WO2004104184A1

WO2004104184A1 - 内胚葉系幹細胞の調製

Info

Publication number: WO2004104184A1
Application number: PCT/JP2004/007227
Authority: WO
Inventors: Shinichi Nishikawa; Takumi Era
Original assignee: Riken
Priority date: 2003-05-20
Filing date: 2004-05-20
Publication date: 2004-12-02
Also published as: EP1627912A1; KR20060010820A; US20060281136A1; EP1627912A4; CA2526397A1; AU2004241380A1; CN1791668A; JPWO2004104184A1

Abstract

　本発明の課題は、多能性幹細胞から内胚葉系幹細胞を分化させ、単離調製することである。本発明では、多能性幹細胞から分化させた種々の内胚葉系幹細胞を、特別な細胞表面マーカー、オルガナイザー特異的マーカーおよびＥ−カドヘリンの発現様式を指標に選別することにより、上記課題を解決する。

Description

明細書内胚葉系幹細胞の調製技術分野

本発明は、多能性幹細胞からインビトロにおいて分化した中間幹細胞の混合物から高度に精製された内胚葉系幹細胞、および目的の幹細胞を調製する方法に関す^ 発明の背景

哺乳類では、原腸胚形成期にダイナミックな形態の変化と共に、内胚葉、中胚葉、外胚葉と呼ばれる 3胚葉が形成される。内胚葉は将来、胃、腸管、肝臓、滕臓、大腸に分化する組織である。他の組織同様に重要な組織であり、したがって内胚葉を分離し増殖させるシステムの開発は、薬物の開発、ホルモンや生理活性物質等の産生細胞、例えばインスリン産生細胞の開発、そして臨床的にも重要な課題である。

1部の内胚葉組織はマウスにおけるオルガナイザー領域から分化することが判明している。オルガナイザー（形成体）とは 1924年、 Spemannと Mangoldらによりその存在が報告された体軸形成の指導的役割を果たす細胞組織群の総称である。すなわち、 1つの胚の原口背唇 (dorsal blastoporal l ip) を別の胚に移植すると移植場所に二次軸の形成が起こる。その後の研究によりオルガナイザ一はゼブラフィッシュ、ニヮトリなど種を超えて存在することが明らかとなった。マウスにおいては、原条 (primitive streak)の先端部分に形成される特別な組織形態をもつ結節 (Node)がこの役割の 1部を担うことが判明している（Cel l, 1999， Vol. 196, pp. 195-209) 。 Node細胞は体軸形成に関わるだけでなく、将来軸索中内胚葉（axial mesendoderm) と呼ばれる組織へと分化するが、ここからは主に中胚葉と内胚葉組織が分化増殖してくる。

マウスではオルガナイザー特異的な細胞は 1個体あたりの細胞数力⁵'少ないことから、その取り扱いは困難であり、よってオルガナイザー関連細胞についての分ィ匕、増殖に関する分子生物学的メカニズムは不明な点が多い。そこで、限られた細胞数しか分離できないという問題点を解決するために、直接個体から分離することが困難な細胞を胚性幹細胞を用いて純ィ匕する研究を行った。

胚性幹細胞（Embryonic stem cel l, E S細胞）とは、初期胚に存在する分化多能性を有する細胞であり、他の胚盤胞中に注入されると生殖細胞をも含む種々の細胞に分ィ匕する。最も研究が進んでいるマウスの胚性幹細胞は、発生 3 . 5日の胞胚内の内部細胞塊より樹立された多能性と自己複製能を持つ細胞である。この細胞は、通常の培養培地に血清と白血病阻害因子（leukemia inhibitory factor： L I F) と呼ばれる増殖因子を加えるだけで、未分化の状態を保持しつつ、増殖を維持できる。マウス胚性幹細胞は、発生 3 . 5日目の胞胚に注入し、その胞胚を母体に戻すことによって、ィンビポで再びすベての組織細胞に分化することができ、キメラマウスやノックアウトマウスの作成に利用されている。また、近年、胚性幹細胞をインビトロで操作して、様々な成熟組織細胞へ分化させることが可能になっている（例えば、西川伸一ら、 Development, 1998， 125号、 pp. 1747-1757、仲野徹ら、 Science, 1994、 265号、 pp. 1098- 1101、江良択実ら、 Blood, 2000， 95号， pp. 870-878) 。このような、胚性幹細胞の持つ分化多能性と簡単な操作性から、将来の医療において、細胞を用いる移植治療の材料としての利用が期待されている。

胚性幹細胞を強制的にィンビト口で分化させた場合、成熟細胞が出現することは本発明者や他のグループの研究で明らかとなった。現在、胚性幹細胞は様々な分化段階にある幹細胞（中間幹細胞）を経て完全な成熟細胞に至ると考えられているが、その分化過程には未だ不明な点が多い。

そして、現在までにこの胚性幹細胞から純度の高い内胚葉細胞を直接分離した幸艮告はなく、その開発は急務である。発明の開示

本発明者らは、胚性幹細胞のインビトロ分化システムを用い、内胚葉細胞の同定、純化と分化能の解析を行った。残念ながら、現在まで内胚葉特異的な細胞表面マーカーは発見されていない。そこで、上記オルガナイザーに特異的に発現する遺伝子の 1つであるグスコイド（goosecoid、 Gsc) 遺伝子にマーカー遺伝子として緑色蛍光タンパク質（GFP) 遺伝子をノックイン（Knock- in) した胚性幹細胞を作製し、内胚葉細胞の同定、純化を試みた。その結果、胚性幹細胞から分化させた内胚葉系幹細胞が、オルガナイザー特異的マ一カーおょぴ E—力ドヘリンを発現していることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成させた。

即ち、本発明は、

( 1 ) 多能性幹細胞からインビト口において分化させた内胚葉系幹細胞であつて、オルガナイザー特異的マーカー陽性および E—力ドヘリン陽性である細胞；好ましくは、

多能性幹細胞が胚性幹細胞である、オルガナイザー特異的マーカーがグースコィドである、標識タンパク質が,禄色蛍光タンパク質（GFP) である、および,またはオルガナイザー特異的マーカーに標識タンパク質が融合されている細胞；

( 2 ) a ) 多能性幹細胞を培養し、 b ) オルガナイザー特異的マーカーおよび E—力ドヘリンを発現している細胞を選別し分離することを特徴とする、内胚葉系幹細胞の調製方法；好ましくは選別段階においてセルソーターを用いる方法、さらに好ましくは、コラーゲン I Vでコートした培養プレート上の無血清培地中、ァクチビンの存在下に多能性幹細胞を培養することにより、多能性幹細胞を内胚葉系幹細胞に分化させる方法；

( 3 ) 本発明の内胚葉系幹細胞を分化させ、目的の内胚葉細胞を調製する方法；好ましくはコラーゲン I Vでコートした培養プレート上の無血清培地中、ァクチビンの存在下に内胚葉系幹細胞を培養することにより、内胚葉系幹細胞を内胚葉細胞に分ィ匕させる方法；さらに好ましくは、ァクチビンととも b F G F (塩基性フィプロブラスト成長因子）の存在下に内胚葉系幹細胞を培養することにより、内胚葉系幹細胞を内胚葉細胞に分化させる方法；より好ましくは、ァクチビンとしてァクチビン Aを用いる方法；およびこれらの調製方法により得られる内胚葉細胞；ならびに

( 4 ) 多能性幹細胞から目的の幹細胞を調製する方法であって、 a ) 多能性幹細胞のゲノム中、所定のマーカー遺伝子の発現系に適合するように標識タンパク質の遺伝子を導入し、それにより所定のマーカー遺伝子の代わりに、またはそれとともに該標識タンパク質が発現されるようにし、 b ) 該標識タンパク質の標識を指標に目的の幹細胞を選別し分離することを特徴とする方法；好ましくは、多能性幹細胞が胚性幹細胞であり、標識タンパク質が緑色蛍光タンパク質である方法、に関する。図面の簡単な説明

図 1 A グースコィド遺伝子のノックイン胚性幹細胞を組立てるスキームである。

図 1 B GSC遺伝子をプロ一プに用いた、相同組換え胚性幹細胞のサザーンプロッテイング分析の結果を示す。

図 2 分化誘導による GFP陽性細胞の出現を示す細胞選別、および GFP陽性細胞でのみグースコィドが発現していることを示す RT- PCRの結果である。

図 3 細胞選別して得られた GFP陽性細胞における遺伝子発現バタ一ンを示す c 図 4 ァクチビン Aを添カ卩した無血清培地による Gsc- GFP陽性細胞の分化誘導の結果を示す。

図 5 ァクチビン Aの濃度依存的に GFP陽性細胞の割合が増加する結果を示す。図 6 GFP陽性細胞の分化誘導に与える BMP- 4と bFGFの影響を示す。

図 7 GFP陽性細胞の E-力ドへリンの発現パターンを示す。

図 8 A GFP陽性 E-力ドヘリン陽性細胞からの上皮様細胞の分化おょぴその細胞形態を示す。

図 8 B GFP陽性 E-カドヘリン（cadher in) 陽性細胞からの上皮様細胞における細胞系列特異的な遺伝子の発現を示す。発明を実施するための最良の形態

( 1 ) 本発明は、多能性幹細胞からインビト口において分ィヒさせた内胚葉系幹細胞であつて、オルガナイザー特異的マーカー陽性および E—力ドヘリン陽性である細胞を提供する。

本明細書において、「多能性幹細胞」とは、外胚葉、中胚葉およぴ内胚葉系幹細胞から選ばれる少なくとも 1つに分化する能力を有する自己複製可能な幹細胞を意味し、これには、胚性幹細胞（embryonic stem cel l : E S細胞）、胚性生殖細胞 (embryonic germ cel l： E G細胞) 、胚性癌細胞 (embryonal carcinoma cel l : E C細胞）、多能性成体前駆細胞（multipotent adult progenitor cel ls: MA P細胞）、成体多能性幹細胞（adult pluripotent stem cel l : A P S細胞）、骨髄幹細胞などが含まれる。ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスタ一、ゥサギ、モルモット、ゥシ、プタ、ィヌ、ゥマ、ネコ、ャギ、ヒッジを含む哺乳類、鳥類、爬虫類などの多様な動物に由来する多能性幹細胞を使用し得るが、通常は哺乳類に由来するものを使用する。

本明細書において、「胚性幹細胞」は、初期胚に存在する分化多能性を有する細胞であって、他の胚盤胞中に注入されると生殖細胞をも含む種々の細胞に分ィ匕し得る細胞を意味する。本発明では、胞胚内の内部細胞塊より新たに樹立した胚性幹細胞を使用してもよく、あるいは既に樹立された細胞系統を使用してもよい。本明細書において、「内胚葉系幹細胞」は、内胚葉系の組織に属する細胞に分化する中間幹細胞であって、中胚葉およぴ外胚葉系の組織に属する細胞には分化しない細胞を意味する。母体内のマウスの発生では、発生 6 . 5日から 7 . 5日にかけて起こる原腸胚形成の際、胞胚を形成する上皮組織の一定領域から離脱した予定中胚葉細胞が胚の内部に入り込み、予定外胚葉と予定内胚葉の間を移動して予定中胚葉を形成する。これら予定外胚葉、予定内胚葉および予定中胚葉を構成する細胞がそれぞれ、外胚葉系幹細胞、内胚葉系幹細胞およぴ中胚葉系幹細胞である。

本明細書において、「中間幹細胞」は、多能性幹細胞の分化が進んだ細胞であつて、外胚葉、中胚葉または内胚葉系幹細胞のいずれか 1つ、あるいはこれらの混合物を意味する。従って、中間幹細胞は、外胚葉、中胚葉または内胚葉細胞のいずれか 1つに分ィヒする能力を有する細胞と表すことができる。

細胞移植治療のためには、試験管内（インビトロ）において胚性幹細胞を分ィ匕させ、特定の胚葉系に分化する中間幹細胞を出現させ、さらにそれを精製して 1 種類の中間幹細胞を調製することが求められる。細胞移植治療に利用される細胞材料として、中間幹細胞は成熟細胞よりも以下の点において利用価値が高い。 1 . ほとんどの組織の成熟細胞の増殖能は低いが、中間幹細胞のィンビト口での増殖能ははるかに高い。即ち、適切な条件さえ整えば、インビトロで強制的に増幅させることが可能となる。

2 . 1種類の中間幹細胞が多種類の成熟細胞に分化するので、治療効果を比較した場合、少ない細胞でより高い成果をあげること力可能である。

本明細書において、「オルガナイザー特異的マーカー」とはオルガナイザーに特異的に発現しているタンパク質を意味し、マウスの場合、グースコイド

(goosecoid、 Gsc)、 HNF - 3 、および limlを包含する。グースコイド遺伝子はホメォボックスドメインをもつ転写因子であり、オルガナイザーに発現する遺伝子の中でもオルガナイザーに特異的に発現することが判明している（Pr inc ip les of Development Lewis Wolpert OXFORD Press, 2002, pl05) 。本発明に使用するオルガナイザー特異的マーカ一は 1つであっても、 2以上であってもよい。オルガナイザー特異的マーカーである HNF- 3 /?は Ang， S. -L. and Rossant, J. (1994) , Cel l 78, 561-574、および! feinstein, D. C.， et al. , (1994) , Cel l 78, 575-588) 等に、 Limlは Shawlot, W et al. , (1995) Nature 374, 425-430にそれぞれ記載されている。

E—力ドヘリンは、細胞間の接着を担う膜貫通型の膜タンパク質であり (Annu. Rev. Cel l, Dev. Biol. 1997： 13, 119-146) 、 E _ C a dを欠損したマウスは、極めて早い時期の胎生致死であることが知られている。

この態様では、オルガナイザー特異的マーカーに標識タンパク質が融合されているか、あるいはマーカー遺伝子が標識タンパク質遺伝子で置き換えられている (ジーンノックアウト法）細胞が好ましい。標識タンパク質としては、緑色蛍光タンパク質（GFP) 、あるいは蛍光活性ィ匕セルソーター（F A C S ) にて利用可能なあらゆるタンパク質、例えば d s R E Dを利用できる。融合は当業者に周知の遺伝子工学的手法、例えば相同組換え、遺伝子導入により行うことができる。本明細書において、ある分子について「陽性（+) 」とは、細胞が当該分子を発現していることを意味し、「陰性（一）」とは、発現していないことを意味する。細胞がある分子を発現しているか否かは、 F A C S等により判定できる。本明細書において、「インビトロ」とは、反応や培養が胚を含む生体外で実施されることを意味する。インビトロで細胞を培養およひンまたは分化させる際には、細胞の成育に適するあらゆる培地、試薬及び容器を使用し得る。また、本明細書における「インビボ」は、反応や培養が胚を含む生体内で実施されること、またはある現象が生体内で起こることを意味する。

(2) 本発明は別の態様として、 a) 多能性幹細胞を培養し、 b) オルガナイザ一特異的マーカーおよび E—力ドヘリンを発現している細胞を選別し分離することを特徴とする、内胚葉系幹細胞の調製方法を提供する。

上記の調製方法では、好ましくはオルガナイザー特異的マーカーに標識タンパク質を融合させておくか、あるいはマーカー遺伝子を標識タンパク質遺伝子で置き換えておく（ジーンノックアウト法）。この場合、標識タンパク質の標識を指標としてセルソーター、好ましくは蛍光活性ィ匕セルソーター（FACS) により目的の細胞を選別する。

FACSは、通常、フローサイトメータ一、レーザー発生装置、光学系、デ一タ処理装置および細胞分取装置を備えている。 FACSの機能は、蛍光標識細胞の自動分離および、蛍光強度のコンピューターによる分析である。 FACSにより、特定物質で蛍光標識した細胞に、細い流路の途中でレーザー光を照射し、散乱光（前方散乱光や側方散乱光）や蛍光のシグナル情報を個々の細胞ごとに測定し、その結果を、例えば度数分布として表示し、特定のシグナル情報を発する細胞を分取することができる。 FACSの装置は Becton-Dickinson等から市販されており、製造者の指示に従って当業者が操作することが可能である。

E—力ドヘリン陽性は、抗 E— C a d抗体を使用して判定する。また、その分子発現に基づいて細胞を選別するためには、蛍光活性化セルソーター（FAC S) を使用できる。

本発明で使用する抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれでもよいが、 FACSで使用する場合、モノクローナル抗体が好ましい。そのような抗体は、実施例に記載の方法を参照して当業者が作成することができるが、市販のものを使用してもよい。抗 E—カドヘリンモノクローナル抗体は宝酒造から市販されており（品番 Ml 08) 、あるいは当業者に周知の手法により容易に調製できる。

E—力ドヘリン陽性は、 E—力ドヘリンの細胞内 mRNAの存在を指標にして選別することも可能である。

胚性幹細胞の培養には、細胞の維持または分化の目的に適する組成の培地を使用する。胚性幹細胞維持用培地は、通常、細胞培養用の最小培地に、血清、 L I F、 L—グルタミン、 2 _メルカプトエタノール等を添加したものであり、組成の一例を挙げると、 85%KNOCKOUT D— MEM、 15%FBS、 10 — ⁴M 2 _ME、 2mM L—グルタミン、 0.1 mM NEAA、 1000 U/ ml L IFである。また、胚性幹細胞分化用培地は、通常、細胞培養用の最小培地に、血清、 L一グルタミン、 2—メルカプトエタノール等を添加したものであり、 L I Fを含有しない。組成の一例を挙げると、 90%αΜΕΜ、 10 % F BS、 5x 10— ⁵M 2 -ME, 2 mM L—グルタミンである。各培地には、抗生物質などの培養に有用な他の物質を添加することができ、各成分に代えて、同等の機能を有する代替物を使用してもよい。また、培地の各成分は、各々適する方法で滅菌して使用する。

本発明による胚性幹細胞の培養方法における具体的な操作は、当該技術分野で常套の操作及び条件に従って行うことができる。例えば、中辻憲夫編：実験医学別冊 ·ボストゲノム時代の実験講座 4 「幹細胞 ·クローン研究プロトコール」、羊土社（2001年）、 Hogan, G. ら編：マウス胚の操作： A Laboratory Manual, Cold ¾prmg Harbor Laboratory Press, Plainview, NY (1994)

Robertson, E. J. 編：奇形ガンおよび胚性幹細胞、 A Practical Approach, IRL Press Oxford, UK (1987) などの記載を参酌して適宜に決定することができる。本発明のある実施態様では、胚性幹細胞を内胚葉系幹細胞に分化させる段階が含まれる。当分野で既知のいかなる方法で分化させてもよいが、典型的には、コラーゲン IVでコートした培養容器内、ァクチビンの存在下に、 L IF不含の無血清培地を使用して胚性幹細胞を培養する。ここに使用するァクチビンは T G F β (トランスフォーミング増殖因子ベータ一）ファミリーに属する大きさ 24 k Dのぺプチド性細胞増殖、分化因子であり、 2個のベータ一サブュニットが S S 結合を介して 2量体を構成している (Ling, Ν·， et al.， (1986) Nature 321, 779-782； Vale, W. , et al., (1986) Nature 321, 776-779) 、本発明においてはァクチビン A、 B、 C、 Dのいずれでも、またヒト、マウス等いずれの動物由来のものをも使用でき、これらは R &Dから市販されている。このなかで、ァクチビン Aが好適に用いられる。使用する多能性幹細胞の由来する動物種と同じ由来のァクチビンを用いるのが好ましく、例えばヒト由来の多能性幹細胞を出発原料とする場合、ヒトァクチビン Aを用いるのが好ましい。ァクチビンの濃度は 1 0 n g/m 1以上が好ましく、 1 0 n g/m 1が最も好ましい。それよりも低濃度でも誘導は起こるが、陽性細胞の割合が低い。

また、ァクチビンととも b F G F (塩基'性フイブロブラスト成長因子）の存在下に多能性幹細胞を培養すれば、より好適に内胚葉系幹細胞へと分化させることができる。 b F G Fは R & Dから入手できる。 b F G Fの濃度は 1 0 n g/m 1 以上が好ましく、 1 0 n g/m 1が最も好ましい。

このような条件で胚性幹細胞を培養すると、マウスの胚性幹細胞では、通常 4 一 6日目に本発明による精製に適する内胚葉系幹細胞の数が最適となる。あるいは、従来から行われている胚体形成法（Embryo id body formation method) によつても、胚性幹細胞を内胚葉系幹細胞に分化させることができる。また、効率は低いが、コラーゲン I Vをゼラチンゃフイブロネクチン等に代えても胚性幹細胞を内胚葉系幹細胞に分化させることができる（例えば、 Wi les, M. et al.

Development 111， 259-267, 1991 参照）。

( 3 ) 本発明は別の態様として、本発明の内胚葉系幹細胞を分化させ、目的の内胚葉細胞を調製する方法、およびこの調製方法により得られる内胚葉細胞を提供する。

この分化方法は上記と同様の手法により行えばよい。

本発明の内胚葉系幹細胞から分ィ匕して得られる内胚葉細胞は、将来、胃、十二指腸、腸管、肝臓、脬臓、大腸に分化する細胞であり、それは、薬物の開発、ホルモンや生理活性物質等の産生細胞、例えばィンスリン産生細胞としての利用、あるいは臨床的な利用があり得る。

( 4 ) 本発明は別の態様として、多能性幹細胞から目的の中間幹細胞を調製する方法を提供する。この態様における目的の中間幹細胞は外胚葉、中胚葉または内胚葉細胞のいずれか 1つに分ィヒする能力を有する。この方法は、 a ) 多能性幹細胞のゲノム中、所定のマーカー遺伝子の発現系に適合するように標識タンパク質の遺伝子を導入し、それにより所定のマーカー遺伝子の代わりに、またはそれとともに該標識タンパク質が発現されるようにする。所定のマーカー遺伝子としては外胚葉、中胚葉、内胚葉系幹細胞のいずれか 1つに特異的に発現するマーカー、例えば外胚葉系幹細胞であれば特異的マーカー遺伝子 S O X 1を、中胚葉系幹細胞であれば特異的マーカー遺伝子 Brachyuryまたは Mesogeninlを、内胚葉系幹細胞であれば特異的マーカ一遺伝子 G A T A 4または S 0 X 1 7を用いることができる。標的タンパク質の遺伝子導入は通常、相同組換えが用いられ、他にプロモ一ターをつないだ Transgenic法を用いることができる。

次いで、該標識タンパク質の標識を指標に目的の中間幹細胞を選別し分離する C ここでは、多能性幹細胞が胚性幹細胞であり、標識タンパク質が緑色蛍光夕ンパク質である方法が好ましい。

この態様における方法は、多能性幹細胞から中間幹細胞の前駆細胞（外胚葉、中胚葉または内胚葉系幹細胞のいずれか 2つに分化できる段階の細胞）を調製する方法にも応用可能である。即ち、本発明は、多能性幹細胞から中間幹細胞の前駆細胞を調製する方法であって、 a ) 多能性幹細胞のゲノム中、所定のマーカー遺伝子の発現系に適合するように標識タンパク質の遺伝子を導入し、それにより所定のマーカー遺伝子の代わりに、またはそれとともに該標識タンパク質が発現されるようにし、 b ) 該標識タンパク質の標識を指標に目的の中間幹細胞を選別し分離することを特徴とする方法をも包含する。

以下の実施例は、本発明の 1態様を示すと共に、本発明の方法に.よって調製した内胚葉系幹細胞が成熟細胞への分化能を有することを証明するものである。実施例

参考例 1 胚性幹細胞の維持

a . 材料

胚性幹細胞の維持には、表 1の試薬および器具を使用した

メーカー名ロロ ¾f

Gl asgow最小必須培地（ G— M E M) Invitrogen 11710-035 フ羊ァ、 Z 11τ腿 u DUU

ά— ^ノ ϊレレノ^ マノ。 "k山丁々ノ )、 ~ノ】レ (、 —— Λ JV/iΓ T?、ノ CTPA/ίΛ mi ΟΔΔ がしべ、リ ξお;^ 佥フ丄 ηνι t ogen 丄丄 yu— ^iDU

M g cr Γし ]丄 ² ^ 、し ci厂し〗 1 ² )

了 L·一ンfノ jiレノヽ ^ Π Π τηΛ丄/Γ 丄 nvi i rogcii ώουύυ— 丄バ百ァ - ノ西 ί"1\ΤΤ Α Δ、丄n し rogcii 1

丄丄丄 ^ /itnu— π UOςηU

'ノノ iJロクしliU冃 Γ _ ノ _CA^U丄丄し Π SFB30-960

T T F Gill 11 ESG1107

0.25% (W/V) トリプシン一 EDTA Invitrogen 25200-072

KNOCKOUT血清代替物 (KSR) Invitrogen

6 c mディッシュ FALCON 353802 胚性幹細胞の維持用培地の組成は、 89% G-MEM 1% FBS 10% KSR 10—⁴ M 2- ME 2mMレグルタミン、 0. ImM NEMおよび lOOOU/ml しんであった。

胚性幹細胞としては、マウス 129系統由来の EB5細胞（Niwa H, et al.,

O O

Genes and Development 1998， 12； 2048-2060) を使用した。 o o

o

O G

b. 操作

6 cmディッシュをゼラチンでコートした。このディッシュに 2 X 10⁵の EB5胚性幹細胞を播種した。翌日、 1度培地を交換した。 2日目でコンフレントになったら、トリプシンを使用して細胞をディッシュから分離し、再び 2 X 10 5の濃度で、ゼラチンコトされたディッシュに播種した。培養は、 37 °C 5%C〇₂のィンキュベータ内で行った。参考例 2 胚性幹細胞の無血清培地での分化誘導

a. 材料

胚性幹細胞の分化誘導には、表 2の材料を使用した。

表 2 メーカー名 ΠΠ1

b. 胚性幹細胞の分化用培地

SF-03粉末に 1リットルの蒸留水を加え、付属の NaHC0₃2.2gを加えて撹拌した。次に、二酸化炭素ガスを培地の色がオレンジ色になるまで加えた。 BSAを濃度が 0.1°/。、 2MEが 10—⁴Mになるように加え、 30分以上撹拌した。最後にろ過滅菌した。

c 分化誘導操作

B I 0C0ATコラーゲン I V被覆 10 cmディッシュに 1 x 10⁵の EB5胚性幹細胞を播種した。 3— 6日目に細胞分離緩衝液（Invitrogen) を使用して細胞を分離し、その後の実験に使用した。参考例 3 FacsVantageによる GFP陽性細胞あるいは GFP陽性 E-力ドヘリン陽性細胞の選別

a. 試薬の調製

表 3の試薬を使用した。

表 3

メーカー名 D

ロロ毋

10 Xハンクス平衡塩溶液 invitrogen 14185-052

(10 Xハンクス緩衝液）ゥシ血清アルブミン（B S A) SIGMA A— 2153 脱イオン水 9 0 0 m lに対して 1 0 O m 1の 1 0 xハンクス緩衝液と 1 0 gの B S A (終濃度 1 %) を加えてよく撹拌した。 B S Aが溶解した後、 0 . 2 ^ 111 フィルターを用いて滅菌した。得られた溶液を以下、 BSA ハンクス緩衝液と称する。

b . 操作

分化 3- 6日目の分化誘導した胚性幹細胞を細胞分離緩衝液を用いてばらばらに分離した後、 1度 1%BSA ハンクス緩衝液で洗浄した。次に、 10⁶あたり 1 mlの 1%BSAハンクス緩衝液に溶解し、 GFP陽性細胞を細胞選別にて回収する。また、 E-力ドヘリンに対する抗体染色を行う場合には、マウス血清を 10⁶あたり 10〃 1カロえ、氷上にて 20分インキュベートしてブロッキングを行った。次に、ピオチン標識した E-力ドヘリンの抗体を加え、氷上にて 20分ィンキュベートした。 20分後、 1度 1%BSAハンクス緩衝液で洗浄した。ストレプトアビジン一ァロピコシァニン (Al lopycocyanine) (A P C ) を含む 500 1の 1%BSAハンクス緩衝液に再溶解し、氷上にて 20分ィンキュベートした。最後に、 2回 1°/。BSAノヽンクス緩衝液で洗浄し、 10⁶あたり 1 mlの 1°/。BSAノヽンクス緩衝液に溶解し、細胞選別に使用した。なお、標識色素が ΤΈ (フィコエリスリン）でも同様の結果であった。

FacsVantage (Becton-Dickinson) の使用方法は、付属のガイドブックに準じた。ノズルの振動の頻度は 2 6 0 0 0程度、レベルは 3 V、 drop delay は約 1 2 - 1 4で行った。参考例グ一スコイド陽性細胞の維持 ·分ィ匕

グースコイド（Gsc) 陽性細胞の維持 ·分化には、表 4の試薬および器具を使用し 7

表 4 メ一力一: ¾ ロロ

,ι、 jy、百 +立

取 ZJ a 地 Invitrogen 丄丄一 Ub3

2—メルカプトエタノール（2— ME) SIGMA M7522

_Lークノレタ ^ ώ U U mlvl Invitrogen ^5U3U— (JiU

ゥシ胎児血清（F B S ) EQUITECH US128311

B I O C O A Tコラーゲン I V被覆 1 0 c m Becton- 35 4453

ディッシュ Dickinson b . 操作

B I 0 C 0 A Tコラーゲン I V被覆 1 0 c mディッシュに、細胞選別した GFP 陽性細胞を播種した。

c . Gsc陽性細胞維持 ·分化培地

維持 ·分ィ匕用培地の組成は、 90% " MEM、 10% FBS、 5xl0"⁵ M 2- ME、および 2mM L-グルタミンであった。実施例 1

グースコィド— GFP ノックィン胚性幹細胞の樹立

常法（例えば、 Gu H， Zou YR, Rajewsky K. , Cell, 1993， 73, 1155-1164) に従い、マウスグースコィド遺伝子の開始コドン ATGに合わせて緑色蛍光タンパク質（Green Fluorecene protein (GFP)) 遺伝子を挿入した組立て物を作成し、胚性幹細胞に導入して相同組換えクローンを得た（図 1 A) 。

目的のクローンであることは、 GSC (グースコィド）遺伝子をプローブに用いたサザーンプロッティング分析により選別した。相同組換えが起こつていない正常細胞では Hindlll消化により 6.5 kb長の断片が出現するのに対し、相同組換えクローンでは 6.5およぴ 5.5kb長の 2種類の断片が出現する（図 1 B) 。さらに、 N E 0遺伝子が完全に除かれているかを確認するため、 N E 0プロ一プでサザンブロッテイングを行い、シグナルの消失を認めた（図 1 B右）。

上記操作を行った胚性幹細胞を、コラーゲン IV被覆培養プレートに LIFなしで、血清を加えた分化用培地とともに加え、 37°C、 5°/。C0₂の培養器で培養すると、 4 日目に約 3 %の GFP陽性細胞を認めた。この細胞を FacsVantageを用いて細胞選別し、 RT- PCR法にてグースコィド遺伝子の発現を調べた。その結果、 GFP陽性細胞でのみグースコィドの発現が見られた（図 2 ) 。これにより、 GFPの発現がグースコィドの発現と一致していることが確認された。

次いで、この GKP陽性細胞が他の Node (結節）細胞特異的遺伝子を発現しているかを同様に RT- PCRを用いて検討した（図 3 ) 。興味深いことにこの細胞は Node 細胞特異的遺伝子のみならず内胚葉特異的マーカー遺伝子（GATA4、 Soxl7) も特異的に発現していた。この遺伝子発現のパターンは Node細胞とその子孫細胞のパターンに類似している。これにより、この細胞群がいわゆる中内胚葉の細胞を含んでいることカ^?判明した。実施例 2

GSC陽性細胞の純化条件の確立

実施例 1にて示されるように、血清添加培地では GFP陽性細胞が 2-3%と出現はするもののその割合は低い。まず血清ありの状態でァクチビン A、 BMP- 4 (骨形成タンパク質- 4) 、 BMP-2、 LiCl等の添カ卩で変ィ匕が見られるか比較検討した。しかし、ァクチビン Aで多少の効果が見られたのみであり、大きな効果は観察できなかつた。そこで GSC-GFP陽性細胞を出現させる培養条件の検討を無血清培地を使レ同様のァクチビン A、 BMP - 4、 BMP - 2、 LiCl等で比較検討した。詳細には、 BI0C0AT コラーゲン IV被覆デイツシュにグ一スコイドノックィン胚性幹細胞を LIFなしで無血清の状態で分化誘導用培地を用いて分化誘導を開始した。このときァクチビン Aを 10 ng/mlの濃度で 0日目から添カ卩しておいた。 2日目から 6日目までの GFPの発現を Facsを用いて解析した。その結果、ァクチビン Aを加えた場合、 6日目に 97%の細胞に GFPの発現が誘導された（図 4 )。一方、 BMP-4、 BMP- 2、 LiClでは誘導されなかった。さらに、ァクチビン Aを 0、 0.3、 1、 10 ng/mlの濃度で 0日目から添カ卩しておく実験を同様に行い、 4日目で GFPの発現を Facsを用いて解析した。これにより、ァクチビン Aの濃度依存的に GFP陽性細胞の割合が増加することが判明した（図 5 )。このようにして得られた細胞の遺伝子発現は、血清添加時に得られた GFP陽性細胞と同じく、 Node細胞特異的遺伝子である HNF - 3 β , Liml、および内胚葉特異的遺伝子である GATA- 4, Soxl7を発現していた。

次に、 GFP陽性細胞の分ィ匕誘導に与える BMP - 4と bFGF (塩基性フイブロブラスト成長因子）の影響を調べた。

BI0C0AT コラーゲン IV被覆ディッシュにグ^"スコィドノックイン胚性幹細胞を LIFなしで無血清の状態で分化誘導用培地を用いて分化誘導を開始した。このときァクチビン Aを 3 ng/mlと一定の濃度で、 BMP4と bFGFを 10ng/mlの濃度で加えた _c BMP4添加時では、 Gsc- GFP陽性細胞の割合が減少し、抑制効果があるのに対し、 bFGF添加時では、逆にァクチビン A単独添加時よりも増強された（図 6 ) 。このことから、 GFP陽性細胞の分化誘導はあらゆる成長因子で誘導されるわけではなく、ァクチビン Aと bFGFがその能力をもつことが分かる（bFGFは補助的であるが）。実施例 3

GFP陽性細胞から内胚葉細胞の分離と増殖

GFP陽性細胞の分化能を解析するため、内胚葉と外胚葉に発現している E -力ドヘリンの発現パターンが胚性幹細胞の分ィ匕に伴ってどのように変ィ匕するか解析した。 BI0C0AT コラーゲン IV被覆ディッシュにグースコィドノックイン胚性幹細胞を LIFなしで無血清の状態で分化誘導用培地を用いて分化誘導を開始した。このときァクチビン Aを 10 ng/mlの濃度で 0日目から添カ卩しておいた。 4日目、 5日目、 6日目に GFPの発現と E-力ドヘリンの発現を Facsを用いて解析した。 4日目では GFP陽性細胞のほとんどが Έ-力ドヘリン陽性であった。分ィ匕が進むにつれ、 GFP陽性 E-カドヘリン陰性細胞が出現し、その割合が増加した（図 7 ) 。この結果は、グースコィドが中内胚葉に発現することと考えあわせると GFP陽性 E-力ドヘリン陽性の細胞は内胚葉系の細胞であることを示すと考えられた。

次いで、 GFP陽性の中で E -力ドヘリン陽性と陰性の細胞からの上皮様細胞への分ィヒを試みた。

BI0C0AT コラーゲン IV被覆デイツシュにグースコイドノックィン胚性幹細胞を LIFなしで無血清の状態で分ィ匕誘導用培地を用いて分化誘導を開始した。このときァクチビン Aを 10 ng/mlの濃度で 0日目から添カ卩しておいた。 6日目に GFP陽性細胞 E-力ドヘリン陽性細胞と GFP陽性 E -力ドヘリン陰性細胞をそれぞれ、 E-力ドヘリンの抗体で染色し、 FacsVantageを用いて細胞選別により純ィ匕した。これらの細胞を血清入りの分化用培地で培養すると E-力ドヘリン陽性分画からは上皮様の細胞のみが効率に出現してきたのに対し、 E-力ドへリン陰性分画からは、このようなの上皮様の細胞の出現はほとんど観察できなかった（図 8 A) これは、 GFP陽性細胞 E-力ドヘリン陽性細胞のほうから優先的に上皮様細胞が出現してくることを意味する。

次に、この上皮様の細胞の細胞系列を調べるために、細胞系列特異的な遺伝子の発現を RT- PCR法にて解析した。その結果、内胚葉特異的マーカ^"である HNF3b、 Soxl7、 GATA4が発現しているものの、肝細胞ゃ脖臓の細胞で発現する分子の発現は見られなかった（図 8 B ) 。細胞形態（図 8 A) と、この遺伝子発現のパターンより、 6日目の GFP陽性 E-カドヘリン陽性から分化した上皮様の細胞は、内胚葉細胞であることが示された。産業上の利用可能 '性

本発明の内胚葉系幹細胞は内胚葉細胞に分化し、得られた内胚葉細胞は、将来、胃、十二指腸、腸管、肝臓、滕臓、大腸に分化する細胞である。この内胚葉細胞は薬物の開発に利用でき、あるいはホルモンや生理活性物質等の産生細胞、例えばィンスリン産生細胞としての利用、または臨床的に利用することができる。

Claims

請求の範囲

1 . 多能性幹細胞からインビトロにおいて分化させた内胚葉系幹細胞であって、オルガナイザー特異的マーカー陽性および E—力ドヘリン陽性である細胞。

2 . 多能性幹細胞が胚性幹細胞である、請求項 1記載の細胞。

3 . オルガナイザー特異的マーカーがグースコイドである、請求項 1または 2 記載の細胞。

4 . オルガナイザー特異的マーカーに標識タンパク質が融合されている、請求項 3記載の細胞。

5. 標識タンパク質が緑色蛍光タンパク質（GFP) である、請求項 4記載の細胞。

6 . a ) 多能性幹細胞を培養し、

b ) オルガナイザー特異的マーカーおよび E—力ドヘリンを発現している細胞を選別し分離する、

ことを特徴とする、内胚葉系幹細胞の調製方法。

7. 選別段階においてセルソーターを用いる、請求項 6記載の方法。

8 . コラーゲン I Vでコートした培養プレート上の無血清培地中、ァクチビンの存在下に多能性幹細胞を培養することにより、多能性幹細胞を内胚葉系幹細胞に分化させる、請求項 6または 7記載の方法。

9 . 請求項 1から 5までのいずれか記載の内胚葉系幹細胞を分化させ、目的の内胚葉細胞を調製する方法。

1 0 . コラーゲン I Vでコートした培養プレート上の無血清培地中、ァクチビンの存在下に内胚葉系幹細胞を培養することにより、内胚葉系幹細胞を内胚葉細胞に分化させる、請求項 9記載の方法。

1 1 . 請求項 9または 1 0記載の調製方法により得られる内胚葉細胞。

1 2 . 多能 1生幹細胞から目的の中間幹細胞を調製する方法であって、

a ) 多能性幹細胞のゲノム中、所定のマーカ ^~遺伝子の発現系に適合するように標識タンパク質の遺伝子を導入し、それにより所定のマーカー遺伝子の代わりに、またはそれとともに該標識タンパク質が発現されるようにし、

b ) 該標識タンパク質の標識を指標に目的の中間幹細胞を選別し分離する、ことを特徴とする方法。

1 3 . 多能性幹細胞が胚性幹細胞であり、標識タンパク質が緑色蛍光タンパク質である、請求項 1 1記載の方法。

1 4 . 中間幹細胞が内胚葉系幹細胞である、請求項 1 2または 1 3記載の方法。