CN1791668A - 内胚层干细胞的制备 - Google Patents

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Abstract

本发明意欲通过从多能干细胞分化和随后分离来制备内胚层干细胞。将特异性细胞表面标记、组织者特异性标记和E－钙粘着蛋白的表达方式用作指示，这个目的可以通过分离已经从多能干细胞中分化的各种内胚层干细胞来实现。

Description

内胚层干细胞的制备
技术领域
本发明涉及高度纯化自中间体(intermediate)干细胞的混合物的内胚层干细胞，所述中间体干细胞在体外分化自多能干细胞，本发明还涉及制备目的干细胞的方法。
发明背景
在哺乳动物中，在原胚肠形成过程中，伴随动态形态变化，形成了三个胚原基层，即内胚层、中胚层和外胚层。内胚层是在将来分化成胃、肠道、肝、脾、大肠的组织。类似于其它组织，内胚层是一种重要的组织，因此开发提供内胚层的分离和增殖的系统是开发药物和细胞以及临床应用的主要目的，所述细胞产生激素和生物活性物质，诸如产胰岛素细胞。
在小鼠中，已经证实了一些内胚层组织分化自组织者(organizer)区域。组织者是在体轴线的形成中具有最主要作用的一群细胞组织的统称术语，Spemann和Mangold，等在1924年报道了它的存在。即，将胚胎的胚孔背唇移植到另一胚胎中导致在植入位点的第二体轴的形成。随后的研究已经揭示组织者存在于物种诸如斑马鱼、鸡和其它中。已经显示，在小鼠中，具有特异组织形态并在原条的顶部形成的节为此作用负责(Cell，1999，Vol.196，pp.195-209)。节细胞不仅涉及体轴线的形成，而且与在未来分化成称为轴中内胚层的组织有关，中胚层和内胚层组织主要分化和增殖自所述轴中内胚层。
小鼠在每个个体中具有小量的组织者特异性细胞，为此原因，处理这些细胞是困难的，并且因此关于组织者相关细胞的分化和增殖的分子生物学机制的许多方面是不清楚的。因此，为了解决仅有有限数量的这些细胞可以被分离这一问题，本发明人已经进行了研究，该研究涉及应用胚胎干细胞纯化难以从个体中直接分离的细胞。
胚胎干细胞(ES)是存在于早期胚胎中并具有分化的多潜能性的细胞，其在被注入其它的blastcysts时，分化成为还包括生殖细胞的不同细胞。关于小鼠胚胎干细胞的研究是最先进的，所述小鼠胚胎干细胞是存在多潜能性和自主复制能力的细胞，其在发育的第3.5天建立自胚囊泡的内细胞团。仅通过将血清和被称为白血病抑制因子(LIF)的生长因子添加到普通培养基中，这些细胞能够维持它们的增殖，而保持它们的未分化状态。通过在发育的第3.5天，被注入胚囊泡中，再将胚囊泡返回母体中，小鼠胚胎干细胞可以在体内再分化成所有的组织细胞并用于产生嵌合体和基因敲除小鼠。此外，最近，体外操作胚胎干细胞以使它们分化成为各种成熟的组织细胞(例如，Shinichi NISHIKAWA et al.，Development，1998，No.125，pp.1747-1757；Toru NAKANO et al.，Science，1994，No.265，pp.1098-1101；Takumi ERA et al.，Blood，2000，No.95，pp.870-878)已经成为可能。因为胚胎干细胞如上所述的分化的多潜能性和易于操作，预期将它们作为移植处理应用细胞的材料用在未来药物治疗中。
本发明人和其它小组的研究已经证实当迫使胚胎干细胞在体外分化时，成熟的细胞出现。目前，尽管期望胚胎干细胞通过在分化的各阶段的干细胞(中间体干细胞)彻底成为成熟细胞，它们分化的过程仍旧在许多方面不清楚。
此外，直到现在，没有关于直接从这些胚胎干细胞中分离高纯度内胚层细胞的报道，因此急切需要它的发展。
发明内容
本发明人体外应用胚胎干细胞的分化系统，已经进行了胚胎干细胞的鉴定，纯化，并分析了内胚层细胞的分化能力。不幸的是，直到今天，还未发现特异于内胚层的细胞表面标记。为此原因，本发明人制备了胚胎干细胞，其中作为标记基因的绿色荧光蛋白(GFP)基因被敲入goosecoid(Gsc)基因，一种在上述组织者中特异性表达的基因，并尝试鉴定和纯化内胚层细胞。结果，发现分化自胚胎干细胞的内胚层干细胞表达组织者-特异性标记和E-钙粘着蛋白，导致基于这种发现的本发明的完成。
因此，本发明涉及：
(1)已经在体外分化自多能干细胞的内胚层干细胞，其中所述细胞是组织者-特异性标记阳性和E-钙粘着蛋白阳性的；
优选地，内胚层干细胞，其中多能干细胞是胚胎干细胞，其中组织者特异性标记是goosecoid，其中标签蛋白是绿色荧光蛋白(GFP)，和/或其中标签蛋白被融合到组织者特异性标记中；
(2)一种制备内胚层干细胞的方法，其包括如下步骤：a)培养多能干细胞，和b)选择和分离表达组织者特异性标记和E-钙粘着蛋白的细胞；优选地，其中将细胞分选仪用在选择步骤中的方法；进一步优选地，其中在包被有胶原蛋白IV的培养平板上的无血清培养基中存在活化素(activin)的情况中培养多能干细胞由此使多能干细胞分化成内胚层干细胞的方法；
(3)一种使本发明的内胚层干细胞分化从而制备目的内胚层细胞的方法；优选地，其中在包被有胶原蛋白IV的培养平板上的无血清培养基中存在活化素的情况中培养内胚层干细胞由此使内胚层干细胞分化成内胚层细胞的方法；进一步优选地，其中在活化素和bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)存在下，培养内胚层干细胞，由此使内胚层干细胞分化成为内胚层细胞的方法；更优选地，其中将活化素A用作活化素的方法；以及通过这种制备方法获得的内胚层细胞；和
(4)一种从多能干细胞中制备目的干细胞的方法，其包括如下步骤：a)将标签蛋白的基因引入多能干细胞的基因组中从而适合于预定标记基因的表达系统，以使所述标签蛋白取代预定标记基因或与其一起表达，和(b)使用所述标签蛋白的标记作为指示物来选择和分离干细胞；优选地，其中多能干细胞是胚胎干细胞和标签蛋白是绿色荧光蛋白的方法。
附图简述
图1A是产生具有敲入(knocked-in)goosecoid基因的胚胎干细胞的图解。
图1B显示将GSC基因用作探针，同源重组胚胎干细胞的DNA印迹法的结果。
图2表示通过诱导分化显示GFP-阳性细胞出现的细胞选择的结果和显示goosecoid仅在GFP-阳性细胞中表达的RT-PCR的结果。
图3显示通过细胞选择获得的在GFP-阳性细胞中的基因表达的模式。
图4显示在补充有活化素A的无血清培养基中诱导Gsc-GFP-阳性细胞分化的结果。
图5显示取决于活化素A的浓度，GFP-阳性细胞的百分比增加的结果。
图6显示BMP-4和bFGF对诱导GFP-阳性细胞的分化的影响。
图7显示E-钙粘着蛋白在GFP-阳性细胞中的表达模式。
图8A显示来自GFP-阳性，E-钙粘着蛋白阳性细胞的上皮样细胞的分化，以及它们的细胞形态。
图8B显示在来自GFP-阳性，E-钙粘着蛋白阳性细胞的上皮样细胞中的细胞系(linage)特异基因的表达。
实施本发明的最佳模式
(1)本发明提供已经在体外分化自多能干细胞的内胚层干细胞，其中所述细胞是组织者特异性标记阳性和E-钙粘着蛋白阳性的。
用于本文时，术语“多能干细胞”意味着能自主复制并具有分化成选自外胚层、中胚层和内胚层干细胞的至少一种细胞的能力的干细胞，并包括胚胎干(ES)细胞、胚胎生殖(EG)细胞，胚胎癌性(EC)细胞，多能成人祖(MAP)细胞，成人多能干(APS)细胞，骨髓干细胞，和其它。可以应用来自包括人、猴、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、豚鼠、牛(caw)、猪、狗、马、猫、山羊、绵羊；鸟、爬行动物和其它的多种动物诸如哺乳动物的多能干细胞。通常，使用来自哺乳动物的多能干细胞。
用于本文时，术语“胚胎干细胞”意味着存在于早期胚胎中并具有分化的多潜能性的细胞，当其被注入其它blastcysts时，其可以分化成还包括生殖细胞的不同细胞。在本发明中，可以应用新鲜建立自在胚囊泡的内细胞团中的胚胎干细胞或已经建立的细胞系。
用于本文时，术语“内胚层干细胞”意味着中间体干细胞，其分化成属于内胚层组织的细胞，但是不分化成属于中胚层和外胚层组织的细胞。当小鼠在母体内发育时，在发育的第6.5-7.5天的原肠胚形成过程中，已经离开形成囊胚的上皮组织的具体区域的假定的中胚层细胞穿入胚胎的内部并在假定的外胚层和内胚层之间移动以形成假定的中胚层。组成这些假定的外胚层，内胚层和中胚层的细胞分别是外胚层，内胚层和中胚层干细胞。
用于本文时，术语“中间体干细胞”指在多能干细胞分化的晚期阶段并且是外胚层，中胚层和内胚层干细胞，或其混合物的任何一个的细胞。因此，可以将中间体干细胞表示为具有分化成外胚层细胞，中胚层细胞或内胚层细胞任何一个的能力的细胞。
细胞移植处理需要在体外分化胚胎干细胞，带来了分化成给定胚原基层的中间体干细胞的出现，并需要进一步纯化它们以制备一种的中间体干细胞。作为用于细胞移植处理的细胞材料，与成熟细胞相比，中间体干细胞在应用上具有更大的价值，因为：
1.大多数组织的成熟细胞具有低增殖能力，而中间体干细胞具有体外更高的增殖能力。这意味着创造合适的条件可以迫使它们进入体外增殖。
2.一种中间体干细胞分化成为各种成熟细胞，并因此当比较治疗效果时，更小量的细胞可以获得更高的结果。
用于本文时，术语“组织者特异性标记”指在组织者中特异性表达的蛋白，并且就小鼠来说，包括goosecoid(Gsc)、HNF-3β和Lim1。所述goosecoid基因是具有同源异型框结构域的转录因子，并且其已经显示在组织者中表达的基因中，该基因在组织者中特异性地表达(Principles ofDevelopment，Lewis Wolpert，OXFORD Press，2002，pp.105)。本发明中所用的组织者特异性标记的数量可以是一个，或两个或更多。
HNF-3β，一种组织者特异性标记，描述于Ang，S.-L.和Rossant，J.(1994)，Cell，78，561-574；Weinstein，D.C.et al.，(1994)，Cell，78，575-588；和其它中；Lim1描述于Shawlot，W. et al.(1995)Nature，374，425-430中。
E-钙粘着蛋白是负责细胞之间粘连的跨膜类型的膜蛋白(Annu.Rev.Cell，Dev.Biol.，1997：13，119-146)并且已知E-Cad缺陷型小鼠是在非常早期的阶段胚胎致死的。
在这个方面，优选其中标签蛋白已经与组织者特异性标记融合或标记基因已经被标签蛋白的基因取代(基因敲除方法)的细胞。可以将绿色荧光蛋白(GFP)，或任何可以被用在荧光激活细胞分选仪(FACS’s)，例如dsRSD上的任何蛋白用作标签蛋白。可以通过本领域那些技术人员众所周知的方法，例如，同源重组和基因引入来进行融合。
用于本文时，给定分子的术语“阳性(+)”指细胞表达该分子，“阴性(-)”指没有发生表达。例如，通过FACS，确定细胞是否表达给定分子是可能的。
用于本文时，术语“在体外”指反应或培养在包括胚胎的活体外进行。当在体外培养和/或分化细胞时，可以使用所有适合于细胞生长的培养基，试剂和容器。说明书中的“在体内”指在包括胚胎的活体内进行反应或培养，或某种现象在活体内发生。
(2)作为另一方面，本发明提供一种制备内胚层干细胞的方法，其包括如下步骤：a)培养多能干细胞，和b)选择和分离表达组织者特异性标记和E-钙粘着蛋白的细胞。
在上述制备方法中，优选标签蛋白与组织者特异性标记融合，或标记基因被标签蛋白的基因取代(基因敲除方法)。在这种情形中，使用标签蛋白的标记作为指示物，用细胞分选仪，优选地用荧光激活细胞分选仪(FACS)选择目的细胞。
通常用流式细胞仪，激光产生装置，光学，数据处理装置和细胞分选装置来提供FACS。FACS的功能是自动分离荧光标记细胞和对它们的荧光强度进行计算机分析。通过FACS，以接近窄流动通道的激光束来辐射用特异性物质荧光标记的细胞，然后测量分散的光(前和后分散的光)的信号信息以及在每个个体细胞上的荧光，并显示其结果，例如，作为频率分布，从而可以分选产生特异性信号信息的细胞。FACS设备可以从Becton-Dickinson和其它商购，并且那些本领域技术人员可以按照制造商的说明书来进行操作。
通过使用抗-E-Cad抗体来确定E-钙粘着蛋白的正性。此外，可以使用荧光激活细胞分选仪(FACS)从而在其分子表达的基础上选择细胞。
用在本发明中的抗体可以是多克隆或单克隆抗体，而当用于FACS上时，单克隆抗体是优选的。参考实施例中所述的方法，本领域技术人员可以产生这些抗体，同时可以使用商购的抗体。抗-E-钙粘着蛋白单克隆抗体是从Takara Shuzo(商品号M108)商购的，或可以通过本领域众所周知的方法容易地进行制备。
还可以使用E-钙粘着蛋白的胞内mRNA的存在作为指示物来选择E-钙粘着蛋白的正性。
对于培养胚胎干细胞，应用具有适合于维持或分化细胞的组成的培养基。通常维持胚胎干细胞的培养基是进行细胞培养的补充有血清、LIF、L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇和其它的基本培养基。这些组成的一个实例是85％的KNOCKOUT D-MEM，15％的FBS，10-4M 2-ME，2mM L-谷氨酰胺，0.1mM的NEAA，和1000U/ml LIF。分化胚胎干细胞的培养基通常是进行细胞培养的补充有血清、L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇和其它，并且不包含LIF的基本培养基。这些组成的一个实例是90％α-MEM，10％FBS，5×10-5M 2-ME，2mM L-谷氨酰胺。可以将用于培养的其它物质，诸如抗生素加入每种培养基中，并可以将具有同等功能的替代物取代相应的成分使用。将培养基的各个成分进行灭菌并以它们合适的方式使用。
可以按照随后的方法和本领域众所周知的条件来进行按照本发明培养胚胎干细胞的方法的具体程序。例如，考虑到在Norio NAKATSUJI，ed.：Zikken Igaku(Experimental Medicine)，Suppl.Vol.，Experimental Course 4 inthe Post-Genome Era，“Stem Cell and Clone Research Protocols”，Yodosha Co.，Ltd.(2001)；Hogan，G.et al.，ed.，Mouse Embryo Manipulations：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，NY(1994)；Robertson，E.J.ed.，Teratocarcinoma and embryonic Stem Cells，APractical Approach，IRL Press，Oxford，UK(1987)中的描述，可以作出适当的决定。
本发明的某些实施方案包括胚胎干细胞分化成内胚层干细胞的步骤。胚胎干细胞可以通过本领域已知的任何方法进行分化，并且使用在包被有胶原蛋白IV的容器中存在活化素而没有LIF的无血清培养基来典型地进行培养。本文所用的活化素是大小为24kD的肽细胞生长/分化因子，属于TGF-β(转化生长因子-β)家族并构成二聚体(dimmer)，所述二聚体具有两个通过S-S连接的β-亚单位。(Ling，N.et al.，(1986)Nature，321，779-782；Vale，W.et al.，(1986)Nature，321，776-779).在本发明中，可以使用活化素A，B，C，和D的任何一种或可以使用来自任何动物，诸如人和小鼠的活化素，并且它们可以从R & D商购。在它们之中，优选使用活化素A。优选使用来自与所用的多能干细胞所衍生自的物种相同的动物物种的活化素。例如，优选当将来自人的多能干细胞用作起始材料时，所使用的人活化素A。活化素的浓度优选地是10ng/ml或更高，其中10ng/ml是最优选的。在低浓度，也可引起诱导，但是阳性细胞的百分比很小。
此外，在存在bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)，并具有活化素的情况中培养多能干细胞的时候，多能干细胞更优选地分化成为内胚层干细胞是可能的。BFGF可以从R & D商购。b-FGF的浓度优选地是10ng/ml或更高，其中10ng/ml是最优选的。
当将胚胎干细胞在这些条件下进行培养时，小鼠胚胎干细胞将到达内胚层干细胞的最佳数量，其适合于通常在第4-6天按照本发明进行纯化。或者，还通过在过去进行的胚状体体转化方法使胚胎干细胞分化成内胚层干细胞是可能的。此外，尽管是以低频率，白明胶、纤连蛋白或胶原蛋白IV的类似物的替代使胚胎干细胞分化成内胚层干细胞(见，例如，Wiles，M.et al.，Development，111，259-267，1991)。
(3)作为另一个方面，本发明提供分化本发明的内胚层干细胞以制备目的内胚层细胞的方法，以及通过这种制备方法获得的内胚层细胞。
可以以与上述相似的方式进行这种分化的方法。
通过分化本发明的内胚层干细胞获得的内胚层细胞是将来分化成胃、十二指肠、肠道、肝、脾和大肠的细胞，可以发现它们在药物开发中的应用，并且作为产激素、生物活性物质和其它的细胞，诸如产胰岛素细胞以及进行临床应用。
(4)作为另一个方面，本发明提供制备来自多能干细胞的目的中间体干细胞的方法。在这个实施方案中的目的中间体干细胞具有分化成外胚层那个细胞，中胚层细胞或内胚层细胞的任何一个的能力。在该方法中，a)将标签蛋白的基因引入多能干细胞的基因组中以适应于预定标记基因的表达系统，从而使所述标签蛋白取代或与预定的标记基因一起进行表达。作为预定的标记基因，应用在外胚层，中胚层和内胚层干细胞任何一个中特异性表达的标记，例如，在作为外胚层干细胞的细胞情形中的特异性标记基因SOX1，在中胚层干细胞情形中的特异性标记基因Brachyury或Mesogeninl，以及在作为内胚层干细胞的细胞情形中的特异性标记基因GATA4或SOX17。对于标签蛋白的基因的引入，通常应用同源重组，并且可以使用其中连接启动子的另外的转基因方法。
随后，将所述标签蛋白的标记用作指示物，来选择和分离目的中间体干细胞。在这个方面，优选多能干细胞是胚胎干细胞并且标签蛋白是绿色荧光蛋白。
在这个方面的方法可以应用于制备来自多能干细胞的中间体干细胞(在能分化成外胚层，中胚层或内胚层干细胞的任何两个的阶段的细胞)的前体细胞的方法。因此，本发明还包括一种方法，所述方法的特征在于a)将标签蛋白的基因引入多能干细胞的基因组中以适应于预定标记基因的表达系统，从而使所述标签蛋白取代或与预定标记基因一起进行表达，以及b)使用所述标签蛋白作为指示物来选择和分离目的中间体干细胞。
随后的实施例表示本发明的实施方案，并且同时证实了通过本发明的方法制备的内胚层干细胞具有分化成成熟细胞的能力。
实施例
参考实施例1：维持胚胎干细胞
a.材料
对于维持胚胎干细胞，使用表1中所示的试剂和设备。
表1
  制造商   商品号
  Glasgow基本必需培养基(G-MEM) Invitrogen 11710-035
  白明胶   SIGMA   G2500
  2-巯基乙醇(2-ME)   SIGMA   M7522
  Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水，MgCl2(-)，CaCl2(-) Invitrogen 14190-250
  L-谷氨酰胺，200mM   Invitrogen   25030-081
  非必需氨基酸(NEAA)   Invitrogen   11140-050
  胎牛血清(FBS)   EQUITECH   SFB30-960
  LIF   Chemicon   ESG1107
  0.25％(w/v)胰蛋白酶-EDTA   Invitrogen   25200-072
  KNOCKOUT血清替换物(KSR)   Invitrogen   10828-028
  6-cm皿   FALCON   353802
维持胚胎干细胞的培养基的组成为：89％G-MEM，1％FBS，10％KSR，10-4M2-ME，2mM L-谷氨酰胺，0.1mM NEAA，和1000U/mlLIF。
将来自小鼠129株(Niwa H.et al.，Genes and Development，1998，12：2048-2060)的EB5细胞用作胚胎干细胞。
b.方法
用白明胶包被6-cm的皿。以2×105EB5胚胎干细胞接种包被的皿。次日，将培养基更换一次。当细胞在第二天汇合时，使用胰蛋白酶使细胞从皿上分离下来，并以2×105细胞的浓度再次接种到白明胶包被的皿上。于37℃在5％CO2的培养箱上进行培养。
参考实施例2：诱导胚胎干细胞在无血清培养基中的分化
a.材料
对于诱导胚胎干细胞的分化，使用表2中所示的材料。
表2
  制造商   商品号
S-克隆(SF-03)   Sanko JunyakuCo.，Ltd. SS1303
  牛血清白蛋白(BSA)   SIGMA   A-2153
  2-巯基乙醇(2-ME)   SIGMA   M7522
  Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水，MgCl2(-)，CaCl2(-) Invitrogen 14190-250
  BIOCOAT胶原蛋白IV-包被的10-cm皿 Becton-Dickinson 354453
  细胞分离缓冲液   Invitrogen   13150-016
  活化素A   Genzyme   23389
抗-钙粘着蛋白抗体(ECCD2)   Takara Shuzo Co.，Ltd. M108
b.分化胚胎干细胞的培养基
将1升蒸馏水加入SF-03粉末并加入伴随的NaHCO3(2.2g)，并搅拌所述混合物。然后，将二氧化碳气体加入培养基中直到培养基的颜色成为橙色。将BSA加至0.1％的浓度，2-ME加到10-4M的浓度，并将所述混合物搅拌超过30分钟。最终将所述溶液过滤灭菌。
c.分化诱导的方法
以1×105EB5胚胎干细胞接种用BIOCOAT胶原蛋白IV-包被的10-cm皿。在第3-6天，使用细胞分离缓冲液(Invitrogen)分离所述细胞并用于随后的实验中。
参考实施例3：通过FacsVantage选择GFP-阳性细胞或GFP-阳性，E-钙粘着蛋白-阳性细胞
a.试剂的制备
使用表3中所示的试剂。
表3
  制造商   商品号
 10xHank’s平衡盐溶液(10xHank’s缓冲液) Invitrogen 14185-052
 牛血清白(BSA)   SIGMA   A-2153
将100ml的10xHank’s缓冲液和10g的BSA(终浓度为1％)加入900ml的去离子水中，并将所述混合物充分搅拌。BSA溶解后，用0.2μm的滤器对溶液进行灭菌。其后，将得到的溶液称作BSA-Hank’s缓冲液。
b.方法
使用细胞分离缓冲液在分化的第3-6天对分化-诱导的胚胎干细胞进行解聚，然后用1％BSA-Hank’s缓冲液洗涤一次。然后，将细胞以106细胞溶解在1ml的1％BSA-Hank’s缓冲液，并通过细胞选择收集GFP-阳性细胞。当进行E-钙粘着蛋白的抗体染色时，加入10μl的106细胞的小鼠血清，并在冰上温育20分钟以进行封闭。加入针对E-钙粘着蛋白的生物素-标记的抗体，并在冰上温育20分钟。20分钟后，用1％BSA-Hank’s缓冲液洗涤细胞一次。将细胞重新溶解于500μl的含链霉抗生物素蛋白-allopycocyanine(APC)的1％BSA-Hank’s缓冲液中，并在冰上温育20分钟。最终，将细胞用1％BSA-Hank’s缓冲液洗涤两次，重新溶解于106细胞的1ml 1％BSA-Hank’s缓冲液中，并用于细胞分离。在标记染料是PE(藻红蛋白)的情形中，获得了相似的结果。
按照随附的手册应用FacsVantage(Becton-Dickinson)。Nozzle变化的频率在26000的等级上，水平在3V，降落滞后(drop delay)是约12-14。
参考实施例4：维持和分化Goosecoid-阳性细胞
对于维持和分化goosecoid(Gsc)-阳性细胞，使用表4所示的试剂和设备。
表4
  制造商   商品号
  基本必需培养基α-培养基 Invitrogen 12571-063
  2-巯基乙醇(2-ME)   SIGMA   M7522
  L-谷氨酰胺，200mM   Invitrogen   25030-081
  胎牛血清(FBS)   EQUITECH   US128311
  BIOCOAT胶原蛋白IV-包被的10cm皿 Becton-Dickinson 354453
b.方法
将细胞分离的GFP-阳性细胞接种在BIOCOAT胶原蛋白IV-包被的10cm皿上。
c.维持和分化Gsc-阳性细胞的培养基
维持和分化培养基的组成是90％α-MEM，10％FBS，5×10-5M2-ME，和2mM L-谷氨酰胺。
实施例1
建立Goosecoid-GFP基因敲入胚胎干细胞
构建了构建物(construct)，并将其引入胚胎干细胞以获得同源重组克隆(图1A)，其中在所述构建物中，按照常规方法(例如，Gu H，Zou YR，Rajewsky K.，Cell，1993，73，1155-1164)绿色荧光蛋白(GFP)被引向小鼠goosecoid基因的起始密码子ATG的框架中。
使用GSC(goosecoid)基因作为探针，通过DNA印迹法分析选择目的克隆。其中没有发生同源重组的正常细胞通过HindIII消化给出6.5-kb长的片段，而同源重组克隆提供具有6.5和5.5kb的两个片段(图1B)。另外，用NEO探针进行DNA印迹法以鉴定NEO基因是否被完全去除，并观察到信号的消失(图1B，右)。
如上所述，将处理的胚胎干细胞加入具有不含LIF并补充有血清的分化培养基的胶原蛋白IV-包被的培养平板上，并于37℃在5％CO2的培养箱中进行培养。在第四天，观察到约3％的GFP-阳性细胞。这些细胞经过细胞分离，应用FacsVantage，并通过RT-PCR方法测试goosecoid基因的表达。该结果显示，goosecoid的表达仅在GFP-阳性细胞中显示(图2)。这证明了GFP的表达对应于goosecoid的表达。
接下来，以类似方式使用RT-PCR检查这些GFP-阳性细胞是否表达特异于节细胞的其它基因(图3)。有趣的是，这些细胞不仅特异性地表达节细胞特异性基因，还特异性地表达内胚层特异性的标记基因(GATA4，Soc17)。所述基因表达的模式类似于节细胞和它们的子代细胞的基因表达模式。从这些发现可见这些细胞的群体包含所谓的内中胚层细胞。
实施例2
确定纯化GSC-阳性细胞的条件
如实施例1所示，GFP-阳性细胞以2％-3％的水平出现在补充血清的培养基中，并且它们的百分比很小。首先通过比较来检查关于在血清存在的情况条件下添加活化素A，BMP-4(骨形态发生蛋白-4)，BMP-2，LiCl和其它是否能导致任何变化。仅观察到了关于活化素A的较小的效果，并且没有检测到任何明显的效果。然后使用无血清培养基，进行关于使GSC-GFP-阳性细胞出现的培养条件的研究，并以相似的方式在活化素A，BMP-4，BMP-2，LiCl，和其它之间进行比较。具体地，在BIOCOAT胶原蛋白IV-包被的皿上，在缺乏血清情况中，使用不含LIF的诱导分化的培养基，使goosecoid基因敲入胚胎干细胞经历对它们分化的诱导。在这种情形下，在第0天，以10ng/ml的浓度添加活化素A。使用Facs在第2-6天分析GFP的表达。结果显示，当加入活化素A时，GFP的表达在第六天在97％的细胞中被诱导(图4)。另一方面，对于BMP-4，BMP-2，和LiCl，GFP的表达没有被诱导。而且，以相似的方式进行了其中在第0天以0，0.3，1和10ng/ml的浓度诱导活化素的实验，并使用Facs分析了在第四天GFP的表达。从这些结果说明以取决于活化素A的浓度的方法，GFP-阳性细胞的百分比增加(图5)。因此获得的细胞的基因表达与在GFP-阳性细胞中的基因表达是相同的，当加入血清：特异于节细胞的基因的HNF-3β，Liml，和特异于内胚层的基因的，GATA-4和Sox17被表达而获得所述GFP-阳性细胞。
接下来，研究了BMP-4和bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)对诱导GFP-阳性细胞分化的影响。
在BIOCOAT胶原蛋白IV-包被的皿上，在缺乏血清的情况中，使用不含LIF的诱导分化的培养基，使goosecoid基因敲入胚胎干细胞经过对它们的分化的诱导。在该情形下，以3ng/ml的固定浓度加入活化素A，以10ng/ml的浓度加入BMP-4和bFGF。相对于只添加活化素A，BMP-4的加入导致Gsc-GFP-阳性细胞百分比的减少，并给出抑制效应，而bFGF的添加相反地导致增加的百分比(图6)。从这些发现了解的是，GFP-阳性细胞的分化没有被所有的生长因子所诱导并且活化素A和bFGF具有所述的能力(尽管bFGF是辅助的)。
实施例3
从GFP-阳性细胞中分离内胚层细胞以及它们的增殖
为了分析GFP-阳性细胞的分化能力，进行了关于在E-钙粘着蛋白的表达的模式中有什么变化的分析，所述E-钙粘着蛋白在由胚胎干细胞的分化所导致的内胚层和外胚层中表达。在BIOCOAT胶原蛋白IV-包被的皿上，在缺乏血清的情况中，使用分化诱导培养基使goosecoid基因敲入胚胎干细胞经历对它们分化的诱导。在该情形下，以10ng/ml的浓度从第0天添加活化素A。使用Facs，分析了在第4，5和6天的GFP和E-钙粘着蛋白的表达。在第4天，大多数GFP-阳性细胞是E-钙粘着蛋白阳性的。当分化进展时，GFP-阳性，E-钙粘着蛋白阴性细胞出现，并且它们的百分比增加(图7)。根据goosecoid在内中胚层中的表达，这些结果将显示GFP-阳性，E-钙粘着蛋白-阳性细胞是内胚层细胞。
接下来，尝试将在GFP-阳性细胞中的E-钙粘着蛋白阳性和E-钙粘着蛋白-阴性细胞分化成上皮样细胞。
在BIOCOAT胶原蛋白IV-包被的皿上，在缺乏血清的情况中，使用不含LIF的分化诱导培养基，使goosecoid基因敲入胚胎干细胞经过对它们分化的诱导。在该情形下，以10ng/ml的浓度在第0天加入活化素A。在第6天，用针对E-钙粘着蛋白的抗体对作为GFP-阳性/E-钙粘着蛋白-阳性和GFP-阳性/E-钙粘着蛋白-阴性的各个细胞进行染色，并使用FacsVantage通过细胞选择进行纯化。当将这些细胞培养在包含血清的分化培养基中时，E-钙粘着蛋白-阳性部分有效导致了仅有上皮样细胞的出现，而E-钙粘着蛋白阴性部分导致了不可观察的如这些细胞的上皮样细胞的出现(图8A)。这意味着上皮样细胞优先从GFP-阳性细胞E-钙粘着蛋白-阳性细胞出现。
接下来，为了研究这些上皮样细胞的细胞系，通过RT-PCR方法分析了特异于该细胞系的基因的表达。该结果显示尽管表达了HNF3b，Sox17和GATA4，所述HNF3b是内胚层-特异性标记，没有检测到分子在肝细胞和脾细胞中的表达(图8B)。细胞形态学(图8A)和这种基因表达模式已经显示在第6天分化自GFP-阳性，E-钙粘着蛋白-阳性细胞的上皮样细胞是内胚层细胞。
工业应用性
按照本发明的内胚层干细胞分化成为内胚层细胞，得到的内胚层细胞是将来分化成为胃、十二指肠、肠道、肝、脾和大肠的细胞。可以将这些内胚层细胞用于开发药物，或者作为产激素、生物活性物质和其它的细胞，诸如产胰岛素细胞，或进行临床应用。

Claims (14)

1.一种已经在体外从多能干细胞分化的内胚层干细胞，其中所述细胞是组织者特异性标记阳性的和E-钙粘着蛋白阳性的。
2.按照权利要求1的细胞，其中多能干细胞是胚胎干细胞。
3.按照权利要求1或2的细胞，其中组织者特异性标记是goosecoid。
4.按照权利要求3的细胞，其中标签蛋白被融合到组织者特异性标记中。
5.按照权利要求4的细胞，其中标签蛋白是绿色荧光蛋白(GFP)。
6.一种制备内胚层干细胞的方法，其包括如下步骤：
a)培养多能干细胞，和
b)选择和分离表达组织者特异性标记和E-钙粘着蛋白的细胞。
7.按照权利要求6的方法，其中将所述细胞分选仪用在选择步骤中。
8.按照权利要求6或7的方法，其中所述多能干细胞在存在活化素的情况中，在包被有胶原蛋白IV的培养平板上的无血清培养基中进行培养，由此使多能干细胞分化为内胚层干细胞。
9.一种分化权利要求1-5中任一项的内胚层干细胞以制备目的内胚层细胞的方法。
10.按照权利要求9的方法，其中在活化素存在的情况中，在包被有胶原蛋白IV的培养平板上的无血清培养基中培养内胚层干细胞，由此将内胚层干细胞分化成内胚层细胞。
11.一种通过按照权利要求9或10的制备方法获得的内胚层细胞。
12.一种由多能干细胞制备目的中间体干细胞的方法，其包括如下步骤：
a)将标签蛋白基因引入多能干细胞的基因组中以适应于预定标记基因的表达系统，从而使所述标签蛋白取代预定标记基因表达或与其一起进行表达，和
b)使用所述标签蛋白的标签作为指示物，选择和分离目的中间体干细胞。
13.按照权利要求11的方法，其中多能干细胞是胚胎干细胞并且标签蛋白是绿色荧光蛋白。
14.按照权利要求12或13的方法，其中所述中间体干细胞是内胚层干细胞。
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