(箭头头部)中用DAPI标记核均可看到清晰的有丝分裂图(D)。
图26是显示在不同培养基条件下正在分化的hESC中CXCR4的相对表达水平的条形图。
图27A-27D是显示一组定形内胚层标志物在如同图26显示的相同分化处理下如何与CXCR4共享非常相似的表达模式的条形图。
图28A-28E是条形图，显示中胚层标志物(BRACHYURY，MOX1)、外胚层标志物(SOX1，ZIC1)和内脏内胚层标志物(SOX7)在如同图26显示的相同处理下如何表现出与CXCR4表达相反的关系。
图29A-29F是显示在图26-28中展示的三种培养基条件下SOX17免疫反应性细胞的相对差异的显微图片。
图30A-30C是流式细胞点图，证明CXCR4+细胞数目随添加至分化培养基的活化素A的浓度的增加而增加。
图31A-31D是条形图，显示从高剂量活化素A处理(A100-CX+)分离的CXCR4+细胞比亲代群(A100)进一步富集定形内胚层标志物。
图32是条形图，显示使用荧光激活的细胞分选术(FACS)分离的CXCR4+和CXCR4-细胞的基因表达以及亲代群中的基因表达。这证明CXCR4+细胞基本包含了每个亲代细胞群中所有的CXCR4基因表达，CXCR4-细胞群包含很少或没有CXCR4基因表达。
图33A-33D是条形图，证明从高剂量活化素A处理分离的CXCR4+细胞中中胚层(BRACHYURY，MOX1)、外胚层(SOX1，ZIC1)和内脏内胚层(SOX7)基因表达的缺失，这些非定形内胚层标志物的表达已经受到抑制。
图34A-34M是显示可用于鉴定定形内胚层细胞的标志物基因的表达模式的条形图。图34G-34L分别显示了定形内胚层标志物FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1和CRIP1的表达分析。图34A-34F分别显示了前面描述的细胞系标记基因SOX17、SOX7、SOX17/SOX7、TM、ZIC1和MOX1)的表达分析。图34M显示了CXCR4的表达分析。对于图34A-M的每一图，标注hESC的柱示来自纯化的人胚胎干细胞的基因表达；2NF表示细胞经过2％FBS处理，不添加活化素；0.1A100表示细胞经0.1％FBS和100ng/ml活化素A处理；1A100表示细胞经过1％FBS和100ng/ml活化素A处理；2A100表示细胞经过2％FBS和100ng/ml活化素A处理。
图35是显示在含有或不含活化素的条件下培养4天和6天的hESC培养物中PDX1基因相对表达的图表，其中在第4天添加视黄酸(RA)和成纤维生长因子(FGF-10)。
图36A-36F是显示在含有或不含活化素的条件下培养4天和6天的hESCs培养物中标志物基因相对表达的图表，其中在第4天添加视黄酸(RA)和成纤维生长因子(FGF-10)。各图显示了下列标志物基因表达的相对水平：(A)SOX17；(B)SOX7；(C)AFP；(D)SOX1；(E)ZIC1；和(F)NFM。
图37A-37C是显示在含有或不含活化素的条件下培养4天和8天的hESC培养物中标志物基因相对表达的图表，其中在第4天添加视黄酸(RA)、成纤维生长因子(FGF-10)和成纤维生长因子(FGF-4)的组合。各图显示了下列标志物基因表达的相对水平：(A)PDX1；(B)SOX7和(C)NFM。
图38A-38G是显示在与50ng/ml FGF-10接触的定形内胚层细胞培养物中标志物基因的相对表达的图表，其中在第4天添加1μM、0.2μM或0.04μM视黄酸(RA)与50ng/ml FGF-10联合使用。各图显示了下列标志物基因表达的相对水平：(A)PDX1；(B)HOXA3；(C)HOXC6；(D)HOXA13；(E)CDX1；(F)SOX1和(G)NFM。
图39A-39E显示在含有或不含活化素，存在视黄酸(RA)、成纤维细胞生长因子(FGF-10)和下列之中的一种：血清替代物(SR)，小牛血清(FBS)或B27构成的组合的条件下培养4天和8天的hESC培养物中标志物基因的相对表达。各栏显示了下列标志物基因表达的相对水平：(A)PDX1；(B)SOX7；(C)AFP；(D)ZIC1和(E)NFM。
图40A-40B是显示6天(刚好在添加RA之前)后和9天(暴露于RA3天后)时hESC培养物中胰(PDX1、HNF6)和肝(HNF6)的标志物基因的相对表达的图表。包括了不同的条件的比较，在25ng/ml(A25)或50ng/ml(A50)的条件下添加了10ng/ml(a10)、25ng/ml(a25)或50ng/ml(a50)的活化素B。不含任何活化素A和活化素B(NF)的条件作为产生定形内胚层和PDX1-阳性内胚层的阴性对照。各图显示了下列标志物基因表达的相对水平：(A)PDX1和(B)HNF6。
图41A-41C显示在含有100ng/ml(A100)、50ng/ml(A50)或不含(NF)活化素A的条件下培养5天(刚好在添加视黄酸之前)时和添加RA后2、4和6天(分别是第7、9和11天)的hESCs培养物中标志物基因的相对表达。每个柱图下直接标记的百分比表明分化3至5天期间的FBS剂量。从第7天开始，用RA处理(R)的细胞在包含0.5％FBS的RPMI培养基中生长。RA的浓度在第7天是2μM，第9天是1μM，第11天是0.2μM。各图显示了下列标志物基因表达的相对水平：(A)PDX1；(B)ZIC1和(C)SOX7。
图42A-42B显示首先在低FBS中用活化素A处理诱导定形内胚层(第5天)，然后用包含25ng/ml活化素A和RA或各种条件培养基(MEFCM、CM#2、CM#3和CM#4)和RA的新鲜(A25R)培养基诱导PDX1-表达内胚层。在第5、6、7、8和9天检测标志物表达。各图显示了下列标志物基因表达的相对水平：(A)PDX1和(B)CDX1。
图43显示了首先在低FBS中用活化素A处理诱导定形内胚层，然后用新鲜培养基处理，该新鲜培养基在以新鲜培养基稀释的条件培养基中包含活化素A和视黄酸(A25R)或者不同量的RA。培养基的总体积均是5ml。
图44是Western印迹，显示PDX1在添加RA和50ng/ml活化素A后3天(d8)和4天(d9)时RA-处理的定形内胚层细胞的免疫沉淀。
图45是一个概要图表，显示遗传标记了在PDX1启动子控制下的EGFP报告基因的PDX1-阳性前肠内胚层细胞荧光激活的细胞分选术(FACS)的结果。
图46为显示分选的活细胞(Live)、EGFP-阴性细胞(Neg)和EGFP-阳性细胞(GFP+)的群在相对于管家基因校正后的相对PDX1表达水平的图表。
图47为显示分选的活细胞(Live)、EGFP-阴性细胞(Neg)、一半带有最低EGFP信号强度(Lo)的EGFP-阳性细胞群和一半带有最高EGFP信号强度(Hi)的EGFP-阳性细胞群的群相对于管家基因校正后的相对PDX1表达水平。
图48A-48E显示分选的活细胞(Live)、EGFP-阴性细胞(Neg)和EGFP-阳性细胞(GFP+)的群相对于管家基因校正后5种胰内胚层标志物的相对表达水平。各图：A-NKX2.2；B-GLUT2；C-HNF3β；D-KRT19和E-HNF4α。
图49是显示分选的活细胞(Live)、EGFP-阴性细胞(Neg)和EGFP-阳性细胞(GFP+)的群在相对管家基因校正后两种非胰内胚层标志物的相对表达水平。各图：A-ZIC1和B-GFAP。
图50A-50D为条形图，显示hESC培养物中标志物基因在添加任何因子之前开始分化时(0d)，以及在100ng/ml活化素A(A100)存在下3天(3d)、然后在4-11天(7d、9d和11d)是3ng/ml BMP4和50ng/mlFGF-10(B3F50)时或者在100ng/ml活化素A(A100)存在下5天(5d)、然后在第6天和第7天(7d)是25ng/ml活化素A和2μM RA(A25R)时的相对表达。各图显示了以下标志物基因的相对表达水平：(A)ALB；(B)PDX1；(C)HB9和(D)HHEX。
图51A-51D为条形图，显示hESC培养物中标志物基因在添加任何因子之前开始分化时(0d)，以及在以下四种条件之一下分化4天时的相对表达水平：(a)100ng/ml BMP4和5μM SU5402(B/SU)；(b)无因子(NF)；(c)15ng/ml活化素A(A15)；或(d)100ng/ml活化素A。在这种分化之后接着在第5至12天(6d、8d、10d和12d)是3ng/ml BMP4、50ng/ml FGF-10和0.5μM KAAD-环杷明(B3F50K0.5)。这些图显示了以下标志物基因的相对表达水平：(A)CER；(B)SOX17；(C)PDX1和(D)ALB。
图52A-52B为图表，显示了hESC培养物中标志物基因在添加任何因子之前开始分化时(0d)；在100ng/ml活化素A(A100)存在下3天(3d)时；第4和第5天(5d)无因子存在(NF)，50ng/ml FGF-10和0.5μM KAAD-环杷明(FK)或3ng/ml BMP4、50ng/ml FGF-10和0.5μMKAAD-环杷明(BFK)时；以及在第6-13天(7d、9d、11d和13d)在无因子存在下的RPMI培养基(2R)中，无因子存在下的补加有B27的RPMI培养基中(0RB)，无因子存在下的补加有B27的CMRL培养基中(0CB)，50ng/ml FGF-10和0.5μM KAAD-环杷明存在下的补加有B27的CMRL培养基中(FK)或3ng/ml BMP4、50ng/ml FGF-10和0.5μMKAAD-环杷明存在下的补加有B27的CMRL培养基中(BFK)的相对表达水平。这些图显示了以下标志物基因的相对表达水平：(A)PDX1和(B)ALB。
图53A-53E为图表，显示了hESC培养物中标志物基因在添加任何因子之前开始分化时(0d)；以及在100ng/ml活化素A(A100)存在下3天(3d)、然后在4-11天(7d、9d和11d)是3ng/ml BMP4和50ng/mlFGF-10(B3F50)时(7d、9d和11d)或者在100ng/ml活化素A(A100)存在下5天(5d)、然后在第6天和第7天是25ng/ml活化素A和2μM RA(A25R)时的相对表达。这些图显示了以下标志物基因的相对表达水平：(A)PDX1；(B)SERPINF2；(C)DUSP9；(D)CDH6和(E)SOX9。
图54A-54D为图表，显示了hESC培养物中标志物基因在添加任何因子之前开始分化时(0d)；以及在100ng/ml活化素A(A100)存在下3天(3d)、然后在4-11天(7d、9d和11d)是3ng/ml BMP4和50ng/mlFGF-10(B3F50)时(7d、9d和11d)或者在100ng/ml活化素A(A100)存在下5天(5d)、然后在第6天和第7天是25ng/ml活化素A和2μM RA(A25R)时的相对表达。这些图显示了以下标志物基因的相对表达水平：(A)HOXA1；(B)PDE11A；(C)FAM49A和(D)WNT5A。
详细描述
称为原肠胚形成的早期人发育中的重要阶段发生于受精后2～3周。原肠胚形成非常重要，因为在这个阶段三种主要胚层第一次特异化和组织化(Lu et al.，2001；Schoenwolf和Smith，2000)。外胚层负责身体外表和整个神经系统的最终形成，而中胚层衍生出心、血、骨、骨骼肌和其他结缔组织。定形内胚层被定义为负责整个肠管(包括食道、胃、小肠和大肠)以及肠管衍生的器官(如肺、肝、胸腺、甲状旁腺、甲状腺、胆囊和胰腺)形成的胚层(Grapin-Botton和Melton，2000；Kimelman和Griffin，2000；Tremblay et al.，2000；Wells和Melton，1999；Wells和Melton，2000))。定形内胚层与称为原始内胚层的完全分离细胞系有重要区别。原始内胚层主要负责胚外组织的形成，主要是胎盘卵黄囊的腔壁和内脏内胚层部分和Reichert’s膜的胞外基质物质。
在原肠胚形成期，定形内胚层形成过程起始于细胞迁移事件，其中中内胚层细胞(有形成中胚层或内胚层能力的细胞)迁移穿过称为原条的结构。定形内胚层衍生自一些迁移穿过原条前部及节(在原条最前部区域的特化结构)的细胞。当迁移发生时，定形内胚层首先群集于最前部肠管，随后以肠管后端的形成终止。
发育过程中PDX1基因表达
PDX1(也称为STF-1、IDX-1、IPF-1、IUF-1和GSF)是胰和喙十二指肠(rostral duodenum)发育必需的转录因子。PDX1首先在胰内胚层表达，胰内胚层来自后部前肠内胚层，产生外分泌和内分泌细胞，在小鼠中开始于E8.5。其后，PDX1限定于β-细胞和一些δ-细胞。这种表达模式在成年后也保持。发育早期PDX1也在邻近形成中的胰的十二指肠内胚层表达，然后在十二指肠的肠细胞和肠内分泌细胞、胃窦及胆总管、胆囊和胆管中表达。在胰表达受限时，这个表达区域主要限于喙十二指肠。
小鼠和人体中PDX1基因的定向破坏导致胰发育不全(Jonsson，J.，et al，Nature，606-609，1994；
MF，et al.Devel.983-995，1996；Stoffers，D.A.，et al.Nature Genetics，106-110，1997)。PDX1还是胰岛素和生长抑素胰内分泌细胞终末分化期间所需要的，人体内单等位基因的功能性破坏与严重的MODY 4型(青春晚期糖尿病)胰机能障碍和迟发II型糖尿病相关(Stoffers D.A.，et al.Nature Genetics 138-139，1997)。
胰脏的胚胎发生过程中，在原肠内胚层的背侧和腹侧上出现未来胰腺组织的出芽。这些突出以区域限定方式出现在前肠内胚层的最后端。小鼠中这发生在约8.5-9.5受孕后天(dpc)，人类在30dpc。人类在35dpc之前，背侧和腹侧芽就已经生长，出现分枝导管系统并融合形成定形器官。PDX1蛋白为早期胰芽扩展并分化为构成胰脏的主要细胞(包括导管、腺泡和内分泌细胞)所需。
由于它们位于肠管的相反侧以及它们各自与脊索和心脏中胚层的结合，背侧和腹侧胰结构的发育模式显著不同。关于控制背侧和腹侧胰原基特化的独特发育模式，我们已经开发了两种独立的方法，用于从定形内胚层(DE)培养物产生偏背侧和偏腹侧的表达PDX1的前肠内胚层，其中该培养物由人胚胎干细胞(hESCs)产生。这些表达PDX1(PDX1阳性)的前肠内胚层细胞能发育为胰和十二指肠上皮以及胃前粘膜的内分泌细胞。
本发明的一些方面涉及这样的发现，定形内胚层细胞可分化为至少两种不同类型的表达PDX1(PDX1阳性)的前肠内胚层细胞。我们已发现，PDX1表达前，定形内胚层细胞可分化为PDX1阴性前肠内胚层细胞。向这些PDX1阴性细胞提供类视黄醇化合物如视黄酸，诱导PDX1表达。在本发明的另一方面，定形内胚层细胞分化为形成背侧PDX1阳性前肠内胚层细胞。在本文中，就PDX1阳性前肠内胚层而言，“背侧的”或“偏背侧的”指PDX1阳性前肠内胚层细胞可产生衍生自前肠后部背侧的组织，例如背胰芽。一旦PDX1阳性前肠内胚层细胞成为“偏背侧的”，则其通常不发育成衍生自前肠后部腹侧的组织。另一方面，定形内胚层细胞分化为形成腹侧PDX1阳性前肠内胚层细胞。在本文中，就PDX1阳性前肠内胚层而言，“腹侧的”或“偏腹侧的”指PDX1阳性前肠内胚层细胞可产生衍生自前肠后部腹侧的组织，例如肝脏和腹胰芽。一旦PDX1阳性前肠内胚层细胞成为“偏腹侧的”，则其通常不发育成衍生自前肠后部背侧的组织。
鉴于上述发现，本发明的实施方案涉及PDX1阴性前肠内胚层细胞、偏背侧PDX1阳性前肠内胚层细胞、偏腹侧PDX1阳性前肠内胚层细胞的组合物和/或包含偏背侧和偏腹侧PDX1阳性前肠内胚层细胞的组合物以及产生这类组合物的方法。本发明的其它实施方案涉及筛选PDX1阴性前肠内胚层细胞以发现促进这类细胞分化的因子。其它实施方案涉及筛选背侧、腹侧PDX1阳性前肠内胚层细胞或其混合群，以发现促进这些细胞分化的因子。“混合群”指包含显著量的背侧PDX1阳性前肠内胚层细胞和腹侧PDX1阳性前肠内胚层细胞的细胞群。
在本文中，FGF家族生长因子包括，但不限于，选自FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22和/或FGF23的FGF家族生长因子。
在本文中，hedgehog抑制剂包括但不限于KKAD-环杷明(KKAD-cyclopamine)、KKAD-环杷明类似物、蒜藜芦碱(jervine)、蒜藜芦碱类似物、hedgehog途径阻断抗体以及本领域技术人员已知的任何其它hedgehog途径功能的抑制剂。
PDX1阴性前肠内胚层细胞和与其相关的过程
本发明的实施方案涉及产生PDX1阴性内胚层细胞的新的、确定的方法，其中PDX1阴性内胚层细胞为多潜能细胞，其可分化为衍生自肠管的前肠/中肠区的细胞、组织或器官(PDX1阴性前肠/中肠内胚层)。在本文中，“多潜能”或“多潜能细胞”指可产生有限数量其它特定细胞类型但不可产生所有三个原始胚胎细胞系(内胚层、外胚层和中胚层)的细胞类型。在本文中，“前肠/中肠”指肠管的前部的细胞以及肠管的中部的细胞，包括前肠/中肠连接处的细胞。
本发明的一些优选实施方案涉及产生PDX1阴性前肠内胚层细胞的方法。在一些实施方案中，这些PDX1阴性前肠内胚层细胞为多潜能细胞，其可分化为衍生自肠管的前部的细胞、组织或器官(PDX1阴性前肠内胚层)。
背侧、腹侧PDX1阳性前肠内胚层细胞及其混合群以及与其相关的过程
本发明的实施方案涉及产生PDX1阴性内胚层细胞的新的、确定的方法，其中PDX1阳性内胚层细胞为多潜能细胞，其可分化为衍生自肠管的前肠/中肠区的细胞、组织或器官(PDX1阳性前肠/中肠内胚层)。本发明的其它实施方案涉及产生PDX1阳性内胚层细胞的新的确定的方法，其中PDX1阳性内胚层细胞为多潜能细胞，其可分化为衍生自肠管的前肠/中肠区的细胞、组织或器官(PDX1阳性前肠/中肠内胚层)。在本文中，“多潜能”或“多潜能细胞”指可产生有限数量其它特定细胞类型但不可产生所有三个原始胚胎细胞系(内胚层、外胚层和中胚层)的细胞类型。在本文中，“前肠/中肠”指肠管的前部的细胞以及肠管的中部的细胞，包括前肠/中肠连接处的细胞。在一些实施方案中，PDX1阳性内胚层细胞为背侧前肠内胚层细胞。在另一些实施方案中，PDX1阳性内胚层细胞为腹侧前肠内胚层细胞。
本发明的一些优选的实施方案涉及产生PDX1阳性前肠内胚层细胞的方法。在一些实施方案中，这些PDX1阳性前肠内胚层细胞为多潜能细胞，其可分化为衍生自肠管前部的细胞、组织或器官(PDX1阳性前肠内胚层)。在一些实施方案中，PDX1阳性内胚层细胞为背侧前肠内胚层细胞。在其它实施方案中，PDX1阳性内胚层细胞为腹侧前肠内胚层细胞。
其它优选的实施方案涉及产生前肠后部的PDX1阳性内胚层细胞的方法。在一些实施方案中，这些PDX1阳性内胚层细胞为多潜能细胞，其可分化为衍生自肠管前肠区后部的细胞、组织或器官。在一些实施方案中，PDX1阳性内胚层细胞为背侧内胚层细胞，其可分化为衍生自前肠后部的细胞、组织或器官，例如背胰芽的细胞。在其它实施方案中，PDX1阳性内胚层细胞为腹侧内胚层细胞，其可分化为衍生自前肠后部的细胞、组织或器官，例如腹胰芽的细胞。
背侧和/或腹侧PDX1阳性前肠内胚层细胞，如根据本文所述方法产生的那些，可被用于产生完全分化的产生胰岛素的β细胞。在本发明的一些实施方案中，通过使不显著表达PDX1的定形内胚层细胞(PDX1阴性定形内胚层细胞；这里也称为定形内胚层)分化，以形成阳性背侧和/或腹侧PDX1阳性前肠内胚层细胞，来产生阳性背侧和/或腹侧PDX1前肠内胚层细胞。如本文所述，或通过任何其它已知的方法，可通过分化多能性细胞如胚胎干细胞来制备PDX1阴性定形内胚层细胞。方便高效的从多能性细胞产生PDX1阴性定形内胚层的方法描述在美国专利11/021,618中，其标题为“DEFINITIVE ENDODERM(定形内胚层)”，于2004年12月23日提交，通过引用将其整体并入本文。
产生包括背侧和/或腹侧PDX1阳性前肠内胚层细胞在内的PDX1阳性前肠内胚层细胞的方法为从多能性细胞有效产生胰组织如腺泡细胞、导管细胞和胰岛细胞提供了基础。在某些优选实施方案中，人背侧和/或腹侧PDX1阳性前肠内胚层细胞衍生自人PDX1阴性定形内胚层细胞，而人PDX1阴性定形内胚层细胞又衍生自hESCs。然后，这些人背侧和/或腹侧PDX1阳性前肠内胚层细胞可用于产生功能性胰岛素产生β细胞。为了获得有用量的产生胰岛素的β细胞，希望在到达胰岛/β细胞命运之前发生的每个步骤都是高效的。因为将PDX1阴性定形内胚层细胞分化为背侧和/或腹侧PDX1阳性前肠内胚层细胞代表了朝向产生功能性胰岛/β细胞的早期步骤(如图1中所显示的)，尤其希望该步骤的分化是高效的。
鉴于希望PDX1阴性定形内胚层细胞有效分化为PDX1阳性前肠内胚层细胞，本发明的一些方面涉及体外方法，其导致PDX1阴性定形内胚层细胞向PDX1阳性前肠内胚层细胞约2-25％的转化。本发明的一些方面涉及体外方法，其导致PDX1阴性定形内胚层细胞向背侧PDX1阳性前肠内胚层细胞约26％至至少约75％的转化。本发明的其它方面涉及体外方法，其导致PDX1阴性定形内胚层细胞向腹侧PDX1阳性前肠内胚层细胞约26％至至少约75％的转化。通常，上述方法包括以确定和时间特异的方式应用培养和生长因子条件。可通过采用特异结合PDX1阳性前肠内胚层细胞的试剂从细胞群中的其它细胞分离和/或纯化PDX1阳性前肠内胚层细胞而实现PDX1阳性前肠内胚层细胞的细胞群(包括背侧和/或腹侧PDX1阳性前肠内胚层细胞)富集。作为选择，可用报告基因如绿色荧光蛋白(GFP)标记PDX1阳性前肠内胚层细胞(包括背侧和/或腹侧PDX1阳性前肠内胚层细胞)，以使得能检测PDX1表达。随后通过荧光活化的细胞分选(FACS)纯化这类荧光标记的细胞。本发明的其它方面涉及包含PDX1阳性前肠内胚层细胞的细胞培养物和富集细胞群，以及鉴定可用于分化至PDX1阳性前肠内胚层和从PDX1阳性前肠内胚层分化的因子的方法。本发明的其它方面涉及包含背侧PDX1阳性前肠内胚层细胞的细胞培养物和富集细胞群，以及鉴定可用于分化至背侧PDX1阳性前肠内胚层和从背侧PDX1阳性前肠内胚层分化的因子的方法。本发明的其它方面涉及包含腹侧PDX1阳性前肠内胚层细胞的细胞培养物和富集细胞群，以及鉴定可用于分化至腹侧PDX1阳性前肠内胚层和从腹侧PDX1阳性前肠内胚层分化的因子的方法。
为了确定PDX1阳性前肠内胚层细胞在细胞培养物或细胞群中的量，需要有将这种细胞类型与培养物或细胞群中的其它细胞区分开的方法。相应地，本发明的某些实施方案涉及细胞标志物以及检测和测定这些标志物表达的方法，其中这些标志物的存在、不存在和/或相对表达水平指示PDX1阳性前肠内胚层细胞，包括背侧和/或腹侧PDX1阳性前肠内胚层细胞。在本文中，“表达”指材料或物质的产生以及材料或物质的产生水平或量。因此，确定特异标志物的表达指检测表达的标志物的相对或绝对量或简单地检测标志物是否存在。在本文中，“标志物”指可观察到或检测到的任何分子。例如，标志物可包括但不限于核酸，如特异基因的转录本，基因的多肽产物、非基因产物多肽、糖蛋白、糖、糖脂、脂、脂蛋白或小分子(例如，分子量小于10,000amu的分子)。
在本发明的一些实施方案中，通过定量PCR(Q-PCR)测定标志物的存在、不存在和/或表达水平。例如，某些遗传标志物如PDX1、SOX17、SOX7、SOX1、ZIC1、NFM、α-胎蛋白(AFP)、同源异型盒A13(HOXA13)、同源异型盒C6(HOXC6)、和/或本文描述的其它标志物产生的转录本的量通过Q-PCR测定。在另一些实施方案中，免疫组织化学被用于检测上述基因表达的蛋白。在另一些实施方案中，Q-PCR和免疫组织化学技术都被用于鉴定和测定这类标志物的量或相对比例。在一些实施方案中，通过Q-PCR和/或免疫组织化学检测背侧和腹侧PDX1阳性前肠内胚层细胞共有的标志物，例如PDX1和/或一种或多种选自表3的标志物。在其它实施方案中，通过Q-PCR和/或免疫组织化学检测优先地、特异地或唯一地在背侧PDX1阳性前肠内胚层细胞中表达的标志物，如选自表4的一种或多种标志物。
通过使用本文描述的分化和检测方法，可能在细胞培养物或细胞群中鉴定PDX1阳性前肠内胚层细胞，包括背侧和/或腹侧PDX1阳性前肠内胚层细胞，以及确定背侧和/或腹侧PDX1阳性前肠内胚层细胞的比例。例如，在本发明的一些实施方案中，所产生的背侧和/或腹侧PDX1阳性前肠内胚层细胞或细胞群以高于PDX1阴性细胞或细胞群至少约2数量级的水平表达PDX1基因。在其它实施方案中，所产生的背侧和/或腹侧PDX1阳性前肠内胚层细胞和细胞群以高于PDX1阴性细胞或细胞群2数量级以上的水平表达PDX1基因。在其它实施方案中，所产生的背侧和/或腹侧PDX1阳性前肠内胚层细胞或细胞群以高于PDX1阴性定形内胚层细胞或细胞群至少约2数量级或2数量级以上的水平表达一种或多种选自PDX1、SOX17、HOXA13和HOXC6的标志物。在其它实施方案中，所产生的背侧和/或腹侧PDX1阳性前肠内胚层细胞或细胞群以高于PDX1阴性定形内胚层细胞或细胞群至少约2数量级或2数量级以上的水平表达一种或多种选自表3的标志物。在其它实施方案中，所产生的背侧PDX1阳性前肠内胚层细胞或细胞群以高于PDX1阴性定形内胚层细胞或细胞群约2数量级或2数量级以上的水平表达一种或多种选自表4的标志物。
本文所描述的组合物和方法具有几个有用特征。例如，包含PDX1阳性内胚层(包括背侧和/或腹侧PDX1阳性前肠内胚层)的细胞或细胞群以及产生这类细胞培养物和细胞群的方法可用于模拟人发育的早期阶段。此外，本文所描述的组合物和方法还可用于疾病状态如糖尿病的治疗性介入。例如，由于PDX1阳性前肠内胚层仅用作有限数量组织的来源，其可被用于纯组织或细胞类型的开发。
从多能性细胞产生PDX1-阴性定形内胚层(定形内胚层)
首先通过产生PDX1-阴性定形内胚层(也称为“定形内胚层”)，来从多能性细胞产生包含PDX1-阳性前肠内胚层细胞的细胞培养物和/或细胞群。下面简单描述了分化多能性细胞以产生包含定形内胚层的细胞培养物和富集的细胞群的方法，详细步骤见2004年12月23日提交的标题为“定形内胚层”的美国专利11/021,618，通过参考将其公开内容整体并入本文。在一些方法中，作为起始材料的多能性细胞是干细胞。某些方法中，定形内胚层细胞培养物和包含定形内胚层细胞的富集的细胞群产自胚胎干细胞。此处使用的“胚胎的”指有机体的一系列发育阶段，开始于单一受精卵，结束于多细胞结构，这种多细胞结构除了发育的配子生殖细胞外不再包含多能性或全能细胞。除了来自配子融合的胚胎，术语“胚胎的”也指来自体细胞核转移的胚胎。优选的获得定形内胚层细胞的方法利用人胚胎干细胞作为起始材料产生定形内胚层。该多能性细胞可以是源自桑椹胚、胚胎内细胞团或从胚胎生殖嵴获得的细胞。可使用本领域已知的方法在培养基中将人胚胎干细胞维持在基本未分化的多能性状态。在如美国专利5,453,357、5,670,372、5,690,926、5,843,780、6,200,806和6,251,671中描述了这些方法。
在产生定形内胚层细胞的一些方法中，hESC维持在饲养层上。该方法中，可使用任何能使得hESC能维持在多能性状态的饲养层。一种常用的培养人胚胎干细胞的饲养层是小鼠成纤维细胞层。最近，人成纤维细胞饲养层已用于培养hESC(参见第2002/0072117号美国专利申请，通过参考将其公开内容整体并入本文)。产生定形内胚层的备选方法允许不用饲养层就可维持多能性hESC。在第2003/0175956号美国专利申请中描述了无饲养层条件下维持多能性hESC的方法，通过参考将其公开内容整体并入本文。
此处使用的人胚胎干细胞可在含或不含血清的培养基中维持。在一些胚胎干细胞维持步骤中，使用血清替代物。在其它步骤中，使用例如第2003/0190748号美国专利申请描述的无血清培养技术，通过参考将其公开内容整体并入本文。
干细胞在培养基中通过常规传代保持多能性状态，直到需要分化为定形内胚层。一些方法中，通过向干细胞培养物中添加足够量的TGFβ超家族的生长因子来促进向定形内胚层分化，以实现分化至定形内胚层。对产生定形内胚层有用的TGFβ超家族的生长因子选自Nodal/活化素(activin)或BMP亚组。在一些优选的分化方法中，生长因子选自Nodal、活化素A、活化素B和BMP4。此外，生长因子Wnt3a和其它Wnt家族成员有利于定形内胚层细胞的产生。某些分化方法中，可使用任意上述生长因子的组合。
对于多能性干细胞向定形内胚层细胞分化的一些方法，添加上述生长因子到细胞中使培养基中生长因子的浓度足以促使至少一部分干细胞向定形内胚层细胞分化。一些方法中，细胞培养基中上述生长因子的浓度是至少约5ng/ml、至少约10ng/ml、至少约25ng/ml、至少约50ng/ml、至少约75ng/ml、至少约100ng/ml、至少约200ng/ml、至少约300ng/ml、至少约400ng/ml、至少约500ng/ml、至少约1000ng/ml、至少约2000ng/ml、至少约3000ng/ml、至少约4000ng/ml、至少约5000ng/ml或多于约5000ng/ml。
在多能性干细胞向定形内胚层细胞分化的某些方法中，先添加上述生长因子，然后再从细胞培养物中去除。例如，生长因子可在添加约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天或约10天内去除。在一个优选的方法中，生长因子在添加约4天后去除。
定形内胚层细胞的培养物可在含减少的血清或无血清的培养基中生长。在某些培养条件下，血清浓度范围可从约0.05％v/v至约20％v/v。例如，在一些分化步骤中，培养基中血清浓度可低于约0.05％(v/v)、低于约0.1％(v/v)、低于约0.2％(v/v)、低于约0.3％(v/v)、低于约0.4％(v/v)、低于约0.5％(v/v)、低于约0.6％(v/v)、低于约0.7％(v/v)、低于约0.8％(v/v)、低于约0.9％(v/v)、低于约1％(v/v)、低于约2％(v/v)、低于约3％(v/v)、低于约4％(v/v)、低于约5％(v/v)、低于约6％(v/v)、低于约7％(v/v)、低于约8％(v/v)、低于约9％(v/v)、低于约10％(v/v)、低于约15％(v/v)或低于约20％(v/v)。一些方法中，定形内胚层在无血清或在血清替代物的条件下生长。其它方法中，定形内胚层细胞在B27存在下生长。这类方法中，B27添加物的浓度范围可从约0.1％v/v至约20％v/v。
监测多能性细胞向PDX1-阴性定形内胚层(定形内胚层)的分化
通过测定定形内胚层特异标志物的表达可监测hESC培养物向定形内胚层的分化进程。在一些方法中，通过检测标志物的存在或缺失确定某种标志物的表达。或者，通过测定细胞培养物或细胞群中细胞的标志物的水平来确定某些标志物的表达。在该方法中，标志物表达的检测可以是定性的，也可以是定量的。使用定量PCR(Q-PCR)是对标志物基因产生的标志物的表达进行定量的一种方法。进行Q-PCR的方法在本领域是公知的。也可用本领域公知的其他方法对标志物基因的表达进行定量。例如，使用对感兴趣的标志物基因产物特异的抗体，检测标志物基因产物的表达。某些方法中，确定定形内胚层特异标志物基因的表达及缺乏hECS和其它细胞类型特异标志物基因的显著表达。
如以下实施例进一步描述的，定形内胚层可靠的标志物是SOX17基因。因此，用此处描述的方法产生的定形内胚层细胞表达SOX17标志物基因，从而产生SOX17基因产物。定形内胚层其它的标志物是MIXL1、GATA4、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1和CRIP1。因为定形内胚层细胞表达SOX17标志物基因的水平高于表达SOX7标志物基因的水平，而这是原始和内脏内胚层的特征(见表1)，所以在一些步骤中，SOX17和SOX7的表达均被监测。其它步骤中，监测了hESC特异的SOX17和OCT4标志物基因的表达。此外，因为定形内胚层细胞中SOX17标志物基因的表达水平比AFP、SPARC或血栓调节蛋白(TM)标志物基因的表达水平高，所以这些基因的表达也被监控。
定形内胚层另一个标志物是CXCR4基因。CXCR4基因编码细胞表面趋化因子受体，这个受体的配体是化学引诱物SDF-1。在成体中含CXCR4受体的细胞的主要作用被认为是造血细胞向骨髓的迁移、淋巴细胞运输以及各种B细胞和巨噬血细胞系的分化[Kim，C.和Broxmeyer，H.J.Leukocyte Biol.65，6-15(1999)]。CXCR4受体还作为HIV-1进入T细胞的共受体[Feng，Y.，et al.Science，272，872-877(1996)]。在[McGrath，K.E.et al.Dev.Biology 213，442-456(1999)]进行的一系列广泛的研究中，描绘了在小鼠的早期发育和成年时期趋化因子受体CXCR4和它唯一的配体SDF-1[Kim，C.和Broxmeyer，H.，J.Leukocyte Biol.65，6-15(1999)]的表达。在发育中CXCR4/SDF1的相互作用变得明显，因为已证实，在转基因小鼠中破坏CXCR4和SDF1中任一基因[Nagasawa et al.Nature，382，635-638(1996)；Ma，Q.，et al Immunity，10，463-471(1999)]，均会导致小鼠在胚胎晚期死亡。McGrath等人利用RNase保护和原位杂交方法的结合证明在原肠形成胚胎早期(E7.5)CXCR4是检测到的最丰富的趋化因子受体信使RNA。在原肠形成胚胎期，CXCR4/SDF-1信号可能主要参与诱导原条胚层细胞的迁移，并在此时的定形内胚层、中胚层和胚外中胚层表达。在E7.2-7.8小鼠胚胎中，CXCR4和α-胎蛋白是互斥的，表明内脏内胚层中表达的缺失[McGrath，K.E.et al.Dev.Biology 213，442-456(1999)]。
因为通过分化多能性细胞产生的定形内胚层细胞表达CXCR4标志物基因，所以可通过监测CXCR4的表达以追踪定形内胚层细胞的产生。此外，用此处描述的方法产生的定形内胚层细胞还表达定形内胚层的其它标志物，这些标志物包括但不限于SOX17、MIXL1、GATA4、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1和CRIP1。因为定形内胚层表达CXCR4标志物基因的水平高于表达SOX7基因的水平，所以可监控CXCR4和SOX7两种基因的表达。其它方法中，CXCR4标志物基因和OCT4标志物基因的表达均被监控。此外，因为定形内胚层细胞表达CXCR4标志物基因的水平高于表达AFP、SPARC或血栓调节蛋白(TM)标志物基因的水平，也可以监控这些基因的表达。
应了解内胚层细胞中CXCR4的表达不妨碍SOX17的表达。因此，用此处描述的方法产生的定形内胚层细胞将大量表达SOX17和CXCR4，但不大量表达AFP、TM、SPARC或PDX1。
定形内胚层的富集、分离和/或纯化
用任意上述方法产生的定形内胚层细胞，可通过利用对这些细胞特异的亲和标签进行富集、分离和/或纯化。对定形内胚层细胞特异的亲和标签的例子是对标志物分子特异的抗体、配体或其它结合试剂，例如多肽，其中所述标志物分子存在于定形内胚层细胞表面上，而基本上不存在于在用此处描述的方法产生的细胞培养物中可以找到的其它细胞类型上。一些方法中，使用与CXCR4结合的抗体作为亲和标签，以富集、分离或纯化定形内胚层细胞。在其它方法中，使用趋化因子SDF-1或基于SDF-1的其它分子作为亲和标签。这些分子包括但不限于SDF-1片段、SDF-1融合物或SDF-1模拟物。
制备抗体和利用抗体进行细胞分离的方法在本领域是公知的，这些方法可用于此处描述的抗体和定形内胚层细胞。在一种方法中，将结合CXCR4的抗体偶联到磁珠上，然后与细胞培养物中的定形内胚层细胞结合，其中该细胞培养物经过酶处理以减少细胞间和底物的粘附。随后将细胞/抗体/磁珠混合物置于可动磁场中，用于分离与磁珠结合的定形内胚层细胞和未结合的细胞。当培养物中定形内胚层细胞与其它细胞进行了物理分离后，抗体结合被破坏，细胞重新接种于合适的组织培养基中。
也可用其它方法获得富集的、分离的或纯化的定形内胚层细胞培养物或细胞群。例如，在一些实施方案中，使CXCR4抗体与含定形内胚层的细胞培养物孵育，其中该培养物经过处理以减少细胞间和底物的粘附。洗涤、离心和重悬细胞。然后细胞悬浮物与二抗，例如能够与一抗结合的FITC偶联的抗体孵育。接着，洗涤、离心并在缓冲液中重悬细胞。然后用荧光激活的细胞分选术(FACS)对细胞悬浮物进行分析和分选。收集与CXCR4-阴性细胞分离后的CXCR4-阳性细胞，从而分离了这种细胞类型。如果需要，可使用另一亲和方法或增加分选次数对分离的细胞组合物进一步纯化，利用的是特异于定形内胚层细胞的相同或不同的标志物。
在其它方法中，利用与CXCR4结合的配体或其它分子富集、分离和/或纯化定形内胚层细胞。一些方法中，这种分子是SDF-1或其片段、融合物或模拟物。
优选方法中，在诱导干细胞培养物向定形内胚层系分化后，从其它非定形内胚层细胞富集、分离和/或纯化定形内胚层细胞。应了解上述富集、分离和纯化步骤可用于该培养物分化的任意阶段。
除了刚刚描述的步骤外，还可以用其他细胞分离技术分离定形内胚层细胞。此外，通过在促进定形内胚层细胞选择性存活或选择性扩增的生长条件下进行系列传代培养的方法富集或分离定形内胚层细胞。
使用此处描述的方法，富集的、分离的和/或纯化的定形内胚层细胞群和/或组织可在体外从多能性细胞培养物或细胞群产生，例如已经进行了至少部分分化的干细胞培养物或群。在一些方法中，细胞进行随机分化。但在优选方法中，细胞主要定向分化为定形内胚层。一些优选的富集、分离和/或纯化方法涉及在体外从人胚胎干细胞产生定形内胚层。使用此处描述的方法，细胞群或细胞培养物中的定形内胚层含量与未处理的细胞群或细胞培养物相比，至少富集了约2至约1000倍。
包含PDX1-阴性定形内胚层(定形内胚层)的组合物
上述方法产生的细胞组合物包括包含定形内胚层的细胞培养物和富集定形内胚层的细胞群。例如，可产生包含定形内胚层细胞的细胞培养物，其中培养物中至少约50～80％的细胞是定形内胚层细胞。因为分化方法的效率可通过改变某些参数(这些参数包括但不限于，细胞生长条件、生长因子浓度和培养步骤的时间控制)来调整，此处描述的分化方法可导致约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或超过约95％的多能性细胞向定形内胚层的转化。在采用分离定形内胚层细胞的方法中，例如，通过使用结合CXCR4受体的亲和试剂，可获得基本上纯的定形内胚层细胞群。
产生PDX1阴性前肠内胚层
可通过进一步分化定形内胚层细胞产生PDX1阴性前肠内胚层细胞，来使其定向胰分化。在本文描述的一些分化方法中，细胞培养物以及包含定形内胚层细胞的富集或纯化的细胞群可被用于进一步分化至包含PDX1阴性前肠内胚层细胞的细胞培养物和/或富集的细胞群。
通常，通过减少或消除SOX17阳性定形内胚层细胞的细胞培养物或细胞群中TGFβ超家族生长因子信号来使定形内胚层细胞分化至PDX1阴性前肠内胚层细胞。在一些实施方案中，通过稀释或除去定形内胚层的细胞培养物或细胞群中外源添加的TGFβ超家族生长因子如活化素A，来介导TGFβ超家族生长因子信号的减弱或消除。在其它实施方案中，通过向定形内胚层细胞提供阻断TGFβ超家族生长因子信号的化合物如卵泡抑制素和/或noggin来减弱或消除TGFβ超家族生长因子信号。在一些实施方案中，TGFβ超家族生长因子信号可在人多能性细胞向定形内胚层细胞分化后约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天或约10天以上被减弱或消除。
在一些实施方案中，通过向定形内胚层细胞培养物或细胞群提供FGF家族生长因子和/或hedgehog途径抑制剂来增强定形内胚层细胞向前肠内胚层细胞的分化。在这些实施方案中，在减弱或消除定形内胚层细胞培养物中TGFβ超家族生长因子信号后约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天或约10天以上提供FGF家族生长因子和/或hedgehog途径抑制剂。在优选的实施方案中，与减弱或消除定形内胚层细胞培养物中TGFβ超家族生长因子信号大约同时提供FGF家族生长因子和/或hedgehog途径抑制剂。
在优选的实施方案中，向定形内胚层细胞培养物或细胞群提供的FGF家族生长因子为FGF10和/或FGF7。但是，应理解，可以提供其它的FGF家族生长因子或FGF家族生长因子类似物或模拟物，或替代FGF10和/或FGF7或作为其补充。例如，可以提供选自FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF 17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22和/或FGF23的FGF家族生长因子。在这些实施方案中，向细胞群的细胞提供FGF家族生长因子和/或FGF家族生长因子类似物或模拟物，以使其存在浓度为至少约10ng/ml、至少约25ng/ml、至少约50ng/ml、至少约75ng/ml、至少约100ng/ml、至少约200ng/ml、至少约300ng/ml、至少约400ng/ml、至少约500ng/ml、或至少约1000ng/ml。
在其它优选的实施方案中，hedgehog抑制剂为KAAD环杷明，但是，应理解可使用其它hedgehog抑制剂。这些抑制剂包括但不限于KAAD环杷明类似物、蒜藜芦碱、蒜藜芦碱类似物、hedgehog途径阻断抗体或本领域普通技术人员已知的其它hedgehog途径功能抑制剂。单独使用或与FGF家族生长因子联合使用时，hedgehog抑制剂可以至少约0.01μM至少约0.02μM、至少约0.04μM、至少约0.08μM、至少约0.1μM、至少约0.2μM、至少约0.3μM、至少约0.4μM、至少约0.5μM、至少约0.6μM、至少约0.7μM、至少约0.8μM、至少约0.9μM、至少约1μM、至少约1.1μM、至少约1.2μM、至少约1.3μM、至少约1.4μM、至少约1.5μM、至少约1.6μM、至少约1.7μM、至少约1.8μM、至少约1.9μM、至少约2μM、至少约2.1μM、至少约2.2μM、至少约2.3μM、至少约2.4μM、至少约2.5μM、至少约2.6μM、至少约2.7μM、至少约2.8μM、至少约2.9μM、至少约3μM、至少约3.5μM、至少约4μM、至少约4.5μM、至少约5μM、至少约10μM、至少约20μM、至少约30μM、至少约40μM或至少约50μM的浓度提供。
在从定形内胚层细胞产生PDX1阴性前肠内胚层细胞的优选方法中，在大部分的人多能性细胞向定形内胚层分化两天后(例如，在下文实施例中描述的3天、4天或5天分化方案后)，减弱或消除TGFβ超家族生长因子信号。大约在同时，向定形内胚层细胞的细胞培养物或细胞群提供50ng/ml的FGF-10和0.2μM KAAD环杷明。
PDX1阴性前肠内胚层细胞的培养物可在含有减少的血清或不含血清的培养基中分化和进一步生长。血清浓度可在约0.05％(v/v)至约20％(v/v)的范围。在一些方法中，PDX1阴性前肠内胚层细胞在血清替代物存在下生长。例如，在某些方法中，培养基的血清浓度可少于约0.05％(v/v)、少于约0.1％(v/v)、少于约0.2％(v/v)、少于约0.3％(v/v)、少于约0.4％(v/v)、少于约0.5％(v/v)、少于约0.6％(v/v)、少于约0.7％(v/v)、少于约0.8％(v/v)、少于约0.9％(v/v)、少于约1％(v/v)、少于约2％(v/v)、少于约3％(v/v)、少于约4％(v/v)、少于约5％(v/v)、少于约6％(v/v)、少于约7％(v/v)、少于约8％(v/v)、少于约9％(v/v)、少于约10％(v/v)、少于约15％(v/v)或少于约20％(v/v)。在本文所描述的一些方法中，分化培养基不包含血清、血清替代物或任何含有胰岛素或胰岛素样生长因子的补加物。
在一些方法中，PDX1阴性前肠内胚层细胞在B27存在下生长。这些分化方法中，可将B27以约0.1％(v/v)至约20％(v/v)的浓度范围或者以大于约20％(v/v)的浓度提供至培养基。在某些方法中，B27在培养基中的浓度为约0.1％(v/v)、约0.2％(v/v)、约0.3％(v/v)、约0.4％(v/v)、约0.5％(v/v)、约0.6％(v/v)、约0.7％(v/v)、约0.8％(v/v)、约0.9％(v/v)、约1％(v/v)、约2％(v/v)、约3％(v/v)、约4％(v/v)、约5％(v/v)、约6％(v/v)、约7％(v/v)、约8％(v/v)、约9％(v/v)、约10％(v/v)、约15％(v/v)或约20％(v/v)。或者，所添加的B27补加物可根据可购得的B27储备溶液的浓度倍数来衡量。例如，B27可作为50X储备溶液从Invitrogen(Carlsbad，CA)获得。向足够体积的生长培养基加入足够量的这储备溶液产生补加有所需量B27的培养基。例如，向90ml的生长培养基添加10ml 50X B27储备溶液将产生补加有5XB27的生长培养基。培养基中B27补加物的浓度可为约0.1X、约0.2X、约0.3X、约0.4X、约0.5X、约0.6X、约0.7X、约0.8X、约0.9X、约1X、约1.1X、约1.2X、约1.3X、约1.4X、约1.5X、约1.6X、约1.7X、约1.8X、约1.9X、约2X、约2.5X、约3X、约3.5X、约4X、约4.5X、约5X、约6X、约7X、约8X、约9X、约10X、约11X、约12X、约13X、约14X、约15X、约16X、约17X、约18X、约19X、约20X以及大于约20X。
在一些实施方案中，通过使细胞与包含类视黄醇如视黄酸(RA)的培养基接触，或向细胞提供这种培养基，PDX阴性前肠内胚层细胞可被进一步分化为PDX1阳性前肠内胚层细胞。在一些实施方案中，向细胞培养物的细胞提供类视黄醇，以使其存在浓度为至少约1nM、至少约0.01μM、至少约0.02μM、至少约0.04μM、至少约0.08μM、至少约0.1μM、至少约0.2μM、至少约0.3μM、至少约0.4μM、至少约0.5μM、至少约0.6μM、至少约0.7μM、至少约0.8μM、至少约0.9μM、至少约1μM、至少约1.1μM、至少约1.2μM、至少约1.3μM、至少约1.4μM、至少约1.5μM、至少约1.6μM、至少约1.7μM、至少约1.8μM、至少约1.9μM、至少约2μM、至少约2.1μM、至少约2.2μM、至少约2.3μM、至少约2.4μM、至少约2.5μM、至少约2.6μM、至少约2.7μM、至少约2.8μM、至少约2.9μM、至少约3μM、至少约3.5μM、至少约4μM、至少约4.5μM、至少约5μM、至少约10μM、至少约20μM、至少约30μM、至少约40μM或至少约50μM。在这些实施方案中，在减弱或消除定形内胚层细胞培养物中TGFβ超家族生长因子信号后约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天或约10天以上向所述细胞提供类视黄醇。在优选的实施方案中，在减弱或消除TGFβ超家族生长因子信号后约2至3天向PDX-1阴性前肠内胚层细胞培养物提供约0.05μM RA至约2μM。
在本文描述的一些分化方法中，上述分化因子在它们添加后从细胞培养物去除。例如，上述分化因子可在它们添加后约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天或约10天内被去除。
监测PDX1阴性定形内胚层向PDX1阴性前肠内胚层的分化
可采用上述方法如Q-PCR和/或免疫细胞化学来检测和/或定量HNF1b和/或FOXA1的表达以及缺乏PDX1表达，以监测PDX1阴性定形内胚层向PDX1阴性前肠内胚层的分化。除了上述标志物，在本发明的一些实施方案中，还测定SOX17的表达。
在一些实施方案中，由本文描述的方法产生的PDX1阴性前肠内胚层细胞培养物基本上无表达SOX7、AFP、SOX1、ZIC1或NFM标志物基因的细胞。在某些实施方案中，通过本文描述的方法产生的PDX1阴性前肠内胚层细胞培养物基本上无内脏内胚层、体壁内胚层和/或神经细胞。
包含PDX1阴性前肠内胚层的组合物
本发明的一些实施方案涉及包含PDX1-阴性前肠内胚层细胞的细胞组合物，例如细胞培养物或细胞群，其中PDX1-阴性前肠内胚层细胞是多潜能细胞，可分化为衍生自肠管前部的细胞、组织或器官。根据某些实施方案，PDX1-阴性前肠内胚层细胞是哺乳动物细胞，在优选实施方案中，这些细胞是人细胞。
本发明的其他实施方案涉及包含一种或多种选自hESC、PDX1-阴性定形内胚层细胞、PDX1-阴性前肠内胚层细胞和中胚层细胞的细胞类型的细胞的组合物，例如细胞培养物或细胞群。一些实施方案中，hES包括少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％或少于约1％的所述培养物中的全部细胞。其它实施方案中，PDX1-阴性定形内胚层包括少于约90％、少于约85％、少于约80％、少于约75％、少于约70％、少于约65％、少于约60％、少于约55％、少于约50％、少于约45％、少于约40％、少于约35％、少于约30％、少于约25％、少于约20％、少于约15％、少于约12％、少于约10％、少于约8％、少于约6％、少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％或少于约1％的所述细胞培养物中的全部细胞。其它实施方案中，中胚层细胞包括少于约90％、少于约85％、少于约80％、少于约75％、少于约70％、少于约65％、少于约60％、少于约55％、少于约50％、少于约45％、少于约40％、少于约35％、少于约30％、少于约25％、少于约20％、少于约15％、少于约12％、少于约10％、少于约8％、少于约6％、少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％或少于约1％的所述培养物中的全部细胞。
本发明的其它实施方案涉及用此处描述的方法产生的包含PDX1-阴性前肠内胚层作为主要细胞类型的组合物，例如细胞培养物或细胞群。一些实施方案中，此处描述的方法产生包含至少约99％、至少约98％、至少约97％、至少约96％、至少约95％、至少约94％、至少约93％、至少约92％、至少约91％、至少约90％、至少约89％、至少约88％、至少约87％、至少约86％、至少约85％、至少约84％、至少约83％、至少约82％、至少约81％、至少约80％、至少约79％、至少约78％、至少约77％、至少约76％、至少约75％、至少约74％、至少约73％、至少约72％、至少约71％、至少约70％、至少约69％、至少约68％、至少约67％、至少约66％、至少约65％、至少约64％、至少约63％、至少约62％、至少约61％、至少约60％、至少约59％、至少约58％、至少约57％、至少约56％、至少约55％、至少约54％、至少约53％、至少约53％、至少约51％或至少约50％PDX1-阴性前肠内胚层细胞的细胞培养物和/或细胞群。优选的实施方案中、细胞培养物或细胞群的细胞包含人细胞。其它实施方案中，此处描述的方法产生包含至少约50％、至少约45％、至少约40％、至少约35％、至少约30％、至少约25％、至少约24％、至少约23％、至少约22％、至少约21％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％或至少约1％的PDX1-阴性前肠内胚层细胞的细胞培养物和/或细胞群。优选实施方案中，细胞培养物或细胞群的细胞包含人类细胞。一些实施方案中，计算细胞培养物或细胞群中PDX1-阴性前肠内胚层细胞的比例时不考虑残留在培养物中的饲养细胞。
本发明的其它实施方案涉及包含PDX1-阴性前肠内胚层细胞和PDX1-阴性定形内胚层细胞的组合物，例如细胞培养物或细胞群。例如，可产生包含至少约5个PDX1-阴性前肠内胚层细胞对应约每95个PDX1-阴性定形内胚层细胞的细胞培养物或细胞群。其它实施方案中，可产生包含至少约95个PDX1-阴性前肠内胚层细胞对应约每5个PDX1-阴性定形内胚层细胞的细胞培养物或细胞群。此外，预期可以得到包含PDX1-阴性前肠内胚层细胞和PDX1-阴性定形内胚层其它比例的细胞培养物或细胞群。例如，预期可得到包含至少约1个PDX1-阴性前肠内胚层细胞对应约每1,000,000个PDX1-阴性定形内胚层细胞、至少约1个PDX1-阴性前肠内胚层细胞对应约每100,000个PDX1-阴性定形内胚层细胞、对应至少约1个PDX1-阴性前肠内胚层细胞约每10,000个PDX1-阴性定形内胚层细胞、至少约1个PDX1-阴性前肠内胚层细胞对应约每1000个PDX1-阴性定形内胚层细胞、至少约1个PDX1-阴性前肠内胚层细胞对应约每500个PDX1-阴性定形内胚层细胞、至少约1个PDX1-阴性前肠内胚层细胞对应约每100个PDX1-阴性定形内胚层细胞、至少约1个PDX1-阴性前肠内胚层细胞对应约每10个PDX1-阴性定形内胚层细胞、至少约1个PDX1-阴性前肠内胚层细胞对应约每5个PDX1-阴性定形内胚层细胞、至少约1个PDX1-阴性前肠内胚层细胞对应约每4个PDX1-阴性定形内胚层细胞、至少约1个PDX1-阴性前肠内胚层细胞对应约每2个PDX1-阴性定形内胚层细胞、至少约1个PDX1-阴性前肠内胚层细胞对应约每1个PDX1-阴性定形内胚层细胞、至少约2个PDX1-阴性前肠内胚层细胞对应约每1个PDX1-阴性定形内胚层细胞、至少约4个PDX1-阴性前肠内胚层细胞对应约每1个PDX1-阴性定形内胚层细胞、至少约5个PDX1-阴性前肠内胚层细胞对应约每1个PDX1-阴性定形内胚层细胞、至少约10个PDX1-阴性前肠内胚层细胞对应约每1个PDX1-阴性定形内胚层细胞、至少约20个PDX1-阴性前肠内胚层细胞对应约每1个PDX1-阴性定形内胚层细胞、至少约50个PDX1-阴性前肠内胚层细胞对应约每1个PDX1-阴性定形内胚层细胞、至少约100个PDX1-阴性前肠内胚层细胞对应约每1个PDX1-阴性定形内胚层细胞、至少约1000个PDX1-阴性前肠内胚层细胞对应约每1个PDX1-阴性定形内胚层细胞、至少约10,000个PDX1-阴性前肠内胚层细胞对应约每1个PDX1-阴性定形内胚层细胞、至少约100,000个PDX1-阴性前肠内胚层细胞对应约每1个PDX1-阴性定形内胚层细胞、以及至少约1,000,000个PDX1-阴性前肠内胚层细胞对应约每1个PDX1-阴性定形内胚层细胞的组合物。
本发明一些实施方案中，用于产生PDX1-阴性前肠内胚层细胞的PDX1-阴性定形内胚层细胞衍生自人多能性细胞，例如人多能性干细胞。某些实施方案中，人多能性细胞衍生自桑椹胚、胚胎内细胞团或胚胎生殖嵴。某些其它实施方案中，人多能性细胞衍生自发育已经越过胚胎期的多细胞结构的性腺组织或生殖组织。
本发明的进一步实施方案涉及包含人细胞(包括人PDX1-阴性前肠内胚层细胞)的组合物，例如细胞培养物或细胞群，其中至少约2％的人细胞中SOX17、HNF1b和/或FOXA1标志物的表达高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM标志物的表达。其它实施方案中，至少5％的人细胞中、至少10％的人细胞中、至少15％的人细胞中、至少20％的人细胞中、至少25％的人细胞中、至少30％的人细胞中、至少35％的人细胞中、至少40％的人细胞中、至少45％的人细胞中、至少50％的人细胞中、至少55％的人细胞中、至少60％的人细胞中、至少65％的人细胞中、至少70％的人细胞中、至少75％的人细胞中、至少80％的人细胞中、至少85％的人细胞中、至少90％的人细胞中、至少95％的人细胞中或至少98％的人细胞中，标志物SOX17、HNF1b和/或FOXA1的表达高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM标志物的表达。一些实施方案中，计算其中SOX17、HNF 1b和/或FOXA1的表达高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM的表达的细胞培养物或群中人细胞的比例时不考虑饲养细胞。
应了解本发明的一些实施方案涉及包含人PDX1-阴性前肠内胚层细胞的组合物，例如细胞培养物或细胞群，其中从至少约2％到超过约98％的人细胞中一种或多种选自SOX17、HNF1b和/或FOXA1的表达高于PDX1标志物的表达。一些实施方案中，至少约5％的人细胞中、至少约10％的人细胞中、至少约15％的人细胞中、至少约20％的人细胞中、至少约25％的人细胞中、至少约30％的人细胞中、至少约35％的人细胞中、至少约40％的人细胞中、至少约45％的人细胞中、至少约50％的人细胞中、至少约55％的人细胞中、至少约60％的人细胞中、至少约65％的人细胞中、至少约70％的人细胞中、至少约75％的人细胞中、至少约80％的人细胞中、至少约85％的人细胞中、至少约90％的人细胞中、至少约95％的人细胞中或至少约98％的人细胞中，一种或多种选自SOX17、HNF1b和/或FOXA1的表达高于PDX1标志物的表达。一些实施方案中，计算其中一种或多种选自SOX17、HNF1b和/或FOXA1的表达高于PDX1标志物的表达的细胞培养物或群中人细胞的比例时不考虑饲养细胞。
使用此处描述的方法，可产生基本上不含其它细胞类型的包含PDX1-阴性前肠内胚层细胞的组合物。关于细胞培养物或细胞群中的细胞，术语“基本上不含”表示细胞培养物或细胞群不含的特异细胞类型在细胞培养物或细胞群的所有细胞中占有的比例少于5％。本发明的一些实施方案中，用此处描述的方法产生的PDX1-阴性前肠内胚层细胞群或细胞培养物基本上不含显著表达AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM标志物基因的细胞。
本发明的一个实施方案中，根据标志物基因的表达对PDX1-阴性前肠内胚层细胞的描述如下：SOX17高、HNF1b高、FOXA1高、PDX1低、AFP低、SOX1低、ZIC1低和NFM低。
直接从PDX1-阴性定形内胚层产生PDX1-阳性前肠内胚层
此处描述的包含PDX1-阳性前肠内胚层细胞的PDX1-阳性前肠内胚层细胞培养物和群由PDX1-阴性定形内胚层产生，其中该PDX1-阴性定形内胚层如上所述从多能性细胞产生。一个优选的方法利用人胚胎干细胞作为起始材料。在一个实施方案中，hESC首先转化为PDX1-阴性定形内胚层细胞，然后转化为PDX1-阳性前肠内胚层细胞。但应了解用于PDX1-阳性前肠内胚层细胞产生的起始材料并不限于用多能性细胞分化方法产生的定形内胚层细胞。而是，任何PDX1-阴性定形内胚层细胞都可用于此处描述的方法，与它们的来源无关。
本发明一些实施方案中，包含PDX1-阴性定形内胚层细胞的细胞培养物或细胞群可用于进一步向包含PDX1-阳性前肠内胚层细胞的细胞培养物和/或富集的细胞群分化。例如，可使用包含人PDX1-阴性、SOX17-阳性的定形内胚层细胞的细胞培养物或细胞群。在一些实施方案中，细胞培养物或细胞群也可以包含从前面分化步骤(即分化多能性细胞为定形内胚层细胞的步骤)残留的分化因子，如活化素、nodal和/或BMP。其它实施方案中，在添加用于PDX1-阴性、SOX17-阳性定形内胚层细胞向PDX1-阳性前肠内胚层细胞分化的因子前，从细胞培养物或细胞群中去除前面分化步骤中的因子。其它实施方案中，用富集PDX1-阴性、SOX17-阳性定形内胚层细胞的细胞群作为产生PDX1-阳性前肠内胚层细胞的来源。
通过向包含PDX1-阴性、SOX17-阳性定形内胚层细胞的细胞培养物中添加促进细胞向PDX1-阳性前肠内胚层细胞分化的分化因子(前肠分化因子)，培养中的PDX1-阴性定形内胚层细胞可分化为PDX1-阳性内胚层细胞。本发明一些实施方案中，前肠分化因子是类视黄醇，例如视黄酸(RA)。一些实施方案中，类视黄醇与诸如FGF-4或FGF-10的成纤维细胞生长因子联用。其它实施方案中，类视黄醇与生长因子TGFβ超家族成员和/或条件培养基联用。
“条件培养基”是指与基本培养基比较发生了改变的培养基。例如，培养基的条件化可能造成从基本培养基的初始水平添加或去除分子，例如营养物和/或生长因子。在一些实施方案中，通过在一定条件下使一定类型的细胞在培养基中生长或维持一定时间而使培养基条件化。例如，通过使hESC在一定温度、一定组成的培养基中扩增、分化或维持一定的时间而使培养基条件化。本领域技术人员应了解的是，细胞、培养基类型、持续时间和环境条件的众多组合可用于产生接近无穷排列的条件培养基。本发明的一些实施方案中，通过在包含约1％至约20％血清浓度的培养基中生长或维持分化的多能性细胞来条件化培养基。在其它实施方案中，通过使分化的多能性细胞在包含约1ng/ml至约1000ng/ml活化素A的培养基中的生长或维持来条件化培养基。在其它实施方案中，通过使分化的多能性细胞在包含约1ng/ml至约1000ng/ml BMP4的培养基中生长或维持来条件化培养基。在优选的实施方案中，通过使分化的hESC在包含约25ng/ml活化素A和约2μM RA的培养基(如RPMI)中生长或维持来制备条件培养基。
本发明的一些实施方案中，用于条件化培养基(这些培养基用于增强PDX1-阴性定形内胚层向PDX1-阳性前肠内胚层的分化)的细胞是在含约0％至约20％血清和/或一种或多种TGFβ超家族生长/分化因子的诸如RPMI的培养基中从诸如hESC的多能性细胞分化超过5天的细胞。添加诸如活化素A和BMP4的分化因子的浓度范围从约1ng/ml至约1000ng/ml。本发明的某些实施方案中，用于条件化培养基的细胞在低血清RPMI中从hESC分化超过5天。根据一些实施方案，低血清RPMI指含有低血清的培养基，其中血清浓度在一定时间段内逐渐增加。例如，在一个实施方案中，低血清RPMI在细胞生长第一天包含浓度约0.2％的胎牛血清(FBS)，细胞生长第二天约0.5％FBS，细胞生长第3至5天约2％FBS。在另一个实施方案中，低血清RPMI第一天包含血清浓度约0％，第二天约0.2％，第3～6天约2％。在某些优选的实施方案中，低血清RPMI中添加一种或多种分化因子，例如活化素A和BMP4。除了制备用于条件化培养基的细胞，低血清RPMI也可用作PDX1-阴性定形内胚层细胞向PDX1-阳性前肠内胚层细胞分化的培养基。
本领域的普通技术人员应了解，可从除了RPMI之外的培养基制备条件培养基，前提是这种培养基不干扰PDX1-阳性前肠内胚层细胞的生长或维持。还应了解用于条件化培养基的细胞可以是不同的类型。在使用新鲜分化的细胞来条件化培养基的实施方案中，这种细胞可以在除了RPMI之外的培养基中分化，前提是这种培养基不会抑制这种细胞的生长或维持。此外，技术人员应了解条件化的持续时间或制备用于条件化的细胞的持续时间不是分别必须是24小时或5天，因为其它的时间长度也足以获得此处报道的效果。
通常，类视黄醇与成纤维细胞生长因子(生长因子TGFβ超家族的成员)、条件培养基或任意这些前肠分化因子的组合联用，都可以造成比单用类视黄醇更强的PDX1-阴性定形内胚层向PDX1-阳性前肠内胚层的分化。在优选的实施方案中，向PDX1-阴性定形内胚层细胞培养物中添加RA和FGF-10。在另一个优选的实施方案中，PDX1-阴性定形内胚层细胞在含有条件培养基、活化素A、活化素B和RA的培养基中分化。
就此处描述的分化方法的一些实施方案而论，将上述前肠分化因子添加到细胞中，使细胞培养物或细胞群中前肠存在的分化因子的浓度足以促进至少部分PDX1-阴性定形内胚层细胞培养物或细胞群向PDX1-阳性前肠内胚层细胞分化。当涉及细胞培养物和/或细胞群时，术语“部分”表示细胞培养物或细胞群任意不为零的数量，范围从单个细胞到整个细胞培养物或细胞群。
本发明的一些实施方案中，向培养物的细胞中添加类视黄醇使其存在浓度为至少约0.01μM、至少约0.02μM、至少约0.04μM、至少约0.08μM、至少约0.1μM、至少约0.2μM、至少约0.3μM、至少约0.4μM、至少约0.5μM、至少约0.6μM、至少约0.7μM、至少约0.8μM、至少约0.9μM、至少约1μM、至少约1.1μM、至少约1.2μM、至少约1.3μM、至少约1.4μM、至少约1.5μM，、至少约1.6μM、至少约1.7μM、至少约1.8μM、至少约1.9μM、至少约2μM、至少约2.1μM、至少约2.2μM、至少约2.3μM、至少约2.4μM、至少约2.5μM、至少约2.6μM、至少约2.7μM、至少约2.8μM、至少约2.9μM、至少约3μM、至少约3.5μM、至少约4μM、至少约4.5μM、至少约5μM、至少约10μM、至少约20μM、至少约30μM、至少约40μM或至少约50μM。此处使用的“类视黄醇(retinoid)”指视黄醇、视黄醛或视黄酸以及这些化合物的任何衍生物。在优选的实施方案中，类视黄醇是视黄酸。
本发明其它实施方案中，细胞培养物中存在一种或多种成纤维细胞生长因子家族的分化因子。例如，在一些实施方案中，存在于细胞培养物中的FGF-4浓度至少约10ng/ml、至少约25ng/ml、至少约50ng/ml、至少约75ng/ml、至少约100ng/ml、至少约200ng/ml、至少约300ng/ml、至少约400ng/ml、至少约500ng/ml或至少约1000ng/ml。本发明进一步实施方案中，存在于细胞培养物中的FGF-10浓度至少约10ng/ml、至少约25ng/ml、至少约50ng/ml、至少约75ng/ml、至少约100ng/ml、至少约200ng/ml、至少约300ng/ml、至少约400ng/ml、至少约500ng/ml、或至少约1000ng/ml。在一些实施方案中，FGF-4或者FGF-10，但不是二者同时，与RA一起添加到细胞培养物中。优选的实施方案中，存在于细胞培养物中的RA浓度为1μM，FGF-10浓度为50ng/ml。
本发明一些实施方案中，在细胞培养物中存在TGFβ超家族的生长因子和/或条件培养基。这些分化因子可与RA和/或其它中前肠分化因子(包括但不限于FGF-4和FGF-10)联用。例如，在一些实施方案中，细胞培养物中可存在活化素A和/或活化素B，其浓度为至少约5ng/ml、至少约10ng/ml、至少约25ng/ml、至少约50ng/ml、至少约75ng/ml、至少约100ng/ml、至少约200ng/ml、至少约300ng/ml、至少约400ng/ml、至少约500ng/ml或至少约1000ng/ml。本发明的另一实施方案中，细胞培养物中存在条件培养基，其浓度是总培养基的至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。一些实施方案中，活化素A、活化素B以及条件培养基与RA一起被添加至细胞培养物中。在优选实施方案中，在包含1μM RA、约25ng/ml活化素A和低血清RPMI培养基(该培养基已被分化的hESC条件化约24小时，其中分化的hESC已在包含100ng/ml活化素A的低血清RPMI中分化约5天)的培养物中PDX1-阴性定形内胚层细胞分化为PDX1-阳性前肠内胚层细胞。在另一优选实施方案中，培养物中还存在活化素B和/或FGF-10，其浓度分别是25ng/ml和50ng/ml。
本发明的某些实施方案中，上述前肠分化因子在添加后从细胞培养物去除。例如，前肠分化因子可以在添加后约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天或约10天内去除。
PDX1-阳性前肠内胚层细胞的培养物可在含有降低血清浓度的培养基中生长。血清浓度范围可从约0.05％(v/v)至约20％(v/v)。在一些实施方案中，PDX1-阳性前肠内胚层细胞在含血清替代物的条件下生长。例如，在某些实施方案中，培养基的血清浓度可低于约0.05％(v/v)、低于约0.1％(v/v)、低于约0.2％(v/v)、低于约0.3％(v/v)、低于约0.4％(v/v)、低于约0.5％(v/v)、低于约0.6％(v/v)、低于约0.7％(v/v)、低于约0.8％(v/v)、低于约0.9％(v/v)、低于约1％(v/v)、低于约2％(v/v)、低于约3％(v/v)、低于约4％(v/v)、低于约5％(v/v)、低于约6％(v/v)、低于约7％(v/v)、低于约8％(v/v)、低于约9％(v/v)、低于约10％(v/v)、低于约15％(v/v)或低于约20％(v/v)。在一些实施方案中，PDX1-阳性前肠内胚层细胞可以在无血清的条件下生长。在其它实施方案中，PDX1-阳性前肠内胚层细胞在含血清替代物的条件下生长。
在其它实施方案中，PDX1-阳性前肠内胚层细胞在B27存在下生长。在这些实施方案中，B27可以约0.1％(v/v)至约20％(v/v)的浓度范围或者大于20％(v/v)的浓度添加到培养基中。在某些实施方案中，培养基中B27的浓度约0.1％(v/v)、约0.2％(v/v)、约0.3％(v/v)、约0.4％(v/v)、约0.5％(v/v)、约0.6％(v/v)、约0.7％(v/v)、约0.8％(v/v)、约0.9％(v/v)、约1％(v/v)、约2％(v/v)、约3％(v/v)、约4％(v/v)、约5％(v/v)、约6％(v/v)、约7％(v/v)、约8％(v/v)、约9％(v/v)、约10％(v/v)、约15％(v/v)或约20％(v/v)。或者，添加的B27补加物的浓度可根据商品化的B27储备溶液浓度的倍数来计算。例如，B27可作为50X的储备溶液从Invitrogen(Carlsbad，CA)得到。向足够体积的生长培养基中添加足量这种储备溶液可以含所需量B27的培养基。例如，向90ml生长培养基中添加10ml 50X B27储备溶液将得到添加了5X B27的生长培养基。培养基中B27添加物的浓度可以是约0.1X、约0.2X、约0.3X、约0.4X、约0.5X、约0.6X、约0.7X、约0.8X、约0.9X、约1X、约1.1X、约1.2X、约1.3X、约1.4X、约1.5X、约1.6X、约1.7X、约1.8X、约1.9X、约2X、约2.5X、约3X、约3.5X、约4X、约4.5X、约5X、约6X、约7X、约8X、约9X、约10X、约11X、约12X、约13X、约14X、约15X、约16X、约17X、约18X、约19X、约20X和高于约20X。
从PDX1-阴性定形内胚层产生背侧PDX1-阳性前肠内胚层
此处描述的包含背侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞的背侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞培养物和群从PDX1-阴性定形内胚层产生，其中该PDX1-阴性定形内胚层如上所述从多能性细胞产生。另外，如上所述，优选的方法利用人胚胎干细胞作为起始材料。在一个实施方案中，hESC首先转化为PDX1-阴性定形内胚层细胞，然后转化为背侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞。但应了解用于PDX1-阳性前肠内胚层细胞产生的起始材料并不限于用多能性细胞分化方法产生的定形内胚层细胞。而是，任何PDX1-阴性定形内胚层细胞都可用于此处描述的方法，与它们的来源无关。
如关于产生PDX1-阳性前肠内胚层细胞的混合群所描述的，本发明一些实施方案中，包含PDX1-阴性定形内胚层细胞的细胞培养物或细胞群可用于进一步向包含背侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞的细胞培养物和/或富集的细胞群分化。例如，可使用包含人PDX1-阴性、SOX17-阳性的定形内胚层细胞的细胞培养物或细胞群。在一些实施方案中，细胞培养物或细胞群也可以包含从前面分化步骤(即分化多能性细胞为定形内胚层细胞的步骤)残留的分化因子，如活化素、nodal和/或BMP。其它实施方案中，在添加用于PDX1-阴性、SOX17-阳性定形内胚层细胞向背侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞分化的因子前，从细胞培养物或细胞群中去除前面分化步骤中的因子。其它实施方案中，用富集PDX1-阴性、SOX17-阳性定形内胚层细胞的细胞群作为产生背侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞的来源。
通过向包含PDX1-阴性、SOX17-阳性定形内胚层细胞的细胞培养物提供类视黄醇如视黄酸(RA)，使培养中的PDX1-阴性定形内胚层细胞分化为背侧PDX1-阳性定形内胚层细胞。在一些实施方案中，类视黄醇与生长因子TGFβ超家族的成员和/或Connaught Medical ResearchLabs培养基(CRML培养基)(Invitrogen，Carlsbad，CA)结合使用。
就这里描述的分化方法的一些实施方案而言，向细胞提供RA或上述分化因子的组合，以使存在于细胞培养物或细胞群中的这些因子的浓度足以促进至少一部分PDX1-阴性定形内胚层细胞培养物或细胞群分化为背侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞。当与细胞培养物和/或细胞群结合使用时，用语“部分”表示细胞培养物或细胞群任意不为零的数量，范围从单个细胞到整个细胞培养物或细胞群。在优选的实施方案中，用语“部分”表示细胞培养物或细胞群的至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％或至少75％。
在一些实施方案中，向细胞培养物的细胞提供类视黄醇，以使其存在浓度为至少约0.01μM、至少约0.02μM、至少约0.04μM、至少约0.08μM、至少约0.1μM、至少约0.2μM、至少约0.3μM、至少约0.4μM、至少约0.5μM、至少约0.6μM、至少约0.7μM、至少约0.8μM、至少约0.9μM、至少约1μM、至少约1.1μM、至少约1.2μM、至少约1.3μM、至少约1.4μM、至少约1.5μM、至少约1.6μM、至少约1.7μM、至少约1.8μM、至少约1.9μM、至少约2μM、至少约2.1μM、至少约2.2μM、至少约2.3μM、至少约2.4μM、至少约2.5μM、至少约2.6μM、至少约2.7μM、至少约2.8μM、至少约2.9μM、至少约3μM、至少约3.5μM、至少约4μM、至少约4.5μM、至少约5μM、至少约10μM、至少约20μM、至少约30μM、至少约40μM或至少约50μM。
在优选的实施方案中，在不存在外源FGF-10或其它FGF家族生长因子时通过提供视黄酸而产生偏背侧的PDX1-阳性前肠内胚层细胞群。在这些实施方案中，以约2μM的浓度提供RA。在优选的实施方案中，RA以约2μM的浓度提供在CMRL培养基中。
在一些实施方案中，活化素A和/或活化素B与RA一起被添加至细胞培养物。例如，在一些实施方案中，RA以约2μM的浓度添加至细胞培养物，活化素A和/或活化素B以至少约5ng/ml、至少约10ng/ml、至少约25ng/ml、至少约50ng/ml、至少约75ng/ml、至少约100ng/ml、至少约200ng/ml、至少约300ng/ml、至少约400ng/ml、至少约500ng/ml、或至少约1000ng/ml的浓度添加至细胞培养物。
在一些实施方案中，在开始从hESC分化后约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天或约10天以上向PDX1-阴性定形内胚层细胞提供所述分化因子和/或CRML培养基。在优选的实施方案中，在开始从hESC分化后约5天向PDX1-阴性定形内胚层细胞提供分化因子和/或CRML培养基。
在本发明的一些实施方案中，上述分化因子在它们添加后从细胞培养物中去除。例如，上述分化因子可在它们添加后约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、或约10天内被去除。
背侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞的培养物可在含有降低血清浓度的培养基中生长。血清浓度范围可从约0.05％(v/v)至约20％(v/v)。在一些实施方案中，背侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞在含血清替代物的条件下生长。例如，在某些实施方案中，培养基的血清浓度可低于约0.05％(v/v)、低于约0.1％(v/v)、低于约0.2％(v/v)、低于约0.3％(v/v)、低于约0.4％(v/v)、低于约0.5％(v/v)、低于约0.6％(v/v)、低于约0.7％(v/v)、低于约0.8％(v/v)、低于约0.9％(v/v)、低于约1％(v/v)、低于约2％(v/v)、低于约3％(v/v)、低于约4％(v/v)、低于约5％(v/v)、低于约6％(v/v)、低于约7％(v/v)、低于约8％(v/v)、低于约9％(v/v)、低于约10％(v/v)、低于约15％(v/v)或低于约20％(v/v)。在一些实施方案中，背侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞可以在无血清的条件下生长。在其它实施方案中，背侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞在含血清替代物的条件下生长。
在其它实施方案中，背侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞在B27存在下生长。在这些实施方案中，B27可以约0.1％(v/v)至约20％(v/v)的浓度范围或者大于20％(v/v)的浓度添加到培养基中。在某些实施方案中，培养基中B27的浓度约0.1％(v/v)、约0.2％(v/v)、约0.3％(v/v)、约0.4％(v/v)、约0.5％(v/v)、约0.6％(v/v)、约0.7％(v/v)、约0.8％(v/v)、约0.9％(v/v)、约1％(v/v)、约2％(v/v)、约3％(v/v)、约4％(v/v)、约5％(v/v)、约6％(v/v)、约7％(v/v)、约8％(v/v)、约9％(v/v)、约10％(v/v)、约15％(v/v)或约20％(v/v)。或者，添加的B27补加物的浓度可根据可购得的B27储备溶液浓度的倍数来计算。例如，B27可作为50X的储备溶液从Invitrogen(Carlsbad，CA)得到。向足够体积的生长培养基中添加足量这种储备溶液可以产生含所需量B27的培养基。例如，向90ml生长培养基中添加10ml 50X B27储备溶液将得到添加了5X B27的生长培养基。培养基中B27添加物的浓度可以是约0.1X、约0.2X、约0.3X、约0.4X、约0.5X、约0.6X、约0.7X、约0.8X、约0.9X、约1X、约1.1X、约1.2X、约1.3X、约1.4X、约1.5X、约1.6X、约1.7X、约1.8X、约1.9X、约2X、约2.5X、约3X、约3.5X、约4X、约4.5X、约5X、约6X、约7X、约8X、约9X、约10X、约11X、约12X、约13X、约14X、约15X、约16X、约17X、约18X、约19X、约20X和高于约20X。
从PDX1-阴性定形内胚层产生腹侧PDX1-阳性前肠内胚层
此处描述的包含腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞的腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞培养物和群从PDX1-阴性定形内胚层产生，其中该PDX1-阴性定形内胚层如上所述从多能性细胞产生。另外，如上所述，优选的方法利用人胚胎干细胞作为起始材料。在一个实施方案中，hESC首先转化为PDX1-阴性定形内胚层细胞，然后转化为腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞。但应了解用于腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞产生的起始材料并不限于用多能性细胞分化方法产生的定形内胚层细胞。而是，任何PDX1-阴性定形内胚层细胞都可用于此处描述的方法，与它们的来源无关。
如关于产生PDX1-阳性前肠内胚层细胞的混合群所描述的，本发明一些实施方案中，包含PDX1-阴性定形内胚层细胞的细胞培养物或细胞群可用于进一步向包含腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞的细胞培养物和/或富集的细胞群分化。例如，可使用包含人PDX1-阴性、SOX17-阳性的定形内胚层细胞的细胞培养物或细胞群。在一些实施方案中，细胞培养物或细胞群也可以包含从前面分化步骤(即分化多能性细胞为定形内胚层细胞的步骤)残留的分化因子，如活化素、nodal和/或BMP。其它实施方案中，在添加用于PDX1-阴性、SOX17-阳性定形内胚层细胞向腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞分化的因子前，从细胞培养物或细胞群中去除前面分化步骤中的因子。其它实施方案中，用富集PDX1-阴性、SOX17-阳性定形内胚层细胞的细胞群作为产生腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞的来源。
通过向包含PDX1-阴性、SOX17-阳性定形内胚层细胞的细胞培养物提供FGF家族生长因子或FGF家族生长因子类似物或模拟物，使培养中的PDX1-阴性定形内胚层细胞分化为腹侧PDX1-阳性定形内胚层细胞。在一些实施方案中，FGF家族生长因子或FGF家族生长因子类似物或模拟物与hedgehog抑制剂和/或Connaught Medical ResearchLabs培养基(CRML培养基)(Invitrogen，Carlsbad，CA)结合使用。在尤其优选的实施方案中，在不存在RA或其它类视黄醇时，向包含PDX1-阴性定形内胚层细胞的细胞培养物提供FGF-10和/或KAAD-环杷明。在某些实施方案中，在不存在RA或其它类视黄醇时，BMP4可以包括在FGF-10和/或KAAD-环杷明中。在添加FGF家族生长因子类似物或模拟物和/或hedgehog抑制剂之后约1天至约10天，提供诸如RA的类视黄醇或含有补加物如B27的类视黄醇，以诱导PDX1的表达。在优选的实施方案中，在添加FGF家族生长因子类似物或模拟物和/或hedgehog抑制剂之后约2天、约3天、约4天或约5天提供RA。在其它实施方案中，在提供FGF家族生长因子类似物或模拟物和/或hedgehog抑制剂的大约同时提供B27。
就这里描述的分化方法的一些实施方案而言，向细胞提供类视黄醇和上述分化因子的组合，以使存在于细胞培养物或细胞群中的这些因子的浓度足以促进至少一部分PDX1-阴性定形内胚层细胞培养物或细胞群分化为腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞。当与细胞培养物和/或细胞群结合使用时，用语“部分”表示细胞培养物或细胞群任意不为零的数量，范围从单个细胞到整个细胞培养物或细胞群。在优选的实施方案中，用语“部分”表示细胞培养物或细胞群的至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％或至少75％。
在一些实施方案中，向细胞培养物的细胞提供FGF家族生长因子或FGF家族生长因子类似物或模拟物，以使其存在浓度为至少约10ng/ml、至少约25ng/ml、至少约50ng/ml、至少约75ng/ml、至少约100ng/ml、至少约200ng/ml、至少约300ng/ml、至少约400ng/ml、至少约500ng/ml、或至少约1000ng/ml。在其它实施方案中，当单独使用或与FGF-10联合使用时，KAAD-环杷明以至少约0.01μM、至少约0.02μM、至少约0.04μM、至少约0.08μM、至少约0.1μM、至少约0.2μM、至少约0.3μM、至少约0.4μM、至少约0.5μM、至少约0.6μM、至少约0.7μM、至少约0.8μM、至少约0.9μM、至少约1μM、至少约1.1μM、至少约1.2μM、至少约1.3μM、至少约1.4μM、至少约1.5μM、至少约1.6μM、至少约1.7μM、至少约1.8μM、至少约1.9μM、至少约2μM、至少约2.1μM、至少约2.2μM、至少约2.3μM、至少约2.4μM、至少约2.5μM、至少约2.6μM、至少约2.7μM、至少约2.8μM、至少约2.9μM、至少约3μM、至少约3.5μM、至少约4μM、至少约4.5μM、至少约5μM、至少约10μM、至少约20μM、至少约30μM、至少约40μM或至少约50μM的浓度提供。
在本发明优选的实施方案中，在不存在RA时通过在CMRL培养基中向PDX1-阴性定形内胚层细胞群提供50ng/ml的FGF-10和0.5μM的KAAD-环杷明而产生偏腹侧的PDX1-阳性前肠内胚层细胞群。在添加FGF-10和KAAD-环杷明后两天时添加2μM RA以完成细胞分化为PDX1-阳性细胞。
在一些实施方案中，在开始从hESC分化后约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天或约10天以上向PDX1-阴性定形内胚层细胞提供所述分化因子和/或CRML培养基。在优选的实施方案中，在开始从hESC分化后约3天向PDX1-阴性定形内胚层细胞提供分化因子和/或CRML培养基。
在本发明的一些实施方案中，上述分化因子在它们添加后从细胞培养物中去除。例如，上述分化因子可在它们添加后约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、或约10天内被去除。
腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞的培养物可在含有降低血清浓度的培养基中生长。血清浓度范围可从约0.05％(v/v)至约20％(v/v)。在一些实施方案中，腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞在含血清替代物的条件下生长。例如，在某些实施方案中，培养基的血清浓度可低于约0.05％(v/v)、低于约0.1％(v/v)、低于约0.2％(v/v)、低于约0.3％(v/v)、低于约0.4％(v/v)、低于约0.5％(v/v)、低于约0.6％(v/v)、低于约0.7％(v/v)、低于约0.8％(v/v)、低于约0.9％(v/v)、低于约1％(v/v)、低于约2％(v/v)、低于约3％(v/v)、低于约4％(v/v)、低于约5％(v/v)、低于约6％(v/v)、低于约7％(v/v)、低于约8％(v/v)、低于约9％(v/v)、低于约10％(v/v)、低于约15％(v/v)或低于约20％(v/v)。在一些实施方案中，腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞可以在无血清的条件下生长。在其它实施方案中，腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞在含血清替代物的条件下生长。
在其它实施方案中，腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞在B27存在下生长。在这些实施方案中，B27可以约0.1％(v/v)至约20％(v/v)的浓度范围或者大于20％(v/v)的浓度添加到培养基中。在某些实施方案中，培养基中B27的浓度约0.1％(v/v)、约0.2％(v/v)、约0.3％(v/v)、约0.4％(v/v)、约0.5％(v/v)、约0.6％(v/v)、约0.7％(v/v)、约0.8％(v/v)、约0.9％(v/v)、约1％(v/v)、约2％(v/v)、约3％(v/v)、约4％(v/v)、约5％(v/v)、约6％(v/v)、约7％(v/v)、约8％(v/v)、约9％(v/v)、约10％(v/v)、约15％(v/v)或约20％(v/v)。或者，添加的B27补加物的浓度可根据可购得的B27储备溶液浓度的倍数来计算。例如，B27可作为50X的储备溶液从Invitrogen(Carlsbad，CA)得到。向足够体积的生长培养基中添加足量这种储备溶液可以产生含所需量B27的培养基。例如，向90ml生长培养基中添加10ml 50X B27储备溶液将得到添加了5X B27的生长培养基。培养基中B27添加物的浓度可以是约0.1X、约0.2X、约0.3X、约0.4X、约0.5X、约0.6X、约0.7X、约0.8X、约0.9X、约1X、约1.1X、约1.2X、约1.3X、约1.4X、约1.5X、约1.6X、约1.7X、约1.8X、约1.9X、约2X、约2.5X、约3X、约3.5X、约4X、约4.5X、约5X、约6X、约7X、约8X、约9X、约10X、约11X、约12X、约13X、约14X、约15X、约16X、约17X、约18X、约19X、约20X和高于约20X。在添加B27的一些实施方案中，不添加类视黄醇来完成PDX1-阴性细胞向腹侧PDX1-阳性前肠内胚层的分化。
监测PDX1-阴性定形内胚层向PDX1-阳性前肠内胚层的分化
如同多能性细胞向定形内胚层细胞分化的情况，PDX1-阴性、SOX17-阳性定形内胚层向PDX1-阳性前肠内胚层分化的进程可通过测定这些细胞类型特征性的标志物的表达来监测。这种监测使得能决定在不同条件下(例如一种或多种分化因子浓度和环境条件)足以产生所需量PDX1-阳性前肠内胚层所需的时间量。优选的实施方案中，通过检测PDX1的表达来决定足以产生所需量PDX1-阳性前肠内胚层的时间量。本发明的一些实施方案中，通过检测标志物的存在或缺失来测定某些标志物的表达。或者，通过测定细胞培养物或细胞群的细胞中标志物存在的水平来测定某些标志物的表达。在这些实施方案中，标志物表达的测量可以是定性或定量的。如上所述，优选的定量检测由标志物基因产生的标志物表达的方法是使用Q-PCR。在具体实施方案中，Q-PCR被用于通过定量检测PDX1-阳性前肠内胚层特征性的标志物基因的表达和其它细胞类型特征性的标志物基因表达的缺失，来监测PDX1-阴性、SOX17-阳性定形内胚层培养物向PDX1-阳性前肠内胚层细胞分化的进程。也可以用本领域其它公知的方法定量检测标志物基因表达。例如，可利用对感兴趣的标志物基因产物特异的抗体来检测标志物基因产物的表达。本发明一些实施方案中，测定了PDX1-阳性前肠内胚层特征性的标志物基因的表达以及PDX-1阴性定形内胚层、hESC和其它细胞类型特征性的标志物基因的显著表达的缺失。
如以下实施例的进一步描述，PDX1是与PDX1-阳性前肠内胚层相关的标志物基因。因此，在本发明的一些实施方案中测定了PDX1的表达。在其它实施方案中，还测定了在PDX1-阳性前肠内胚层表达的其它标志物的表达，这些标志物包括但不限于SOX17、HOXA13和/或HOXC6。因为某些其它细胞类型(即内脏内胚层和某些神经外胚层)也表达PDX1，所以本发明一些实施方案涉及证明与内脏内胚层和/或神经外胚层有关的基因表达的缺失或基本上缺失。例如，在一些实施方案中，在内脏内胚层和/或神经外胚层表达的标志物，包括但不限于SOX7、AFP、SOX1、ZIC1和/或NFM的表达被测定。
在一些实施方案中，用本文所述方法产生的PDX1-阳性前肠内胚层细胞培养物基本上不含表达SOX7、AFP、SOX1、ZIC1或NFM标志物基因的细胞。在某些实施方案中，用此处所述步骤产生的PDX1-阳性前肠内胚层细胞培养物基本上不含内脏内胚层、体壁内胚层和/或神经细胞。
监测PDX1-阴性定形内胚层向背侧PDX1-阳性前肠内胚层的分化
可采用上述方法如Q-PCR和/或免疫细胞化学检测和/或定量表3和/或表4中描述的一种或多种标志物的表达，以监测PDX1-阴性定形内胚层向背侧PDX1-阳性前肠内胚层的分化。与偏背侧的和偏腹侧的PDX1-阳性前肠内胚层细胞相关的标志物描述在表3中。这些标志物中，选自CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2和SLC27A2的标志物为细胞表面标志物。一些优选的列在表3中用于监测背侧PDX1-阳性前肠内胚层产生的标志物选自SERPINF2、DUSP9、CDH6和SOX9。与偏背侧前肠内胚层有关的标志物描述在表4中。与其它PDX1-阳性细胞相比，表4标志物的每一个都优先、特异或唯一地在背侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞中表达。这些标志物中，选自ADORA2A、CD47、EPB41L1、MAG、SFRP5、SLC16A10、SLC16A2、SLC1A3、SLC30A4、SLICK、SLITRK4和XPR1的标志物为细胞表面标志物。一些优选的列在表4中用于监测背侧PDX1-阳性前肠内胚层产生的标志物选自HOXA1、PDE11A、FAM49A和WNT5A。
除了上述标志物，在一些本发明的实施方案中，还测定在PDX1-阳性前肠内胚层中表达的其它标志物的表达，这些标志物包括但不限于SOX17、HOXA13和/或HOXC6。由于PDX1也可由其它细胞类型(即，内脏内胚层和某些神经外胚层)表达，本发明的一些实施方案涉及证实与内脏内胚层和/或神经外胚层相关的标志物基因表达的缺失或基本缺失。例如，在一些实施方案中，测定在内脏内胚层和/或神经细胞中表达的标志物的表达，这些标志物包括但不限于SOX7、AFP、SOX1、ZIC1和/或NFM。
在一些实施方案中，通过本文描述的方法产生的背侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞培养物基本上没有表达SOX7、AFP、SOX1、ZIC1或NFM标志物基因的细胞。在某些实施方案中，通过本文描述的方法产生的背侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞培养物基本上没有内脏内胚层、脏壁内胚层和/或神经细胞。
监测PDX1-阴性定形内胚层向腹侧PDX1-阳性前肠内胚层的分化
如之前部分所述，与偏背侧的和偏腹侧的PDX1-阳性前肠内胚层细胞相关的标志物描述在表3中。这样，可采用上述方法如Q-PCR和/或免疫细胞化学检测和/或定量表3中描述的一种或多种标志物的表达，以监测PDX1-阴性定形内胚层向腹侧PDX1-阳性内胚层的分化。表3描述的标志物中，选自CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2和SLC27A2的标志物为细胞表面标志物。一些优选的列在表3中用于监测腹侧PDX1-阳性前肠内胚层产生的标志物选自SERPINF2、DUSP9、CDH6和SOX9。此外，由于描述在表4中的标志物优先、特异或唯一地在偏背侧的前肠内胚层中表达，所以监测一种或多种这些标志物相对于背侧PDX1-阳性前肠内胚层中的表达，其表达缺失或减弱了表达，也可用于监测PDX1-阴性定形内胚层向腹侧PDX1-阳性内胚层的分化。表4标志物中，选自ADORA2A、CD47、EPB41L1、MAG、SFRP5、SLC16A10、SLC16A2、SLC1A3、SLC30A4、SLICK、SLITRK4和XPR1的标志物为细胞表面标志物。一些优选的列在表4中用于监测背侧PDX1-阳性前肠内胚层产生的标志物选自HOXA1、PDE11A、FAM49A和WNT5A。这样，这些标志物在表达一种或多种选自表3的标志物的PDX1-阳性细胞中表达的缺失或不实质表达表明为腹侧PDX1-阳性。
除了上述标志物，在一些本发明的实施方案中，还测定在PDX1-阳性前肠内胚层中表达的其它标志物的表达，这些标志物包括但不限于SOX17、HOXA13和/或HOXC6。由于PDX1也可由其它细胞类型(即，内脏内胚层和某些神经外胚层)表达，本发明的一些实施方案涉及证实与内脏内胚层和/或神经外胚层相关的标志物基因表达的缺失或基本缺失。例如，在一些实施方案中，测定在内脏内胚层和/或神经细胞中表达的标志物的表达，这些标志物包括但不限于SOX7、AFP、SOX1、ZIC1和/或NFM。
在一些实施方案中，通过本文描述的方法产生的腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞培养物基本上没有表达SOX7、AFP、SOX1、ZIC1或NFM标志物基因的细胞。在某些实施方案中，通过本文描述的方法产生的腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞培养物基本上没有内脏内胚层、脏壁内胚层和/或神经细胞。
富集、分离和/或纯化背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层
用任意上述方法产生的PDX1-阳性前肠内胚层细胞，包括背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞，可通过利用对这些细胞特异的亲和标签进行富集、分离和/或纯化。对背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞特异的亲和标签的例子是对标志物分子特异的抗体、配体或其它结合试剂，例如多肽，其中所述标志物分子存在于背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞表面上，而基本上不存在于在用本文描述的方法产生的细胞培养物中可以找到的其它细胞类型上。一些方法中，使用与选自CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2、SLC27A2、ADORA2A、CD47、EPB41L1、MAG、SFRP5、SLC16A10、SLC16A2、SLC1A3、SLC30A4、SLICK、SLITRK4和XPR1的细胞表面标志物结合的抗体作为亲和标签，以富集、分离或纯化背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞。
制备抗体和利用抗体进行细胞分离的方法在本领域是公知的，这些方法可用于本文描述的背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞。在一种方法中，将结合选自CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2、SLC27A2、ADORA2A、CD47、EPB41L1、MAG、SFRP5、SLC16A10、SLC16A2、SLC1A3、SLC30A4、SLICK、SLITRK4和XPR1的标志物的抗体连接到磁珠上，然后与细胞培养物中的背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞结合，其中该细胞培养物经过酶处理以减少细胞间和底物的粘附。随后将细胞/抗体/磁珠混合物置于可动磁场中，用于分离与磁珠结合的定形内胚层细胞和未结合的细胞。当培养物中背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞与其它细胞进行了物理分离后，抗体结合被破坏，细胞重新种于合适的组织培养基中。
也可用其它方法获得富集的、分离的或纯化的背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞培养物或细胞群。例如，在一些实施方案中，使结合选自CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2、SLC27A2、ADORA2A、CD47、EPB41L1、MAG、SFRP5、SLC16A10、SLC16A2、SLC1A3、SLC30A4、SLICK、SLITRK4和XPR1的标志物的抗体与含背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层的细胞培养物孵育，其中该培养物经过处理以减少细胞间和底物的粘附。洗涤、离心和重悬细胞。然后细胞悬浮物与二抗孵育，例如能够与一抗结合的FITC偶联的抗体孵育。接着，洗涤、离心并在缓冲液中重悬细胞。然后用荧光激活的细胞分选术(FACS)对细胞悬浮物进行分析和分选。分别收集标志物阳性细胞和标志物阴性细胞，从而分离了这些细胞类型。如果需要，可使用另一亲和方法或增加分选次数对分离的细胞组合物进一步纯化，利用的是特异于背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞的相同或不同的标志物。
在其它方法中，利用与选自CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2、SLC27A2、ADORA2A、CD47、EPB41L1、MAG、SFRP5、SLC16A10、SLC16A2、SLC1A3、SLC30A4、SLICK、SLITRK4和XPR1的标志物结合的配体或其它分子富集、分离和/或纯化背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞。
优选方法中，在诱导PDX1-阴性定形内胚层细胞培养物向背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞分化后，从其它细胞富集、分离和/或纯化背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞。应了解上述富集、分离和纯化步骤可用于该培养物分化的任意阶段。
除了刚刚描述的步骤外，还可以用其它细胞分离技术分离背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞。此外，可以通过在促进背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞选择性存活或选择性扩增的生长条件下进行系列传代培养的方法，富集或分离背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞。
使用本文描述的方法，富集的、分离的和/或纯化的背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞群和或组织可在体外从PDX1-阴性定形内胚层细胞培养物或细胞群产生，该PDX1-阴性定形内胚层细胞培养物或细胞群进行了至少部分分化。在一些方法中，细胞进行随机分化。但在优选方法中，细胞主要定向分化为背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞。一些优选的富集、分离和/或纯化方法涉及在体外从人PDX1-阴性定形内胚层细胞产生背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞。使用本文描述的方法，细胞群或细胞培养物中的背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞含量与未处理的细胞群或细胞培养物相比，富集了至少约2至约1000倍。在一些实施方案中，与未处理的细胞群或细胞培养物相比，背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞可富集至少约5至约500倍。在其它实施方案中，与未处理的细胞群或细胞培养物相比，背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞可富集至少约10至约200倍。在其它实施方案中，与未处理的细胞群或细胞培养物相比，背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞可富集至少约20至约100倍。在其它实施方案中，与未处理的细胞群或细胞培养物相比，背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞可富集至少约40至约80倍。在某些实施方案中，与未处理的细胞群或细胞培养物相比，背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞可富集至少约2至约20倍。
富集、分离和/或纯化背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层
根据本发明的其他方面，背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞可以被富集、分离和/或纯化。本发明的一些实施方案中，富集背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞的细胞群通过从细胞培养物中分离这些细胞来产生。
本发明的一些实施方案中，背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞用荧光标记，然后用荧光激活的细胞分选术(FACS)来与未标记细胞分离。在这类实施方案中，用编码绿色荧光蛋白(GFP)的核酸或如编码荧光素酶的基因的另一编码可表达荧光标志物基因的核酸标记PDX1-阳性细胞。例如，在一些实施方案中，至少一个拷贝的编码GFP或其生物学活性片段的核酸被导入多能性细胞中，优选的是人胚胎干细胞中，位于选自表3或表4基因的启动子的下游，以便GFP基因产物或其生物学活性片段的表达受这种启动子的控制。在一些实施方案中，编码选自表3或表4的标志物的核酸的整个编码区域被编码GFP或其生物学活性片段的核酸替换。在其它实施方案中，编码GFP或其生物学活性片段的核酸与编码选自表3或表4的标志物的核酸的至少一部分进行同框(in frame)融合，从而产生融合蛋白。在这类实施方案中，融合蛋白保留与GFP相似的荧光活性。
如前所述，荧光标记的细胞(例如上述的多能性细胞)分化为定形内胚层，然后是背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层。因为背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞表达荧光标志物基因，而PDX1-阴性细胞不表达，这两种细胞类型可被分开。在一些实施方案中，用FACS分选包含荧光标记的背侧和/或腹侧PDX1-阳性细胞和未标记的PDX1-阴性细胞的混合物的细胞悬浮物。背侧和/或腹侧PDX1阳性前肠内胚层细胞与PDX1-阴性细胞分开收集，从而分离这些细胞类型。如果需要，可使用相同的或不同的对背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层特异的标志物增加分选次数，以进一步纯化分离的细胞组合物。
应了解上述富集、分离和纯化步骤可用于这类培养物的任意分化阶段。
使用本文描述的方法，富集的、分离的和/或纯化的背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞的群和/或组织可在体外从已经进行至少部分分化的PDX1-阴性、SOX17-阳性定形内胚层细胞培养物或细胞群得到。在一些实施方案中，细胞进行随机分化。但在优选的实施方案中，细胞主要定向分化为背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞。一些优选的富集、分离和/或纯化方法涉及在体外从人胚胎干细胞产生背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞。
使用本文描述的方法，与未处理的细胞群或细胞培养物相比，细胞群或细胞培养物中的背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞含量可被富集至少约2至约1000倍。一些实施方案中，与未处理的细胞群或细胞培养物相比，背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞可被富集至少约5至约500倍。其它实施方案中，与未处理的细胞群或细胞培养物相比，背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞可被富集至少约10至约200倍。其它实施方案中，与未处理的细胞群或细胞培养物相比，PDX1-阳性前肠内胚层细胞可被富集至少约20至约100倍。其它实施方案中，与未处理的细胞群或细胞培养物相比，背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞可被富集至少约40至约80倍。某些实施方案中，与未处理的细胞群或细胞培养物相比，背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞可被富集至少约2至约20倍。
包含背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层的组合物
本发明的一些实施方案涉及包含背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞的细胞组合物，例如细胞培养物或细胞群，其中背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞是多潜能细胞，可分化为衍生自肠管前部的细胞、组织或器官，例如背胰芽和/或腹胰芽。根据某些实施方案，背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞是哺乳动物细胞，在优选实施方案中，这些细胞是人细胞。
本发明的其它实施方案涉及包含一种或多种选自hESC、PDX1-阴性定形内胚层细胞、背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞和中胚层细胞的细胞类型的细胞的组合物，例如细胞培养物或细胞群。一些实施方案中，hESC包括少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％或少于约1％的所述培养物的全部细胞。其它实施方案中，PDX1-阴性定形内胚层细胞包括少于约90％、少于约85％、少于约80％、少于约75％、少于约70％、少于约65％、少于约60％、少于约55％、少于约50％、少于约45％、少于约40％、少于约35％、少于约30％、少于约25％、少于约20％、少于约15％、少于约12％、少于约10％、少于约8％、少于约6％、少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％或少于约1％的所述培养物的全部细胞。其它实施方案中，中胚层细胞包括少于约90％、少于约85％、少于约80％、少于约75％、少于约70％、少于约65％、少于约60％、少于约55％、少于约50％、少于约45％、少于约40％、少于约35％、少于约30％、少于约25％、少于约20％、少于约15％、少于约12％、少于约10％、少于约8％、少于约6％、少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％或少于约1％的所述培养物的全部细胞。
本发明的其它实施方案涉及用本文描述的方法产生的包含背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层作为主要细胞类型的组合物，例如细胞培养物或细胞群。一些实施方案中，用此处描述的方法产生包含至少约99％、至少约98％、至少约97％、至少约96％、至少约95％、至少约94％、至少约93％、至少约92％、至少约91％、至少约90％、至少约89％、至少约88％、至少约87％、至少约86％、至少约85％、至少约84％、至少约83％、至少约82％、至少约81％、至少约80％、至少约79％、至少约78％、至少约77％、至少约76％、至少约75％、至少约74％、至少约73％、至少约72％、至少约71％、至少约70％、至少约69％、至少约68％、至少约67％、至少约66％、至少约65％、至少约64％、至少约63％、至少约62％、至少约61％、至少约60％、至少约59％、至少约58％、至少约57％、至少约56％、至少约55％、至少约54％、至少约53％、至少约52％、至少约51％或至少约50％的背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞的细胞培养物和/或细胞群。优选的实施方案中，细胞培养物或细胞群的细胞包含人细胞。其它实施方案中，用此处描述的方法产生包含至少约50％、至少约45％、至少约40％、至少约35％、至少约30％、至少约25％、至少约24％、至少约23％、至少约22％、至少约21％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％或至少约1％的背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞的细胞培养物和/或细胞群。优选实施方案中，细胞培养物或细胞群的细胞包含人细胞。一些实施方案中，计算细胞培养物或细胞群中PDX1-阳性前肠内胚层细胞的比例时不考虑残留在培养物中的饲养细胞。
本发明的其它实施方案涉及包含背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞和PDX1-阴性定形内胚层细胞的混合物的组合物，例如细胞培养物或细胞群。例如，可产生包含至少约5个背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞对应约每95个PDX1-阴性定形内胚层细胞的细胞培养物或细胞群。其它实施方案中，可产生包含至少约95个背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞对应约每5个PDX1-阴性定形内胚层细胞的细胞培养物或细胞群。此外，预期可以得到包含背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞和PDX1-阴性定形内胚层其它比例的细胞培养物或细胞群。例如，预期可以得到包含至少约1个背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞对应约每1,000,000个PDX1-阴性定形内胚层细胞、至少约1个背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞对应约每100,000个PDX1-阴性定形内胚层细胞、至少约1个背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞对应约每10,000个PDX1-阴性定形内胚层细胞、至少约1个背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞对应约每1000个PDX1-阴性定形内胚层细胞、至少约1个背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞对应约每500个PDX1-阴性定形内胚层细胞、至少约1个背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞对应约每100个PDX1-阴性定形内胚层细胞、至少约1个背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞对应约每10个PDX1-阴性定形内胚层细胞、至少约1个背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞对应约每5个PDX1-阴性定形内胚层细胞、至少约1个背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞约对应每4个PDX1-阴性定形内胚层细胞、至少约1个背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞对应约每2个PDX1-阴性定形内胚层细胞、至少约1个背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞对应约每1个PDX1-阴性定形内胚层细胞、至少约2个背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞对应约每1个PDX1-阴性定形内胚层细胞、至少约4个背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞对应约每1个PDX1-阴性定形内胚层细胞、至少约5个背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞对应约每1个PDX1-阴性定形内胚层细胞、至少约10个背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞对应约每1个PDX1-阴性定形内胚层细胞、至少约20个背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞对应约每1个PDX1-阴性定形内胚层细胞、至少约50个背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞对应约每1个PDX1-阴性定形内胚层细胞、至少约100个背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞对应约每1个PDX1-阴性定形内胚层细胞、至少约1000个背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞对应约每1个PDX1-阴性定形内胚层细胞、至少约10,000个背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞对应约每1个PDX1-阴性定形内胚层细胞、至少约100,000个背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞对应约每1个PDX1-阴性定形内胚层细胞、和至少约1,000,000个背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞对应约每1个PDX1-阴性定形内胚层细胞的组合物。
本发明一些实施方案中，用于产生背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞的PDX1-阴性定形内胚层细胞衍生自人多能性细胞，例如人多能干细胞。某些实施方案中，人多能性细胞衍生自桑椹胚、胚胎内细胞团或胚胎生殖嵴。某些其他实施方案中，人多能性细胞衍生自发育已经越过胚胎期的多细胞结构的性腺组织或生殖组织。
本发明的进一步实施方案涉及包含人细胞(包括人背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层)的组合物，例如细胞培养物或细胞群，其中至少约2％的人细胞中PDX1标志物的表达高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM标志物的表达。其它实施方案中，至少5％的人细胞中、至少10％的人细胞中、至少15％的人细胞中、至少20％的人细胞中、至少25％的人细胞中、至少30％的人细胞中、至少35％的人细胞中、至少40％的人细胞中、至少45％的人细胞中、至少50％的人细胞中、至少55％的人细胞中、至少60％的人细胞中、至少65％的人细胞中、至少70％的人细胞中、至少75％的人细胞中、至少80％的人细胞中、至少85％的人细胞中、至少90％的人细胞中、至少95％的人细胞中或至少98％的人细胞中，PDX1标志物的表达高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM标志物的表达。一些实施方案中，计算细胞培养物或群中人细胞(其中PDX1的表达高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM的表达)的比例时不考虑饲养细胞。
应了解本发明的一些实施方案涉及包含人背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞的组合物，例如细胞培养物或细胞群，其中从至少约2％到超过至少约98％的人细胞中一种或多种选自SOX17、HOXA13和HOXC6的表达高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM标志物的表达。一些实施方案中，至少约5％的人细胞中、至少约10％的人细胞中、至少约15％的人细胞中、至少约20％的人细胞中、至少约25％的人细胞中、至少约30％的人细胞中、至少约35％的人细胞中、至少约40％的人细胞中、至少约45％的人细胞中、至少约50％的人细胞中、至少约55％的人细胞中、至少约60％的人细胞中、至少约65％的人细胞中、至少约70％的人细胞中、至少约75％的人细胞中、至少约80％的人细胞中、至少约85％的人细胞中、至少约90％的人细胞中、至少约95％的人细胞中或至少约98％的人细胞中，一种或多种选自SOX17、HOXA13和HOXC6的表达高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM的表达。一些实施方案中，计算细胞培养物或群中人细胞(一种或多种选自SOX17、HOXA13和HOXC6的表达高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM的表达)的比例时不考虑饲养细胞。
本发明的其它实施方案涉及包含人细胞(包括人背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞)的组合物，例如细胞培养物或细胞群，其中至少约2％的人细胞中一种或多种选自表3的标志物的表达高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM标志物的表达。其它实施方案中，至少约5％的人细胞中、至少约10％的人细胞中、至少约15％的人细胞中、至少约20％的人细胞中、至少约25％的人细胞中、至少约30％的人细胞中、至少约35％的人细胞中、至少约40％的人细胞中、至少约45％的人细胞中、至少约50％的人细胞中、至少约55％的人细胞中、至少约60％的人细胞中、至少约65％的人细胞中、至少约70％的人细胞中、至少约75％的人细胞中、至少约80％的人细胞中、至少约85％的人细胞中、至少约90％的人细胞中、至少约95％的人细胞中或至少约98％的人细胞中，一种或多种选自表3的标志物的表达高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM标志物的表达。一些实施方案中，计算细胞培养物或群中人细胞(其中一种或多种选自表3的标志物的表达高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM的表达)的比例时不考虑饲养细胞。
本发明的其它实施方案涉及包含人细胞(包括人背侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞)的组合物，例如细胞培养物或细胞群，其中至少约2％的人细胞中一种或多种选自表4的标志物的表达高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM标志物的表达。其它实施方案中，至少约5％的人细胞中、至少约10％的人细胞中、至少约15％的人细胞中、至少约20％的人细胞中、至少约25％的人细胞中、至少约30％的人细胞中、至少约35％的人细胞中、至少约40％的人细胞中、至少约45％的人细胞中、至少约50％的人细胞中、至少约55％的人细胞中、至少约60％的人细胞中、至少约65％的人细胞中、至少约70％的人细胞中、至少约75％的人细胞中、至少约80％的人细胞中、至少约85％的人细胞中、至少约90％的人细胞中、至少约95％的人细胞中或至少约98％的人细胞中，一种或多种选自表4的标志物的表达高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM标志物的表达。一些实施方案中，计算细胞培养物或群中人细胞(其中一种或多种选自表4的标志物的表达高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM的表达)的比例时不考虑饲养细胞。
本发明的其它实施方案涉及包含人细胞(包括人腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞)的组合物，例如细胞培养物或细胞群，其中至少约2％的人细胞中选自表3的标志物的表达高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM标志物的表达，以及选自表4的标志物与该相同标志物在背侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞中的表达相比不大量表达。其它实施方案中，至少约5％的人细胞中、至少约10％的人细胞中、至少约15％的人细胞中、至少约20％的人细胞中、至少约25％的人细胞中、至少约30％的人细胞中、至少约35％的人细胞中、至少约40％的人细胞中、至少约45％的人细胞中、至少约50％的人细胞中、至少约55％的人细胞中、至少约60％的人细胞中、至少约65％的人细胞中、至少约70％的人细胞中、至少约75％的人细胞中、至少约80％的人细胞中、至少约85％的人细胞中、至少约90％的人细胞中、至少约95％的人细胞中或至少约98％的人细胞中，选自表3的标志物的表达高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM标志物的表达。在这些实施方案中，选自表4的标志物与该相同标志物在背侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞中的表达相比不大量表达。一些实施方案中，计算细胞培养物或群中人细胞(其中选自表3的标志物的表达高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM标志物的表达，以及其中选自表4的标志物与该相同标志物在背侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞中的表达相比不大量表达)的比例时不考虑饲养细胞。
本发明的其它实施方案涉及包含哺乳动物内胚层细胞(例如人内胚层细胞)的组合物，如细胞培养物或细胞群，其中在至少约2％的内胚层细胞中PDX1标志物的表达和一种或多种选自表3或表4的标志物的表达高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM标志物的表达。在其它实施方案中，在至少约5％的内胚层细胞中、至少约10％的内胚层细胞中、至少约15％的内胚层细胞中、至少约20％的内胚层细胞中、至少约25％的内胚层细胞中、至少约30％的内胚层细胞中、至少约35％的内胚层细胞中、至少约40％的内胚层细胞中、至少约45％的内胚层细胞中、至少约50％的内胚层细胞中、至少约55％的内胚层细胞中、至少约60％的内胚层细胞中、至少约65％的内胚层细胞中、至少约70％的内胚层细胞中、至少约75％的内胚层细胞中、至少约80％的内胚层细胞中、至少约85％的内胚层细胞中、至少约90％的内胚层细胞中、至少约95％的内胚层细胞中或至少约98％的内胚层细胞中PDX1标志物的表达和一种或多种选自表3或表4的标志物的表达高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM标志物的表达。
本发明的其它实施方案涉及包含哺乳动物内胚层细胞(例如人内胚层细胞)的组合物，如细胞培养物或细胞群，其中在至少约2％的内胚层细胞中一种或多种选自SOX17、HOXA13和HOXC6的标志物的表达和一种或多种选自表3或表4的标志物的表达高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM标志物的表达。在其它实施方案中，在至少约5％的内胚层细胞中、至少约10％的内胚层细胞中、至少约15％的内胚层细胞中、至少约20％的内胚层细胞中、至少约25％的内胚层细胞中、至少约30％的内胚层细胞中、至少约35％的内胚层细胞中、至少约40％的内胚层细胞中、至少约45％的内胚层细胞中、至少约50％的内胚层细胞中、至少约55％的内胚层细胞中、至少约60％的内胚层细胞中、至少约65％的内胚层细胞中、至少约70％的内胚层细胞中、至少约75％的内胚层细胞中、至少约80％的内胚层细胞中、至少约85％的内胚层细胞中、至少约90％的内胚层细胞中、至少约95％的内胚层细胞中或至少约98％的内胚层细胞中一种或多种选自SOX17、HOXA13和HOXC6的标志物的表达和一种或多种选自表3或表4的标志物的表达高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM标志物的表达。
使用本文描述的方法，可产生基本上不含其它细胞类型的包含背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞的组合物。关于细胞培养物或细胞群中的细胞，用语“基本上不含”表示细胞培养物或细胞群不含的特异细胞类型在细胞培养物或细胞群的所有细胞中占有的比例少于约5％。本发明的一些实施方案中，用本文描述的方法产生的背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞群或细胞培养物基本上不含显著表达AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM标志物基因的细胞。
本发明的一个实施方案中，根据标志物基因的表达对背侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞的描述如下：PDX1高、选自表3的标志物高、选自表4的标志物高、AFP低、SOX7低、SOX1低、ZIC1低和NFM低。
本发明的一个实施方案中，根据标志物基因的表达对腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞的描述如下：PDX1高、选自表3的标志物高、选自表4的标志物与该相同标志物在背侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞中的表达相比低、AFP低、SOX7低、SOX1低、ZIC1低和NFM低。
增加SOX17-阳性定形内胚层细胞中PDX1的表达
本发明的一些方面涉及增加包含SOX17-阳性定形内胚层细胞的细胞培养物或细胞群中表达PDX1基因产物的方法。在这类实施方案中，使SOX17-阳性定形内胚层细胞与足以增加PDX1基因产物表达的一定量的分化因子接触。与分化因子接触的SOX17-阳性定形内胚层细胞可以是PDX1-阴性或PDX1-阳性。在一些实施方案中，分化因子可以是类视黄醇。某些实施方案中，使SOX17-阳性定形内胚层细胞与浓度范围约0.01μM至约50μM的类视黄醇接触。在优选的实施方案中，所述类视黄醇是RA。
在本发明的其它实施方案中，通过使SOX17-阳性定形内胚层细胞与成纤维细胞生长因子家族的分化因子接触来增加包含SOX17-阳性定形内胚层细胞的细胞培养物或细胞群中PDX1基因产物的表达。这类分化因子可单独使用或与RA联用。一些实施方案中，使SOX17-阳性定形内胚层细胞与浓度范围约10ng/ml至约1000ng/ml的成纤维细胞生长因子接触。一个优选实施方案中，FGF生长因子是FGF-10。
本发明的一些实施方案中，通过使SOX17-阳性细胞与B27接触来增加包含SOX17-阳性定形内胚层细胞的细胞培养物或细胞群中PDX1基因产物的表达。这类分化因子可以单独使用或与类视黄醇和FGF家族分化因子中的一种或两种联用。一些实施方案中，使SOX17-阳性定形内胚层细胞与浓度范围约0.1％(v/v)至约20％(v/v)的B27接触。在优选的实施方案中，使SOX17-阳性定形内胚层细胞与RA、FGF-10和B27接触。
增加包含SOX17-阳性定形内胚层细胞的细胞培养物或细胞群中PDX1基因产物表达的方法可在降低血清浓度或无血清的生长培养基中进行。一些实施方案中，血清浓度范围从约0.05％(v/v)至约20％(v/v)。一些实施方案中，SOX17-阳性定形内胚层细胞在含血清替代物的条件下生长。
应理解，上述方法也可用于增加背侧PDX1阳性前肠内胚层细胞中选自表3和/或表4的一种或多种标志物的表达。类似地，这些方法可用于增加腹侧PDX1阳性前肠内胚层细胞中选自表3的一种或多种标志物的表达。
能够促进PDX1-阴性定形内胚层细胞向PDX1-阳性前肠内胚层细胞分
化的因子的鉴定
本发明的其它方面涉及鉴定一种或多种能够促进PDX1-阴性定形内胚层细胞向PDX1-阳性前肠内胚层细胞分化的分化因子的方法。在这类方法中，获得包含PDX1-阴性定形内胚层细胞的细胞培养物或细胞群，并测定细胞培养物或细胞群中PDX1的表达。在测定PDX1表达后，使细胞培养物或细胞群的细胞与候选分化因子接触。在一些实施方案中，在使细胞与候选分化因子接触时或与候选分化因子接触后不久检测PDX1的表达。然后在使细胞与候选分化因子接触后的一个或多个时间点检测PDX1表达。与接触候选分化因子前的PDX1的表达相比，如果在接触候选分化因子后PDX1的表达增加，候选分化因子可被鉴定为能够促进PDX1-阴性定形内胚层细胞向PDX1-阳性前肠内胚层细胞的分化。
一些实施方案中，上述鉴定能够促进PDX1-阴性定形内胚层细胞向PDX1-阳性前肠内胚层细胞分化的分化因子的方法还包括测定细胞培养物或细胞群中HOXA13和/或HOXC6基因的表达。在这类实施方案中，在使细胞与候选分化因子接触前后分别测定HOXA13和/或HOXC6基因的表达。与接触分化因子前PDX1和HOXA13的表达相比，如果在接触候选分化因子后，PDX1和HOXA13的表达增加，就可鉴定候选分化因子能够促进PDX1-阴性定形内胚层细胞向PDX1-阳性前肠内胚层细胞的分化。相似地，与接触分化因子前比较，如果在接触候选分化因子后，PDX1和HOXC6的表达增加，就可鉴定候选分化因子能够促进PDX1-阴性定形内胚层细胞向PDX1-阳性前肠内胚层细胞的分化。在优选的实施方案中，通过在使细胞培养物或细胞群的细胞与候选分化因子接触前后分别测定PDX1、HOXA13和HOXC6的表达来鉴定可以促进PDX1-阴性定形内胚层细胞向PDX1-阳性前肠内胚层细胞分化的候选分化因子。优选实施方案中，用Q-PCR检测PDX1、HOXA13和/或HOXC6的表达。
应了解在一些实施方案中，在使细胞培养物或细胞群中的细胞与候选分化因子接触时或在接触候选分化因子后不久检测PDX1、HOXA13和HOXC6中一种或多种的表达，而不是在细胞接触候选分化因子之前检测。在这类实施方案中，将在使细胞与候选分化因子接触时或在接触候选分化因子后不久PDX1、HOXA13和HOXC6中的一种或多种的表达与在细胞接触候选分化因子后的一个或多个时间点的PDX1、HOXA13和HOXC6中的一个或多个表达进行比较。
在上述方法的一些实施方案中，在细胞与候选分化因子接触后检测PDX1表达的一个或多个时间点的范围可以从约1小时至约10天。例如，可以在细胞与候选分化因子接触后约1小时、细胞与候选分化因子接触后约2小时、细胞与候选分化因子接触后约4小时、细胞与候选分化因子接触后约6小时、细胞与候选分化因子接触后约8小时、细胞与候选分化因子接触后约10小时、细胞与候选分化因子接触后约12小时、细胞与候选分化因子接触后约16小时、细胞与候选分化因子接触后约24小时，细胞与候选分化因子接触后约2天、细胞与候选分化因子接触后约3天、细胞与候选分化因子接触后约4天、细胞与候选分化因子接触后约5天、细胞与候选分化因子接触后约6天、细胞与候选分化因子接触后约7天、细胞与候选分化因子接触后约8天、细胞与候选分化因子接触后约9天、细胞与候选分化因子接触后约10天或细胞与候选分化因子接触后超过10天检测PDX1的表达。
用于此处描述的方法的候选分化因子可以选自化合物，例如多肽和小分子。例如，候选多肽包括但不限于生长因子、细胞因子、趋化因子、胞外基质蛋白和合成肽。在优选的实施方案中，生长因子来自FGF家族，例如FGF-10。候选小分子包括但不限于从组合化学合成的化合物和天然产物，例如类固醇、类异戊二烯、萜类化合物、类苯基丙烷(phenylpropanoid)、生物碱类和类黄酮。本领域技术人员应了解有数千种天然和合成的小分子可以利用，预期可用于本文描述的方法的小分子不限于以上举例的种类。通常，小分子的分子量低于10,000amu。在优选的实施方案中，小分子是类视黄醇，例如RA。
应理解，通过监测一种或多种选自表4的标志物表达，上述方法可用于鉴定能够促进PDX1-阴性定形内胚层细胞向背侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞分化的因子。在一些实施方案中，监测一种或多种选自表3的标志物和一种或多种选自表4的标志物的表达。
类似地，也应理解，通过监测一种或多种选自表3的标志物表达，上述方法可用于鉴定能够促进PDX1-阴性定形内胚层细胞向腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞分化的因子。在一些实施方案中，监测一种或多种选自表3的标志物和一种或多种选自表4的标志物的表达。
能够促进背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞分化的因子的鉴
定
某些本文描述的筛选方法涉及鉴定至少一种能够促进背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞分化的分化因子的方法。在这些方法的一些实施方案中，获得包含背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞的细胞群，例如人背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞的细胞群。接着向细胞群提供候选分化因子。在提供候选分化因子之前或与其大概同时的第一时间点，测定标志物的表达。或者，可在提供候选分化因子后测定标志物的表达。在第一时间点之后并且在向细胞群提供候选分化因子之后的第二时间点，再次测定相同标志物的表达。通过比较标志物在第一时间点的表达和标志物在第二时间点的表达，可确定候选分化因子是否能够促进背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞的分化。如果与第一时间点标志物的表达相比，第二时间点时标志物的表达增加或减少了，则候选分化因子能够促进背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞的分化。在优选的实施方案中，用Q-PCR检测标志物的表达。
本文描述的筛选方法的一些实施方案利用包含人背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞的细胞群或细胞培养物。例如，该细胞群可为基本上纯的人背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞群。或者，该细胞群可为人背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞的富集群，其中该细胞群中至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％或高于至少约97％的人细胞为人背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞。在本文描述的其它实施方案中，该细胞群包含人细胞，其中至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％或高于至少约85％的人细胞为人背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞。在一些实施方案中，该细胞群包含非人细胞，如非人饲养细胞。在其它实施方案中，该细胞群包含人饲养细胞。在这类实施方案中，除了所述饲养细胞外，至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或高于至少约95％的人细胞为人背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞。
在本文描述的筛选方法的实施方案中，使细胞群与候选分化因子接触，或者以其它方式提供候选(测试)分化因子。该候选分化因子可包括任何可能有能力促进人背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞分化的分子。在这里描述的一些实施方案中，候选分化因子可包括已知为一种或多种细胞类型的分化因子的分子。在备选实施方案中，候选分化因子可包括未知可促进细胞分化的分子。在优选的实施方案中，候选分化因子包括未知可促进背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞分化的分子。
在本文描述的筛选方法的一些实施方案中，候选分化因子包括小分子。在优选的实施方案中，小分子为分子量约10,000amu或更小的分子。在一些实施方案中，该小分子包括类视黄醇。在一些实施方案中，该小分子包括视黄酸。
在本文描述的其它实施方案中，候选分化因子包括多肽。该多肽可为任何多肽，包括但不限于，糖蛋白、脂蛋白、细胞外基质蛋白、细胞因子、趋化因子、肽激素、白介素或生长因子。优选的多肽包括生长因子。
在本文描述的筛选方法的其它实施方案中，候选分化因子包括一种或多种生长因子，选自双调蛋白、B-淋巴细胞刺激剂、IL-16、胸腺生成素、TRAIL/Apo-2、前B细胞集落促进因子、内皮分化相关因子1(EDF1)、内皮单核细胞活化多肽II、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、天然杀伤细胞促进因子(NKEFA)、骨形态发生蛋白2、骨形态发生蛋白8(成骨蛋白2)、骨形态发生蛋白6、骨形态发生蛋白7、结缔组织生长因子(CTGF)、CGI-149蛋白(神经内分泌分化因子)、细胞因子A3(巨噬细胞炎性蛋白1-α)、胶质瘤细胞分化相关蛋白(GBDR1)、肝癌衍生生长因子、神经介素U-25前体、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子B(VEGF-B)、T细胞特异RANTES前体、胸腺树突状细胞衍生因子1、转铁蛋白、白介素-1(IL 1)、白介素-2(IL 2)、白介素-3(IL 3)、白介素-4(IL 4)、白介素-5(IL 5)、白介素-6(IL 6)、白介素-7(IL 7)、白介素-8(IL 8)、白介素-9(IL 9)、白介素-10(IL 10)、白介素-11(IL 11)、白介素-12(IL 12)、白介素-13(IL 13)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、促红细胞生成素、血小板生成素、维生素D3、表皮生长因子(EGF)、脑源性神经营养因子、白细胞抑制因子、甲状腺激素、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、aFGF、FGF-4、FGF-6、胶质化细胞生长因子(KGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血小板衍生生长因子-BB、β神经生长因子、活化素A、转化生长因子β1(TGF-β1)、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、爆式促进活性(BPA)、红系促进活性(EPA)、PGE2、胰岛素生长因子-1(IGF-1)、IGF-II、神经生长素生长因子(NGF)、神经生长素-3、神经生长素4/5、睫状节神经细胞营养因子、胶质衍生的连接蛋白、地塞米松、β-巯基乙醇、视黄酸、丁羟基茴香醚、5-氮杂胞苷、两性霉素B、抗坏血酸、抗坏血酸盐(Ascrorbate)、异丁基黄嘌呤、吲哚美辛、β-磷酸甘油酯、烟酰胺、DMSO、噻唑烷二酮类、TWS 119、催产素、加压素、促黑素细胞激素、促皮质素、促脂素、促甲状腺激素、生长激素、催乳素、促黄体生成激素、人体绒毛膜促性腺激素、滤泡刺激激素、促皮质释放因子、促性腺激素释放因子、催乳素释放因子、催乳素抑制因子、生长激素释放因子、生长抑素、促甲状腺技术释放因子、降钙素基因相关肽、甲状旁腺激素、胰高血糖素样肽1、葡萄糖依赖的促胰岛素多肽、胃泌素、分泌素、胆囊收缩素、胃动素、血管作用肠肽、P物质、胰多肽、酪酪肽、神经肽Y、胰岛素、以高血糖素、胎盘催乳素、松弛素、血管紧张素II、钙三醇(calctriol)、心房利钠肽、以及褪黑素、甲状腺素、三碘甲腺原氨酸、降钙素、雌二醇、雌酮、黄体酮、睾酮、考的松、皮质酮、醛固酮、肾上腺素、去甲肾上腺素、雄烯(androstiene)、钙三醇(calcitriol)、胶原、地塞米松、β-巯基乙醇、视黄酸、丁羟基茴香醚、5-氮杂胞苷、两性霉素B、抗坏血酸、抗坏血酸盐(Ascrorbate)、异丁基黄嘌呤、吲哚美辛、β-磷酸甘油酯、烟酰胺、DMSO、噻唑烷二酮类、以及TWS 119。
在本文描述的筛选方法的其它实施方案中，候选分化因子以一个或多个浓度提供给细胞群。在一些实施方案中，向细胞群提供候选分化因子，使得候选分化因子在围绕细胞的培养基中的浓度为约0.1ng/ml至约10mg/ml。在一些实施方案中，候选分化因子在围绕细胞的培养基中的浓度为约1ng/ml至约1mg/ml。在其它实施方案中，候选分化因子在围绕细胞的培养基中的浓度为约10ng/ml至约100μg/ml。在其它实施方案中，候选分化因子在围绕细胞的培养基中的浓度为约100ng/ml至约10μg/ml。在优选的实施方案中，候选分化因子在围绕细胞的培养基中的浓度为约5ng/ml、约25ng/ml、约50ng/ml、约75ng/ml、约100ng/ml、约125ng/ml、约150ng/ml、约175ng/ml、约200ng/ml、约225ng/ml、约250ng/ml、约275ng/ml、约300ng/ml、约325ng/ml、约350ng/ml、约375ng/ml、约400ng/ml、约425ng/ml、约450ng/ml、约475ng/ml、约500ng/ml、约525ng/ml、约550ng/ml、约575ng/ml、约600ng/ml、约625ng/ml、约650ng/ml、约675ng/ml、约700ng/ml、约725ng/ml、约750ng/ml、约775ng/ml、约800ng/ml、约825ng/ml、约850ng/ml、约875ng/ml、约900ng/ml、约925ng/ml、约950ng/ml、约975ng/ml、约1μg/ml、约2μg/ml、约3μg/ml、约4μg/ml、约5μg/ml、约6μg/ml、约7μg/ml、约8μg/ml、约9μg/ml、约10μg/ml、约11μg/ml、约12μg/ml、约13μg/ml、约14μg/ml、约15μg/ml、约16μg/ml、约17μg/ml、约18μg/ml、约19μg/ml、约20μg/ml、约25μg/ml、约50μg/ml、约75μg/ml、约100μg/ml、约125μg/ml、约150μg/ml、约175μg/ml、约200μg/ml、约250μg/ml、约300μg/ml、约350μg/ml、约400μg/ml、约450μg/ml、约500μg/ml、约550μg/ml、约600μg/ml、约650μg/ml、约700μg/ml、约750μg/ml、约800μg/ml、约850μg/ml、约900μg/ml、约950μg/ml、约1000μg/ml或大于约1000μg/ml。
在这里描述的筛选方法的某些实施方案中，向细胞群提供候选分化因子，该候选分化因子包括除类视黄醇、FGF-10、FGF-4、BMP-4、活化素A、活化素B或任何其它前肠分化因子之外的任何分子。在一些实施方案中，向细胞群提供候选分化因子，该候选分化因子包括除视黄酸之外的任何分子。
在一些实施方案中，本文描述的筛选方法的步骤包括在第一时间点和第二时间点测定至少一种标志物的表达。在一些这类实施方案中，第一时间点可在向细胞群提供候选分化因子之前或与其大概同时。或者，在一些实施方案中，第一时间点在向细胞群提供候选分化因子之后。在一些实施方案中，在第一时间点测定多种标志物的表达。
除了在第一时间点测定至少一种标志物的表达，这类描述的筛选方法的一些实施方案考虑在第二时间点测定至少一种标志物的表达，该第二时间点在第一时间点之后并且在向细胞群提供候选分化因子之后。在这类实施方案中，在第一和第二时间点测定相同标志物的表达。在一些实施方案中，在第一和第二时间点测定多种标志物的表达。在这类实施方案中，在第一和第二时间点测定多个相同标志物的表达。在一些实施方案中，在多个时间点测定标志物的表达，所述多个时间点在第一时间点之后，并且也在向细胞群提供候选分化因子之后。在一些实施方案中，通过Q-PCR测定标志物表达。在其它实施方案中，通过免疫细胞化学测定标志物表达。
在本文描述的筛选方法的某些实施方案中，其表达在第一和第二时间点被测定的标志物与人背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞向特定细胞前体的分化相关，该特定细胞前体会形成衍生自前肠后部的组织和/或器官。在一些实施方案中，衍生自前肠后部的组织和/或器官包括终末分化细胞。在一些实施方案中，标志物指示胰细胞或胰前体细胞。在一些实施方案中，标志物选自表3或表4。
在本文描述的筛选方法的一些实施方案中，在向细胞群提供候选分化因子和在第二时间点测定标志物表达之间允许有足够长的时间。向细胞群提供候选分化因子和在第二时间点测定标志物表达之间的足够长时间可少至约1小时，多至约10天。在一些实施方案中，至少一种标志物的表达在向细胞群提供候选分化因子后的多个时间点被测定。在一些实施方案中，足够长的时间为至少约1小时、至少约6小时、至少约12小时、至少约18小时、至少约24小时、至少约30小时、至少约36小时、至少约42小时、至少约48小时、至少约54小时、至少约60小时、至少约66小时、至少约72小时、至少约78小时、至少约84小时、至少约90小时、至少约96小时、至少约102小时、至少约108小时、至少约114小时、至少约120小时、至少约126小时、至少约132小时、至少约138小时、至少约144小时、至少约150小时、至少约156小时、至少约162小时、至少约168小时、至少约174小时、至少约180小时、至少约186小时、至少约192小时、至少约198小时、至少约204小时、至少约210小时、至少约216小时、至少约222小时、至少约228小时、至少约234小时或至少约240小时。
本文描述的方法的一些实施方案中，进一步确定与第一时间点标志物的表达相比，第二时间点该标志物的表达是否增加或减少。至少一种标志物表达的增加或减少表明该候选分化因子能够促进背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞的分化。类似地，如果测定了多个标志物的表达，则进一步确定与第一时间点时多个标志物的表达相比，第二时间点时该多个标志物的表达是否增加或减少。可通过测量或以其它方式评估第一和第二时间点时细胞群中标志物的量、水平或活性来确定标志物表达的增加或减少。这种确定可为相对于其它标志物如看家基因表达，或者为绝对值。标志物表达在第二时间点相对于第一时间点增加的某些实施方案中，增加量为至少约2倍、或至少约5倍、或至少约10倍、或至少约20倍、或至少约30倍、或至少约40倍、或至少约50倍、或至少约60倍、或至少约70倍、或至少约80倍、或至少约90倍、或至少约100倍或大于至少约100倍。在一些实施方案中，增加量为少于约2倍。标志物表达在第二时间点相对于第一时间点减少的某些实施方案中，减少量为至少约2倍、、或至少约5倍、或至少约10倍、或至少约20倍、或至少约30倍、或至少约40倍、或至少约50倍、或至少约60倍、或至少约70倍、或至少约80倍、或至少约90倍、或至少约100倍或大于至少约100倍。在一些实施方案中，减少量为少于约2倍。
尽管本文公开的每种方法都关于背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠内胚层细胞，应了解在某些实施方案中，这些方法可用于产生包含本文描述的背侧和/或腹侧PDX1-阳性前肠/中肠内胚层细胞和/或本文描述的前肠后部的背侧和/或腹侧PDX1-阳性内胚层细胞的组合物。此外，本说明书中公开的任何PDX1-阳性内胚层细胞类型都可用在此处描述的筛选方法中。
以上概括描述了本发明，可通过参照本文提供的某些具体实施例进一步理解本发明，这些实施例仅是为了说明而不是限制本发明。
实施例
以下很多实施例描述了人多能性细胞的使用。产生人多能性细胞的方法在现有技术中是公知的，在许多科学出版物中都有描述，包括第5,453,357、5,670,372、5,690,926、6,090,622、6,200,806和6,251,671号美国专利及公开号为2004/0229350的美国专利申请，通过引用将它们的公开内容整体并入本文。
实施例1
人ES细胞
为研究内胚层发育，我们采用了人胚胎干细胞，其为多能性的，在培养中似乎可无限分裂同时保持正常的核型。采用免疫学或机械方法分离，从5天的胚胎内细胞团得到ES细胞。尤其是，人胚胎干细胞系hESCyt-25是经患者同意后从体外受精周期的多余的冷冻胚胎中得到。孵化的胚泡解冻后种植在ES培养基(DMEM、20％FBS、非必须氨基酸、β-巯基乙醇、ITS添加物)中的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上。胚胎粘附在培养皿上，大约两周后，未分化的hESC区域被转移到含MEF的新培养皿中。转移采用机械剪切和分散酶的简单消化，然后用机械力除去细胞簇，清洗和重新种植细胞。自衍生后，hESCyt-25已经经过一系列超过100次传代。我们利用人胚胎干细胞系hESCyt-25作为产生定形内胚层的起始材料。
本领域技术人员应了解干细胞或其它多能性细胞也可用作本文描述的分化步骤的起始材料。例如，可通过本领域中已知的方法分离的来源于胚胎生殖嵴的细胞可用作多能性细胞的起始材料。
实施例2
hESCyt-25的特征
人胚胎干细胞系hESCyt-25在培养超过18个月后仍保持正常的形态、核型、生长和自我更新性质。此细胞系对OCT4、SSEA-4和TRA-1-60抗原均显示很强的免疫反应性(这几个抗原都是未分化hESC的特征性抗原)、显示碱性磷酸酶活性以及与其它已建立的hESC系相似的形态。此外，人胚胎干细胞系hESCyt-25在悬浮培养时容易形成胚状体(EB)。hESCyt-25可以分化为代表三种主要胚层的不同细胞类型，这表明hESCyt-25了多能性。对ZIC1的Q-PCR检测以及对nestin和更多成熟神经标志物的免疫细胞化学(ICC)鉴定证明了外胚层的产生。在延伸细胞簇中观察到了β-III微管蛋白的免疫细胞化学染色，这是早期神经元的特征。之前，我们以视黄酸处理悬浮液中的EB，以诱导多能干细胞向内脏内胚层(VE)、胚外细胞系分化。经54小时处理后，经处理的细胞大量表达两种VE的标志物：α-胎蛋白(AFP)和SOX7。免疫细胞化学染色表明细胞在零星块中表达AFP的单细胞层中分化。下面将描述，在无AFP表达时，SOX-17的实时定量聚合酶链式反应(Q-PCR)和免疫细胞化学检测证明hESCyt-25细胞系还可以形成定形内胚层。在不同时间点检测了分化的EB中Brachyury基因的表达以证明向中胚层的分化。在实验过程中Brachyury表达逐渐提高。综上所述，hESCyt-25细胞系具有形成代表三种胚层的细胞的能力，因此是多能性的。
实施例3
SOX17抗体的产生
在hESC培养物中鉴定定形内胚层的主要障碍就是缺乏合适的工具，因此我们制备了抗人SOX17蛋白的抗体。
定形内胚层在原肠胚形成期产生后，所有定形内胚层都表达标志物SOX17，它的表达在肠管中继续(尽管表达水平沿A-P轴变化)直至器官发生的开始。SOX17还在胚外内胚层细胞亚型中表达。在中胚层或外胚层中未发现此蛋白的表达。现在发现当与排除胚外细胞系的标志物联用时，SOX17是定形内胚层细胞系的合适标志物。
如本文详细描述的，SOX17抗体用于特异检测目的是产生SOX17阳性定形内胚层细胞的不同处理方法和分化步骤的效果。与AFP、SPARC和血栓调节蛋白反应的其它抗体被用来排除内脏和体壁内胚层(胚外内胚层)的产生。
为了产生抗SOX17的抗体，抗体制备公司GENOVAC(Freiberg，Germany)根据其开发的步骤，与SOX17蛋白羧基端氨基酸172-414(SEQ ID NO：2)对应的部分人SOX17cDNA(SEQ ID NO：1)被用于大鼠的遗传免疫。遗传免疫步骤可参见第5,830,876、5,817,637、6,165,993和6,261,281号美国专利，及公开号为WO 00/29442和WO 99/13915的国际专利申请。以引用的方式将这些公开整体引入本文。
遗传免疫的其它适用方法在非专利文献中也有描述。例如，Barry等人在Biotechniques 16：616-620，1994中描述了用遗传免疫方法产生单克隆抗体，以引用的方式将其公开整体引入本文。以下是用遗传免疫方法制备特异蛋白抗体的具体实例：如Costaglia等人，(1998)Genetic immunization against the human thyrotropin receptor causesthyroiditis and allows production of monoclonal antibodies recognizingthe native receptor(抗人促甲状腺激素受体的遗传免疫导致甲状腺炎，并能产生识别天然受体的单克隆抗体)，J.Immunol.160：1458-1465；Kilpatrick等人，(1998)Gene gun delivered DNA-based immunizationsmediate rapid production of murine monoclonal antibodies to the Flt-3receptor(基因枪输送的基于DNA的免疫作用调节针对抗Flt-3受体的小鼠单克隆抗体的快速产生)，Hybridoma 17：569-576；Schmolke等人(1998)Identification of hepatitis G virus particles in human serum byE2-specific monoclonal antibodies generated by DNA immunization(DNA免疫产生的E2-特异单克隆抗体鉴定人血清中庚型肝炎病毒颗粒)，J.Virol.72：4541-4545；Krasemann等人(1999)Generation ofmonoclonal antibodies against proteins with an unconventional nucleicacid-based immunization strategy(利用非常规的基于核苷酸的免疫策略产生针对蛋白的单克隆抗体)，J.Biotechnol.73：119-129；和Ulivieri等人(1996)Generation of a monoclonal antibody to a defined portion ofthe Heliobacter pylori vacuolating cytotoxin by DNA immunization(通过DNA免疫产生抗Heliobacter pylorivacuolating内毒素指定部分的单克隆抗体)J.Biotechnol.51：191-194，通过引用将它们的公开内容整体并入本文。
如图3关系树状图所示，在Sox家族中SOX7和SOX18是与SOX17关系最近的家族成员。我们利用人SOX7多肽作为阴性对照证明遗传免疫产生的SOX17抗体对SOX17特异，而不与它关系最近的家族成员反应。具体地，使SOX7和其它蛋白在人成纤维细胞中表达，然后通过Western印迹和ICC方法分析与SOX17抗体的交叉反应性。例如，以下方法用来产生SOX17、SOX7和EGFP表达载体，将载体转染人成纤维细胞，然后进行Western印迹分析。用于产生SOX17、SOX7和EGFP的表达载体分别是pCMV6(OriGene Technologies，Inc.，Rockville，MD)、pCMV-SPORT6(Invitrogen，Carlsbad，CA)和pEGFP-N1(Clonetech，Palo Alto，CA)。为制备蛋白，超螺旋DNA采用Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)瞬时转染端粒酶永生化的MDX人成纤维细胞。转染36小时后在50mM TRIS-HCl(pH 8)、150mM NaCl、0.1％SDS、0.5％脱氧胆酸、含有蛋白酶抑制剂的混合物(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN)中收集全部溶胞产物。Western印迹分析步骤如下：100μg细胞蛋白在NuPAGE(4-12％梯度聚丙烯酰胺，Invitrogen，Carlsbad，CA)上SDS-PAGE分离，电转到PDVF膜(Hercules，CA)，大鼠SOX17抗血清用10mM TRIS-HCl(pH8)、150mM NaCl、10％BSA、0.05％Tween-20(Sigma，St.Louis，MO)1/1000稀释作为探针，然后用碱性磷酸酶偶联的抗大鼠IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA)孵育，最后用Vector Black碱性磷酸酶染色(Vector Laboratories，Burlingame，CA)显现。所用的蛋白分子量标准为宽范围的颜色标志物(Sigma，St.Louis，MO)。
图4中，从瞬时转染了SOX17、SOX7或EGFP cDNA的人成纤维细胞的蛋白提取物用SOX17抗体进行Western印迹检测。只有转染了hSOX17的细胞的蛋白提取物在约51Kda产生一个条带，与预测人SOX17蛋白的分子量46Kda非常接近。SOX17抗体与来自转染了人SOX7或EGFP的细胞的提取物没有反应性。此外，SOX17抗体清楚地标记了转染hSOX17表达构建体的人成纤维细胞的细胞核，但没有标记只转染了EGFP的细胞。同样，ICC检测也显示了SOX17抗体的特异性。
实施例4
SOX17抗体作为定形内胚层标志物的证实
部分分化的hESC用SOX17和AFP抗体同时标记，以表明SOX17抗体特异于SOX17蛋白，并进一步标记定形内胚层。已证明SOX17、SOX7(SOX基因家族亚群F(图3)的关系最近的成员)和AFP在内脏内胚层中均有表达。但是，在ICC检测水平在定形内胚层细胞中未发现AFP和SOX7的表达，因此，它们可作为bonifide定形内胚层细胞的阴性标志物。显示SOX17抗体标记作为离散的细胞簇形式存在或是与AFP阳性细胞混合的细胞群。具体地，图5A显示少数SOX17细胞被AFP共同标记；但是，在SOX17+细胞范围内也发现了近乎没有或者根本没有AFP+细胞的区域(图5B)。相似地，因为据报道体壁内胚层表达SOX17，用体壁标志物SPARC和/或血栓调节蛋白(TM)与SOX-17抗体共标记可鉴定属于体壁内胚层的SOX17+细胞。如图6A-C所示，血栓调节蛋白和SOX-17共标记的体壁内胚层细胞通过hES细胞的随机分化产生。
综上细胞标记实验，由标志物特征SOX17hi/AFPlo/[TMlo或SPARClo]可建立鉴定定形内胚层细胞的方法。换言之，SOX17标志物的表达高于AFP标志物的表达，这是内脏内胚层的特征，而TM或SPARC标志物是体壁内胚层的特征。因此，那些SOX17阳性，而AFP阴性和TM或SPARC阴性的细胞是定形内胚层细胞。
为了获得进一步证据证实标志物特征SOX17hi/AFPlo/TMloSPARClo指示定形内胚层，使SOX17和AFP基因的表达与相应数量的抗体标记的细胞进行了定量比较。如图7A所示，经视黄酸(内脏内胚层诱导剂)或活化素A(定形内胚层诱导剂)处理的hESC，在SOX17mRNA表达水平上有10倍差异。这个结果反映了SOX17抗体标记细胞数目的10倍差异(图7B)。此外，如图8A所示，hESC经活化素A处理，与未经处理的比较，可抑制AFP基因表达6.8倍。图8B-C所示培养物中AFP标记细胞的数量显著减少直观反映了这点。为进一步定量，经流式细胞检测(图9A-B)证实AFP基因表达降低约7倍是AFP抗体标记细胞数目减少大约7倍的结果。这个结果非常重要，因为它表明Q-PCR显示的基因表达量的改变反映了细胞类型的变化，这可通过抗体染色观察到。
hESC与Nodal家族成员(Nodal，活化素A和活化素B-NAA)孵育后随时间推移导致SOX17抗体标记细胞的显著增加。经过活化素连续5天的处理后超过50％细胞可以标记为SOX17(图10A-F)。而经活化素处理5天后几乎很少或没有细胞标记为AFP。
总之，产生的抗人SOX17蛋白羧基端242个氨基酸的抗体在Western印迹中鉴定了人SOX17蛋白，但不识别SOX17在Sox家族中最接近的成员SOX7。SOX17抗体识别正在分化的hESC培养物中的亚群，它们主要是SOX17+/AFPlo/-(超过95％的标记细胞)以及少部分(＜5％)共标记SOX17和AFP的细胞(内脏内胚层)。用活化素处理hESC培养物导致SOX17基因表达的显著升高以及SOX17标记细胞的明显增加，并显著抑制AFP mRNA的表达，减少AFP抗体标记细胞的数目。
实施例5
Q-PCR基因表达分析
在以下实验中，实时定量RT-PCR(Q-PCR)是用于筛查不同处理对hESC分化的作用的主要分析方法。尤其是，基因表达的实时检测是以Q-PCR在不同时间点分析多种标志物基因。对期望的以及不期望的细胞类型的特征性标志物基因进行评估，以便更好的理解细胞群的整体动态。Q-PCR分析的优点在于它的极端灵敏性以及新增必须标志物时的相对便捷，因为基因组序列是容易得到。此外，Q-PCR的极高灵敏性可以检测到非常大的细胞群中相对较少数目的细胞的基因表达。而且，检测极低水平基因表达的能力为细胞群的“分化偏向”提供了指征。在细胞表型明显的分化之前，向特定分化途径的偏向用免疫细胞化学技术是检测不出的。为此，Q-PCR提供了一种分析方法，这种方法对用于筛选成功的分化处理来说至少是免疫细胞化学技术的补充，而且可能更优于它。此外，Q-PCR提供了一种机制，这种机制可以利用半高通量定量分析评价分化实验设计是否成功。
此处采用的方法为在Rotor Gene 3000装置(Corbett Research)上利用SYBR Green化学和两步RT-PCR模式进行相对定量。这种方法允许保存cDNA样品用于将来分析其他标志物的基因，避免了样品间逆转录效率的差异。
根据去除从污染的基因组DNA扩增产物的经验，设计的引物应位于外显子-外显子边界，或者如有可能跨越至少800bp的内含子。当使用的标志物基因不含内含子或者具有假基因时，RNA样品应用DNase I进行处理。
我们通常用Q-PCR检测靶细胞和非靶细胞类型的多种标志物的基因表达，从而产生细胞样品中的广谱的基因表达谱。以下表1列出了与hESC分化早期(特别是外胚层、中胚层、定形内胚层和胚外内胚层)相关的标志物以及已确认的可用引物对。已经证明这些引物对的人特异性。这非常重要，因为hESC通常在小鼠饲养层上生长。最具代表性的是，每种条件取三个样品，然后独立进行两次分析，以评估与每次定量测定有关的生物学差异。
为产生PCR模板，用RNeasy(Qiagen)分离总RNA并用RiboGreen(Molecular Probes)定量。350-500ng总RNA的逆转录使用iScript逆转录酶试剂盒(BioRad)进行，试剂盒含有oligo-dT和随机引物的混合物。每20μL反应液稀释到总体积100μL，然后3μL用于每10μL Q-PCR反应(含400nM正向和反向引物及5μL 2X SYBR Green mastermix(Qiagen))中。两步循环参数如下：85-94℃变性5秒(具体根据每种引物对扩增子的融解温度选择)；60℃退火/延伸45秒。在每个延伸期的后15秒收集荧光数据。每个点重复三次，以10倍梯度稀释系列产生每次运行的标准曲线，然后基于该标准曲线将循环阈值(Ct’s)转化为定量值。每个样品的定量值用管家基因结果校正，计算三份样品的平均和标准偏差。当PCR循环完成时，进行融解曲线分析确定反应的特异性。单一特异产物由适于PCR扩增子的Tm处的单一峰表示。此外，以不含逆转录酶的反应作为阴性对照，不发生扩增。
建立Q-PCR方法的第一步是在实验系统中确证合适的管家基因(HG)。由于HG被用于样品间RNA添加、RNA完整性和RT效率的校正，因此重要的是所有样品类型中HG显示出随时间稳定水平的表达，这样的话校正才有意义。我们检测了正在分化的hESC中亲环素G(Cyclophilin G)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT)、β-2-微球蛋白、羟甲基胆素合酶(HMBS)、TATA-结合蛋白(TBP)和葡糖醛酸糖苷酶β(GUS)的表达。我们的结果表明在分化过程中β-2-微球蛋白的表达水平增高，因此我们排除这种基因用于校正。其它基因在分化期和处理期的表达水平均保持稳定。我们通常用亲环素G和GUS计算所有样品的校正因子。同时使用多种HG降低了校正过程自身的波动，从而提高了相对基因表达数值的可靠性。
获得用于校正的基因后，用Q-PCR确定经过不同实验处理的样品的标志物基因的相对基因表达水平。选择这些标志物基因是因为它们在代表早期胚层的细胞群中含量高，尤其关注的是那些在定形内胚层和胚外内胚层差异表达的基因集合。这些基因及它们的相对富集情况在表1中指出。
表1
| 胚层 | 基因 | 表达范围 |
| 内胚层胚外外胚层中胚层 | SOX17MIXL1GATA4HNF3bGSCSOX7AFPSPARCTMZIC1BRACH | 定形、内脏和体壁内胚层内胚层和中胚层定形和原始内胚层定形内胚层和原始内胚层、中胚层、神经板内胚层和中胚层内脏内胚层内脏内胚层，肝体壁内胚层体壁内胚层/滋养外胚层神经管，神经前体新生中胚层 |
因为许多基因在不只一个胚层上表达，所以有必要在相同实验中定量比较多种基因的表达水平。SOX17在定形内胚层中表达，在内脏和体壁内胚层中表达要低一些。SOX7和AFP在发育早期的内脏内胚层中表达。SPARC和TM在体壁内胚层表达，Brauchyury在早期中胚层表达。
定形内胚层据预测表达高水平的SOX17 mRNA和低水平的AFP和SOX7(内脏内胚层)、SPARC(体壁内胚层)和Brachyury(中胚层)。此外，此处用ZIC1进一步排除早期外胚层的诱导。最后，GATA4和HNF3b在定形内胚层和胚外内胚层均表达，因此与SOX17在定形内胚层的表达有联系(表1)。一个代表性的实验如图11-14所示，它证明了表1描述的标志物基因在不同样品中如何相互联系，从而突出了向定形内胚层和胚外内胚层以及向中胚层和神经细胞类型的特定分化模式。
综合以上数据可以清楚得出活化素的剂量增加导致SOX17基因表达提高。而且这种SOX17表达主要代表定形内胚层而不是胚外内胚层。这个结论源自观察到SOX17基因表达与AFP、SOX7和SPARC的基因表达负相关。
实施例6
人ES细胞向定形内胚层的定向分化
如果不是在有效维持细胞未分化状态的条件下培养，人ES细胞将发生随机分化。这种异质分化产生包含体壁和内脏内胚层(表达AFP、SPARC和SOX7)的胚外内胚层细胞，以及以ZIC1和Nestin(外胚层)和Brachyury(中胚层)表达为标志的早期外胚层和中胚层衍生物。因为在ES细胞培养物中缺乏特异抗体标志物，定形内胚层细胞形态没有被检测或详细说明。同样地，由于缺乏手段，对ES细胞培养物中早期定形内胚层的产生没有进行深入研究。因为没有可用的合适的抗定形内胚层细胞的抗体试剂，大部分鉴定集中于外胚层和胚外内胚层。总的说来，在随机分化的ES细胞培养物中，胚外和神经外胚层细胞类型的数目远大于SOX17hi定形内胚层细胞的数目。
当未分化的hESC克隆在成纤维饲养层上扩增时，克隆边缘的细胞表现出与克隆内部细胞不同的另一种形态。很多这些外层细胞因为不均一、较大胞体的形态并且OCT4的表达更高所以易被区分。已有描述，当ES细胞开始分化时，OCT4的表达水平相对未分化的ES细胞上升或下降。OCT4水平上升或下降的改变如果超过未分化阈值可能表明从多能状态向分化初始阶段的转变。
当用SOX17免疫细胞化学检测未分化的克隆时，有时在未分化的hESC克隆的边缘和交界处的随机位置可发现小的含10-15个SOX17阳性细胞的细胞簇。如上所述，这些外围克隆边缘的分散细胞团可能是从经典ES细胞形态分化的第一批细胞，此时克隆尺寸增加、变得更加稠密。更早期、更小的完全未分化的克隆(＜1mm；4-5天龄)在克隆内部或边缘不含SOX17阳性细胞，而更晚期、更大的克隆(直径1-2mm，＞5天龄)在一些克隆外围或上述不显示典型hESC形态的边缘内部有零星SOX17阳性、AFP阴性细胞分布。因为这是第一次研制出有效的SOX17抗体，在早期“未分化”ES细胞培养物中产生定形内胚层细胞以前从未被证实。
因为Q-PCR确定SOX17与SPARC基因表达负相关，大部分的SOX17阳性、AFP阴性细胞将对体壁内胚层标志物的抗体共标记呈阴性反应。这在表达TM的体壁内胚层细胞得到特异证明，如图15A-B所示。与Nodal因子活化素A和B接触会减少TM表达的强度和TM阳性细胞的数目。对活化素处理的培养物用SOX17、AFP和TM抗体三重标记后，观察到AFP和TM阴性的SOX17阳性细胞簇(图16A-D)。这是首次在细胞水平上证明在分化hESC培养物中的SOX17阳性定形内胚层细胞(图16A-D和17)。
利用上述SOX17抗体和Q-PCR方法，我们设计了一些步骤，能够有效地将hESC分化为SOX17hi/AFPlo/SPARC/TMlo的定形内胚层细胞。我们采用不同的分化方法以提高这些细胞的数目和增殖能力，这通过在群水平用Q-PCR测定SOX17基因表达和在单个细胞水平用抗体标记SOX17蛋白来衡量。
我们首次分析和描述TGFβ家族生长因子(如Nodal/活化素/BMP)在体外培养物中从胚胎干细胞产生定形内胚层细胞的应用中的效果。在代表性实验中，活化素A、活化素B、BMP或这些因子的组合被添加至未分化人干细胞系hESCyt-25中以起始分化过程。
如图19所示，添加100ng/ml活化素A导致在分化到第4天时相对未分化的hESC诱导了19倍的SOX17基因表达。同时添加活化素B(活化素家族第二个成员)和活化素A导致在混合活化素处理后第4天时相对未分化hESC 37倍的诱导。最后，添加来自Nodal/活化素和BMP亚族的TGFβ家族的第三个成员BMP4，与活化素A和活化素B联用，导致相对未分化hESC增加57倍的诱导(图19)。当以活化素和BMP诱导SOX17，与无因子培养基对照比较时，第4天时出现5、10和15倍的诱导。当用活化素A、B和BMP三重处理5天后，SOX17被诱导的水平比未分化hESC高70倍。这些数据表明用高剂量和长时间的Nodal/活化素TGFβ家族成员处理会增加SOX17表达。
在体内或体外Nodal和相关分子活化素A、B和BMP促进SOX17表达和定形内胚层形成。此外，添加BMP会促进SOX17诱导表达，可能是因为进一步诱导了Nodal共受体Cripto。
我们已经证明活化素A和B与BMP4的联用导致SOX17的额外增加以及定形内胚层的形成。在活化素A和B混合物中添加BMP4较长时间(＞4天)可以在体壁和内脏内胚层及定形内胚层诱导SOX17。因此本发明的一些实施例中，在添加BMP4处理4天内有必要去除BMP4。
为了在单个细胞水平检测TGFβ因子处理的效果，用SOX17抗体标记检测了TGFβ因子添加的时程。如之前在图10A-F中所示，随时间延长SOX17标记细胞的相对数目显著增加。相对定量(图20)显示SOX17标记细胞增加超过20倍。这个结果表明细胞数目及SOX17基因表达水平随TGFβ因子暴露时间增加。如图21所示，在用Nodal，活化素A、活化素B和BMP4处理4天后，SOX17诱导水平达到未分化hESC的168倍。图22显示SOX17阳性细胞的相对数目也与剂量有关。100ng/ml活化素A或更多的剂量能够有效诱导SOX17基因表达，增加细胞数目。
除了TGFβ家族成员，Wnt家族分子也可能在定形内胚层的特异分化和/或保持中起作用。Wnt分子的使用也有利于hESC向定形内胚层的分化，与单独使用活化素相比，用活化素加Wnt3a处理后样品中SOX17基因的表达增高(图23)。
所有上述实验均使用包含10％血清和添加的因子的组织培养基。令人惊讶的是，如图24A-C所示，我们发现在添加活化素的情况下血清浓度对SOX17的表达水平有影响。当血清水平从10％降到2％时，在含有活化素A和B的条件下，SOX17的表达增加3倍。
最后，如图25A-D所示我们证明活化素诱导的SOX17+细胞在培养基中分裂。箭头显示处于有丝分裂期的SOX17/PCNA/DAPI标记的细胞，这是通过PCNA/DAPI标记的有丝分裂板模式和相差有丝分裂特征证实。
实施例7
趋化因子受体4(CXCR4)表达与定形内胚层的标志物有关，而与中胚
层、外胚层或内脏内胚层的标志物无关
如上所述，使用TGFβ家族、尤其是活化素/nodal亚族的细胞因子可诱导hESC分化为定形内胚层生殖层。此外，我们显示分化培养基的胎牛血清(FBS)水平影响hESC分化为定形内胚层的效率。这种影响是在培养基中活化素A为给定浓度下，高水平的FBS会抑制向定形内胚层的最大程度分化。如缺少外源的活化素A，hESC向定形内胚层系的分化效率非常低，FBS在hESCs分化过程中的影响也更缓和。
在这些实验中，hESC在含有0.5％、2.0％或10％FBS的RPMI培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA；cat#61870-036)中生长分化，其中添加或不添加100ng/ml活化素A培养6天。此外，在分化的前3天以0.5％-2.0％的FBS梯度与100ng/ml活化素A联用。6天后，每种培养条件收集双份样品，用实时定量PCR分析相对基因表达。剩余细胞进行固定用于SOX17蛋白的免疫荧光检测。
根据使用的7种培养条件，CXCR4的表达水平变化非常大(图26)。一般来说，活化素A处理的培养物(A100)中CXCR4表达较高，而如果不含外源活化素A(NF)则CXCR4表达较低。此外，在A100处理的培养基中，当FBS浓度最低的时候CXCR4表达最高。在10％FBS条件下CXCR4水平有显著降低，因此相对表达更加符合不含活化素A(NF)的条件。
如上所述，SOX17、GSC、MIXL1和HNF3β基因的表达与定形内胚层细胞的特征一致。7种分化条件下这4种基因的相对表达与CXCR4的一致(图27A-D)。这证明CXCR4也是定形内胚层的标志物。
根据不同标志物的表达，外胚层和中胚层系可区别于定形内胚层。早期中胚层表达Brachyury和MOX1基因，而新生神经外胚层表达SOX1和ZIC1。图28A-d证明不接受外源活化素A的培养物中更倾向于中胚层和外胚层基因的表达，而在活化素A处理的培养物中，10％FBS的条件也增加中胚层和外胚层标志物表达的水平。这些表达模式与CXCR4的相反，表明在该发育阶段分化自hESC的中胚层或外胚层的CXCR4表达不高。
在哺乳动物发育早期，也发生向胚外细胞系的分化。此处尤其相关的是内脏内胚层的分化，它与定形内胚层许多基因的表达相同，包括SOX17。为区分定形内胚层和胚外内脏内胚层，应该检测它们之间不同的标志物。SOX7代表了一种在内脏内胚层而不在定形内胚层系表达的标志物。因此，显示SOX17基因高表达而无SOX7表达的培养条件可能包含定形内胚层而不是内脏内胚层。如图28E所示，在不含活化素A的培养物中SOX7高表达，当FBS浓度为10％时即使含有活化素A，SOX7也显示表达增加。这与CXCR4的表达模式相反，表明CXCR4在内脏内胚层中表达不高。
还测定了存在于上述每种分化条件下的有SOX17免疫反应性(SOX17+)的细胞的相对数目。当hESC在高剂量活化素A和FBS低浓度(0.5％-0.2％)条件下分化时，SOX17+细胞分布于整个培养物中。当使用高剂量活化素A和10％FBS(v/v)时，SOX17+细胞出现频率降低，一般出现在孤立的细胞簇中而不是在整个培养物中平均分布(图29A和C以及B和E)。当不使用外源活化素A时SOX17+细胞数目进一步减少。在这些条件下SOX17+细胞也在细胞簇中出现，这些细胞簇比用高剂量活化素A和低浓度FBS处理得到的细胞簇更小更少(图29C和F)。这些结果证明在每种条件下CXCR4表达模式不仅对应定形内胚层基因表达，而且对应定形内胚层细胞的数目。
实施例8
富集定形内胚层的分化条件增加CXCR4阳性细胞的比例
活化素A的剂量也影响hESC向定形内胚层分化的效率。这个实施例证明增加活化素A的剂量会提高培养物中CXCR4+细胞的比例。
hESC在补加了0.5％-2％FBS(在分化前3天从0.5％增加到1.0％到2.0％)和0、10或100ng/ml活化素A的RPMI培养基中分化。分化7天后用含有2％FBS和2mM(EDTA)、不含Ca2+/Mg2+的PBS室温解离细胞5分钟。细胞用35μm尼龙筛过滤，计数并沉淀。沉淀用小体积50％人血清/50％正常驴血清重新悬浮，冰浴2分钟以封闭非特异性抗体结合位点。50μl细胞悬液(含有约105细胞)中添加1μl小鼠抗CXCR4抗体(Abcam，cat#ab10403-100)，在冰上进行标记45分钟。用5ml含有2％人血清的PBS(缓冲液)洗涤细胞，然后沉淀。用5ml缓冲液进行第二次洗涤后以每105细胞在50μl缓冲液中重新悬浮。以终浓度5μg/ml添加二抗(FITC偶联的驴抗小鼠；JacksonImmunoResearch，cat#715-096-151)，孵育30分钟，然后用上述缓冲液洗涤2次。细胞以5×106细胞/ml浓度在缓冲液中重新悬浮，在流式细胞仪中心(The Scripps Research Institute)用FACS Vantage(BecktonDickenson)进行分析和分选。细胞直接用RLT裂解缓冲液(Qiagen)收集，然后分离总RNA，用实时定量PCR分析基因表达。
当分化培养基中活化素A的剂量增加时，流式细胞仪观测到CXCR4+细胞数目显著增加(图30A-C)。CXCR4+细胞是那些落入R4门(gate)的细胞，这个门仅使用二抗作为对照来设置，对于该对照来说，0.2％的事件位于R4门。当活化素A剂量提高时，CXCR4+细胞数目的显著增加对应定形内胚层基因表达的增强(图31A-D)。
实施例9
分离富集表达定形内胚层基因的CXCR4阳性细胞并去除表达中胚层、
外胚层和内脏内胚层标志物的细胞
收集实施例8中鉴定的CXCR4+和CXCR4-细胞，分析相对基因表达，同时确定亲代细胞群的基因表达。
随活化素A剂量的增加CXCR4基因表达的相对水平显著增加(图32)。这与依赖活化素A的剂量的CXCR4+细胞的增加非常相符(图30A-C)。而且从细胞群分离CXCR4+细胞相当于分离了细胞群中几乎所有CXCR4基因表达。这证明了FACS方法收集细胞的效率。
基因表达分析显示CXCR4+细胞不仅包含大部分CXCR4基因表达，而且包含了其它定形内胚层标志物的基因表达。如图31A-D所示，相对亲代A100细胞群CXCR4+细胞进一步富集了SOX17、GSC、HNF3B和MIXL1的表达。此外，CXCR4-部分几乎不含这些定形内胚层标志物的基因表达。而且CXCR4+和CXCR4-细胞群对中胚层、外胚层和胚外内胚层显示了相反的基因表达模式。图33A-D显示相对A100亲代细胞群，CXCR4+细胞消除了Brachyury、MOX1、ZIC1和SOX7的基因表达。与低剂量或无活化素A的条件相比，A100亲代细胞群中这些标志物的表达已经较低。这些结果显示在高剂量活化素A分化条件下从hESCs分离CXCR4+细胞得到了高度富集、相当纯的定形内胚层细胞群。
实施例10
用CXCR4定量细胞群中定形内胚层细胞
为了证实如此处前面所述和2003年12月23日提交的第60/532,004号美国临时专利申请(标题为“定形内胚层”)确定细胞培养物或细胞群中定形内胚层细胞比例的方法，FACS被用来分析表达CXCR4和其它定形内胚层标志物的细胞，通过参考将该专利申请公开内容整体并入本文。
使用上述实施例中的方法，hESC被分化以产生定形内胚层。具体地，为增加正在分化的细胞培养物的产量和纯度，控制培养基中血清浓度如下：第一天0.2％FBS，第二天1.0％FBS，第3-6天2.0％FBS。FACS利用三种细胞表面表位E-钙粘蛋白(ECAD)、CXCR4和血栓调节蛋白对分化的培养物进行分类。然后用Q-PCR分析分类的细胞群以检测定形和胚外内胚层及其它细胞类型标志物的相对表达水平。从最佳分化培养物中获得的CXCR4分选的细胞，可使分离的定形内胚层细胞纯度大于98％。
表2显示了用本文所述方法分化自hESC的定形内胚层培养物的标志物分析的结果
表2定形内胚层培养物的组成
具体地，表2表明CXCR4和SOX17阳性细胞(内胚层)占细胞培养物的70％至80％。在这些表达SOX17的细胞中，少于2％表达TM(体壁内胚层)，少于1％表达AFP(内脏内胚层)。从SOX17/CXCR4阳性细胞部分去除TM阳性和AFP阳性细胞(腔壁和内脏内胚层混合物；总计3％)后，可看出大约67％-77％的细胞培养物是定形内胚层。大约10％细胞是ECAD阳性，这是hESC的标志物，大约10-20％的细胞是其它细胞类型。
我们发现与上述低血清步骤相比，通过在整个5-6天的分化步骤中保持FBS浓度≤0.5％可以提高在FACS分离前获得的分化细胞培养物中定形内胚层的纯度。但是，在整个5-6天的分化步骤中保持FBS浓度≤0.5％也导致产生的定形内胚层细胞数目减少。
用此处描述的方法产生的定形内胚层细胞在含有活化素的条件下保持和扩增，超过50天也没有观察到明显地分化。在这些情况，在培养期间SOX17、CXCR4、MIXL1、GATA4和HNF3β维持表达。此外，这些培养物中未检测到TM、SPARC、OCT4、AFP，SOX7、ZIC1和BRACH。可能这类细胞可以在培养基中维持和扩增超过50天而观察不到明显分化。
实施例11
定形内胚层细胞的其它标志物
在以下实验中，从纯化的定形内胚层和人胚胎干细胞群中分离RNA。然后在每种纯化的细胞群中用RNA的基因芯片分析检测基因表达。再用Q-PCR进一步分析在定形内胚层而不在胚胎干细胞表达的可能基因，以作为定形内胚层的标志物。
人胚胎干细胞(hESC)被维持在添加20％KnockOut血清替代物、4ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、0.1mMβ-巯基乙醇、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸和青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基中。通过在添加100ng/ml重组人活化素A、FBS和青霉素/链霉素的RPMI培养基中培养5天后hESC分化为定形内胚层。FBS浓度每天按照以下变化：0.1％(第一天)，0.2％(第二天)，2％(第3-5天)。
用FACS分离细胞获得纯化的hESC和定形内胚层细胞群，以用于基因表达分析。用SSEA4抗原(R&D Systems，cat#FAB1435P)免疫纯化hESC，用CXCR4(R&D Systems，cat#FAB170P)纯化定形内胚层。细胞用胰蛋白酶/EDTA(Invitrogen，cat#25300-054)解离，用含2％人血清的磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤，然后在100％人血清中冰浴重悬10分钟以封闭非特异性结合。向含5×106细胞的800μl人血清中添加200μl藻红蛋白偶联抗体在冰上染色30分钟。细胞用8ml PBS洗涤两次，在1ml PBS中重悬。FACS分离是在Scripps Research Institute的核心实验室用FACS Vantage(BD Bioscience)进行的。细胞直接用RLT裂解缓冲液(Qiagen)收集，然后按照使用说明书(Qiagen)用RNeasy分离RNA。
提交双份纯化的RNA给Expression Analysis(Durham，NC)，以便采用Affymetrix平台和U133 Plus 2.0高密度多核苷酸阵列产生表达谱。获得的数据是一组比较，其鉴定在hESC和定形内胚层细胞群中差异表达的基因。选择在表达水平上与hESC中相比有明显上调变化的基因作为定形内胚层最具特征性的新的候选标志物。选择的基因用上述Q-PCR检测以证实基因芯片发现的基因表达变化，并研究hESC分化过程中这些基因的表达模式。
图34A-M显示一些标志物的基因表达结果。显示了添加100ng/m1活化素A1、3和5天后分析的细胞培养物，5天分化步骤(CXDE)结束后纯化的表达CXCR4的定形内胚层细胞和纯化的hESC中的结果。图34C和G-M的比较证明六个标志物基因，FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1和CRIP1显示了几乎相同的表达模式，并且也与CXCR4的表达模式和SOX17/SOX7的比例也相似。如前所述，在定形内胚层和表达SOX7的胚外内胚层中SOX17均有表达。因为在定形内胚层SOX7不表达，根据SOX17/SOX7的比例可以可靠估计定形内胚层对整个细胞群中观察到的SOX17的表达的贡献。图G-L和图M与图C的相似性表明FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1和CRIP1可能是定形内胚层的标志物，它们在胚外内胚层细胞中表达不高。
应该了解的是此处描述的Q-PCR结果可被ICC进一步证实。
实施例12
视黄酸和FGF-10特异地在定形内胚层培养物中诱导PDX1
以下实验证明RA和FGF-10在定形内胚层细胞中诱导PDX1的表达。
人胚胎干细胞在含有或不含活化素的条件下培养4天。在第4天，向培养基中添加1μM RA和50ng/ml FGF-10。在添加RA/FGF-1048小时后，用Q-PCR定量PDX1标志物基因和对前肠内胚层非特异的其它标志物基因的表达。
用RA处理定形内胚层细胞导致PDX1基因表达的显著增加(参见图35)，但不增加内脏内胚层(SOX7、AFP)、神经的(SOX1、ZIC1)或神经元的(NFM)基因表达标志物的表达(图36A-F)。与定形内胚层中观察到的相比，在暴露于1μM RA和50ng/ml FGF-10 48小时后，PDX1基因表达水平约诱导至增加约500倍。此外，这些结果显示与那些在RA处理前未使用活化素的细胞培养物相比，活化素处理的细胞培养物中PDX1表达提高160倍，表明较高的PDX1诱导只存在于已分化为定形内胚层(SOX17)的细胞培养物中。
实施例13
与单用RA相比FGF-10提供PDX1更高表达
这个实施例显示与单独使用RA相比，RA和FGF-10联用诱导更高的PDX1表达。
如同在前面实施例中，使hESC在含或不含活化素的条件下培养4天。在第4天，细胞用下述物质之一处理：单独的1μM RA；1μM RA与FGF-4或FGF-10联用；或1μM RA与FGF-4和FGF-10联用。RA或RA/FGF处理96小时后，以Q-PCR定量PDX1、SOX7和NFM的表达。
先用活化素然后用视黄酸处理hESC培养物可诱导PDX1基因表达增加60倍。RA处理时添加FGF-4可轻微增加PDX1表达(约是单独使用RA的3倍)。但是，同时添加FGF-10和视黄酸，对PDX1的诱导比单独使用RA进一步增强60倍(见图37A)。这种非常强的PDX1诱导比未用活化素或RA/FGF处理高约1400倍。有趣的是，同时添加FGF-4和FGF-10抵消了FGF-10的有益效果，只产生了归结于FGF-4的添加的有限的PDX1增强。
与未经RA/FGF处理的细胞相比，联用RA/FGF-4或RA/FGF-10不增加与前肠内胚层无关的标志物基因表达(图37B-C)。
实施例14
视黄酸剂量影响体外前后(Anterior-Posterior，A-P)位置
进行以下实验以确定视黄酸剂量是否影响体外细胞培养物中A-P位置。
人胚胎干细胞在含或不含活化素的条件下培养4天。在第4天，培养基中添加50ng/ml FGF-10和0.04μM、0.2μM或1.0μM RA。通过Q-PCR定量PDX1标志物基因及其他前肠内胚层非特异标志物的表达。
添加不同剂量的视黄酸与50ng/ml FGF-10联用，诱导与特异的前后位置模式相关的差别基因表达模式。最高剂量的RA(1μM)优先的诱导前部内胚层标志物(HOXA3)的表达，并产生PDX1的最强增加(图38A-B)。中等剂量RA(0.2μM)诱导中肠内胚层标志物(CDX1、HOXC6)(见图38C和41E)的表达，而最低剂量RA(0.04μM)优先的诱导后肠内胚层标志物(H0XA13)(见图38D)的表达。RA剂量对神经(SOX1)或神经元(NFM)标志物的相对表达没有实质影响(见图38F-G)。这个实施例突出了在体外使用RA作为形态发生素的用途，尤其作为衍生自hESC的内胚层衍生物的形态发生素。
实施例15
B27补加物的使用增强PDX1的表达
通过使用一些因子和细胞生长/分化条件可影响定形内胚层中PDX1表达。在以下实验中，我们显示添加B27会增强定形内胚层细胞中PDX1表达。
用高剂量的活化素A(100-200ng/ml，溶于0.5-2％FBS/DMEM/F12中)处理在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养的未分化hES细胞4天，以诱导人胚胎干细胞分化为定形内胚层。无活化素A对照在没有活化素A的0.5-2％FBS/DMEM/F12中培养。第4天，细胞培养物用以下培养基处理：2％FBS中无活化素A(无)，2％血清替代物中无活化素A(SR)，或含有50ng/ml活化素A以及2μM RA和50ng/ml FGF-10的2％FBS/DMEM/F12(无，+FBS，+B27)和相似的在2％血清替代物中(SR)。B27添加物(Gibco/BRL)经1/50稀释后直接添加至2％FBS/DMEM/F12(+B27)。每点取双份细胞样品，如上分离总RNA和进行Q-PCR分析。
图39A-E显示与无血清培养的细胞相比，无血清添加物B27可进一步诱导PDX1基因表达，但不诱导前肠非特异标志物表达的增加。
实施例16
使用活化素B增强PDX1诱导
本实施例显示在体外细胞培养中活化素B增强PDX1阴性细胞向PDX1-阳性细胞的分化。
在低血清/RPMI中用高剂量活化素A(50ng/ml)处理在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养的未分化hES细胞6天，以诱导人胚胎干细胞分化为定形内胚层。FBS剂量第1天为0％，第2天0.2％，第3-6天2％。用于定形内胚层的阴性对照(NF)在不添加活化素A的2％FBS/RMPI中培养。为诱导PDX1表达，在第6天每种培养物接受含2μM视黄酸的2％FBS/RPMI。1-5天用活化素A处理的培养物中添加不同剂量组合的活化素A和活化素B或仍保持单独使用50ng/ml活化素A。无活化素A的对照培养物(NF)中不加活化素A和活化素B。这种RA/活化素处理进行3天，然后用Q-PCR检测双份细胞样品的PDX1基因表达。
图40A显示在25ng/ml(A25)或50ng/ml(A50)活化素A存在的条件下，添加剂量范围10-50ng/ml(a10、a25和a50)的活化素B比单独使用50ng/ml活化素A的培养物提高PDX1表达至少2倍。作为添加活化素B结果的PDX1增加不伴随HNF6的增加(图40B)，它是在发育的这个时间段肝及胰的标志物。这个结果表明相对于肝，分化为胰的细胞比例增加。
实施例17
使用血清剂量增强PDX1诱导
在整个分化过程中，细胞培养物的血清量影响定形内胚层细胞的PDX1表达。以下实验显示在hESC向PDX1-阴性定形内胚层的分化过程中培养物中的血清水平影响这些细胞向PDX1-阳性内胚层进一步分化过程中的PDX1表达。
在低血清/RPMI中用高剂量活化素A(100ng/ml)处理在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养的未分化hESC 5天，以诱导人胚胎干细胞分化为定形内胚层。FBS剂量第一天为0.1％、第二天0.5％、第3-5天0.5％、2％或10％。无活化素A对照(NF)接受不含活化素A的同样FBS/RMPI剂量。在第6天通过添加RA诱导PDX1表达。在6-7天，培养物在含2μM视黄酸的0.5％FBS/RPMI中培养，第8天1μM，9-11天0.2μM。在视黄酸处理期间活化素A降低到50ng/ml，无活化素A对照(NF)仍不加活化素A。
图41A显示在定形内胚层诱导的3天期间(第3、4和5天)，FBS剂量具有持续改变视黄酸处理期间诱导PDX1基因表达的能力。这不伴随ZIC1(图41B)或SOX7(图41C)基因表达模式的明显改变。
实施例18
使用条件培养基增强PDX1诱导
我们还研究了影响定形内胚层细胞PDX1表达的其它因子和生长条件。以下实验显示条件培养基对PDX1-阴性定形内胚层细胞向PDX1-阳性内胚层细胞分化的影响。
在低血清/RPMI中用高剂量活化素A(100ng/ml)处理在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养的未分化hESC 5天，以诱导人胚胎干细胞分化为定形内胚层。FBS剂量第一天为0.1％，第二天0.5％，第3-5天2％。
在活化素A处理5天后产生的定形内胚层培养物中添加RA(溶于含有25ng/ml活化素A的2％FBS/RPMI)4天以诱导向表达PDX1的内胚层的分化。前两天添加2μM RA，第3天1μM，第4天0.5μM。用于PDX1诱导的基本培养基是新鲜培养基(2A25R)或被四种不同细胞群之一条件化24小时后的培养基。条件化的培养基(CM)由小鼠胚胎成纤维细胞(MEFCM)或用以下三种条件之一分化5天的hESC产生：i)3％FBS/RPMI(CM2)，ii)活化素A(CM3)或iii)成骨蛋白4(BMP4)(CM4)。在上述相同的FBS剂量方案(0.2％、0.5％、2％)下添加活化素A或BMP4的浓度为100ng/ml。这三种不同的分化范例产生三种非常不同的人细胞群，通过它们可进行PDX1诱导培养基的条件化。不加生长因子的3％FBS(NF)产生主要由胚外内胚层、外胚层和中胚层细胞组成的异质细胞群。活化素A处理的培养物(A100)产生高比例的定形内胚层，BMP4处理的培养物(B100)主要产生滋养外胚层和一些胚外内胚层。
图42A显示在RA处理的前两天新鲜和条件培养基中PDX1诱导相同。但是，到第3天在新鲜培养基和MEF条件培养基处理中PDX1表达开始降低。分化的hESC产生的条件培养基可维持或进一步提高PDX1基因表达，与新鲜培养基相比可提高3-4倍。hESC-条件培养基维持PDX1高表达的效果在RA处理第4天进一步加强，比新鲜培养基高约6-7倍。图42B显示条件培养基处理导致大大降低的CDX1基因表达，这个基因不在表达PDX1的内胚层部分表达。这表明用来自分化的hESC培养物的条件培养基处理定形内胚层，可显著提高PDX1表达内胚层总的纯度。
图43显示PDX1基因表达对用于定形内胚层细胞的条件培养基的量呈正剂量反应。添加每个培养皿的培养基总体积为5ml，将指定体积(如图43所示)的条件培养基稀释到新鲜培养基中(A25R)。应当注意在4ml新鲜培养基中仅添加1ml条件培养基就可诱导和保持比单用5ml新鲜培养基更高的PDX1表达水平。这表明条件培养基诱导PDX1表达内胚层的有益效果依赖于某种或某些细胞的物质在条件培养基中的释放，这种或这些物质剂量依赖地增强PDX1表达内胚层的产生。
实施例19
结合PDX1的抗体的证实
与PDX1结合的抗体是监控细胞群中PDX1表达的诱导的有用工具。本实施例表明PDX1的兔多克隆抗体和IgY抗体可用于检测该蛋白的存在。
在第一个实验中，Western印迹分析证实IgY抗-PDX1(IgY α-PDX1)抗体与细胞裂解物中的PDX1结合。在本分析中，比较了IgY α-PDX1抗体与50μg来自MDX12人成纤维细胞或转染PDX1表达载体24小时后的MDX12细胞的总细胞裂解物的结合。细胞裂解物用SDS-PAGE分离，通过电印迹转到膜上，以IgY α-PDX1一抗抗血清及随后的碱性磷酸酶偶联的兔抗-IgY(Rb α-IgY)二抗探查。不同稀释度的一抗和二抗按下述组合用于单独的条状膜：A(500x稀释的一抗，10,000x稀释的二抗)，B(2,000x，10,000x)，C(500x，40,000x)，D(2,000x，40,000)，E(8,000x，40,000x)。
在所有测试的抗体组合中，转染PDX1表达载体的细胞检出结合。在未转染(PDX1-阴性)的成纤维细胞中只在同时使用最高浓度的一抗和二抗(组合A)时才观察到结合。这是非特异性结合，因为在转染和未转染的成纤维细胞中均检测到分子量略大于PDX1的额外条带。
在第二个实验中，用免疫细胞化学测试兔抗-PDX1(Rb α-PDX1)多克隆抗体与PDX1的结合。为给本实验产生PDX1表达细胞，MS1-V细胞(ATCC # CRL-2460)被瞬时转染PDX1-EGFP表达载体(用pEGFP-N1构建，Clontech)。转染的细胞然后用Rb α-PDX1和α-EGFP抗血清标记。用EGFP荧光以及使用Cy5偶联的二抗的α-EGFP免疫细胞化学均观察到转染的细胞。使用α-Rb Cy3-偶联的二抗观察到PDX1免疫荧光。
Rb α-PDX1和α-EGFP抗体的结合与GPF表达共定位。
实施例20
人胰组织的免疫细胞化学
本实施例表明PDX1特异抗体可用于通过免疫细胞化学鉴定人PDX1-阳性细胞。
在第一实验中，对石蜡包埋的人胰切片进行染色以检测胰岛素，通过先1/200稀释的豚鼠抗胰岛素(Gp α-Ins)一抗，然后1/100稀释的Cy2偶联的狗抗豚鼠(D α-Gp)二抗进行。在第二实验中，对相同的石蜡包埋的人胰切片染色以检测PDX1，通过先1/4000稀释的IgYα-PDX1一抗，然后用1/300稀释的AF555偶联的Rb α-IgY二抗进行。将从第一和第二实验中收集的图片进行整合。在第三实验中，经IgYα-PDX1染色的细胞也用DAPI染色。
对人胰切片的分析揭示朗格汉斯胰岛强染色的存在。尽管胰岛(胰岛素阳性)显示最强的PDX1信号，腺泡组织(胰岛素阴性)也见到弱染色。DAPI和PDX1共染色显示PDX1主要但不是完全定位于核。
实施例21
经视黄酸处理的细胞的PDX1免疫沉淀
为进一步证实已在RA存在下分化的定形内胚层细胞中存在PDX1表达，以及未在RA条件下分化的定形内胚层细胞无PDX1表达，用兔抗-PDX1(Rb α-PDX1)的抗体免疫沉淀来自RA分化的和未分化的定形内胚层细胞的PDX1。使用IgY α-PDX1抗体通过Western印迹分析检测免疫沉淀的RA。
为获得用于免疫沉淀的未分化和分化的定形内胚层细胞裂解物，用含100ng/ml活化素A的低血清处理hESC5天(定形内胚层)，然后以50ng/ml活化素A和2μM全反式RA处理2天，1μM 1天，0.2μM1天(PDX1-阳性前肠内胚层)。制备转染了PDX1表达载体的MS1-V细胞(ATCC # CRL-2460)的细胞裂解物作为阳性对照。向每一裂解物中添加Rb α-PDX1和兔特异性二抗以免疫沉淀PDX1。离心收集沉淀。免疫沉淀物溶于含SDS的缓冲液中，随后上样于聚丙烯酰胺凝胶。经分离，通过电印迹将蛋白转到膜上，用IgY α-PDX1一抗和随后的标记的Rb α-IgY二抗探查。
收集自MS1-V阳性对照细胞及第8天(d8泳道，开始RA处理后3天)和第9天(d9泳道，开始RA处理后4天)的细胞的免疫沉淀物为PDX1蛋白阳性(图44)。来自未分化的定形内胚层细胞(即活化素A处理第5天的细胞-图44中标为(A))和未分化的hESC(即未经处理的第5天的细胞-图44中标为(NF))的沉淀物对PDX1显示阴性。
实施例22
PDX1启动子-EGFP转基因hESC系的产生
为使用PDX1标志物分离细胞，我们用可表达的报告基因遗传标记PDX1-阳性前肠内胚层细胞。本实施例描述包含报告盒的载体的构建，该报告盒包括受PDX1调节区控制的报告基因。本实施例还描述了制备转染了这种载体的诸如人胚胎干细胞的细胞以及该报告盒整合到其基因组的细胞。
通过使GFP报告基因置于PDX1基因调节区(启动子)的控制下，构建了用报告基因遗传标记的表达PDX1的定形内胚层细胞系。首先，用人PDX1控制区(Genebank登录号AF192496，其公开内容通过引用整体并入本文)替换pEGFP-N1(Clontech)载体的CMV启动子，产生其中EGFP表达由人PDX1基因启动子驱动的质粒载体，所述人PDX1控制区包含从PDX1转录起始位点上游约4.4千碱基对(kb)到下游约85碱基对(bp)的核苷酸序列。这个区域包括PDX1基因的特征性调控元件，足以在转基因小鼠中显示正常的PDX1表达模式。在构建的载体中，PDX1启动子驱动EFGP表达。在一些实验中，这个载体被转染进hESC。
从以上载体切除PDX1启动子/EGFP盒，亚克隆入包括受磷酸甘油酸激酶-1启动子控制的新霉素磷酸转移酶基因的选择载体。所述选择盒侧翼连接flp重组酶识别位点，以去除该盒。使这个选择载体线性化，然后用标准脂转染方法导入hESC。G418选择10天-14天后，分离扩增未分化的转基因hESC克隆。
实施例23
PDX1-阳性前肠内胚层的分离
以下实施例证明包含PDX1启动子/EGFP盒的hESC能够分化为PDX1-阳性内胚层细胞，然后用荧光激活细胞分选术(FACS)分离。
PDX1启动子/EGFP转基因hESC在含活化素A的培养基中分化5天，然后在含活化素A和RA的培养基中分化2天。分化的细胞随后用胰酶消化收获，在Becton Dickinson FACS Diva分选后直接加到RNA裂解缓冲液或PBS中。取出单一活细胞样品，而不以EGFP(Live)圈选(gating)，以及单一活细胞圈选进EGFP阳性(GFP)群和GFP阴性(Neg)群。在一种实验中，根据荧光强度(Hi和Lo)将EGFP阳性部分分到两个相同大小的群中。
分选后，用Q-PCR和免疫细胞化学分析细胞群。用Qiagen RNeasy柱制备RNA然后转为cDNA用于Q-PCR分析。Q-PCR按前述方法进行。为进行免疫细胞化学分析，细胞分选后加到PBS中，在4％多聚甲醛中固定10分钟，用细胞离心涂片器离心使细胞黏附于载玻片。细胞角蛋白19(KRT19)的一抗来自Chemicon；肝细胞核因子3β(HNF3β)的一抗来自Santa Cruz；葡萄糖转运蛋白2(GLUT2)来自R&D系统。使用合适的偶联FITC(绿色)或罗丹明(红色)的二抗检测一抗的结合。
分化细胞的代表性FACS分选如图45所示。这个实施例中分离的PDX1-阳性细胞比例约为7％，其根据分化效率在约1％-约20％之间变化。
分选的细胞进一步用于Q-PCR分析。分化的细胞表明EGFP荧光与内源PDX1基因表达有关。与无荧光细胞相比，EGFP阳性细胞的PDX1表达水平增加20倍以上(图46)。高和低EGFP强度细胞的分离表明EGFP表达水平与PDX1表达水平相关(图47)。除了PDX1标志物分析，在分选的细胞中利用Q-PCR分析几种在胰内胚层表达的基因。这些标志物基因(NKX2.2、GLUT2、KRT19、HNF4α和HNF3β)的每一种的产物在EGFP阳性部分均得到富集(图48A-图48E)。相反地，神经标志物ZIC1和GFAP在分选的EGFP表达细胞中不富集(图49A和图49B)。
使用免疫细胞化学可看出，实际上所有分离的PDX1-阳性细胞都表达KRT19和GLUT2。对于胰内胚层系细胞，预期了该结果。经抗体染色许多这种细胞也是HNF3β阳性的。
实施例24
产生PDX1-阳性背侧和腹侧前肠内胚层
本实施例描述PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层的产生以及PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层的产生。
采用3天或5天方案从未分化hESC产生定形内胚层，其中每天向培养基提供浓度100ng/ml的活化素A。对于背侧和腹侧分化，用于第一个5天的培养基组合物如下：第1天-RPMI+0％胎牛血清(FBS)，第2天-RPMI+0.2％FBS，第3天-RPMI+2.0％FBS，第4天-RPMI+2.0％FBS，第5天-RPMI+2.0％FBS。对于腹侧分化，持续3天在100ng/ml活化素A下产生定形内胚层，然后与3ng/ml的BMP4和50ng/ml的FGF10接触。BMP4/FGF10的添加在第一个2天是在RPMI+2％FBS中进行，然后在含有B27补加物(1份B27对应200份培养基，体积比-(1∶200))(Invitrogen，Carlsbad，CA)的Connaught MedicalResearch Labs(CMRL)培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)(参见，ParkerR.C.，et al.1957.N.Y.Academy of Sciences 5：303，通过参考将其公开内容整体并入本文)中进行。对于背侧分化过程，持续5天在100ng/ml活化素A中产生定形内胚层，然后在含有B27补加物(1∶200)的CMRL培养基中与2μM视黄酸(RA)和25ng/ml活化素A接触。
在基于RA的背侧分化过程中，对PDX1有强诱导作用并维持了HB9表达，没有诱导HHEX或白蛋白的表达，它们是腹侧肝标志物(图50A-图50D)。在不使用RA而是使用FGF10和BMP的腹侧分化方案中，也强烈诱导了PDX1基因表达。与RA处理相比，没有维持HB9(背侧内胚层标志物)表达，并且如白蛋白和HHEX的腹侧肝标志物与PDX1一起被强烈诱导(图50A-图50D)。这些数据表明，在RA存在下，前肠PDX1表达内胚层无肝(腹侧器官)标志物，并且表达背侧标志物如HB9。在不存在RA时，PDX1的表达不伴随有高HB9表达水平。此外，由于肝专一地衍生自腹侧内胚层，如白蛋白和HHEX的传统肝标志物的表达表明定形内胚层优选进行腹侧分化程序。
实施例25
PDX1-阳性腹侧前肠内胚层细胞的产生依赖于定形内胚层形成。
本实施例描述了从包含不同量定形内胚层细胞的培养物产生PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层。不含定形内胚层的培养物显示很少地产生PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层。随着定形内胚层细胞的起始量增加，偏腹侧的前肠内胚层的产生也增加。
将四种单独的条件用于处理hESC，其导致向定形内胚层不同比例的分化。所有四种条件都利用了RPMI，其在第1天补加0％FBS，第二天补加0.2％FBS，第3和4天补加2％FBS。四种条件如下：(a)BMP4100ng/mL，SU5402 5μM；(b)无外源生长因子；(c)活化素A15ng/mL；以及(d)活化素A 100ng/ml。在前4天分化后，所产生的定形内胚层的相对水平通过cerberus(CER)和SOX17表达水平指示，这样，在条件(a)下基本上没有定形内胚层，在条件(b)下有最低量的定形内胚层，在条件(c)下存在定形内胚层，在条件(d)下大量存在定形内胚层。然后将所有的培养物都在含2％FBS的RPMI的基础培养基中与3ng/mL BMP4、50ng/ml FGF10以及0.5μM KAAD-环杷明孵育2天，接着在由含有1∶200稀释的B27提取物的CMRL组成的基础培养基中与3ng/mL BMP4、50ng/ml FGF10以及0.5μM KAAD-环杷明孵育6天。
在SU5402和BMP4存在时，即在通过缺乏CER和SOX 17基因表达(图51A和51B)而证实的无定形内胚层产生的条件下，在经BMP4/FGF10(腹侧内胚层条件)处理后没有PDX1或白蛋白基因表达的诱导(图51C和51D)。类似地，对于无生长因子条件(条件(b))也是如此，其中如低水平的CER和SOX17(图51A和51B)所指示的，形成非常最低水平的无定形内胚层。尽管PDX1和白蛋白基因表达在无生长因子条件下非常低(图51C和51D)，但是基因表达量显著高于条件(a)所产生的。经中(15ng/ml)和高(100ng/ml)剂量活化素A处理的hESC产生有力的定形内胚层分化，这由高SOX17基因表达水平指出(图51B)。如通过非常高的CER表达水平所指出的，高剂量活化素处理产生主要具有前部特征的定形内胚层。如通过高水平PDX1和白蛋白基因表达所指出的，条件(c)和条件(d)处理都显示了有力的腹侧内胚层分化(图51C和51D)。PDX1和白蛋白表达水平在最前部内胚层中最高，因为前部内胚层保留了分化为较后部内胚层命运的能力，而后部内胚层细胞失去了获得较前部命运的能力。这些数据强有力的指出腹侧PDX1表达前肠内胚层和肝的产生依赖于有效地产生定形内胚层。
实施例26
BMP4不是PDX1-阳性腹侧前肠内胚层必需的
本实施例描述不存在BMP4时产生PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层。
通过使未分化的hESC暴露于溶于RPMI基础培养基的100ng/mL活化素而产生定形内胚层，该基础培养基在第1至3天分别补加0％的FBS、0.2％的FBS、和2％的FBS。在3天的活化素A处理后，将所述培养物转换至由含有2％FBS的RPMI组成的基础培养基并在如下条件之一下维持：(a)BMP4，3ng/ml，FGF10，50ng/ml以及KAAD-环杷明，0.5μM；(b)FGF10，50ng/ml和KAAD-环杷明，0.5μM；或(c-e)无外源因子。两天后，将基础培养基换为添加了B27补加物的CMRL(1∶200)，并根据以上条件(a-c)维持细胞。或者，无外源因子下在含有B27补加物的RPMI(1∶200)中(条件(d))或含有2％FBS的RPMI中(条件(e))维持细胞。保持相同的因子处理条件用于再分化8天。
如不存在BMP4时对PDX1和白蛋白表达的有力诱导所指示的(图52A和52B)，BMP4不是产生PDX1-阳性腹侧前肠的或肝的内胚层细胞所需的。BMP4的添加看起来对于产生PDX1-阳性腹侧前肠内胚层作用较小，但是向FGF10和KAAD-环杷明处理添加BMP4不减少腹侧前肠肝内胚层基因表达(图52A和52B)。不存在添加的因子时(条件(c))，使用含有B27补加物的CMRL有一定能力诱导PDX1表达，而含有B27的RPMI(条件(d))和含有2％FBS的RPMI(条件(e))没有显示出对PDX1表达的任何诱导(图52A)。基础培养基对肝基因表达的诱导没有显示显著作用。总之，FGF10和KAAD-环杷明足以产生PDX1-阳性腹侧前肠内胚层。
实施例27
鉴定PDX1-阳性背侧和腹侧前肠内胚层的标志物
本实施例描述了可用于PDX1-阳性背侧和腹侧前肠内胚层的鉴定、检测、富集、分离、纯化、靶向和/或证实等的标志物。
对如实施例24中所描述的经分化的细胞培养物进行基因芯片分析，以便整体上监测发生在hESC分化为定形内胚层以及进一步至更成熟的背侧和腹侧内胚层表型过程中的基因表达动态。在实施例24中所指出的时间分离双份样品。采用Affymetrix U 133 plus 2.0高密度寡核苷酸阵列通过表达分析(Durham，NC)，根据其内部标准操作程序确定基因表达谱。通过人工检验以及通过层级聚类分析，我们评估了跨这7种条件/时间点的基因表达模式。我们寻找匹配PDX1表达(背侧和腹侧)的暂时模式的基因表达模式，以发现在腹侧和背侧分化范例中都表达的新基因。
所提供的基因在表达模式方面与PDX1有显著相似性，因此可以在表达PDX1的前肠内胚层细胞中共表达。列在表3中的基因在背侧和腹侧PDX1分化中都表达。表4中的基因为偏背侧的并优先在背侧PDX1模式中表达。
表3列出了39种标志物，它们在背侧和腹侧PDX1-阳性前肠内胚层中表达。第1列提供了每一标志物的公知基因符号。第2至4列分别提供了Unigene、位点链接、和OMIM登录号。第5列描述了包括第1列中描述的标志物的核酸序列的Genebank登录号。最后，第6列提供了对所列遗传标志物编码的多肽标志物的功能性活性的描述。
应理解，本领域普通技术人员可利用列在表3中的登录号来检索关于表中所描述的每一序列的特异信息，所述信息包括每一这些标志物的一级核酸序列和一级多肽序列。
图53A-图53E进一步说明了PDX1和选自表3的标志物之间的表达谱共性。尤其是，图53A-图53E提供了该实验中监测的跨7种条件/时间的显示出与PDX1的基因表达模式几乎一致的基因表达模式的基因实例。这种程度相似性的模式识别最有可能反映了这些基因在表达PDX1的相同细胞中的共表达，因而使得这些标志物为背侧和腹侧内胚层来源的PDX1-阳性前肠内胚层的极好的新候选标志物。
表4列出了特异和/或优先在背侧PDX1阳性前肠内胚层中表达的50种标志物。第1列提供了每一标志物的公知基因符号。第2至4列分别提供了Unigene、位点链接、和OMIM登录号。第5列描述了包括第1列中描述的标志物的核酸序列的Genebank登录号。最后，第6列提供了对所列遗传标志物编码的多肽标志物的功能性活性的描述。
应理解，本领域普通技术人员可利用列在表4中的登录号来检索关于表中所描述的每一序列的特异信息，所述信息包括每一这些标志物的一级核酸序列和一级多肽序列。
图54A-图54D提供了基因实例，它们显示出的基因表达模式指出了在背侧内胚层条件下(RA处理)的特异(HOXA1和PDE11A)或优先(FAM49A和WNT5A)表达。这些标志物为鉴定PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层的新候选基因。
实施例28
PDX1-阴性前肠内胚层的产生
本实施例描述了PDX1-阴性前肠内胚层的产生
通过2步骤方案将人胚胎干细胞分化7天，以获得PDX1细胞。该第一步包括在活化素A(100ng/ml)中分化5天，以有力地产生DE(D′Amour，K.，et al.，Nature Biotechnology 23，1534-1541，(2005))。步骤2包括在含有2％FBS以及FGF10(50ng/ml)和KAAD-环杷明(0.5μM)的新鲜RPMI中分化2天。
与KAAD-环杷明(0.1μM-2μM，sonic hedgehog(音猬蛋白)抑制剂)的添加一起添加FGF10(5ng/ml-500ng/ml)是有益的，其进一步指定定形内胚层细胞成为前肠内胚层结构域。
本文描述的方法、组合物和装置是目前优选实施方案的代表，起示范作用，不是为了限制本发明的范围。本领域技术人员可以作出包括在本发明的精神内并通过本公开内容的范围定义的对本文的改变和其它用途。相应地，对本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的范围和精神下，可对本文公开的发明作出各种替换和修改。
用在所附权利要求书和整个公开内容中的短语“本质上由...组成”的含义是包括该短语后所列的任意要素并限于对所列要素的公开内容所指的活性或作用不起干扰或促成作用的其他要素。因此，短语“本质上由...组成”表明所列要素是必需或强制的，但其它要素是可选的，它们的存在与否依赖于其是否影响所列要素的活性或作用。
参考文献
本专利申请引用了大量文献和专利。通过参考将本专利申请中引用的每篇文献都整体并入本文。
文中给出了一些文献的完整引用，其它文献引用时只列出了作者和年代，其完整引用如下：
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序列表
<110>赛瑟拉公司(CYTHERA，Inc.)
凯文·艾伦·达穆尔(D’Amour，Kevin Allen)
艾伦·D·阿古尼克(Agulnick，Alan D.)
苏珊·埃利泽(Eliazer，Susan)
伊曼纽尔·E·贝特格(Baetge，Emmanuel E.)
<120>表达PDX1的背侧和腹侧前肠内胚层
<130>CYTHERA.052VPC
<160>2
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>1245
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>1
atgagcagcc cggatgcggg atacgccagt gacgaccaga gccagaccca gagcgcgctg 60
cccgcggtga tggccgggct gggcccctgc ccctgggccg agtcgctgag ccccatcggg 120
gacatgaagg tgaagggcga ggcgccggcg aacagcggag caccggccgg ggccgcgggc 180
cgagccaagg gcgagtcccg tatccggcgg ccgatgaacg ctttcatggt gtgggctaag 240
gacgagcgca agcggctggc gcagcagaat ccagacctgc acaacgccga gttgagcaag 300
atgctgggca agtcgtggaa ggcgctgacg ctggcggaga agcggccctt cgtggaggag 360
gcagagcggc tgcgcgtgca gcacatgcag gaccacccca actacaagta ccggccgcgg 420
cggcgcaagc aggtgaagcg gctgaagcgg gtggagggcg gcttcctgca cggcctggct 480
gagccgcagg cggccgcgct gggccccgag ggcggccgcg tggccatgga cggcctgggc 540
ctccagttcc ccgagcaggg cttccccgcc ggcccgccgc tgctgcctcc gcacatgggc 600
ggccactacc gcgactgcca gagtctgggc gcgcctccgc tcgacggcta cccgttgccc 660
acgcccgaca cgtccccgct ggacggcgtg gaccccgacc cggctttctt cgccgccccg 720
atgcccgggg actgcccggc ggccggcacc tacagctacg cgcaggtctc ggactacgct 780
ggccccccgg agcctcccgc cggtcccatg cacccccgac tcggcccaga gcccgcgggt 840
ccctcgattc cgggcctcct ggcgccaccc agcgcccttc acgtgtacta cggcgcgatg 900
ggctcgcccg gggcgggcgg cgggcgcggc ttccagatgc agccgcaaca ccagcaccag 960
caccagcacc agcaccaccc cccgggcccc ggacagccgt cgccccctcc ggaggcactg 1020
ccctgccggg acggcacgga ccccagtcag cccgccgagc tcctcgggga ggtggaccgc 1080
acggaatttg aacagtatct gcacttcgtg tgcaagcctg agatgggcct cccctaccag 1140
gggcatgact ccggtgtgaa tctccccgac agccacgggg ccatttcctc ggtggtgtcc 1200
gacgccagct ccgcggtata ttactgcaac tatcctgacg tgtga 1245
<210>2
<211>414
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>2
Met Ser Ser Pro Asp Ala Gly Tyr Ala Ser Asp Asp Gln Ser Gln Thr
1 5 10 15
Gln Ser Ala Leu Pro Ala Val Met Ala Gly Leu Gly Pro Cys Pro Trp
20 25 30
Ala Glu Ser Leu Ser Pro Ile Gly Asp Met Lys Val Lys Gly Glu Ala
35 40 45
Pro Ala Asn Ser Gly Ala Pro Ala Gly Ala Ala Gly Arg Ala Lys Gly
50 55 60
Glu Ser Arg Ile Arg Arg Pro Met Asn Ala Phe Met Val Trp Ala Lys
65 70 75 80
Asp Glu Arg Lys Arg Leu Ala Gln Gln Asn Pro Asp Leu His Asn Ala
85 90 95
Glu Leu Ser Lys Met Leu Gly Lys Ser Trp Lys Ala Leu Thr Leu Ala
100 105 110
Glu Lys Arg Pro Phe Val Glu Glu Ala Glu Arg Leu Arg Val Gln His
115 120 125
Met Gln Asp His Pro Asn Tyr Lys Tyr Arg Pro Arg Arg Arg Lys Gln
130 135 140
Val Lys Arg Leu Lys Arg Val Glu Gly Gly Phe Leu His Gly Leu Ala
145 150 155 160
Glu Pro Gln Ala Ala Ala Leu Gly Pro Glu Gly Gly Arg Val Ala Met
165 170 175
Asp Gly Leu Gly Leu Gln Phe Pro Glu Gln Gly Phe Pro Ala Gly Pro
180 185 190
Pro Leu Leu Pro Pro His Met Gly Gly His Tyr Arg Asp Cys Gln Ser
195 200 205
Leu Gly Ala Pro Pro Leu Asp Gly Tyr Pro Leu Pro Thr Pro Asp Thr
210 215 220
Ser Pro Leu Asp Gly Val Asp Pro Asp Pro Ala Phe Phe Ala Ala Pro
225 230 235 240
Met Pro Gly Asp Cys Pro Ala Ala Gly Thr Tyr Ser Tyr Ala Gln Val
245 250 255
Ser Asp Tyr Ala Gly Pro Pro Glu Pro Pro Ala Gly Pro Met His Pro
260 265 270
Arg Leu Gly Pro Glu Pro Ala Gly Pro Ser Ile Pro Gly Leu Leu Ala
275 280 285
Pro Pro Ser Ala Leu His Val Tyr Tyr Gly Ala Met Gly Ser Pro Gly
290 295 300
Ala Gly Gly Gly Arg Gly Phe Gln Met Gln Pro Gln His Gln His Gln
305 310 315 320
His Gln His Gln His His Pro Pro Gly Pro Gly Gln Pro Ser Pro Pro
325 330 335
Pro Glu Ala Leu Pro Cys Arg Asp Gly Thr Asp Pro Ser Gln Pro Ala
340 345 350
Glu Leu Leu Gly Glu Val Asp Arg Thr Glu Phe Glu Gln Tyr Leu His
355 360 365
Phe Val Cys Lys Pro Glu Met Gly Leu Pro Tyr Gln Gly His Asp Ser
370 375 380
Gly Val Asn Leu Pro Asp Ser His Gly Ala Ile Ser Ser Val Val Ser
385 390 395 400
Asp Ala Ser Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Tyr Pro Asp Val
405 410
Claims (171)
1.包含人细胞的细胞培养物，其中至少约26％的所述人细胞是表达至少一种选自CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2、SLC27A2、SERPINF2、DUSP9、CDH6和SOX9的标志物的胰-十二指肠同源框因子-1(PDX1)阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞，所述PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞是能够分化为背胰芽细胞的多潜能细胞。
2.如权利要求1所述的细胞培养物，其中所述标志物选自SERPINF2、DUSP9、CDH6和SOX9。
3.如权利要求1所述的细胞培养物，其中所述标志物为细胞表面标志物，其选自CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2和SLC27A2。
4.如权利要求1所述的细胞培养物，其中所述PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞表达至少一种选自ADORA2A、CD47、EPB41L1、MAG、SFRP5、SLC16A10、SLC16A2、SLC1A3、SLC30A4、SLICK、SLITRK4、XPR1、HOXA1、PDE11A、FAM49A和WNT5A的标志物。
5.如权利要求4所述的细胞培养物，其中所述标志物选自HOXA1、PDE11A、FAM49A和WNT5A。
6.如权利要求4所述的细胞培养物，其中所述标志物为细胞表明标志物，其选自ADORA2A、CD47、EPB41L1、MAG、SFRP5、SLC16A10、SLC16A2、SLC1A3、SLC30A4、SLICK、SLITRK4和XPR1。
7.如权利要求1所述的细胞培养物，其中所述人细胞的至少约30％为PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞。
8.如权利要求1所述的细胞培养物，其中所述人细胞的至少约40％为PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞。
9.如权利要求1所述的细胞培养物，其中所述人细胞的至少约50％为PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞。
10.如权利要求1所述的细胞培养物，其中所述人细胞的至少约60％为PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞。
11.如权利要求1所述的细胞培养物，其中所述人细胞的至少约75％为PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞。
12.如权利要求1所述的细胞培养物，其中在所述培养物中存在人饲养细胞，并且除了所述人饲养细胞外至少约2％的人细胞为PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞。
13.如权利要求1所述的细胞培养物，其中在所述PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞中PDX1的表达高于选自α-胎蛋白(AFP)、SOX7、SOX1、ZIC1和NFM的标志物的表达。
14.如权利要求1所述的细胞培养物，其中所述细胞培养物基本不含选自内脏内胚层细胞、体壁内胚层细胞和神经细胞的细胞。
15.如权利要求1所述的细胞培养物，还包含类视黄醇。
16.如权利要求15所述的细胞培养物，其中所述类视黄醇为视黄酸(RA)。
17.如权利要求16所述的细胞培养物，还包含B27。
18.包含人细胞的细胞培养物，其中至少约2％的所述人细胞是表达至少一种选自CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2、SLC27A2、SERPINF2、DUSP9、CDH6和SOX9的标志物的胰-十二指肠同源框因子-1(PDX1)阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞，所述PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞是能够分化为腹胰芽细胞的多潜能细胞。
19.如权利要求18所述的细胞培养物，其中所述标志物选自SERPINF2、DUSP9、CDH6和SOX9。
20.如权利要求18所述的细胞培养物，其中所述标志物为细胞表面标志物，其选自CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2和SLC27A2。
21.如权利要求18所述的细胞培养物，其中所述PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞不大量表达一种或多种选自ADORA2A、CD47、EPB41L1、MAG、SFRP5、SLC16A10、SLC16A2、SLC1A3、SLC30A4、SLICK、SLITRK4、XPR1、HOXA1、PDE11A、FAM49A和WNT5A的标志物。
22.如权利要求18所述的细胞培养物，其中所述人细胞的至少约5％为PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞。
23.如权利要求18所述的细胞培养物，其中所述人细胞的至少约10％为PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞。
24.如权利要求18所述的细胞培养物，其中所述人细胞的至少约25％为PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞。
25.如权利要求18所述的细胞培养物，其中所述人细胞的至少约50％为PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞。
26.如权利要求18所述的细胞培养物，其中所述人细胞的至少约75％为PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞。
27.如权利要求18所述的细胞培养物，其中在所述培养物中存在人饲养细胞，并且除了所述人饲养细胞外至少约2％的人细胞为PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞。
28.如权利要求18所述的细胞培养物，其中在所述PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞中PDX1的表达高于选自α-胎蛋白(AFP)、SOX7、SOX1、ZIC1和NFM的标志物的表达。
29.如权利要求18所述的细胞培养物，其中所述细胞培养物基本不含选自内脏内胚层细胞、体壁内胚层细胞和神经细胞的细胞。
30.如权利要求18所述的细胞培养物，还包含类视黄醇。
31.如权利要求30所述的细胞培养物，其中所述类视黄醇为视黄酸(RA)。
32.如权利要求31所述的细胞培养物，还包含B27。
33.包含细胞的细胞群，其中所述细胞的至少约90％为表达至少一种选自CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2、SLC27A2、SERPINF2、DUSP9、CDH6和SOX9的标志物的人PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞，所述PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞是能够分化为背胰芽细胞的多潜能细胞。
34.如权利要求33所述的细胞群，其中所述标志物选自SERPINF2、DUSP9、CDH6和SOX9。
35.如权利要求33所述的细胞群，其中所述标志物为细胞表面标志物，其选自CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2和SLC27A2。
36.权利要求33所述的细胞群，其中所述PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞表达至少一种选自ADORA2A、CD47、EPB41L1、MAG、SFRP5、SLC16A10、SLC16A2、SLC1A3、SLC30A4、SLICK、SLITRK4、XPR1、HOXA1、PDE11A、FAM49A和WNT5A的标志物。
37.如权利要求36所述的细胞群，其中所述标志物选自HOXA1、PDE11A、FAM49A和WNT5A。
38.如权利要求36所述的细胞群，其中所述标志物为细胞表面标志物，其选自ADORA2A、CD47、EPB41L1、MAG、SFRP5、SLC16A10、SLC16A2、SLC1A3、SLC30A4、SLICK、SLITRK4和XPR1。
39.如权利要求33所述的细胞群，其中所述细胞的至少约95％为PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞。
40.如权利要求33所述的细胞群，其中所述细胞的至少约98％为PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞。
41.如权利要求33所述的细胞群，其中所述PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞中PDX1的表达高于选自AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和NFM的标志物的表达。
42.包含细胞的细胞群，其中所述细胞的至少约90％为表达至少一种选自CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2、SLC27A2、SERPINF2、DUSP9、CDH6和SOX9的标志物的人PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞，所述PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞是能够分化为腹胰芽细胞的多潜能细胞。
43.如权利要求42所述的细胞群，其中所述标志物选自SERPINF2、DUSP9、CDH6和SOX9。
44.如权利要求42所述的细胞群，其中所述标志物为细胞表面标志物，选自CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2和SLC27A2。
45.如权利要求42所述的细胞群，其中所述PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞不大量表达一种或多种选自ADORA2A、CD47、EPB41L1、MAG、SFRP5、SLC16A10、SLC16A2、SLC1A3、SLC30A4、SLICK、SLITRK4、XPR1、HOXA1、PDE11A、FAM49A和WNT5A的标志物。
46.如权利要求42所述的细胞群，其中所述细胞的至少约95％为PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞。
47.如权利要求42所述的细胞群，其中所述细胞的至少约98％为PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞。
48.如权利要求42所述的细胞群，其中所述PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞中PDX1的表达高于选自AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和NFM的标志物的表达。
49.产生PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
获得包含PDX1-阴性定形内胚层细胞的细胞群；以及
向所述细胞群提供足够量的类视黄醇以促进所述PDX1-阴性定形内胚层细胞群的至少约26％分化为表达至少一种选自CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2、SLC27A2、SERPINF2、DUSP9、CDH6和SOX9的标志物的PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞，其中所述PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞为能够分化为背胰芽细胞的多潜能细胞。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞还表达至少一种选自ADORA2A、CD47、EPB41L1、MAG、SFRP5、SLC16A10、SLC16A2、SLC1A3、SLC30A4、SLICK、SLITRK4、XPR1、HOXA1、PDE11A、FAM49A和WNT5A的标志物。
51.如权利要求50所述的方法，还包括允许足够时间让PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞形成的步骤，其中所述用于PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞形成的足够时间通过检测所述细胞群中偏背侧前肠内胚层细胞中选自ADORA2A、CD47、EPB41L1、MAG、SFRP5、SLC16A10、SLC16A2、SLC1A3、SLC30A4、SLICK、SLITRK4、XPR1、HOXA1、PDE11A、FAM49A和WNT5A的标志物的存在来确定。
52.如权利要求50所述的方法，其中所述选自CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2、SLC27A2、SERPINF2、DUSP9、CDH6和SOX9的标志物或选自ADORA2A、CD47、EPB41L1、MAG、SFRP5、SLC16A10、SLC16A2、SLC1A3、SLC30A4、SLICK、SLITRK4、XPR1、HOXA1、PDE11A、FAM49A和WNT5A的标志物的表达通过定量聚合酶链式反应(Q-PCR)测定。
53.如权利要求50所述的方法，其中所述选自CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2、SLC27A2、SERPINF2、DUSP9、CDH6和SOX9或ADORA2A、CD47、EPB41L1、MAG、SFRP5、SLC16A10、SLC16A2、SLC1A3、SLC30A4、SLICK、SLITRK4、XPR1、HOXA1、PDE11A、FAM49A和WNT5A的标志物的表达通过细胞免疫化学测定。
54.如权利要求49所述的方法，其中所述PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞中PDX1的表达高于选自α-胎蛋白(AFP)、SOX7、SOX1、ZIC1和NFM的标志物的表达。
55.如权利要求49所述的方法，其中所述类视黄醇为RA。
56.如权利要求55所述的方法，其中RA以约0.5μM至约50μM的浓度提供。
57.如权利要求56所述的方法，其中RA以约1μM至约20μM的浓度提供。
58.如权利要求57所述的方法，其中RA以约2μM的浓度提供。
59.如权利要求55所述的方法，其中RA在所述培养物约5天龄时提供。
60.如权利要求49所述的方法，还包括向所述培养物提供B27。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述B27以总培养基的约0.1％至约20％的浓度提供。
62.如权利要求61所述的方法，其中B27以总培养基的约0.5％至约2％的浓度提供。
63.如权利要求62所述的方法，其中B27以总培养基的约0.5％的浓度提供。
64.如权利要求60所述的方法，其中B27在与所述类视黄醇大概相同的时间提供。
65.如权利要求49所述的方法，还包括向所述培养物提供活化素A。
66.如权利要求65所述的方法，其中活化素A以约10ng/ml至约200ng/ml的浓度提供。
67.如权利要求66所述的方法，其中活化素A以约20ng/ml至约100ng/ml的浓度提供。
68.如权利要求67所述的方法，其中活化素A以约25ng/ml的浓度提供。
69.如权利要求49所述的方法，其中所述PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞在CMRL培养基中生长。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述CMRL培养基包含约2μM的RA，约25ng/ml的活化素A和总培养基的约0.5％的B27。
71.如权利要求49所述的方法，其中所述获得包含PDX1-阴性定形内胚层细胞的细胞群的步骤包括获得包含多能性人细胞的细胞群，向所述细胞群提供足够量的至少一种TGFβ超家族生长因子以促进所述多能性细胞向定形内胚层细胞的分化，并允许足够时间来让定形内胚层细胞形成，其中所述用于定形内胚层细胞形成的足够时间通过检测所述细胞群中定形内胚层细胞的存在来确定。
72.通过权利要求49所述的方法产生的PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞。
73.产生PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
获得包含PDX1-阴性定形内胚层细胞的细胞群；以及
向所述细胞群提供足够量的FGF-10以促进所述PDX1-阴性定形内胚层细胞群的至少一部分分化为表达至少一种选自CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2、SLC27A2、SERPINF2、DUSP9、CDH6和SOX9的标志物的PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞，其中所述PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞为能够分化为腹胰芽细胞的多潜能细胞。
74.如权利要求73所述的方法，其中所述细胞群在不存在RA下分化。
75.如权利要求73所述的方法，其中所述PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞不表达一种或多种选自ADORA2A、CD47、EPB41L1、MAG、SFRP5、SLC16A10、SLC16A2、SLC1A3、SLC30A4、SLICK、SLITRK4、XPR1、HOXA1、PDE11A、FAM49A和WNT5A的标志物。
76.如权利要求75所述的方法，还包括允许足够时间让PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞形成的步骤，其中所述用于PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞形成的足够时间通过检测所述细胞群中偏腹侧的前肠内胚层细胞中选自CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2、SLC27A2、SERPINF2、DUSP9、CDH6和SOX9的标志物的存在来确定。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述选自CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2、SLC27A2、SERPINF2、DUSP9、CDH6和SOX9的标志物的表达通过定量聚合酶链式反应(Q-PCR)测定。
78.如权利要求76所述的方法，其中所述选自CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2、SLC27A2、SERPINF2、DUSP9、CDH6和SOX9的标志物的表达通过细胞免疫化学测定。
79.如权利要求73所述的方法，其中所述PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞中PDX1的表达高于选自α-胎蛋白(AFP)、SOX7、SOX1、ZIC1和NFM的标志物的表达。
80.如权利要求73所述的方法，其中FGF-10以约5ng/ml至约500ng/ml的浓度提供。
81.如权利要求80所述的方法，其中FGF-10以约10ng/ml至约100ng/ml的浓度提供。
82.如权利要求81所述的方法，其中FGF-10以约50ng/ml的浓度提供。
83.如权利要求73所述的方法，其中所述FGF-10在所述培养物约3天龄时提供。
84.如权利要求73所述的方法，还包括向所述培养物提供B27。
85.如权利要求84所述的方法，其中所述B27以总培养基的约0.1％至约20％的浓度提供。
86.如权利要求85的方法，其中B27以总培养基的约0.5％至约2％的浓度提供。
87.如权利要求86所述的方法，其中B27以总培养基的约0.5％的浓度提供。
88.如权利要求84所述的方法，其中B27在与所述FG-10大概相同的时间提供。
89.如权利要求73所述的方法，还包括向所述培养物提供KAAD-环杷明。
90.如权利要求89所述的方法，其中KAAD-环杷明以约0.1μM至约50μM的浓度提供。
91.如权利要求90所述的方法，其中KAAD-环杷明以约0.5μM至约10μM的浓度提供。
92.如权利要求91所述的方法，其中KAAD-环杷明以约0.5μM的浓度提供。
93.如权利要求73所述的方法，其中所述PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞在CMRL培养基中生长。
94.如权利要求93所述的方法，其中所述CMRL培养基包含约50ng/ml的FGF-10，约0.5μM的KAAD-环杷明和总培养基的约0.5％的B27。
95.如权利要求94所述的方法，其中所述CMRL培养基不含RA。
96.如权利要求73所述的方法，所述获得包含PDX1-阴性定形内胚层细胞的细胞群的步骤包括获得包含多能性人细胞的细胞群，向所述细胞群提供足够量的至少一种TGFβ超家族生长因子以促进所述多能性细胞向定形内胚层细胞的分化，并允许足够时间来让定形内胚层细胞形成，其中所述用于定形内胚层细胞形成的足够时间通过检测所述细胞群中定形内胚层细胞的存在来确定。
97.通过权利要求73所述的方法产生的PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞。
98.产生富集PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞的细胞群的方法，所述方法包括以下步骤：
分化PDX1-阴性定形内胚层细胞群中的细胞以便产生PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞，所述PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞为能够分化为背胰芽细胞的多潜能细胞；
向所述细胞群提供结合在所述PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞中表达但不在所述细胞群中存在的其它细胞类型中大量表达的标志物的试剂；以及
将结合至所述试剂的所述PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞与所述细胞群中存在的所述其它细胞类型分开，由此产生富集PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞的细胞群。
99.如权利要求98所述的方法，其中所述标志物选自ADORA2A、CD47、EPB41L1、MAG、SFRP5、SLC16A10、SLC16A2、SLC1A3、SIC30A4、SLICK、SLITRK4和XPR1。
100.如权利要求98所述的方法，其中所述标志物选自CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2和SLC27A2。
101.如权利要求98所述的方法，其中所述分化步骤进一步包括获得包含PDX1-阴性定形内胚层细胞的细胞群，向所述细胞群提供足够量的类视黄醇以促进所述PDX1-阴性定形内胚层细胞向PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞分化，并允许足够时间让PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞形成，其中所述用于PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞形成的足够时间通过检测所述细胞群中PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞的存在来确定，所述PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞为能够分化为背胰芽细胞的多潜能细胞。
102.如权利要求101所述的方法，其中提供步骤还包括提供B27。
103.如权利要求101所述的方法，其中检测包括检测至少一种选自ADORA2A、CD47、EPB41L1、MAG、SFRP5、SLC16A10、SLC16A2、SLC1A3、SLC30A4、SLICK、SLITRK4、XPR1、HOXA1、PDE11A、FAM49A和WNT5A的标志物的表达。
104.如权利要求98所述的方法，其中所述细胞的至少约95％为PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞。
105.如权利要求98所述的方法，其中所述细胞的至少约98％为PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞。
106.如权利要求98所述的方法，其中所述试剂为抗体。
107.如权利要求106所述的方法，其中所述抗体对选自ADORA2A、CD47、EPB41L1、MAG、SFRP5、SIC16A10、SIC16A2、SLC1A3、SLC30A4、SLICK、SLITRK4、XPR1、CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2和SLC27A2的细胞表面多肽有亲和力。
108.通过权利要求98所述的方法产生的PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞的富集群。
109.产生富集PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞的细胞群的方法，所述方法包括以下步骤：
分化PDX1-阴性定形内胚层细胞群中的细胞以便产生PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞，所述PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞为能够分化为腹胰芽细胞的多潜能细胞；
向所述细胞群提供结合在所述PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞中表达但不在所述细胞群中存在的其它细胞类型中大量表达的标志物的试剂；以及
将结合至所述试剂的所述PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞与所述细胞群中存在的所述其它细胞类型分开，由此产生富集PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞的细胞群。
110.如权利要求109所述的方法，其中所述标志物选自CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2和SLC27A2。
111.如权利要求109所述的方法，其中所述分化步骤进一步包括获得包含PDX1-阴性定形内胚层细胞的细胞群，向所述细胞群提供足够量的FGF-10以促进所述PDX1-阴性定形内胚层细胞向PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞分化，并允许足够时间让PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞形成，其中所述用于PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞形成的足够时间通过检测所述细胞群中PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞的存在来确定，所述PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞为能够分化为腹胰芽细胞的多潜能细胞。
112.如权利要求111所述的方法，其中所述提供步骤还包括提供B27。
113.如权利要求111所述的方法，其中检测包括检测至少一种选自CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2、SLC27A2、SERPINF2、DUSP9、CDH6和SOX9的标志物的表达。
114.如权利要求109所述的方法，其中所述细胞的至少约95％为PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞。
115.如权利要求109所述的方法，其中所述细胞的至少约98％为PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞。
116.如权利要求109所述的方法，其中所述试剂为抗体。
117.如权利要求116所述的方法，其中所述抗体对选自CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2和SLC27A2的细胞表面多肽有亲和力。
118.通过权利要求109所述的方法产生的PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞的富集群。
119.产生富集PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞的细胞群的方法，所述方法包括以下步骤：
获得多能性细胞群，其中至少一个所述多能性细胞群的细胞包含至少一个拷贝的由选自ADORA2A、CD47、EPB41L1、MAG、SFRP5、SIC16A10、SLC16A2、SIC1A3、SLC30A4、SLICK、SLITRK4、XPR1、HOXA1、PDE11A、FAM49A和WNT5A的任一标志物基因的启动子控制的核酸，所述核酸包含编码荧光蛋白或其生物学活性片段的序列；
分化所述多能性细胞以产生PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞，所述PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞为能够分化为背胰芽细胞的多潜能细胞；以及
将所述PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞与所述细胞群中存在的其它细胞类型分开。
120.如权利要求119所述的方法，其中所述富集的细胞群包含至少约95％的PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞。
121.如权利要求119所述的方法，其中所述富集的细胞群包含至少约98％的PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞。
122.如权利要求119所述的方法，其中所述分化步骤进一步包括，向所述多能性细胞群提供足够量的至少一种TGFβ超家族生长因子以促进所述多能性细胞向PDX1-阴性定形内胚层细胞分化，并且向所述PDX1-阴性定形内胚层细胞提供足够量的类视黄醇以促进所述PDX1-阴性定形内胚层细胞向PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞分化。
123.如权利要求122所述的方法，其中所述类视黄醇为RA。
124.如权利要求123所述的方法，其中所述提供步骤还包括提供B27。
125.如权利要求119所述的方法，其中所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白(GFP)。
126.如权利要求119所述的方法，其中通过荧光激活的细胞分选术(FACS)将所述PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞与所述细胞群中的其它细胞类型分开。
127.通过权利要求119所述的方法产生的PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞的富集群。
128.产生富集PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞的细胞群的方法，所述方法包括以下步骤：
获得多能性细胞群，其中至少一个所述多能性细胞群的细胞包含至少一个拷贝的由选自CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2、SLC27A2、SERPINF2、DUSP9、CDH6和SOX9的任一标志物基因的启动子控制的核酸，所述核酸包含编码荧光蛋白或其生物学活性片段的序列；
分化所述多能性细胞以产生PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞，所述PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞为能够分化为腹胰芽细胞的多潜能细胞；以及
将所述PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞与非偏腹侧的前肠内胚层细胞分开。
129.如权利要求128所述的方法，其中所述富集的细胞群包含至少约95％的PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞。
130.如权利要求128所述的方法，其中所述富集的细胞群包含至少约98％的PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞。
131.如权利要求128所述的方法，其中所述分化步骤进一步包括，向所述多能性细胞群提供足够量的至少一种TGFβ超家族生长因子以促进所述多能性细胞向PDX1-阴性定形内胚层细胞分化，并且向所述PDX1-阴性定形内胚层细胞提供足够量的FGF-10以促进所述PDX1-阴性定形内胚层细胞向PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞分化。
132.如权利要求128所述的方法，其中所述提供步骤还包括提供B27。
133.如权利要求128所述的方法，其中所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白(GFP)。
134.如权利要求128所述的方法，其中通过荧光激活的细胞分选术(FACS)将所述PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞与所述细胞群中存在的其它细胞类型分开。
135.通过权利要求128所述的方法产生的PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞的富集群。
136.鉴定能够促进包含人细胞的细胞群中人PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞分化的分化因子的方法，所述方法包括以下步骤：
获得包含人PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞的细胞群；
向所述细胞群提供候选分化因子；
在第一时间点确定所述细胞群中标志物的表达；
在第二时间点确定所述细胞群中相同标志物的表达，其中所述第二时间点在所述第一时间点之后并且所述第二时间点在向所述细胞群提供所述候选分化因子之后；以及
确定与所述第一时间点时所述细胞群中标志物的表达相比，所述第二时间点时所述细胞群中所述标志物的表达是否增加或减少，其中所述第二时间点时所述细胞群中所述标志物的表达增加或减少表明所述候选分化因子能够促进所述人PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞的分化。
137.如权利要求136所述的方法，其中所述标志物选自ADORA2A、CD47、EPB41L1、MAG、SFRP5、SLC16A10、SLC16A2、SLC1A3、SLC30A4、SLICK、SLITRK4、XPR1、HOXA1、PDE11A、FAM49A和WNT5A。
138.如权利要求136所述的方法，其中所述人PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞包含至少约10％的所述细胞群中的人细胞。
139.如权利要求136所述的方法，其中在所述细胞群中存在人饲养细胞，并且除了所述饲养细胞外至少约10％的人细胞为PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞。
140.如权利要求136所述的方法，其中所述人PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞包含至少约90％的所述细胞群中的人细胞。
141.如权利要求136所述的方法，其中在所述细胞群中存在人饲养细胞，并且除了所述饲养细胞外至少约90％的人细胞为PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞。
142.如权利要求136所述的方法，其中所述人PDX1-阳性、偏背侧的前肠内胚层细胞能够分化为背胰芽细胞。
143.如权利要求136所述的方法，其中所述人定形内胚层细胞应答所述候选分化因子而分化为胰前体细胞。
144.如权利要求136所述的方法，其中所述第一时间点在向所述细胞群提供所述候选分化因子之前。
145.如权利要求136的方法，其中所述第一时间点大概在向所述细胞群提供所述候选分化因子的同时。
146.如权利要求136所述的方法，其中所述第一时间点在向所述细胞群提供所述候选分化因子之后。
147.如权利要求136所述的方法，其中所述标志物的表达增加。
148.如权利要求136所述的方法，其中所述标志物的表达减少。
149.如权利要求136所述的方法，其中所述标志物的表达通过定量聚合酶链式反应(Q-PCR)来测定。
150.如权利要求136所述的方法，其中所述标志物的表达通过细胞免疫化学来测定。
151.如权利要求136所述的方法，其中所述分化因子包括小分子。
152.如权利要求136所述的方法，其中所述分化因子包括多肽。
153.如权利要求136所述的方法，其中所述分化因子包括生长因子。
154.鉴定能够促进包含人细胞的细胞群中人PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞分化的分化因子的方法，所述方法包括以下步骤：
获得包含人PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞的细胞群；
向所述细胞群提供候选分化因子；
在第一时间点确定所述细胞群中标志物的表达；
在第二时间点确定所述细胞群中相同标志物的表达，其中所述第二时间点在所述第一时间点之后并且所述第二时间点在向所述细胞群提供所述候选分化因子之后；以及
确定与所述第一时间点时所述细胞群中标志物的表达相比，所述第二时间点时所述细胞群中所述标志物的表达是否增加或减少，其中所述第二时间点时所述细胞群中所述标志物的表达增加或减少表明所述候选分化因子能够促进所述人PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞的分化。
155.如权利要求154所述的方法，其中所述标志物选自CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2、SLC27A2、SERPINF2、DUSP9、CDH6和SOX9。
156.如权利要求154所述的方法，其中所述人PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞包含至少约10％的所述细胞群中的人细胞。
157.如权利要求154所述的方法，其中在所述细胞群中存在人饲养细胞，并且除了所述饲养细胞外至少约10％的人细胞为PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞。
158.如权利要求154所述的方法，其中所述人PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞包含至少约90％的所述细胞群中的人细胞。
159.如权利要求154所述的方法，其中在所述细胞群中存在人饲养细胞，并且除了所述饲养细胞外至少约90％的人细胞为PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞。
160.如权利要求154所述的方法，其中所述人PDX1-阳性、偏腹侧的前肠内胚层细胞能够分化为腹胰芽细胞。
161.如权利要求154所述的方法，其中所述人定形内胚层细胞应答所述候选分化因子而分化为胰前体细胞。
162.如权利要求154所述的方法，其中所述第一时间点在向所述细胞群提供所述候选分化因子之前。
163.如权利要求154所述的方法，其中所述第一时间点大概在向所述细胞群提供所述候选分化因子同时。
164.如权利要求154所述的方法，其中所述第一时间点在向所述细胞群提供所述候选分化因子之后。
165.如权利要求154所述的方法，其中所述标志物的表达增加。
166.如权利要求154所述的方法，其中所述标志物的表达减少。
167.如权利要求154所述的方法，其中所述标志物的表达通过定量聚合酶链式反应(Q-PCR)来测定。
168.如权利要求154所述的方法，其中所述标志物的表达通过细胞免疫化学来测定。
169.如权利要求154所述的方法，其中所述分化因子包括小分子。
170.如权利要求154所述的方法，其中所述分化因子包括多肽。
171.如权利要求154所述的方法，其中所述分化因子包括生长因子。
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