KR20060010820A

KR20060010820A - 내배엽계 줄기세포의 제조

Info

Publication number: KR20060010820A
Application number: KR1020057022121A
Authority: KR
Inventors: 시니치 니시카와; 다쿠미 에라
Original assignee: 도꾸리쯔교세이호징 리가가쿠 겐큐소
Priority date: 2003-05-20
Filing date: 2004-05-20
Publication date: 2006-02-02
Also published as: WO2004104184A1; EP1627912A1; US20060281136A1; EP1627912A4; CA2526397A1; AU2004241380A1; CN1791668A; JPWO2004104184A1

Abstract

본 발명의 과제는 다능성 줄기세포로부터 내배엽계 줄기세포를 분화시켜, 분리 제조하는 것이다. 본 발명에서는, 다능성 줄기세포로부터 분화된 다양한 내배엽계 줄기세포를, 특별한 세포 표면 마커, 오거나이저-특이적 마커 및 E-카드헤린의 발현 양식을 지표로 선별함으로써 상기 과제를 해결한다.

Description

내배엽계 줄기세포의 제조{PREPARATION OF ENDODERMAL STEM CELLS}

본 발명은 다능성 줄기세포로부터 생체외에서 분화된 중간 줄기세포의 혼합물로부터 고도로 정제된 내배엽계 줄기세포 및 목적하는 줄기세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.

포유류에서, 원시 장배 형성기에 다이나믹한 형태의 변화와 함께 내배엽, 중배엽 및 외배엽이라고 불리는 3배엽이 형성된다. 내배엽은 장차 위, 장관, 간장, 췌장, 대장으로 분화하는 조직이다. 다른 조직과 유사하게 내배엽은 중요한 조직이므로 내배엽을 분리하여 증식시키는 시스템의 개발은 약물의 개발 및 호르몬 및 생리활성물질 등의 생산세포, 예컨대 인슐린 생산세포의 개발뿐만 아니라 임상적으로도 또한 중요한 과제이다.

일부 내배엽 조직은 마우스에서 오거나이저(organizer) 영역으로부터 분화되는 것이 밝혀졌다. 오거나이저(형성체)는 1924년에 스페만(Spemann) 및 만골드(Mangold)에 의해 그 존재가 보고된 체축(體軸) 형성의 지도적 역할을 하는 세포 조직군의 총칭이다. 즉, 하나의 태아의 원구배순(dorsal b1astoporal 1ip)을 별도 의 배(胚)로 이식하면 이식 장소에서 2차 축의 형성이 일어난다. 그후의 연구에 의해 오거나이저는 제브라피쉬(zebrafish), 닭 등의 종을 초월하여 존재하는 것이 밝혀졌다. 마우스에 있어서, 원조(primitive streak)의 선단 부분에 형성되는 특별한 조직 형태를 갖는 결절(node)이 이러한 역할의 일부를 담당하는 것이 밝혀졌다(문헌 [Cel1, 1999년, Vo1.196, 195-209]). 결절(노드) 세포는 체축 형성에 관계하는 것뿐만 아니라, 장차 축삭 중내배엽(axial mesendoderm)이라고 불리는 조직으로 분화되지만, 여기에서부터는 주로 중배엽 및 내배엽 조직이 분화 및 증식되어 간다.

마우스에서는 오거나이저-특이적인 세포의 1개체당 세포수가 적기 때문에 그 취급이 곤란하고, 이에 따라 오거나이저-관련 세포의 분화 및 증식에 관한 분자 생물학적 매커니즘은 불명확한 점이 많다. 따라서, 한정된 세포수밖에 분리할 수 없다는 문제점을 해결하기 위해, 직접 개체로부터 분리하기 어려운 세포를 내배엽 줄기세포를 이용하여 순화하는 연구를 수행하였다.

배성(胚性)줄기세포(Embryonic stem ce11, ES 세포)는 초기 배에 존재하는 분화 다능성을 갖는 세포이며, 다른 배반포(胚盤胞) 내로 주입되면 생식 세포들도 포함하는 여러가지 세포로 분화한다. 연구가 가장 진보되어 있는 마우스의 배성줄기세포는 발생 3.5일의 포배내의 내부 세포 덩어리로부터 수립된 다능성 및 자기 복제능을 갖는 세포이다. 이 세포는 보통의 배양 배지에 혈청 및 백혈병 저해인자(leukemia inhibitory factor: LIF)라고 불리는 증식인자를 첨가하는 것만으로도 미분화 상태를 유지하면서 증식을 유지할 수 있다. 마우스 배성줄기세포는 발생 3.5일째의 포배에 주입하고 그 포배를 모체로 되돌림으로써 생체내에서 다시 모든 조직세포로 분화할 수 있고, 키메라(chimera) 마우스나 녹-아웃(knock-out) 마우스의 제조에 이용되고 있다. 또한, 최근 배성줄기세포는 생체외에서 조작하여 다양한 성숙 조직세포로 분화시킬 수 있게 되었다(예를 들어, 문헌 [NISHIKAWA Shinichi, Development, l998, 125호, pp.1747-1757], 문헌 [NAKANO Toru, Science, 1994년 , 265호, pp.1098-ll01], 문헌 [ERA Takumi, Blood, 2000년, 95호, pp.870-878]). 이러한 배성줄기세포가 갖는 분화 다능성 및 간단한 조작성 때문에 장래의 의료에 있어 세포를 이용하는 이식 치료를 위한 재료로서 이용되는 것이 기대되고 있다.

배성줄기세포를 강제적으로 생체외에서 분화시킨 경우, 성숙세포의 출현은 본 발명자나 다른 그룹의 연구에 의해 분명하게 밝혀졌다. 현재, 배성줄기세포는 다양한 분화 단계에 있는 줄기세포(중간 줄기세포)를 경유하여 완전한 성숙세포에 이른다고 생각되지만, 그 분화 과정에는 아직 불명확한 점이 많이 있다.

또한, 현재까지 이러한 배성줄기세포로부터 순도가 높은 내배엽 세포를 직접 분리한 보고는 없고, 그 개발이 시급하다.

발명의 요약

본 발명자들은 배성줄기세포의 생체외 분화 시스템을 이용하여 내배엽 세포의 동정, 순화 및 분화능의 분석을 수행하였다. 유감스럽게도, 현재까지, 내배엽 특이적인 세포 표면 마커는 발견되지 않았다. 따라서, 상기 오거나이저에 특이적 으로 발현하는 유전자의 하나인 구스코이드(goosecoid, Gsc) 유전자에 마커 유전자로서 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자를 녹-인(knoced-in)한 배성줄기세포를 제작하여, 내배엽 세포를 동정 및 순화하는 것을 시도하였다. 그 결과, 배성줄기세포로부터 분화된 내배엽계 줄기세포가 오거나이저-특이적 마커 및 E-카드헤린(E-cadherin)을 발현하는 것을 발견하고, 이 지견에 기초하여 본 발명을 완성시켰다.

즉, 본 발명은

(1) 다능성 줄기세포로부터 생체외에서 분화된 내배엽계 줄기세포로서, 오거나이저-특이적 마커 양성 및 E-카드헤린 양성인 세포; 바람직하게는, 다능성 줄기세포가 배성줄기세포이고/이거나, 오거나이저-특이적 마커가 구스코이드이고/이거나, 표지 단백질이 녹색 형광 단백질(GFP) 이고/이거나 오거나이저-특이적 마커에 표지 단백질이 융합되어 있는 세포;

(2) a)다능성 줄기세포를 배양하고, b) 오거나이저-특이적 마커 및 E-카드헤린을 발현하고 있는 세포를 선별하여 분리하는 것을 특징으로 하는 내배엽계 줄기세포의 제조 방법; 바람직하게는 선별 단계에서 세포 분류기(cell sorter)를 이용하는 방법, 더 바람직하게는 콜라겐 IV로 코팅된 배양 플레이트상의 무혈청 배지중에서 액티빈(activin)의 존재하에 다능성 줄기세포를 배양함으로써 다능성 줄기세포를 내배엽계 줄기세포로 분화시키는 방법;

(3) 본 발명의 내배엽계 줄기세포를 분화시켜, 목적하는 내배엽 세포를 제조하는 방법; 바람직하게는 콜라겐 IV로 코팅된 배양 플레이트상의 무혈청 배지중에서 액티빈의 존재하에 내배엽계 줄기세포를 배양함으로써 내배엽계 줄기세포를 내 배엽 세포로 분화시키는 방법; 더 바람직하게는 액티빈과 함께 bFGF(염기성 피브로블래스트 성장인자)의 존재하에 내배엽계 줄기세포를 배양함으로써 내배엽계 줄기세포를 내배엽 세포로 분화시키는 방법; 보다 바람직하게는 액티빈으로서 액티빈 A를 이용하는 방법; 및 이들의 제조 방법에 의해 수득되는 내배엽 세포; 및

(4) 다능성 줄기세포로부터 목적하는 줄기세포를 제조하는 방법으로서, a)다능성 줄기세포의 게놈 중에 소정의 마커 유전자의 발현계에 적합하도록 표지 단백질의 유전자를 도입하고, 그것에 의해 소정의 마커 유전자 대신에 또는 이와 함께 상기 표지 단백질이 발현되도록 하고, b)상기 표지 단백질의 표지를 지표로 하여 목적하는 줄기세포를 선별하여 분리하는 것을 특징으로 하는 방법; 바람직하게는, 다능성 줄기세포가 배성줄기세포이고, 표지 단백질이 녹색 형광 단백질인 방법에 관한 것이다.

도 1A는 구스코이드 유전자의 녹-인 배성줄기세포를 제조하기 위한 도식이다.

도 1B는 GSC 유전자를 프로브로서 이용하는 상동 재조합형 배성줄기세포의 써던 블롯팅(southern blotting) 분석의 결과를 나타낸 것이다.

도 2는 분화 유도에 의한 GFP-양성세포의 출현을 나타내는 세포 선별, 및 GFP-양성세포에서만 구스코이드가 발현하고 있는 것을 나타내는 RT-PCR의 결과이다.

도 3은 세포 선별에 의해 수득된 GFP-양성세포에서 유전자 발현의 패턴을 나타낸 것이다.

도 4는 액티빈 A를 첨가한 무혈청 배지에 의한 Gsc-GFP-양성세포의 분화 유도의 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 GFP-양성세포의 비율이 액티빈 A의 농도 의존적으로 증가하는 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 GFP-양성세포의 분화 유도에 대한 BMP-4 및 bFGF의 영향을 나타낸 것이다.

도 7은 GFP 양성세포에서 E-카드헤린의 발현 패턴을 나타낸 것이다.

도 8A는 GFP-양성, E-카드헤린-양성세포로부터 상피모양 세포의 분화 및 그의 세포 형태를 나타낸 것이다.

도 8B는 GFP-양성, E-카드헤린-양성세포로부터 상피모양 세포에서의 세포 계열 특이적인 유전자의 발현을 나타낸 것이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

(1) 본 발명은 다능성 줄기세포로부터 생체외에서 분화된 내배엽 줄기세포로서, 오거나이저-특이적 마커 양성 및 E-카드헤린 양성인 세포를 제공한다.

본 발명에서 용어 "다능성 줄기세포"는 외배엽, 중배엽 및 내배엽계 줄기세포로부터 선택되는 적어도 하나의 세포로 분화하는 능력을 갖고 자기복제가 가능한 줄기세포를 의미하며, 이것에는 배성줄기세포(embryonic stem cell: ES 세포), 배성 생식세포(embryonic gemc el1: EG 세포), 배성 암세포(embryonal carcinoma cel1: EC 세포), 다능성 성체 전구세포(multipotent adult progenitor ce11s: MAP 세포), 성체 다능성 줄기세포(adult pluripotent stem cell: APS 세포) 및 골수 줄기세포 등이 포함된다. 인간, 원숭이, 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼, 기니 피그, 소, 돼지, 개, 말, 고양이, 염소, 양을 포함하는 포유류, 조류, 파충류등의 다양한 동물로부터 유래하는 다능성 줄기세포를 사용할 수 있지만, 보통은 포유류로부터 유래하는 것을 사용한다.

본 발명에서 용어 "배성줄기세포"는 초기 배에 존재하는 분화 다능성을 갖는 세포이고, 다른 배반포내로 주입되면 생식 세포도 포함하는 여러가지 세포로 분화할 수 있는 세포를 의미한다. 본 발명에서, 포배내의 내부 세포 덩어리보다 새롭게 수립된 배성줄기세포를 사용할 수도 있고, 또는 이미 수립된 세포 계통을 사용할 수도 있다.

본 발명에서 용어 "내배엽계 줄기세포"는 내배엽계 조직에 속하는 세포로 분화되는 중간 줄기세포로서, 중배엽 및 외배엽계 조직에 속하는 세포로는 분화되지 않는 세포를 의미한다. 모체내의 마우스 발생에서, 발생 6.5일부터 7.5일에 걸쳐서 일어나는 원장배 형성 동안, 포배를 형성하는 상피 조직의 일정 영역으로부터 이탈한 예정 중배엽세포가 배아의 내부로 들어가고 예정 외배엽과 예정 내배엽사이로 이동하여 예정 중배엽을 형성한다. 이들 예정 외배엽, 예정 내배엽 및 예정 중배엽을 구성하는 세포가 각각 외배엽계 줄기세포, 내배엽계 줄기세포 및 중배엽계 줄기세포이다.

본 발명에서 용어 "중간 줄기세포"는 다능성 줄기세포의 분화가 진행된 세포로서, 외배엽, 중배엽 또는 내배엽계 줄기세포중 어느 하나, 또는 이들의 혼합물을 의미한다. 따라서, 중간 줄기세포는 외배엽, 중배엽 또는 내배엽 세포중 어느 하나로 분화되는 능력을 갖는 세포로 표현할 수 있다.

세포이식 치료를 위해서는, 시험관내(생체외)에서 배성줄기세포를 분화시켜 특정 배엽계로 분화하는 중간 줄기세포를 출현시키고 추가로 그것을 정제하여 1종류의 중간 줄기세포를 제조하는 것이 요구된다. 세포이식 치료에 이용되는 세포 재료로서, 중간 줄기세포는 성숙세포보다 하기 관점에서 이용가치가 높다.

(1) 대부분 조직의 성숙세포는 증식능이 낮지만, 중간 줄기세포의 생체외 증식능은 훨씬 높다. 즉, 적절한 조건이 갖춰지면, 생체외에서 강제적으로 증폭시키는 것이 가능하다.

(2) 1 종류의 중간 줄기세포가 다종류의 성숙세포로 분화되기 때문에, 치료 효과를 비교한 경우 적은 수의 세포로 보다 높은 성과를 나타낼 수 있다.

본 발명에서 용어 "오거나이저-특이적 마커"는 오거나이저에 특이적으로 발현하고 있는 단백질을 의미하고, 마우스의 경우 구스코이드(Gsc), HNF-3β, 및 Lim1을 포함한다. 구스코이드 유전자는 호모박스 도메인(homobox domain)을 갖는 전사인자이고, 오거나이저에 발현하는 유전자 중에서도 오거나이저에 특이적으로 발현하는 것으로 밝혀졌다(문헌 [in Principles of Development, Lewis Wolpert, OXF0RD Press, 2002, pl05]). 본 발명에 사용되는 오거나이저-특이적 마커는 하나 또는 2 이상일 수 있다.

오거나이저-특이적 마커인 HNF-3β는 문헌 [Ang, S.-L. and Rossant, J. (1994), Cel1 78, 561-574], 문헌 [Weinstein, D.C. et al.,(1994), Cel1 78, 575- 588]) 등에 기재되어 있고, Lim1은 문헌 [Shawlot, W et al., (1995) Nature, 374, 425-430]에 기재되어 있다.

E-카드헤린은 세포사이의 접착을 담당하는 막 관통형의 막단백질이며(문헌 [Annu.Rev.Cel1, Dev. Biol., 1997:13, 119-146]), E-카드-결손 마우스는 매우 이른 시기의 태생 치사인 것이 알려져 있다.

이러한 태양에서, 오거나이저-특이적 마커에 표지 단백질이 융합되어 있거나 마커 유전자가 표지단백질 유전자로 치환되어 있는(유전자 녹-아웃법) 세포가 바람직하다. 표지 단백질로서는, 녹색 형광 단백질(GFP), 또는 형광 활성화 세포분류기(FACS)로 이용 가능한 모든 단백질, 예컨대 dsRSD를 이용할 수 있다. 융합은 당업자에게 공지된 유전자 공학적 방법, 예컨대 상동 재조합 및 유전자 도입에 의해 수행될 수 있다.

본 발명에서 어떤 분자에 대한 "양성(+)"이라는 용어는 세포가 상기 분자를 발현하고 있는 것을 의미하고, "음성(-)"은 발현하고 있지 않는 것을 의미한다. 세포가 어떤 분자를 발현하고 있는지의 여부는 FACS등에 의해 판정할 수 있다.

본 발명에서 용어 "생체외"는 반응 또는 배양이 배를 포함하는 생체외에서 실시되는 것을 의미한다. 세포를 생체외에서 배양 및/또는 분화시키는 경우 세포 육성에 적합한 모든 배지, 시약 및 용기를 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어 "생체내"는 반응 또는 배양이 배아를 포함하는 생체내에서 실시되는 것 또는 어떤 현상이 생체내에서 일어나는 것을 의미한다.

(2) 본 발명의 다른 태양으로서, a)다능성 줄기세포를 배양하고, b)오거나이저-특이적 마커 및 E-카드헤린을 발현하고 있는 세포를 선별하여 분리하는 것을 특징으로 하는 내배엽계 줄기세포의 제조 방법을 제공한다.

상기의 제조 방법에서는, 바람직하게는 오거나이저-특이적 마커에 표지 단백질을 융합시키거나 마커 유전자를 표지 단백질 유전자로 치환한다(유전자 녹-아웃법). 이 경우, 표지 단백질의 표지를 지표로 하여 세포 분류기, 바람직하게는 형광 활성화 세포분류기(FACS)에 의해 목적하는 세포를 선별한다.

FACS는 보통 유동 세포 계산기(flow cytometer), 레이저 발생장치, 광학계, 데이터 처리장치 및 세포 분취장치를 구비하고 있다. FACS의 기능은 형광 표지세포의 자동 분리 및 형광 강도의 컴퓨터에 의한 분석이다. FACS에 의해, 특정 물질로 형광 표지된 세포에 좁은 유로의 도중에 레이저광을 조사하고, 산란광(전방 산란광 및 측방 산란광) 및 형광의 시그널 정보를 개개의 세포마다 측정하고, 그 결과를 예컨대 도수 분포로서 표시하고, 특정한 시그널 정보를 발하는 세포를 분취하는 것이 가능하다. FACS의 장치는 벡톤-딕킨슨(Becton-Dickinson)등으로부터 시판되고 있고, 제조자의 지시에 따라 당업자가 조작할 수 있다.

E-카드헤린 양성은 항-E-Cad 항체를 사용하여 판정한다. 또한, 그 분자 발현에 기초하여 세포를 선별하기 위해서는 형광 활성화 세포분류기(FACS)를 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체 중 어느 것이라도 가능하지만, FACS에 사용하는 경우 모노클로날 항체가 바람직하다. 이러한 항체는 실시예에 기재된 방법을 참조하여 당업자가 제조할 수 있지만, 시판되는 것을 사용할 수도 있다. 항-E-카드헤린 모노클로날 항체는 다카라 슈조(Takara Shuzo)로부터 시판되고 있고(제품 번호 Ml08), 또는 당업자에게 주지된 방법에 의해 용이하게 제조할 수 있다.

또한, E-카드헤린 양성은 E-카드헤린의 세포내 mRNA의 존재를 지표로 하여 선별할 수 있다.

배성줄기세포의 배양에는 세포의 유지 또는 분화의 목적에 적합한 조성의 배지를 사용한다. 배성줄기세포를 유지하기 위한 배지는 보통 세포 배양용 최소 배지에 혈정, LIF, L-글루타민, 2-머캅토에탄올 등을 첨가한 것이고, 조성의 예를 들면, 85% 녹아웃 디-멤(KNOCKOUT D-MEM), 15% FBS, 10^-4M 2-ME, 2mM L-글루타민, 0.lmM NEAA 및 1000U/ml LIF이다. 또한, 배성줄기세포를 분화하기 위한 배지는 보통 세포 배양용 최소 배지에 혈청, L-글루타민, 2-머캅토에탄올 등을 첨가한 것이고, LIF는 함유하지 않는다. 조성의 예를 들면, 90% α-MEM, 10% FBS, 5 xl0^-5M 2-ME, 2mM L-글루타민이다. 각 배지에는 항생 물질등의 배양에 유용한 다른 물질을 첨가할 수 있고, 각 성분 대신 그와 동등한 기능을 갖는 대체물을 사용할 수도 있다. 또한, 배지의 각 성분은 각각 적합한 방법으로 멸균하여 사용한다.

본 발명에 따른 배성줄기세포의 배양 방법에서의 구체적인 조작은 당해 기술 분야에서 공지된 조작 및 조건에 따라 수행할 수 있다. 예를 들면, 노리오 나카츠지(Norio NAKATSUJI): 실험의학 별책, 포스트 게놈시대의 실험 강좌 4 "줄기세포 및 클론연구 프로토콜", 요도샤(2001년); 호건,G(Hogan, G.) et al: 마우스 배의 조작: 실험 메뉴얼, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY(l994); Robertson, E.J.ed., 기형 및 배성줄기세포, 실용적 접근, IRL Press Oxford, UK(1987) 등의 기재 내용을 참고하여 적절히 결정할 수 있다.

본 발명의 어떤 실시태양은 배성줄기세포를 내배엽계 줄기세포로 분화시키는 단계를 포함한다. 배성줄기세포는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 분화시킬 수 있지만, 전형적으로는 콜라겐 IV로 코팅된 배양 용기내에서 액티빈의 존재 하에 LIF가 없는 무혈청 배지를 사용하여 배성줄기세포를 배양한다. 여기에 사용되는 액티빈은 TGF-β(트랜스포밍 증식인자-베타)과에 속하는 크기 24kD의 펩티드성 세포증식/분화인자이고, 2개의 베타-서브유닛(β-subunit)이 S-S 결합을 통해서 2량체를 구성하고 있으며(문헌 [Ling,N. et al., (1986) Nature, 321, 779-782]; 문헌 [Vale, W. et al., (1986) Nature, 321, 776-779]), 본 발명에서는 액티빈 A, B, C 및 D중 어느 것 또는 임의의 동물, 예를 들어 인간 및 마우스로부터의 액티빈도 사용할 수 있으며, 이들은 R&D로부터 입수가능하다. 이 중에서 액티빈 A가 바람직하게 사용된다. 사용되는 다능성 줄기세포의 유래 동물종과 동일한 유래의 액티빈을 이용하는 것이 바람직하며, 예컨대 인간 유래의 다능성 줄기세포를 출발 원료로 사용하는 경우, 휴먼 액티빈 A를 이용하는 것이 바람직하다. 액티빈의 농도는 lOng/㎖이상이 바람직하고, 1Ong/㎖가 가장 바람직하다. 그것보다 저농도일지라도 유도는 일어나지만 양성세포의 비율이 낮다.

또한, 액티빈과 함께 bFGF(염기성 피브로블래스트 성장인자)의 존재 하에 다능성 줄기세포를 배양하면, 보다 바람직하게 내배엽계 줄기세포로 분화시킬 수 있다. bFGF는 R&D로부터 입수가능하다. bFGF의 농도는 10ng/㎖이상이 바람직하고, 1Ong/㎖가 가장 바람직하다.

이러한 조건으로 배성줄기세포를 배양하면, 마우스의 배성줄기세포에서는 보통 4-6일째에 본 발명에 의한 정제에 적합한 내배엽계 줄기세포의 수가 최적으로 된다. 또는, 종래부터 실시되고 있는 배체 형성법(embryoid body formation method)에 의해서도 배성줄기세포를 내배엽계 줄기세포로 분화시킬 수 있다. 또한, 효율은 낮지만, 콜라겐 IV를 젤라틴이나 피브로넥틴 등으로 대체하여 배성줄기세포를 내배엽계 줄기세포로 분화시킬 수 있다(예를 들어, 문헌 [Wiles, M. et a1., Development, 111, 259-267, 1991] 참조).

(3) 본 발명은 다른 태양으로서, 본 발명의 내배엽계 줄기세포를 분화시켜 목적하는 내배엽 세포를 제조하는 방법, 및 이 제조 방법에 의해 수득되는 내배엽 세포를 제공한다.

이 분화 방법은 상기와 같은 방법에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 내배엽계 줄기세포로부터 분화하여 수득되는 내배엽 세포는 장차 위, 십이지장, 장관, 간장, 췌장, 대장으로 분화하는 세포이며, 그것은 약물의 개발, 호르몬 및 생리활성물질 등의 생산세포, 예를 들어 인슐린 생산세포로서 이용 하거나 임상적인 이용을 할 수 있다.

(4) 본 발명은 다른 태양으로서, 다능성 줄기세포로부터 목적하는 중간 줄기세포를 제조하는 방법을 제공한다. 이 태양에 있어서 목적하는 중간 줄기세포는 외배엽, 중배엽 또는 내배엽 세포중 어느 하나로 분화하는 능력을 갖는다. 이 방법은, a)다능성 줄기세포의 게놈중 소정의 마커 유전자 발현계에 적합하도록 표지 단백질의 유전자를 도입하여, 그것에 의해 소정의 마커 유전자 대신에 또는 이와 함께 상기 표지 단백질이 발현되도록 한다. 소정의 마커 유전자로서는 외배엽, 중배엽, 내배엽계 줄기세포 중 어느 하나로 특이적으로 발현하는 마커, 예를 들어 외배엽계 줄기세포이면 특이적 마커 유전자 속스1(SOXl)을, 중배엽계 줄기세포이면 특이적 마커 유전자 브라츄리(Brachyury) 또는 메조제닌(Mesogeninl)을, 내배엽계 줄기세포이면 특이적 마커 유전자 가타4(GATA4) 또는 속스17(SOX17)을 이용할 수 있다. 표적 단백질의 유전자 도입은 보통 상동 재조합이 사용되고, 그 외에 프로모터를 연결하는 트랜스제닉(transgenic)법이 이용될 수 있다.

이어서, 상기 표지 단백질의 표지를 지표로 하여 목적하는 중간 줄기세포를 선별하여 분리한다. 여기서 다능성 줄기세포가 배성줄기세포이고 표지 단백질이 녹색형광 단백질인 방법이 바람직하다.

이 태양의 방법은 다능성 줄기세포로부터 중간 줄기세포의 전구 세포(외배엽, 중배엽 또는 내배엽계 줄기세포중 어느 2개로 분화할 수 있는 단계의 세포)를 제조하는 방법에도 응용이 가능하다. 즉, 본 발명은 다능성 줄기세포로부터 중간줄기세포의 전구 세포를 제조하는 방법으로, a)다능성 줄기세포의 게놈중 소정의 마커 유전자의 발현계에 적합하도록 표지 단백질의 유전자를 도입하고, 그것에 의해 소정의 마커 유전자 대신에 또는 이와 함께 상기 표지 단백질이 발현되도록 하고, b)상기 표지 단백질의 표지를 지표로 하여 목적하는 중간 줄기세포를 선별하여 분리하는 것을 특징으로 하는 방법을 포함한다.

이하의 실시예는 본 발명의 한 태양을 나타내는 동시에 본 발명의 방법에 의해 제조된 내배엽계 줄기세포가 성숙세포로의 분화능을 갖는 것을 증명하는 것이다.

참조예 1 : 배성줄기세포의 유지

a. 재료

배성줄기세포를 유지하기 위해, 표 1의 시약 및 기구를 사용하였다.

배성줄기세포의 유지용 배지의 조성은 89% G-MEM, 1% FBS, 10% KSR, 10^-4M 2-Me, 2mM L-글루타민, 0.1mM NEAA 및 1000U/㎖ LIF이었다.

배성줄기세포로서는, 마우스 l29계통 유래의 EB5 세포(문헌 [Niwa H, et al., Genes and Development 1998,12; 2048-2060])를 사용하였다.

b.조작

6㎝ 디쉬를 젤라틴으로 코팅하였다. 이 디쉬에 2xl0⁵의 EB5 배성줄기세포를 파종하였다. 다음날, 배지를 1회 교환하였다. 2일째에 세포가 융합(confluent)하게 되면, 트립신을 사용하여 세포를 디쉬로부터 분리하고, 다시 2x10⁵의 농도로 젤라틴 코팅된 디쉬에 파종하였다. 배양은 37℃, 5% CO₂의 배양기에서 실시하였다.

참조예 2 : 배성줄기세포의 무혈청 배지로에서의 분화 유도

a. 재료

배성줄기세포의 분화 유도를 위해, 표 2의 재료를 사용하였다.

b. 배성줄기세포의 분화용 배지

SF-03 분말에 1리터의 증류수를 가하고, 부속의 NaHC0₃2.2g을 가하여 교반하였다. 다음으로 이산화탄소 가스를 배지의 색이 오렌지색이 될 때까지 첨가하였다. BSA를 농도가 0.1%, 2ME가 10^-4M이 되도록 첨가하고, 30분 초과동안 교반하였다. 마지막으로 여과 멸균했다.

c. 분화 유도 조작

바이오코트(BIOCOAT) 콜라겐 IV-코팅된 1Ocm 디쉬에 1x10⁵의 EB5 배성줄기세포를 파종하였다. 3-6일째에 세포 분리 완충액(인비트로겐)을 사용하여 세포를 분리하고 이후의 실험에 사용하였다.

참조예 3 : 팍스밴티지(FacsVantage)에 의한 GFP-양성세포 또는 GFP-양성, E-카드헤린-양성세포의 선별

a. 시약의 제조

표3의 시약을 사용하였다.

탈이온수 900㎖에 100㎖의 10x 한크 완충액과 10g의 BSA(최종농도 1%)를 첨가하여 잘 교반하였다. BSA가 용해된 후, 0.2μm 필터를 이용하여 멸균하였다. 이하에서는 수득된 용액을 한크 완충액이라 지칭한다.

b. 조작

분화 3-6일째의 분화 유도된 배성줄기세포를 세포 분리 완충액을 이용하여 분리한 후, 1% BSA 한크 완충액으로 1회 세정하였다. 다음으로, 세포를 10⁶당 l㎖의 1% BSA-한크 완충액에 용해하고, GFP-양성세포를 세포 선별에 의해 회수하였다. 또한, E-카드헤린에 대한 항체 염색을 하는 경우, 마우스 혈정을 10⁶당 10㎕ 첨가하고, 빙상에서 20분동안 배양하여 블로킹을 실시하였다. 다음으로, 바이오틴-표지된 E-카드헤린 항체를 가하여, 빙상에서 20분동안 배양하였다. 20분 후, 세포를 1% BSA-한크 완충액으로 1회 세정하였다. 상기 세포를 스트렙타비딘-알로파이코사이아닌(APC)을 함유하는 500㎕의 1% BSA-한크 완충액에 재용해하여, 빙상에서 20분동안 배양하였다. 마지막으로, 1% BSA-한크 완충액으로 2회 세정하고 10⁶당 1㎖의 1% BSA-한크 완충액에 용해하여, 세포 선별에 사용하였다. 한편, 표지 색소가 PE(파이코에리뜨린)인 경우에도 동일한 결과였다.

팍스밴티지(벡톤-딕킨슨; Becton-Dickinson)의 사용 방법은 부속의 가이드 북에 준했다. 노즐의 진동 빈도는 26000 정도, 레벨은 3V, 드롭 지연(drop delay)은 약 12-14로 실시하였다.

참조예 4 : 구스코이드-양성세포의 유지 및 분화

구스코이드(Gsc)-양성세포를 유지 및 분화하기 위해, 표 4의 시약 및 장비를 사용하였다.

b. 조작

바이오코트 콜라겐 IV-코팅된 10㎝ 디쉬에, 세포 선별된 GFP-양성세포를 파종하였다.

c. Gsc-양성세포의 유지 및 분화용 배지

유지 및 분화용 배지의 조성은 90% α-MEM, l0% FBS, 5xl0^-5M 2-ME 및 2mM L-글루타민이었다.

실시예 1

구스코이드-GFP 녹-인 배성줄기세포의 수립

통상적 방법(예컨대, 문헌 [Gu H, Zou YR, Rajewsky K., Ce11, 1993, 73, 1155-1164])에 따라 마우스 구스코이드 유전자의 개시 코든 ATG에 맞춰 녹색 형광 단백질(GFP)) 유전자를 삽입하여 조립물을 작성하고, 배성줄기세포에 도입하여 상동 재조합 클론을 얻는다(도 1 A).

목적하는 클론은 GSC(구스코이드) 유전자를 프로브로서 이용한 써던 블롯팅 분석에 의해 선별하였다. 상동 재조합이 일어나지 않은 정상세포에서는 힌드III(HindIII) 소화(消化)에 의해 6.5-kb-길이의 단편이 나타나는 한편, 상동 재조합 클론에서는 6.5 및 5.5kb 길이의 2 종류의 단편이 나타난다(도 1B). 또한, NEO 유전자가 완전히 제거되고 있는지를 확인하기 위해, NEO 프로브로 써던 블롯팅을 수행하여 시그널의 소실을 확인하였다(도 1B 오른쪽).

상기 조작을 행한 배성줄기세포를, 콜라겐 IV-코팅된 배양 플레이트에 LIF가 없이 혈청을 가한 분화용 배지와 함께 첨가하고, 37℃, 5% C0₂의 배양기에서 배양하면, 4 일째에 약 3% GFP-양성세포를 관찰하였다. 이 세포를 팍스밴티지를 이용하여 세포를 선별하고, RT-PCR법에 의해 구스코이드 유전자의 발현을 조사하였다. 그 결과, GFP-양성세포에서만 쿠스코이드의 발현이 나타났다(도 2). 이에 의해, GFP의 발현이 구스코이드의 발현과 일치하고 있는 것을 확인하였다.

이어서, 이 GFP-양성세포가 다른 노드(결절)세포 특이적 유전자를 발현하고 있는지의 여부를 비슷한 방식으로 RT-PCR를 이용하여 검토하였다(도 3). 흥미롭게도, 이 세포는 노드 세포 특이적 유전자 뿐만 아니라 내배엽 특이적 마커 유전자(GATA4, Sox17)도 특이적으로 발현하였다. 이 유전자 발현의 패턴은 노드 세포와 그 자손 세포의 패턴과 유사하다. 이것에 의해, 이 세포군이 이른바 중내배엽의 세포를 포함하고 있는 것이 밝혀졌다.

실시예 2

GSC-양성세포의 순화 조건의 확립

실시예 1에 나타낸 것과 같이, 혈청 첨가 배지에서는 GFP-양성세포가 2-3%로 출현하며 그 비율은 낮다. 우선 혈청이 있는 상태에서 액티빈 A, BMP-4(뼈형성 단백질-4), BMP-2, LiCl 등의 첨가로 변화가 보이는지를 비교 검토하였다. 그러나, 액티빈 A에서 다소의 효과가 보일 뿐이고, 큰 효과는 관찰할 수 없었다. 그래서 GSC-GFP-양성세포를 출현시키는 배양 조건의 검토를 무혈청 배지를 사용하여 같은액티빈 A, BMP-4, BMP-2, LiCl 등으로 비교 검토하였다. 구체적으로, 바이오코트 콜라겐 IV-코팅된 디쉬에 구스코이드 녹-인 배성줄기세포를 LIF가 없는 무혈청 의 상태에서 분화 유도용 배지를 이용하여 분화 유도를 시작하였다. 이 때 액티빈 A를 l0ng/㎖의 농도로 0일째부터 첨가하였다. 2 일째부터 6 일째까지의 GFP의 발현을 Facs를 이용하여 분석하였다. 그 결과, 액티빈 A를 가한 경우 6일째에 97%의 세포에 GFP 발현이 유도되었다(도 4). 한편, BMP-4, BMP-2, LiCl에서는 유도되지 않았다. 또한, 액티빈 A를 0, 0.3, 1, 10ng/㎖의 농도로 0일째부터 첨가하는 실험을 같은 방식으로 수행하여, 4 일째 GFP의 발현을 Facs를 이용하여 분석하였다. 이것에 의해, 액티빈 A가 농도 의존적으로 GFP-양성세포의 비율이 증가하는 것을 발견하였다(도 5). 이와 같이 수득된 세포에서 유전자 발현은 혈청 첨가시 수득된 GFP-양성세포와 같이 노드세포 특이적 유전자인 HNF-3β, Lim1 및 내배엽 특이적 유전자인 GATA-4, Sox17을 발현하였다.

다음으로, GFP-양성세포의 분화 유도에 기여하는 BMP-4 및 bFGF(염기성 피브로블래스트 성장인자)의 영향을 조사하였다.

바이오코트 콜라겐 IV-코팅된 디쉬에 구스코이드 녹-인 배성줄기세포를 LIF가 없는 무혈정의 상태에서 분화 유도용 배지를 이용하여 분화유도를 시작하였다. 이 때 액티빈 A를 3ng/㎖의 일정한 농도로, BMP-4 및 bFGF를 10ng/㎖의 농도로 첨가하였다. BMP-4 첨가에서는 Gsc-GFP-양성세포의 비율이 감소하여 억제 효과가 있는 한편, bFGF 첨가에서는 반대로 액티빈 A 단독 첨가보다도 증가되었다(도 6). 이로 인해, GFP-양성세포의 분화유도는 모든 성장인자로 유도되는 것은 아니고, 액티빈 A 및 bFGF가 그 능력을 갖는다는 것으로 이해된다(bFGF는 보조적임).

실시예 3

GFP-양성세포로부터 내배엽 세포의 분리 및 증식

GFP-양성세포의 분화능을 분석하기 위해, 내배엽 및 외배엽에 발현하고 있는 E-카드헤린의 발현 패턴이 배성줄기세포의 분화에 따라 어떻게 변화되는지를 분석하였다. 바이오코트 콜라겐 IV-코팅된 디쉬에 구스코이드 녹-인 배성줄기세포를 LIF가 없는 무혈청 상태에서 분화 유도용 배지를 이용하여 분화유도를 시작하였다. 이 때 액티빈 A를 10ng/㎖의 농도로 0 일째부터 첨가하였다. 4 일째, 5 일째, 6 일째 GFP의 발현 및 E-카드헤린의 발현을 Facs를 이용하여 분석하였다. 4일째는 GFP-양성세포의 대부분이 E-카드헤린 양성이었다. 분화가 진행됨에 따라 GFP-양성, E-카드헤린-음성세포가 출현하였고 그 비율이 증가하였다(도 7). 이 결과는, 구스코이드가 중배엽에서 발현한 것이라고 생각하여 GFP-양성, E-카드헤린-양성세포는 내배엽계 세포인 것을 나타낸다고 생각되었다.

이어서, GFP-양성 중 E-카드헤린-양성 및 음성의 세포로부터 상피모양 세포로의 분화를 시도하였다.

바이오코트 콜라겐 IV-코팅된 디쉬에 구스코이드 녹-인 배성줄기세포를 LIF가 없는 무혈청 상태에서 분화 유도용 배지를 이용하여 분화유도를 시작하였다. 이 때 액티빈 A를 10ng/㎖의 농도로 O 일째부터 첨가하였다. 6일째 GFP-양성/E-카드헤린-양성세포 및 GFP-양성/E-카드헤린-음성세포를 각각 E-카드헤린의 항체로 염색하고, 팍스밴티지를 이용하여 세포 선별에 의해 순화하였다. 이들의 세포를 혈청을 함유한 분화용 배지에서 배양하면, E-카드헤린-양성 분획으로부터는 상피모양 세포만이 효율적으로 출현하는 한편, E-카드헤린-음성 분획으로부터는 이와 같은 상피모양 세포의 출현은 거의 관찰할 수 없었다(도 8A). 이것은 GFP-양성세포, E-카드헤린-양성세포로부터 우선적으로 상피모양 세포가 출현하는 것을 의미한다.

다음으로, 상피모양 세포의 세포 계열을 조사하기 위해, 세포계열 특이적인 유전자의 RT-PCR법으로 분석하였다. 그 결과, 내배엽 특이적 마커인 HNF3b, Sox17, GATA4가 발현되고 있지만, 줄기세포나 췌장의 세포에서 발현되는 분자의 발현은 관찰되지 않았다(도 8B). 세포 형태(도 8A) 및 이 유전자 발현 패턴에 의해, 6일째의 GFP-양성, E-카드헤린-양성세포로부터 분화된 상피모양 세포는 내배엽 세포인 것이 밝혀졌다.

본 발명의 내배엽계 줄기세포는 내배엽 세포로 분화하고, 수득된 내배엽 세포는 장차 위, 십이지장, 장관, 간장, 췌장, 대장으로 분화하는 세포이다. 이 내배엽 세포는 약물의 개발에 이용할 수 있고 호르몬이나 생리활성물질 등의 생산세포, 예컨대 인슐린 생산세포로서의 이용하거나 임상적으로 이용할 수 있다.

Claims

다능성 줄기세포로부터 생체외에서 분화된 내배엽계 줄기세포로서, 오거나이저-특이적 마커 양성 및 E-카드헤린 양성인 세포.
제 1항에 있어서,

다능성 줄기세포가 배성줄기세포인 세포.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,

오거나이저-특이적 마커가 구스코이드인 세포.
제 3항에 있어서,

오거나이저-특이적 마커에 표지 단백질이 융합되어 있는 세포.
제 4항에 있어서,

표지 단백질이 녹색 형광 단백질(GFP)인 세포.
a) 다능성 줄기세포를 배양하고,

b) 오거나이저-특이적 마커 및 E-카드헤린을 발현하고 있는 세포를 선별하여 분리하는

것을 특징으로 하는 내배엽계 줄기세포의 제조 방법.
제 6항에 있어서,

선별 단계에서 세포 분리기를 이용하는 제조 방법.
제 6항 또는 제 7항에 있어서,

콜라겐 IV로 코팅된 배양 플레이트 상의 무혈청 배지중에서 액티빈의 존재 하에 다능성 줄기세포를 배양함으로써 다능성 줄기세포를 내배엽계 줄기세포로 분화시키는 제조 방법.
제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항에 기재된 내배엽계 줄기세포를 분화시켜 목적하는 내배엽 세포를 제조하는 방법.
제 9항에 있어서,

콜라겐 IV로 코팅된 배양 플레이트 상의 무혈청 배지중에서 액티빈의 존재 하에 내배엽계 줄기세포를 배양함으로써 내배엽계 줄기세포를 내배엽 세포로 분화시키는 제조 방법.
제 9항 또는 제 10항의 제조 방법에 의해 수득된 내배엽 세포.
다능성 줄기세포로부터 목적하는 중간 줄기세포를 제조하는 방법으로서,

a)다능성 줄기세포의 게놈중 소정의 마커 유전자의 발현계에 적합하도록 표지 단백질의 유전자를 도입하고, 그것에 의해 소정의 마커 유전자 대신에 또는 이와 함께 상기 표지 단백질이 발현되도록 하고,

b)상기 표지 단백질의 표지를 지표로 하여 목적하는 중간 줄기세포를 선별하여 분리하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 11항에 있어서,

다능성 줄기세포가 배성줄기세포이고, 표지 단백질이 녹색 형광 단백질인 제조 방법.
제 12항 또는 제 13항에 있어서,

중간 줄기세포가 내배엽계 줄기세포인 제조 방법.