WO2023054325A1 - 細胞表面マーカーを用いた下垂体細胞および視床下部細胞の分離法 - Google Patents

細胞表面マーカーを用いた下垂体細胞および視床下部細胞の分離法 Download PDF

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WO2023054325A1
WO2023054325A1 PCT/JP2022/035857 JP2022035857W WO2023054325A1 WO 2023054325 A1 WO2023054325 A1 WO 2023054325A1 JP 2022035857 W JP2022035857 W JP 2022035857W WO 2023054325 A1 WO2023054325 A1 WO 2023054325A1
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cell
pituitary
medium
culture
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侑 小谷
美穂 河田
弘 長崎
英隆 須賀
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学校法人藤田学園
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Definitions

  • the present invention relates to a method for separating and purifying pituitary hormone-producing cells and their progenitor cells and hypothalamic cells differentiated from pluripotent stem cells in vitro.
  • the pituitary gland is a small endocrine organ located in contact with the lower part of the diencephalon and plays a major role as a control center for various hormones. For example, it produces a variety of pituitary hormones, including adrenocorticotropic hormone (ACTH), which promotes the production of adrenocortical hormones essential for sustaining life, and growth hormone, which promotes the growth of children. As such, pituitary dysfunction causes severe systemic disease.
  • ACTH adrenocorticotropic hormone
  • Patent Document 1 non-patent.
  • References 1 and 2 a hypothalamic-pituitary composite tissue is formed in one cell mass by three-dimensional culture.
  • the adenohypophysis and its progenitor tissue are mainly located in the surface layer of the cell mass, and by exfoliating it and transplanting it under the renal capsule of hypophysectomized mice, activity, survival, and body weight Therapeutic effects such as amelioration of reduction have been confirmed (Patent Document 1, Non-Patent Document 1).
  • the above method relied on the experimenter's subjective judgment based on morphology to identify desquamated adenohypophysis and its progenitor tissue.
  • EpCAM EpCAM as a cell surface antigen for objective and reliable isolation of pituitary hormone-producing cells and their progenitor cells. It was found that pituitary hormone-producing cells and their progenitor cells can be effectively separated and purified from cell aggregates containing glandular pituitary gland and/or its progenitor tissue by sorting cells using EpCAM as an indicator. In addition, the separated and purified cells can be reaggregated and maintained in culture. It was found that the function of pituitary hormone-producing cells is equivalent to that of the pituitary hormone-producing cells in vivo.
  • the present invention identifies cell surface antigens other than EpCAM that can separate and purify pituitary hormone-producing cells and/or hypothalamic cells from the cell aggregates, and uses such cell surface antigens as indicators to identify target cells.
  • An object is to provide a separation method.
  • the present inventors analyzed the expression of surface antigens on the cell group that constitutes the hypothalamic-pituitary complex tissue, and found that CD49c (integrin ⁇ 3 ) were successfully identified.
  • CD49c integrated ⁇ 3
  • pituitary cells and hypothalamic cells can be simultaneously separated from cell aggregates derived from human pluripotent stem cells by sorting using the identified surface antigen CD49c as an indicator, and the separated cells can be reaggregated.
  • the inventors have found that cultured tissue with hormone-secreting ability equivalent to that of the hypothalamic-pituitary system in vivo can be produced.
  • the present inventors have also found that pituitary cells and hypothalamic cells can be separated separately by sorting using a combination of pituitary surface antigen (EpCAM) and CD49c, leading to the completion of the present invention.
  • EpCAM pituitary surface antigen
  • [1] Pituitary hormone-producing cells and/or their progenitor cells and the thalamus, comprising separating cells expressing CD49c from cell aggregates comprising glandular pituitary gland and/or its progenitor tissue and hypothalamic neuroepithelial tissue. A method for separating bottom cells.
  • [2] A method for isolating pituitary hormone-producing cells and/or their progenitor cells, comprising the step of isolating cells expressing CD49c and EpCAM from cell aggregates containing glandular pituitary and/or progenitor tissues thereof.
  • the method of [1] or [2], wherein the step of separating cells expressing CD49c or cells expressing CD49c and EpCAM comprises the following steps.
  • a first step of dispersing the cell aggregate into a cell population (2) a second step of culturing the cell population obtained in the first step on a culture vessel coated with laminin or a fragment thereof; and (3) expressing CD49c from the cell population obtained in the second step.
  • a third step of isolating cells or cells expressing CD49c and EpCAM [4] The method according to any one of [1] to [3], comprising separating cells negative for at least one cell surface antigen selected from the group consisting of CD90, CD29, CD44, CD58 and CD166. [5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the cell aggregate is obtained by inducing differentiation of pluripotent stem cells.
  • the progenitor tissue is pituitary placode and/or Rathke's pouch.
  • Pituitary hormone-producing cells and/or their progenitor cells and thalamus comprising separating cells expressing CD49c from cell aggregates comprising adenohypophysis and/or its progenitor tissue and hypothalamic neuroepithelial tissue
  • a method for manufacturing a lower cell [8] A method for producing pituitary hormone-producing cells and/or their progenitor cells, comprising the step of separating cells expressing CD49c and EpCAM from cell aggregates containing glandular pituitary and/or progenitor tissues thereof.
  • a method for producing a cell aggregate or cell sheet containing pituitary hormone-producing cells and/or progenitor cells thereof comprises the following steps. (1) a first step of dispersing the cell aggregate into a cell population; (2) a second step of culturing the cell population obtained in the first step on a culture vessel coated with laminin or a fragment thereof; and (3) expressing CD49c from the cell population obtained in the second step.
  • a third step of isolating cells or cells expressing CD49c and EpCAM The method according to any one of [7] to [11], further comprising separating cells negative for at least one cell surface antigen selected from the group consisting of CD90, CD29, CD44, CD58 and CD166.
  • the pituitary hormone-producing cells are growth hormone (GH)-producing cells, prolactin (PRL)-producing cells, adrenocorticotropic hormone (ACTH)-producing cells, thyroid-stimulating hormone (TSH)-producing cells, and follicle-stimulating hormone (FSH)-producing cells.
  • GH growth hormone
  • PRL prolactin
  • ACTH adrenocorticotropic hormone
  • TSH thyroid-stimulating hormone
  • FSH follicle-stimulating hormone
  • LH luteinizing hormone
  • a therapeutic agent for transplantation comprising the cell aggregate or cell sheet produced by the method according to any one of [9] to [13].
  • the transplantation therapeutic agent according to [15] for treating diseases based on adenohypophysis disorders and/or damaged states of the adenohypophysis.
  • the group of diseases based on adenohypophysis disorders consisting of panhypopituitarism, pituitary dwarfism, adrenal hypocortical insufficiency, partial hypopituitarism and isolated anterior pituitary hormone deficiency.
  • the transplantation therapeutic agent of [16] which is selected from [18] A therapeutic agent for a disease based on adenohypophysis disorder or a state of adenohypophysis damage, comprising the cell aggregate or cell sheet produced by the method according to any one of [9] to [13]. .
  • a therapeutic agent for a disease based on adenohypophysis disorder or a state of adenohypophysis damage comprising the cell aggregate or cell sheet produced by the method according to any one of [9] to [13]. .
  • Based on glandular pituitary disorders including transplanting an effective amount of the cell aggregate or cell sheet produced by the method according to any one of [9] to [13] to a subject in need of transplantation A method of treating a disease or damaged condition of the adenohypophysis.
  • cell populations containing functional pituitary hormone-producing cells and/or their progenitor cells and hypothalamic cells can be efficiently extracted from cell aggregates derived from pluripotent stem cells. It can be separated and purified.
  • the isolated and purified cell population exhibits excellent pituitary hormone secretion ability by physiological pituitary hormone secretion stimulation, and can function in cooperation with hypothalamic cells. Treatment of diseases related to the pituitary gland can be performed.
  • the results of immunostaining of human ES cell (hESC)-derived cell clusters are shown. EpCAM was confirmed to be expressed in the pituitary and cystic areas. The results of immunostaining of hESC-derived cell clusters (Day 152) are shown. CD49c was confirmed to be expressed in the pituitary region and some non-pituitary regions (mainly believed to be hypothalamic nerve tissue). The results of immunostaining in undifferentiated regions of hESC-derived cell clusters (Day 152) are shown. It was confirmed that EpCAM is expressed in the undifferentiated cell region, but CD49c is not expressed. The results of immunostaining in serial sections of undifferentiated regions of hESC-derived cell clusters (Day 152) are shown.
  • the region enclosed by the dotted line is considered to be the hypothalamic cell region because it expresses hypothalamic markers (Rx::Venus) and/or neuronal markers (Tuj1, DCX).
  • Rx::Venus hypothalamic markers
  • Tuj1, DCX neuronal markers
  • EpCAM was not expressed, but CD49c was confirmed to be widely expressed.
  • Fig. 4 shows improvement in cell viability by iMatrix-511 adhesion treatment using reaggregation ability as an index.
  • Method A hESC-derived cell clusters (Day 448) induced by the Feeder-free differentiation method were dispersed, treated with either Method A or Method B below, reaggregated at 15,000 cells, and observed 3 days later.
  • Method A Collect viable cells with MACS Dead Cell Removal KitMethod
  • B Collect iMatrix-511 adherent cell fractionThe dotted line indicates the outline of the clump, and the cells surrounding the clump are mostly dead cells. rice field.
  • the iMatrix-511 adherent cell fraction (Method B) was confirmed to have fewer dead cells and form larger clumps.
  • the results of immunostaining of reaggregated masses (Day 7) after iMatrix-511 adhesion treatment are shown. Reaggregates expressed pituitary markers (ACTH, Lhx3) and hypothalamic markers (Rx::Venus), and many Rx::Venus-positive cells co-expressed neuronal markers (Tuj1). It was confirmed that This result demonstrated that pituitary cells and hypothalamic cells were recovered as the iMatrix-511 adherent fraction.
  • CD49c-positive cells have high basal ACTH secretion and increase ACTH secretion in response to CRH, a physiological secretory stimulator, whereas CD49c-negative cells have low basal ACTH secretion and do not respond to CRH. was confirmed. This demonstrated that ACTH cells were separated into CD49c-positive cells. Determine the fluorescence intensity range between CD49c-positive and CD49c-negative cells by fluorescence-activated cell sorting (FACS), separate CD49c-positive and CD49c-negative cells, and measure the size of reaggregates on Day 8 and The results of comparison on day 36 are shown.
  • FACS fluorescence-activated cell sorting
  • CD49c-positive cells Due to the autofluorescence of cells, it is difficult to distinguish between CD49c-positive cells and CD49c-negative cells only with fluorescent staining of CD49c. Therefore, simultaneous fluorescence staining of CD49c and SSEA5, a marker of undifferentiated cells, is used as an index for determining the fluorescence intensity range of CD49c-negative cells.
  • a cell population (dotted line area) that highly expresses SSEA5 is an undifferentiated cell. In subsequent experiments, a cell population obtained by sorting CD49c-positive cells was used so as not to contaminate undifferentiated cells.
  • C Shows the results of quantifying the size (area) of reaggregates.
  • CD49c-positive cells show that in CD49c-positive cells, enlargement of cell clusters was remarkably suppressed by removing proliferative cells including undifferentiated cells.
  • day 36 Day 36
  • CD49c-positive cells there are cell clusters with large changes in some areas. Since these are considered to be cell aggregates in which proliferative cells remain, therapeutic cells can be purified by removing these cell aggregates on the basis of area or morphology.
  • CD49c-positive cells were separated by FACS, and ACTH secretion ability after reaggregation of the cells is shown.
  • A Shows the results of measuring the amount of ACTH secretion per cell cluster before and after CRH stimulation.
  • hiPSC samples also have a similar expression pattern of surface markers. was done. The results of measuring the amount of ACTH secreted per cell mass before and after CRH stimulation by hiPSC samples are shown. As a test method, cell aggregates that were reaggregated after FACS purification from hiPSC samples and cultured for 21 days were used.
  • the cell clumps were transferred one by one to a 1.5 ml microtube and incubated in 250 ⁇ l of standard glucose medium (glucose-free DMEM + 5.56 mM D-glucose + 4.44 mM D-mannitol) at 37°C for 30 minutes, then the medium was collected. . Subsequently, the medium was collected after incubation at 37°C for 30 minutes in 250 ⁇ l of standard glucose medium containing 1 ⁇ g/ml CRH (Peptide Institute, #4136-s). The ACTH concentration in the recovered medium was measured by the ECLIA method used in clinical laboratory tests.
  • CD49c-positive cells have high basal ACTH secretion and increase ACTH secretion in response to CRH, a physiological secretory stimulator, whereas CD49c-negative cells have low basal ACTH secretion and do not respond to CRH. was confirmed. This demonstrated that ACTH cells were separated into CD49c-positive cells in hiPSC samples as in hESC-derived cells.
  • FIG. 10 shows surface marker search results of mesenchymal stem cell-like proliferative cells using exfoliated tissue.
  • the proliferating cells appear as detached tissue from cell clumps in culture.
  • Desquamated tissues from hiPSC samples were collected, treated with 10x TrypLE select to disperse (almost completely single cells), fluorescently stained for stem cell lineage surface markers, and positive rates were quantified using a flow cytometer. bottom.
  • the expression of the 6 types of markers shown in the figure was confirmed in the exfoliated tissue. These are known to be expressed in mesenchymal stem cells (MSCs), and CD90 in particular is one of the major markers highly expressed in MSCs. From this result, it was confirmed that the proliferative cells in the desquamated tissue express a common surface antigen with mesenchymal stem cells.
  • the present invention contains a glandular pituitary gland and / or its progenitor tissue, optionally further comprising a hypothalamic neuroepithelial tissue from cell aggregates (hereinafter also referred to as "cell aggregates before cell separation”). , a method for isolating pituitary hormone-producing cells and/or their progenitor cells, and optionally further hypothalamic cells (hereinafter sometimes referred to as "the isolation method of the present invention”).
  • the separation method of the present invention is characterized by including the step of separating cells from the cell aggregates using expression of CD49c and/or EpCAM as an index.
  • the cell aggregates used in the separation method of the present invention can typically be obtained by culturing aggregates of pluripotent stem cells.
  • Pluripotent stem cells are daughter cells that have the ability to differentiate into all the cells that make up the body (pluripotency) and have the same differentiation potential as the self through cell division. It refers to cells that have the ability to produce (self-renewal ability).
  • Pluripotency can be evaluated by transplanting the cells to be evaluated into nude mice and examining the presence or absence of teratoma formation containing cells of each of the three germ layers (ectoderm, mesoderm, and endoderm). can.
  • pluripotent stem cells examples include embryonic stem cells (ES cells), embryonic germ cells (EG cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), and embryonic tumor cells (EC cells). As long as the cell has both pluripotency and self-renewal ability, it is not limited to this.
  • ES cells or iPS cells are preferably used.
  • the above-mentioned pluripotent stem cells are ES cells or any cells derived from human embryos, the cells may be cells produced by destroying embryos or those produced without destroying embryos. Although it may be, preferably the cell is produced without destroying the embryo.
  • Human ES cells used in the present invention are established from human embryos within 14 days of fertilization.
  • Fused ES cells obtained by cell fusion of ES cells and somatic cells are also included in the ES cells used in the methods of the present invention.
  • ES cells can be obtained from designated institutions, and can also be purchased commercially.
  • human ES cells KhES-1, KhES-2 and KhES-3 are available from the Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University.
  • EG cells can be established by culturing primordial germ cells in the presence of LIF, bFGF, SCF (Matsui et al., Cell, 70, 841-847 (1992), Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(23), 13726-13731 (1998), Turnpenny et al., Stem Cells, 21(5), 598-609, (2003)).
  • iPS cells are cells that have artificially acquired pluripotency and self-renewal ability by exposing somatic cells (e.g., fibroblasts, skin cells, lymphocytes, etc.) to nuclear reprogramming factors.
  • somatic cells e.g., fibroblasts, skin cells, lymphocytes, etc.
  • nuclear reprogramming factors consisting of Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc into somatic cells (e.g. fibroblasts, skin cells, etc.) (Cell, 126: p 663-676, 2006). Since then, many researchers have made various improvements to combinations of reprogramming factors and methods of introducing factors, and various iPS cell production methods have been reported.
  • the nuclear reprogramming factor is a substance (group) capable of inducing cells having pluripotency and self-renewal ability from somatic cells such as fibroblasts, it is a protein factor or a nucleic acid encoding it (vector (including a form incorporated in a device), or may be composed of any substance such as a low-molecular-weight compound.
  • the nuclear reprogramming factor is a proteinaceous factor or a nucleic acid encoding it, the following combinations are preferably exemplified (only the name of the proteinaceous factor is described below).
  • a combination of 4 factors, (2) a combination of 3 factors, and (5) 6 factors are preferred. .
  • (1) a combination of 4 factors and (2) a combination of 3 factors are more preferable.
  • the four factors Oct3/4, Klf4, Sox2 and c-Myc, or Five factors plus Lin28 or Nanog are preferred.
  • iPS cells are preferably used for autologous transplantation.
  • Pluripotent stem cells whose genes on the chromosome have been modified using known genetic engineering techniques can also be used in the present invention.
  • Pluripotent stem cells can be obtained by knocking in a marker gene (e.g., a fluorescent protein such as GFP) in-frame to a gene encoding a differentiation marker using a known method, and by using the expression of the marker gene as an index, the corresponding differentiation stage. It may be a cell that is identifiable that it has reached
  • pluripotent stem cells for example, homeothermic animal, preferably mammalian pluripotent stem cells can be used. Mammals include, for example, rodents such as mice, rats, hamsters and guinea pigs, laboratory animals such as rabbits, livestock such as pigs, cows, goats, horses and sheep, pets such as dogs and cats, humans, monkeys, Primates such as orangutans and chimpanzees can be mentioned.
  • the pluripotent stem cells are preferably rodent (mouse, rat, etc.) or primate (human, etc.) pluripotent stem cells, most preferably human pluripotent stem cells.
  • Pluripotent stem cells can be maintained and cultured by a method known per se.
  • pluripotent stem cells are preferably maintained by serum-free culture using a serum substitute such as Knockout TM Serum Replacement (KSR) or feeder-free cell culture.
  • KSR Knockout TM Serum Replacement
  • the pluripotent stem cells used in the present invention are preferably isolated.
  • isolated means that an operation has been performed to remove factors other than the target cells and components, and that the state of being present in nature has been removed.
  • Purity of "isolated human pluripotent stem cells” is usually 70% or higher, preferably 80% or higher, more preferably 90% or higher, even more preferably is 99% or more, most preferably 100%.
  • aggregates of pluripotent stem cells There is no particular limitation on the method for preparing aggregates of pluripotent stem cells. It may be cultured (ie, floating culture) or cultured under adhesive conditions (ie, adherent culture). In a preferred embodiment, aggregates of pluripotent stem cells are obtained by culturing dispersed pluripotent stem cells in a culture vessel under non-adherent conditions (i.e., suspension culture) to obtain a plurality of pluripotent stem cell aggregates. It can be obtained by assembling sex stem cells to form aggregates.
  • the culture vessel used for this aggregate formation is not particularly limited, but examples include flasks, tissue culture flasks, dishes, petri dishes, tissue culture dishes, multidishes, microplates, microwell plates, micropores, and multiplates. , multiwell plates, chamber slides, petri dishes, tubes, trays, culture bags, and roller bottles.
  • the incubator is preferably cell non-adherent so as to allow culture under non-adherent conditions.
  • Non-cell-adhesive incubators include those whose surface has been artificially treated to make it non-adhesive to cells, and those that have been artificially treated for the purpose of improving adhesion to cells (e.g. , coating treatment with an extracellular matrix, etc.) can be used.
  • the medium used for forming aggregates can be prepared using the medium used for culturing mammalian cells as a basal medium.
  • the medium is not particularly limited as long as it can be used for culture.
  • a mixed medium of IMDM medium and Ham's F-12 medium is used.
  • the medium used for culture can be a serum-containing medium or a serum-free medium.
  • Serum-free medium means a medium that does not contain unprepared or unpurified serum, and a medium containing purified blood-derived components or animal tissue-derived components (e.g., growth factors) is classified as a serum-free medium. It shall be. From the viewpoint of avoiding contamination with chemically undetermined components, a serum-free medium is preferably used in the present invention.
  • the medium used for forming aggregates may contain a serum replacement.
  • Serum replacements may suitably contain, for example, albumin, transferrin, fatty acids, collagen precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol or 3' thiol glycerol, or equivalents thereof.
  • Such serum substitutes can be prepared, for example, by the method described in WO98/30679.
  • commercially available serum substitutes can be used. Examples of such commercially available serum substitutes include KSR (knockout serum replacement) (manufactured by Invitrogen), Chemically-defined Lipid concentrated (manufactured by Gibco), and Glutamax (manufactured by Gibco).
  • the medium used to form aggregates can contain other additives to the extent that they do not adversely affect the induction of differentiation from pluripotent stem cells to the pituitary gland, its partial tissues, or its progenitor tissues.
  • Additives include, for example, insulin, iron sources (e.g., transferrin), minerals (e.g., sodium selenate, etc.), sugars (e.g., glucose, etc.), organic acids (e.g., pyruvic acid, lactic acid, etc.), serum proteins (e.g., albumin, etc.). ), amino acids (e.g.
  • L-glutamine, etc. L-glutamine, etc.
  • reducing agents e.g., 2-mercaptoethanol, etc.
  • vitamins e.g., ascorbic acid, d-biotin, etc.
  • antibiotics e.g., streptomycin, penicillin, gentamicin, etc.
  • buffering agents For example, HEPES, etc.
  • the medium used for forming aggregates may be the medium used in the first culture step, which will be described later.
  • pluripotent stem cells When forming aggregates of pluripotent stem cells, first, pluripotent stem cells are collected from subculture and dispersed to a single cell or a state close to it. Dispersion of pluripotent stem cells is performed using a suitable cell dissociation solution.
  • a suitable cell dissociation solution for example, EDTA; trypsin, collagenase IV, proteolytic enzymes such as metalloprotease, and the like can be used alone or in appropriate combination. Among them, those with low cytotoxicity are preferred, and commercially available products such as dispase (Edia), TrypLE (Invitrogen), and Accutase (MILLIPORE) are available as such cell dissociation solutions.
  • the dispersed pluripotent stem cells are suspended in the medium.
  • ROCK Rho-associated coiled-coil kinase
  • the concentration of the ROCK inhibitor used for suspension culture is a concentration that can suppress cell death of pluripotent stem cells induced by dispersion.
  • concentrations are usually about 0.1-200 ⁇ M, preferably about 2-50 ⁇ M.
  • concentration of the ROCK inhibitor may be varied during the period of addition, eg, the concentration can be halved later in the period.
  • a suspension of dispersed pluripotent stem cells is sown in the above culture vessel, and the dispersed pluripotent stem cells are cultured in the culture vessel under non-adhesive conditions to obtain a plurality of multipotent stem cells.
  • Potent stem cells aggregate to form clumps.
  • a relatively large culture vessel such as a 10 cm dish
  • multiple pluripotent stem cell aggregates can be simultaneously formed in one culture compartment.
  • Methods for rapidly aggregating such dispersed pluripotent stem cells include, for example, the following methods: 1) A method of confining dispersed pluripotent stem cells in a culture compartment of relatively small volume (eg, 1 ml or less, 500 ⁇ l or less, 200 ⁇ l or less, 100 ⁇ l or less) and forming a single aggregate in the compartment. After confining the dispersed pluripotent stem cells, the culture compartment is allowed to settle.
  • culture compartments include multiwell plates (384 wells, 192 wells, 96 wells, 48 wells, 24 wells, etc.), wells in micropores, chamber slides, tubes, medium droplets in the hanging drop method, etc. can be, but are not limited to: Dispersed pluripotent stem cells confined in the compartment are forced to settle in one place by gravity, or adhere to each other to form one clump per culture compartment.
  • the shape of the bottom of multiwell plates, micropores, chamber slides, tubes, etc. is preferably U-bottomed or V-bottomed so that dispersed pluripotent stem cells can easily settle in one place. 2) A method in which dispersed pluripotent stem cells are placed in a centrifugation tube and centrifuged to precipitate the pluripotent stem cells at one location, thereby forming one aggregate in the tube.
  • the number of pluripotent stem cells to be seeded in one culture compartment is such that one aggregate is formed per culture compartment, and by the method of the present invention, in the aggregate, from the pluripotent stem cells, the pituitary gland or its
  • the number is usually about 1 ⁇ 10 3 to about 5 ⁇ 10 4 , preferably about 1 ⁇ 10 3 to about 1 ⁇ 10 3 per culture compartment.
  • About 2 ⁇ 10 4 , more preferably about 2 ⁇ 10 3 to about 1.2 ⁇ 10 4 pluripotent stem cells are seeded.
  • the pluripotent stem cells usually about 1 ⁇ 10 3 to about 5 ⁇ 10 4 , preferably about 1 ⁇ 10 3 to about 2 ⁇ 10 4 , or more per culture compartment.
  • one cell aggregate consisting of about 2 ⁇ 10 3 to about 1.2 ⁇ 10 4 pluripotent stem cells is formed.
  • the time to clump formation is such that one clump is formed per compartment, and by the method of the present invention, in the clump, the pluripotent stem cells to the pituitary gland or its subtissues, or its progenitor tissues.
  • efficient induction of differentiation to the target pituitary gland or its partial tissue, or its progenitor tissue can be expected. is preferably shorter.
  • pluripotent stem cell aggregates are formed within 24 hours, more preferably within 12 hours, even more preferably within 6 hours, and most preferably within 2 to 3 hours.
  • a person skilled in the art can appropriately adjust the time until the formation of aggregates by adjusting tools for aggregating cells, centrifugation conditions, and the like.
  • culture temperature is not particularly limited, but is, for example, about 30-40°C, preferably about 37°C.
  • CO 2 concentration is, for example, about 1-10%, preferably about 5%.
  • pluripotent stem cell aggregates By preparing a plurality of culture compartments under the same culture conditions and forming one pluripotent stem cell aggregate in each culture compartment, a qualitatively uniform population of pluripotent stem cell aggregates can be obtained. Obtainable.
  • the qualitative homogeneity of pluripotent stem cell aggregates was determined by the size and number of aggregates, macroscopic morphology, microscopic morphology and homogeneity by tissue staining analysis, expression of differentiation and undifferentiation markers and It can be evaluated based on the homogeneity, expression control and synchrony of differentiation markers, reproducibility of differentiation efficiency between aggregates, and the like.
  • the population of pluripotent stem cell aggregates used in the method of the present invention has a uniform number of pluripotent stem cells contained in the aggregates.
  • a population of pluripotent stem cell aggregates is “homogeneous”, 90% or more of the aggregates in the entire aggregate population are the average value of the parameter in the aggregate population ⁇ 10 %, preferably mean ⁇ 5%.
  • the cell aggregates before cell separation are aggregates of pluripotent stem cells, an osteogenic factor signaling pathway activator and sonic It can be obtained by a method including suspension culture in a medium containing a hedgehog (Shh) signaling pathway agent.
  • Shh hedgehog
  • the adenohypophysis refers to a tissue containing at least one type of pituitary hormone-producing cells in the anterior or middle lobe of the pituitary gland.
  • Pituitary hormone-producing cells include growth hormone (GH)-producing cells, prolactin (PRL)-producing cells, adrenocorticotropic hormone (ACTH)-producing cells, thyroid-stimulating hormone (TSH)-producing cells, and follicle-stimulating hormone (FSH)-producing cells.
  • GH growth hormone
  • PRL prolactin
  • ACTH adrenocorticotropic hormone
  • TSH thyroid-stimulating hormone
  • FSH follicle-stimulating hormone
  • pituitary hormone-producing cells can express EpCAM as a marker in addition to the expression of pituitary hormones specific to each cell type.
  • the glandular pituitary contains at least one, preferably two or more selected from the group consisting of GH-producing cells, PRL-producing cells, ACTH-producing cells, TSH-producing cells, FSH-producing cells, and LH-producing cells. Contains (2, 3, 4, 5 or 6) pituitary hormone-producing cells.
  • the glandular pituitary contains at least one, preferably two, more preferably three pituitary hormone-producing cells selected from the group consisting of GH-producing cells, PRL-producing cells, and ACTH-producing cells. including.
  • tissue refers to the structure of a cell population having a structure in which multiple types of cells with different morphologies and properties are three-dimensionally arranged in a certain pattern.
  • Progenitor tissues of the adenohypophysis include pituitary placode, Rathke's pouch, and the like.
  • the pituitary placode is a thickened structure that is formed in the epidermal ectoderm region (oral ectoderm) during embryogenesis and expresses at least the pituitary progenitor cell marker EpCAM and Lhx3 or Pitx1. obtained, preferably expressing all of EpCAM, Lhx3, and Pitx1.
  • Rathke's pouch refers to a bag-like structure formed by invagination of the pituitary placode.
  • Rathke's pouch may also express at least the pituitary progenitor cell markers EpCAM and Lhx3 or Pitx1, preferably all of EpCAM, Lhx3 and Pitx1.
  • pituitary progenitor cell markers expression of Isl1/2, Cytokeratin, etc. may be further confirmed in addition to the above.
  • cells capable of expressing at least EpCAM, which is a pituitary progenitor cell marker, and Lhx3 or Pitx1 are referred to as pituitary progenitor cells, and the progenitor cells preferably express all of EpCAM, Lhx3, and Pitx1. obtain.
  • pituitary progenitor cells are also referred to as progenitor cells of pituitary hormone-producing cells.
  • “cell aggregates before cell separation” include, for example, cell aggregates positive for at least one marker selected from LHX3, NKX2.1, PITX1 and ACTH. Further, examples of “cell aggregates before cell separation” include LHX3-, NKX2.1-, PITX1-, and ACTH-positive cell aggregates.
  • the cell aggregates before cell separation used in the separation method and production method of the present invention can be produced by the following method.
  • the method comprises floating culture of pluripotent stem cell aggregates in a medium containing an activator of osteogenic factor signaling pathway and an active substance of Shh signaling pathway, thereby producing hypothalamic neuroepithelial tissue and hypothalamic neuroepithelial tissue.
  • epidermal ectoderm including oral ectoderm
  • hypothalamic neuroepithelial tissue By further floating-culturing the cell aggregate containing epidermal ectoderm (including oral ectoderm) in a medium containing an activator of osteogenic factor signaling pathway and an active substance of Shh signaling pathway, 1) hypothalamic neuroepithelium and 2) obtaining cell clumps containing pituitary placode and/or Rathke's pouch (second culture step).
  • the first culture step differentiation of pluripotent stem cells into hypothalamic neuroepithelial tissue and epidermal ectoderm (including oral ectoderm) is induced, and the obtained hypothalamic neuroepithelial tissue and epidermal ectoderm (oral cavity) are induced.
  • a second culture step induces further differentiation of the epidermal ectoderm region (oral ectoderm) into the pituitary placode and/or Rathke's pouch. .
  • the cell aggregates before cell separation may be cell aggregates obtained by the second culture step.
  • “Suspension culture” of pluripotent stem cell aggregates means culturing the pluripotent stem cell aggregates in a medium under non-adhesive conditions to the incubator. This enables efficient induction of the glandular pituitary gland or its progenitor tissue, which has hitherto been difficult.
  • the medium used for suspension culture contains an activator of osteogenic factor signaling pathway and an active substance of Shh signaling pathway. Differentiation of pluripotent stem cells into hypothalamic neuroepithelial tissue and epidermal ectoderm is induced by the action of osteogenic factor signaling pathway activators and Shh signaling pathway agonists.
  • a substance that activates the osteogenic factor signaling pathway means any substance that activates a pathway in which a signal is transduced by the binding of the osteogenic factor and its receptor.
  • bone morphogenetic factor signaling pathway activators include BMP2, BMP4, BMP7, GDF5 and the like.
  • the bone morphogenetic factor signaling pathway activator is BMP4.
  • BMP4 will be mainly described below, the osteogenic factor signaling pathway activator used in the present invention is not limited to BMP4.
  • BMP4 is a known cytokine and its amino acid sequence is also known.
  • the BMP4 used in the present invention is mammalian BMP4.
  • Representative amino acid sequences of human BMP4 are NCBI accession numbers NP_001193.2 (updated June 15, 2013), NP_570911.2 (updated June 15, 2013), NP_570912.2 (updated June 15, 2013). updated on June 15), an amino acid sequence (mature human BMP4 amino acid sequence) obtained by removing the N-terminal signal sequence (1-24) from each of these amino acid sequences, and the like.
  • the Shh signal pathway agonist is not particularly limited as long as it can enhance signal transduction mediated by Shh.
  • Shh signal pathway agonists include proteins belonging to the Hedgehog family or fragments thereof (e.g., Shh, Ihh, Shh(C24II) N-Terminus, Shh(C25II) N-Terminus), Shh receptors, Shh receptor agonists , Purmorphamine, Smoothened Agonist (SAG) (3-Chloro-N-[trans-4-(methylamino)cyclohexyl]-N-[[3-(4-pyridinyl)phenyl]methyl]-benzo[b]thiophene-2- carboxamide) and the like, but are not limited to these. Among them, SAG is preferable.
  • a preferred combination of osteogenic factor signaling pathway activator and Shh signaling pathway agonist is BMP4 and SAG.
  • the concentration of the substance that activates the osteogenic factor signaling pathway in the medium can be appropriately set within a range that can induce the differentiation of pluripotent stem cells into hypothalamic neuroepithelial tissue and epidermal ectoderm in cell aggregates.
  • concentration is usually 0.01 nM or higher, preferably 0.1 nM or higher, more preferably 1 nM or higher.
  • the BMP4 concentration in the medium is typically 0.01-1000 nM, preferably 0.1-100 nM, more preferably 1-10 nM (eg, 5 nM).
  • Exogenous bone morphogenetic factor signaling pathway activators in particular, 1) actively induce the formation of epidermal ectoderm, and 2) induce the differentiation of neuroepithelial tissue in the hypothalamus, but not in the cerebrum, into cell aggregates. and is included in the medium at a concentration capable of achieving these effects.
  • the osteogenic factor signaling pathway activator may not be contained in the medium throughout the first culture step. For example, for 2 to 4 days (e.g., 3 days) from the start of suspension culture of aggregates of pluripotent stem cells, no bone morphogenetic factor signaling pathway activator is added to the medium, and then osteogenic factor signaling pathway Activating substances may be added to the medium.
  • the concentration of the Shh signaling pathway agent in the medium can be appropriately set within a range that can induce the differentiation of pluripotent stem cells into hypothalamic neuroepithelial tissue and epidermal ectoderm in cell aggregates.
  • SAG is used as a signal pathway agonist
  • its concentration is usually 1 nM or higher, preferably 10 nM or higher, more preferably 100 nM or higher.
  • the SAG concentration in the medium is typically 1 nM to 1000 ⁇ M, preferably 10 nM to 100 ⁇ M, more preferably 100 nM to 10 ⁇ M (eg, 2 ⁇ M).
  • Exogenous Shh signaling pathway agonists may achieve this effect, especially since they play a role in inducing the differentiation of the neuroepithelial tissue of the hypothalamus (preferably the ventral hypothalamus), but not the neural retina, into cell aggregates. contained in the medium at a concentration
  • the Shh signal pathway agonist may not be contained in the medium for the entire period of the first culture step. For example, for 5 to 7 days (e.g., 6 days) from the start of suspension culture of pluripotent stem cell aggregates, no Shh signaling pathway agonist is added to the medium, and then the Shh signaling pathway agonist is added to the medium. may
  • pluripotent stem cell aggregates are subjected to suspension culture for 2 to 4 days in a medium containing no osteogenic factor signaling pathway activator and Shh signaling pathway agonist, and then the resulting aggregates are , Floating culture for 2 to 4 days in a medium containing an activator of the osteogenic factor signaling pathway and not containing an active substance for the Shh signaling pathway, and the resulting aggregates were treated with an activator of the osteogenic factor signaling pathway and Shh signal. Culture in media containing pathway agonists until hypothalamic neuroepithelial tissue and epidermal ectoderm are induced.
  • the bone morphogenetic factor signaling pathway activator such as BMP4 used in the present invention is preferably isolated.
  • isolated means that an operation has been performed to remove the desired components and factors other than cells, and that the substance has escaped from its naturally occurring state. Therefore, "isolated protein X" does not include endogenous protein X produced from cells or tissues to be cultured.
  • the purity of "isolated protein X" (weight percentage of protein X to total protein weight) is usually 70% or higher, preferably 80% or higher, more preferably 90% or higher, still more preferably 99% or higher, Most preferably 100%.
  • the isolated osteogenic factor signaling pathway activator contained in the medium used for suspension culture is exogenously added to the medium. Accordingly, in one aspect, the invention comprises exogenously adding an isolated bone morphogenetic factor signaling pathway activator to the medium used in the first culturing step.
  • an inhibitor of Rho-associated coiled-coil kinase was added to suppress the cell death of pluripotent stem cells (especially human pluripotent stem cells) induced by dispersal.
  • ROCK Rho-associated coiled-coil kinase
  • a ROCK inhibitor is added, for example, within 15 days, preferably within 10 days, and more preferably within 6 days from the start of culture.
  • ROCK inhibitors include Y-27632 ((+)-(R)-trans-4-(1-aminoethyl)-N-(4-pyridyl)cyclohexanecarboxamide dihydrochloride) and the like.
  • the concentration of the ROCK inhibitor used for suspension culture is a concentration that can suppress cell death of pluripotent stem cells induced by dispersion.
  • concentrations are usually about 0.1-200 ⁇ M, preferably about 2-50 ⁇ M.
  • concentration of the ROCK inhibitor may be varied during the period of addition, eg, the concentration can be halved later in the period.
  • the medium used for suspension culture of cell aggregates can be prepared using the medium used for culturing mammalian cells as a basal medium.
  • the medium is not particularly limited as long as it can be used for culture.
  • a mixed medium of IMDM medium and Ham's F-12 medium is used.
  • the medium used for culture can be a serum-containing medium or a serum-free medium. From the viewpoint of avoiding contamination with chemically undetermined components, the medium used for suspension culture of cell aggregates is preferably a serum-free medium.
  • the medium used for suspension culture of cell aggregates may contain a serum substitute.
  • Serum replacements may suitably contain, for example, albumin, transferrin, fatty acids, collagen precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol or 3' thiol glycerol, or equivalents thereof.
  • serum substitutes can be prepared, for example, by the method described in WO98/30679.
  • commercially available serum substitutes can be used. Examples of such commercially available serum substitutes include KSR (knockout serum replacement) (manufactured by Invitrogen), Chemically-defined Lipid concentrated (manufactured by Gibco), and Glutamax (manufactured by Gibco).
  • the medium used for suspension culture of cell aggregates can contain other additives to the extent that they do not adversely affect differentiation induction from pluripotent stem cells to hypothalamic neuroepithelial tissue and epidermal ectoderm.
  • Additives include, for example, insulin, iron sources (e.g., transferrin), minerals (e.g., sodium selenate, etc.), sugars (e.g., glucose, etc.), organic acids (e.g., pyruvic acid, lactic acid, etc.), serum proteins (e.g., albumin, etc.). ), amino acids (e.g.
  • L-glutamine, etc. L-glutamine, etc.
  • reducing agents e.g., 2-mercaptoethanol, etc.
  • vitamins e.g., ascorbic acid, d-biotin, etc.
  • antibiotics e.g., streptomycin, penicillin, gentamicin, etc.
  • buffering agents For example, HEPES, etc.
  • the medium used for suspension culture of cell aggregates is specifically described herein from the viewpoint of not adversely affecting differentiation induction into hypothalamic neuroepithelial tissue and epidermal ectoderm. It is a growth-factor-free Chemically Defined Medium (gfCDM) containing no growth factors other than those added with serum substitutes (KSR, etc.).
  • growth factor as used herein includes Fgf; BMP; patterning factors such as Wnt, Nodal, Notch and Shh; insulin and Lipid-rich albumin.
  • Growth factor-free chemically defined media include, for example, gfCDM disclosed in Wataya et al, Proc Natl Acad Sci USA, 105(33): 11796-11801, 2008.
  • culture temperature is, for example, about 30-40°C, preferably about 37°C.
  • the CO 2 concentration is for example about 1-10%, preferably about 5%.
  • the O2 concentration is for example about 20%.
  • one pluripotent stem cell clump is placed in each well of a 96-well plate.
  • one pluripotent stem cell clump is added to activate the osteogenic factor signaling pathway.
  • Suspension culture is carried out in a medium containing a substance and an agent acting on the Shh signaling pathway.
  • any of the aspects 1) and 2) above may be adopted, and the aspect may be changed during the culture (1) to 2), or 2 ) to 1)).
  • the first culturing step employs the aspect of 1)
  • the second culturing step employs the aspect of 2).
  • the culture period may vary depending on the animal species of the pluripotent stem cells and the types of the osteogenic factor signaling pathway activator and the Shh signaling pathway active substance, so it cannot be specified unconditionally.
  • the first culture step is usually 15-20 days (eg, 18 days).
  • cell aggregates containing hypothalamic neuroepithelial tissue and epidermal ectoderm can be obtained.
  • hypothalamic neuroepithelial tissue is a neuroepithelial tissue expressing hypothalamic markers, capable of differentiating into cells (e.g., neurons, glial cells, etc.) constituting the hypothalamus, and hypothalamus having self-renewal ability.
  • cells e.g., neurons, glial cells, etc.
  • Progenitor cells, and tissues that contain neurons and glial cells that have lost self-renewal ability due to differentiation As used herein, cells that constitute the hypothalamus are also referred to as "hypothalamus cells", and examples of such cells include hypothalamic progenitor cells, neurons, glial cells, and the like.
  • hypothalamic progenitor cells The ratio of hypothalamic progenitor cells and differentiated cells in the hypothalamic neuroepithelial tissue that constitutes the hypothalamic neuroepithelium depends on the degree of differentiation. It has been confirmed that many hypothalamic progenitor cells differentiate into hypothalamic neurons (Cell Reports, 30, 18-24, January 7, 2020).
  • the hypothalamus includes the ventral hypothalamus and the dorsal hypothalamus. Examples of hypothalamic markers include NKx2.1 (ventral hypothalamic marker) and Pax6 (dorsal hypothalamic marker).
  • the ventral hypothalamic neuroepithelial tissue is Rx-positive, Chx10-negative, Pax6-negative, and Nkx2.1-positive neuroepithelial tissue.
  • the dorsal hypothalamic neuroepithelial tissue is Rx-positive, Chx10-negative, Nkx2.1-negative, and Pax6-positive neuroepithelial tissue.
  • the hypothalamic neuroepithelial tissue contained in the cell aggregates obtained in the first culture step is preferably ventral hypothalamic neuroepithelial tissue.
  • EpCAM is not expressed in any of the above hypothalamic neuroepithelial tissues, which suggests that all cells that make up the hypothalamic neuroepithelial tissue (not only hypothalamic progenitor cells but also differentiated and self-renewing cells) EpCAM is not expressed in lost neurons, glial cells, etc.).
  • the epidermal ectoderm is the ectodermal cell layer formed on the surface of the embryo during embryogenesis.
  • Epidermal ectoderm markers include pan-cytokeratin.
  • Epidermal ectoderm can generally differentiate into anterior pituitary, skin, oral epithelium, tooth enamel, skin glands, and the like.
  • the epidermal ectoderm is an E-cadherin-positive and pan-cytokeratin-positive cell layer.
  • the hypothalamic neuroepithelial tissue occupies the inside of the cell aggregate, and the monolayer epidermal ectoderm cells are present on the surface of the cell aggregate.
  • the epidermal ectoderm may include a thickened epidermal placode in part thereof.
  • (3.2) Second culture step In the second culture step, cell aggregates containing hypothalamic neuroepithelial tissue and epidermal ectoderm (including oral ectoderm) obtained in the first culture step, Cells containing 1) hypothalamic neuroepithelial tissue and 2) pituitary placode and/or Rathke's pouch are further cultured in suspension in a medium containing an activator of osteogenic factor signaling pathway and an active substance of Shh signaling pathway. Agglomerates are obtained. The action of osteogenic factor signaling pathway activators and Shh signaling pathway agonists induces differentiation from epidermal ectoderm to pituitary placode and/or Rathke's pouch.
  • osteogenic factor signaling pathway activator and the Shh signaling pathway active substance are as described in the explanation of the first culture step.
  • the osteogenic factor signaling pathway activator used in the second culture step is BMP4 as in the first culture step.
  • the Shh signaling pathway agonist used in the second culturing step is SAG as in the first culturing step.
  • a preferred combination of osteogenic factor signaling pathway activator and Shh signaling pathway agonist is BMP4 and SAG.
  • the concentration of the substance for activating the osteogenic factor signaling pathway in the medium can be appropriately set within a range in which differentiation from epidermal ectoderm to pituitary placode and/or Rathke's pouch can be induced in cell aggregates.
  • concentration is usually 0.01 nM or higher, preferably 0.1 nM or higher, more preferably 1 nM or higher.
  • the BMP4 concentration in the medium is typically 0.01-1000 nM, preferably 0.1-100 nM, more preferably 1-10 nM (eg, 5 nM).
  • the concentration of the osteogenic factor signaling pathway activator may be varied during the period of addition, for example, the above concentration at the start of the second culture step, and the ratio is halved stepwise every 2 to 4 days. Concentration can be reduced.
  • the concentration of the Shh signal pathway agent in the medium can be appropriately set within a range in which differentiation from epidermal ectoderm to pituitary placode and/or Rathke's pouch can be induced in cell aggregates.
  • SAG When SAG is used as a pathway agonist, its concentration is usually 1 nM or higher, preferably 10 nM or higher, more preferably 100 nM or higher. There is no particular upper limit as long as there is no adverse effect on differentiation into pituitary placode and/or Rathke's pouch, but from the viewpoint of culture costs, it is usually 1000 ⁇ M or less, preferably 100 ⁇ M or less, more preferably 10 ⁇ M or less. be. In one aspect, the SAG concentration in the medium is typically 1 nM to 1000 ⁇ M, preferably 10 nM to 100 ⁇ M, more preferably 100 nM to 10 ⁇ M (eg, 2 ⁇ M).
  • the medium used in the second culture step contains FGF2.
  • FGF2 promotes differentiation from epidermal ectoderm to pituitary placode.
  • FGF2 is a known cytokine, also called basic fibroblast growth factor (bFGF), and its amino acid sequence is also known.
  • the FGF2 used in the present invention is generally mammalian FGF2. Examples of mammals include those described above. Since FGF2 has cross-reactivity among many mammalian species, any mammalian FGF2 may be used as long as the object of the present invention can be achieved. A single mammalian FGF2 is used. For example, rodent (mouse, rat, etc.) or primate (human, etc.) FGF2 is used.
  • mouse FGF2 means that FGF2 has the amino acid sequence of FGF2 naturally expressed in mice in vivo. In this specification, other proteins and the like are interpreted similarly.
  • a representative amino acid sequence of mouse FGF2 is NCBI accession number NP_032032.1 (updated on February 18, 2014). mature mouse FGF2 amino acid sequence) and the like can be exemplified.
  • a representative amino acid sequence of human FGF2 can be exemplified by NCBI accession number NP_001997.5 (updated on February 18, 2014).
  • the concentration of FGF2 in the medium is not particularly limited as long as it can promote differentiation from epidermal ectoderm to pituitary placode, but it is usually 1 ng/ml or more, preferably 10 ng/ml or more. is. There is no particular upper limit of FGF2 concentration as long as it does not adversely affect differentiation into pituitary placode and/or Rathke's pouch, but from the viewpoint of culture cost, it is usually 1000 ng/ml or less, preferably 500 ng/ml or less. . In one embodiment, the FGF2 concentration in the medium is usually 1-1000 ng/ml, preferably 10-100 ng/ml.
  • the bone morphogenetic factor signaling pathway activator such as BMP4 and FGF2 used in the present invention are preferably isolated.
  • the isolated osteogenic factor signaling pathway activator and isolated FGF2 contained in the medium used in the second culture step were added exogenously to the medium. Therefore, in one aspect, the present invention exogenously adds an isolated bone morphogenetic factor signaling pathway activator (and optionally isolated FGF2) to the medium used for the second culture step. including the step of
  • the medium used for the second culture step can be prepared using a medium used for culturing mammalian cells as a basal medium, similar to the medium used for the first culture step.
  • the medium is not particularly limited as long as it can be used for culture.
  • a mixed medium of IMDM medium and Ham's F-12 medium is used.
  • the medium used for culture can be a serum-containing medium or a serum-free medium. From the viewpoint of avoiding contamination with chemically undetermined components, the medium used for suspension culture of cell aggregates is preferably a serum-free medium.
  • the medium used for suspension culture of cell aggregates may contain a serum substitute.
  • Serum replacements may suitably contain, for example, albumin, transferrin, fatty acids, collagen precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol or 3' thiol glycerol, or equivalents thereof.
  • serum substitutes can be prepared, for example, by the method described in WO98/30679.
  • commercially available serum substitutes can be used. Examples of such commercially available serum substitutes include KSR (knockout serum replacement) (manufactured by Invitrogen), Chemically-defined Lipid concentrated (manufactured by Gibco), and Glutamax (manufactured by Gibco).
  • the medium used for suspension culture of cell aggregates can contain other additives to the extent that they do not adversely affect differentiation induction from epidermal ectoderm to pituitary placode and/or Rathke's pouch.
  • Additives include, for example, insulin, iron sources (e.g., transferrin), minerals (e.g., sodium selenate, etc.), sugars (e.g., glucose, etc.), organic acids (e.g., pyruvic acid, lactic acid, etc.), serum proteins (e.g., albumin, etc.). ), amino acids (e.g.
  • L-glutamine, etc. L-glutamine, etc.
  • reducing agents e.g., 2-mercaptoethanol, etc.
  • vitamins e.g., ascorbic acid, d-biotin, etc.
  • antibiotics e.g., streptomycin, penicillin, gentamicin, etc.
  • buffering agents For example, HEPES, etc.
  • the medium used for suspension culture of cell aggregates is specifically described herein from the viewpoint of not adversely affecting differentiation induction into pituitary placode and/or Rathke's pouch. It is a growth-factor-free Chemically Defined Medium (gfCDM) containing no growth factors other than those added with serum substitutes (KSR, etc.).
  • growth factor as used herein includes Fgf; BMP; patterning factors such as Wnt, Nodal, Notch and Shh; insulin and Lipid-rich albumin.
  • Growth factor-free chemically defined media include, for example, gfCDM disclosed in Wataya et al, Proc Natl Acad Sci USA, 105(33): 11796-11801, 2008.
  • the suspension culture in the second culture step is preferably performed under high oxygen partial pressure conditions. Further suspension culture of cell aggregates containing hypothalamic neuroepithelial tissue and epidermal ectoderm under high oxygen partial pressure conditions allows oxygen to reach the inside of the cell aggregates and maintain and culture the cell aggregates for a long period of time. This is achieved, allowing efficient induction of differentiation into pituitary placode and/or Rathke's pouch.
  • a high oxygen partial pressure condition means an oxygen partial pressure condition that exceeds the oxygen partial pressure in air (20%).
  • the oxygen partial pressure in the second culture step is, for example, 30-60%, preferably 35-60%, more preferably 38-60%.
  • culture temperature is, for example, about 30-40°C, preferably about 37°C.
  • CO 2 concentration is for example about 1-10%, preferably about 5%.
  • the second culture step is performed for a period of time sufficient to induce differentiation from epidermal ectoderm to pituitary placode and/or Rathke's pouch.
  • a pituitary placode is formed in the epidermal ectoderm (more specifically in the oral ectoderm). Also, some or all of the pituitary placode may invaginate toward the interior of the cell clump (ie, the adjacent hypothalamic neuroepithelium) to form the Rathke's pouch.
  • hypothalamic neuroepithelial tissue preferably ventral hypothalamic neuroepithelial tissue
  • hypothalamic neuroepithelial tissue and epidermal ectoderm are simultaneously formed in the cell aggregate by the first culturing step, and in a preferred embodiment, the hypothalamic neuroepithelial tissue occupies the inside of the cell aggregate.
  • a single layer of epidermal ectodermal cells constitute the surface of the cell clump.
  • the second culturing step is continued until 10% or more, preferably 30% or more, more preferably 50% or more of the cell clumps in the culture contain pituitary placodes and/or Rathke's pouch.
  • the culture period may vary depending on the animal species of the pluripotent stem cells and the types of the osteogenic factor signaling pathway activator and the Shh signaling pathway active substance, so it cannot be specified unconditionally.
  • the second culture step is usually 6 days or more, for example 6 to 12 days.
  • the cell aggregates before cell separation may be cell aggregates obtained by the second culture step.
  • (3.3) Third culture step Cell aggregates containing 1) hypothalamic neuroepithelial tissue and 2) pituitary placode and/or Rathke's pouch obtained in the second culture step were subjected to Shh signaling pathway action.
  • Cell aggregates containing glandular pituitary glands can be obtained by further carrying out suspension culture in a medium containing the substance (third culture step).
  • the third culturing step induces differentiation from the pituitary placode and/or Rathke's pouch into pituitary hormone-producing cells, giving rise to pituitary hormone-producing cells in the pituitary placode and/or Rathke's pouch, and A pituitary gland is formed.
  • the cell aggregates before cell separation may be cell aggregates obtained by the third culturing step.
  • the definition of the Shh signal pathway agonist is as described in the explanation of the first culture step.
  • the Shh signaling pathway agonist used in the third culture step is SAG as in the first and second culture steps.
  • the concentration of the Shh signaling pathway agent in the medium can be appropriately set within a range capable of inducing the differentiation of the pituitary placode and/or Rathke's pouch into pituitary hormone-producing cells in the cell aggregates.
  • SAG is used as the Shh signaling pathway agonist
  • its concentration is usually 1 nM or higher, preferably 10 nM or higher, more preferably 100 nM or higher.
  • concentration is usually 1000 ⁇ M or less, preferably 100 ⁇ M or less, more preferably 10 ⁇ M or less.
  • the SAG concentration in the medium is typically 1 nM to 1000 ⁇ M, preferably 10 nM to 100 ⁇ M, more preferably 100 nM to 10 ⁇ M (eg, 2 ⁇ M).
  • the medium used in the third culture step contains FGF2.
  • FGF2 promotes differentiation from the pituitary placode and/or Rathke's pouch to pituitary hormone-producing cells.
  • FGF2 The definition of FGF2 is as described in the explanation of the second culture process.
  • the concentration of FGF2 in the medium is not particularly limited as long as it is a concentration that can promote the differentiation of the pituitary placode and/or Rathke's pouch into pituitary hormone-producing cells, usually 1 ng/ml or more, Preferably, it is 10 ng/ml or more.
  • FGF2 concentration in the medium is usually 1-1000 ng/ml, preferably 10-100 ng/ml.
  • the medium used in the third culture step contains a Notch signal inhibitor.
  • Notch signaling inhibitors promote differentiation from the pituitary placode and/or Rathke's pouch into pituitary hormone-producing cells, particularly ACTH-producing cells.
  • Notch signaling inhibitors upregulate transcription factor Tbx19, which is an upstream regulator of ACTH production.
  • Notch signal inhibitor is not particularly limited as long as it can suppress signal transduction mediated by Notch.
  • Notch signaling inhibitors include gamma secretase inhibitors such as DAPT (N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-l-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester), DBZ, MDL28170, and the like. Among them, DAPT is preferred.
  • the concentration of the Notch signal inhibitor in the medium is not particularly limited as long as it is a concentration that can promote the differentiation of the pituitary placode and/or Rathke's pouch into pituitary hormone-producing cells (especially ACTH-producing cells).
  • DAPT for example, it is usually 0.1 ⁇ M or more, preferably 1 ⁇ M or more.
  • DAPT concentration in the medium is typically 0.1-1000 ⁇ M, preferably 1-100 ⁇ M (eg, 10 ⁇ M).
  • the FGF2 used in the present invention is preferably isolated.
  • the isolated FGF2 contained in the medium used in the third culture step was exogenously added to the medium. Accordingly, in one aspect, the invention comprises exogenously adding isolated FGF2 to the medium used for the second culturing step.
  • the cell aggregates may be treated with adrenocortical hormones by adding adrenocortical hormones to the medium.
  • Pituitary hormone-producing cells other than ACTH-producing cells i.e., GH-producing cells, PRL-producing cells, TSH-producing cells, LH-producing cells, FSH-producing cells, etc.
  • differentiation is promoted.
  • adrenocortical hormones include natural glucocorticoids such as hydrocortisone, cortisone acetate and fludrocortisone acetate; artificially synthesized glucocorticoids such as dexamethasone, betamethasone, prednisolone, methylprednisolone and triamcinolone. It can be, but is not limited to.
  • the concentration of adrenocortical hormones in the medium is not particularly limited as long as it can promote differentiation from the pituitary placode and/or Rathke's pouch into pituitary hormone-producing cells (excluding ACTH-producing cells).
  • it can be appropriately set depending on the type of adrenocortical hormones.
  • hydrocortisone it is usually 100 ng/ml or more, preferably 1 ⁇ g/ml or more.
  • hydrocortisone concentration it is usually 1000 ⁇ g/ml or less, preferably 100 ⁇ g, from the viewpoint of culture cost.
  • the third culturing step when adrenal corticosteroids are added to the medium, differentiation from the pituitary placode and/or Rathke's pouch into pituitary hormone-producing cells (excluding ACTH-producing cells) is promoted. It is not particularly limited as long as it is possible, and the adrenocortical hormones may be added to the medium from the start of the third culture step, or after the start of the third culture step, cultured in a medium to which no adrenocortical hormones are added for a certain period of time. Afterwards, corticosteroids may be added to the culture medium.
  • adrenocortical hormones are added to the medium. That is, until the appearance of ACTH-producing cells is confirmed in the cell aggregates, the cell aggregates are cultured in a medium to which adrenocortical hormones are not added, and after the appearance of ACTH-producing cells is confirmed, adrenal Continue the third culture step in medium containing cortical hormones.
  • the appearance of ACTH-producing cells can be confirmed by immunohistological staining using an antibody against ACTH.
  • human pluripotent stem cells are used, the emergence of ACTH-producing cells can generally be expected after 37 days from the start of the third culture step. On the following days, corticosteroids are added to the medium.
  • the period of treatment of cell aggregates with adrenocortical hormones is not particularly limited as long as differentiation from pituitary placode and/or Rathke's pouch to pituitary hormone-producing cells (excluding ACTH-producing cells) can be promoted.
  • promotion of differentiation into pituitary hormone-producing cells is confirmed.
  • the clumps are treated with corticosteroids.
  • the treatment period is usually 7 days or more, preferably 12 days or more.
  • the upper limit of the treatment period is not particularly limited. Once the promotion is confirmed, corticosteroids may be removed from the culture medium.
  • adrenocortical hormones to the medium suppresses differentiation induction of ACTH-producing cells by feedback inhibition.
  • the medium used for the third culture step can be prepared using the medium used for culturing mammalian cells as a basal medium, similar to the medium used for the first and second culture steps.
  • the medium is not particularly limited as long as it can be used for culture.
  • a mixed medium of IMDM medium and Ham's F-12 medium is used.
  • the medium used for culture can be a serum-containing medium or a serum-free medium. From the viewpoint of avoiding contamination with chemically undetermined components, the medium used for suspension culture of cell aggregates is preferably a serum-free medium.
  • the medium used for suspension culture of cell aggregates may contain a serum substitute.
  • Serum replacements may suitably contain, for example, albumin, transferrin, fatty acids, collagen precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol or 3' thiol glycerol, or equivalents thereof.
  • serum substitutes can be prepared, for example, by the method described in WO98/30679.
  • commercially available serum substitutes can be used. Examples of such commercially available serum substitutes include KSR (knockout serum replacement) (manufactured by Invitrogen), Chemically-defined Lipid concentrated (manufactured by Gibco), and Glutamax (manufactured by Gibco).
  • the medium used for suspension culture of cell aggregates has other additives to the extent that it does not adversely affect differentiation induction from pluripotent stem cells to pituitary placode and/or Rathke's pouch, and pituitary hormone-producing cells.
  • Additives include, for example, insulin, iron sources (e.g., transferrin), minerals (e.g., sodium selenate, etc.), sugars (e.g., glucose, etc.), organic acids (e.g., pyruvic acid, lactic acid, etc.), serum proteins (e.g., albumin, etc.). ), amino acids (e.g.
  • L-glutamine, etc. L-glutamine, etc.
  • reducing agents e.g., 2-mercaptoethanol, etc.
  • vitamins e.g., ascorbic acid, d-biotin, etc.
  • antibiotics e.g., streptomycin, penicillin, gentamicin, etc.
  • buffering agents For example, HEPES, etc.
  • the medium used for the suspension culture of the cell aggregates contains media other than those specifically described herein, from the viewpoint of not adversely affecting the induction of differentiation into pituitary hormone-producing cells. It is a growth-factor-free chemically defined medium (gfCDM) supplemented with a serum replacement (KSR, etc.).
  • growth factor as used herein includes Fgf; BMP; patterning factors such as Wnt, Nodal, Notch and Shh; insulin and Lipid-rich albumin.
  • Growth factor-free chemically defined media include, for example, gfCDM disclosed in Wataya et al, Proc Natl Acad Sci USA, 105(33): 11796-11801, 2008.
  • the suspension culture in the third culture step is preferably performed under high oxygen partial pressure conditions.
  • oxygen partial pressure conditions By further floating culture of cell aggregates containing 1) hypothalamic neuroepithelial tissue and 2) pituitary placode and/or Rathke's pouch under high oxygen partial pressure conditions, oxygen reaches the inside of the cell aggregates, And long-term maintenance culture of cell aggregates is achieved, and efficient induction of differentiation into pituitary hormone-producing cells becomes possible.
  • culture temperature is, for example, about 30-40°C, preferably about 37°C.
  • the CO 2 concentration is for example about 1-10%, preferably about 5%.
  • the third culture step is performed for a period of time sufficient to induce differentiation from the pituitary placode and/or Rathke's pouch into pituitary hormone-producing cells.
  • the pituitary placode and/or Rathke's pouch are induced to differentiate into pituitary hormone-producing cells, and the pituitary hormone-producing cells are induced in the pituitary placode and/or Rathke's pouch. occurs, the adenohypophysis is formed.
  • At least one selected from the group consisting of growth hormone (GH)-producing cells, prolactin (PRL)-producing cells, and adrenocorticotropic hormone (ACTH)-producing cells from the pituitary placode and/or Rathke's pouch Preferably two types, more preferably three types of pituitary hormone-producing cells are induced to differentiate from growth hormone (GH)-producing cells, prolactin (PRL)-producing cells, and adrenocorticotropic hormone (ACTH)-producing cells
  • a glandular pituitary gland containing at least one, preferably two, more preferably three pituitary hormone-producing cells selected from the group consisting of is formed.
  • thyroid-stimulating hormone (TSH)-producing cells In addition to growth hormone (GH)-, prolactin (PRL)-, and adrenocorticotropic hormone (ACTH)-producing cells, thyroid-stimulating hormone (TSH)-producing cells and follicles from the pituitary placode and/or Rathke's pouch
  • Other pituitary hormone-producing cells such as stimulating hormone (FSH)-producing cells, luteinizing hormone (LH)-producing cells, melanocyte-stimulating hormone (MSH)-producing cells can be induced.
  • FSH stimulating hormone
  • LH luteinizing hormone
  • MSH melanocyte-stimulating hormone
  • the glandular pituitary gland formed by the third culture step contains at least one selected from the group consisting of growth hormone (GH)-producing cells, prolactin (PRL)-producing cells, and adrenocorticotropic hormone (ACTH)-producing cells.
  • GH growth hormone
  • PRL prolactin
  • ACTH adrenocorticotropic hormone
  • TSH thyroid-stimulating hormone
  • FSH follicle-stimulating hormone
  • LH luteinizing hormone
  • MSH melanocyte-stimulating hormone
  • Differentiation into pituitary hormone-producing cells can be confirmed, for example, by detecting pituitary hormone-positive cells by immunohistochemistry using a specific antibody against pituitary hormones. For example, culturing is carried out until 10% or more, preferably 30% or more, more preferably 50% or more of the cell aggregates during culturing contain pituitary hormone-producing cells.
  • the culture period may vary depending on the animal species of the pluripotent stem cells and the type of Shh signal pathway agonist, so it cannot be specified unconditionally.
  • the culture step of 3 is usually 37 days or more, for example 37 to 70 days.
  • suspension culture of aggregates is carried out in the presence or absence of feeder cells as long as it is possible to induce differentiation from pluripotent stem cells to glandular pituitary glands or their progenitor tissues.
  • suspension culture of cell aggregates in the absence of feeder cells.
  • the culture vessel used for suspension culture of cell aggregates is not particularly limited, but examples include flasks, tissue culture flasks, dishes, petri dishes, tissue culture dishes, multidishes, microplates, Examples include microwell plates, micropores, multiplates, multiwell plates, chamber slides, petri dishes, tubes, trays, culture bags, and roller bottles.
  • the incubator is preferably cell non-adherent so as to allow culture under non-adherent conditions.
  • Non-cell-adhesive incubators include those whose surface has been artificially treated to make it non-adhesive to cells, and those that have been artificially treated for the purpose of improving adhesion to cells (e.g. , coating treatment with an extracellular matrix, etc.) can be used.
  • an oxygen-permeable one As an incubator used for floating culture of cell aggregates, an oxygen-permeable one may be used. By using an oxygen-permeable incubator, the supply of oxygen to cell aggregates is improved, which can contribute to long-term maintenance and culture of cell aggregates.
  • the aggregates may be statically cultured, or the aggregates may be intentionally moved by rotating culture or shaking culture.
  • Static culture refers to a culture method in which aggregates are cultured in a state in which they are not intentionally moved. That is, for example, the medium convects with a change in local medium temperature, and the convection may move the aggregates. In the present invention, it is referred to as static culture, including the case.
  • Static culture may be performed during the entire period of suspension culture, or static culture may be performed only for a part of the period. In a preferred embodiment, static culture is performed throughout the suspension culture period. Static culture does not require equipment, is expected to cause less damage to cell clusters, and is advantageous in that the amount of culture solution can be reduced.
  • cell aggregates containing adenohypophysis and/or its progenitor tissue and hypothalamic neuroepithelial tissue In one aspect of the method for separating pituitary glands of the present invention, cell aggregates containing adenohypophysis and/or its progenitor tissue and hypothalamic neuroepithelial tissue.
  • Pituitary hormone-producing cells and/or their progenitor cells and hypothalamic cells herein, these cells for the purpose of separation are referred to as "therapeutic cells”.
  • CD49c can be expressed on the surface of pituitary hormone-producing cells and their progenitor cells and hypothalamic cells, but CD49c cannot be expressed on the surface of undifferentiated cells and cyst-forming cells.
  • CD49c as a marker, pituitary hormone-producing cells and their progenitor cells, hypothalamic cells, undifferentiated cells and cyst-forming cells can be separated.
  • the cell population isolated using the cell surface marker of the present invention may contain cells other than the hypothalamic and pituitary lineages (such as undifferentiated cells), so that cell populations with higher therapeutic effects and transplanted tissues ( Cell aggregates, cell sheets, etc.), it is preferable to purify therapeutic cells.
  • proliferative cells with different growth rates could be mixed. That is, based on the area of the cell population on day 8 after reaggregation of the cells separated by the separation method of the present invention, a cell population that proliferated more than 3 times after 21 days and a cell population that proliferated more than 3 times after 28 days. It was found that there existed a cell population that accelerated more than twice and a cell population that showed little change in area up to the 36th day.
  • the proliferative cells are presumed to be the result of some undifferentiated cells and cyst-forming cells remaining in the separated cell population and proliferating.
  • therapeutic cells can be purified by selecting, from the reaggregated cell aggregates, a cell population that shows little proliferation even after a predetermined period of time based on the area of the cell population.
  • cells that proliferate at an early stage have a string-like form after proliferation, and cells that proliferate at a later stage undergo proliferation and cyst enlargement is observed.
  • Small cell populations can also be sorted.
  • the separation method of the present invention may include a step of removing SSEA5-positive (especially SSEA5 strongly positive) cells. Such a step may be performed simultaneously with the step of separating cells expressing CD49c from the cell aggregates before cell separation, or may be performed before or after the step.
  • the present inventors have found that EpCAM can be expressed on the surface of pituitary hormone-producing cells and their progenitor cells, but that EpCAM cannot be expressed on the surface of hypothalamic cells. Therefore, using CD49c and EpCAM as markers, pituitary hormone-producing cells and their progenitor cells can be separated from hypothalamic cells. Therefore, in another embodiment of the separation method of the present invention, cells expressing CD49c and EpCAM are separated from cell aggregates containing glandular pituitary gland and/or its progenitor tissue and optionally further containing hypothalamic neuroepithelial tissue.
  • Such a step may be performed simultaneously with the step of separating cells expressing CD49c and/or EpCAM from the cell aggregates before cell separation, or may be performed before or after said step.
  • it can be performed by separating cells that are CD49c positive and negative for the negative marker of the present invention.
  • CD90 is particularly preferred as the negative marker of the present invention.
  • the cell aggregates before cell separation used in the separation method of the present invention may be either cell aggregates obtained by the second culture step or cell aggregates obtained by the third culture step. good.
  • the specific number of days after initiation of induction of differentiation from the above-described pluripotent stem cells to the pituitary gland, its partial tissue, or its progenitor tissue is, for example, 30 days to 600 days, preferably 90 days to 500 days, More preferably 110 to 490 days, still more preferably 150 to 400 days, still more preferably 200 to 350 days.
  • the separation method of the present invention includes the following steps.
  • epiitary hormone-producing cells and/or their progenitor cells, and hypothalamic cells separated from cell aggregates using CD49c as an indicator are single or multiple pituitary hormone-producing cells and/or their progenitor cells. and single or multiple hypothalamic cells.
  • the step (A) of dispersing the cell aggregates to obtain a single cell population may include (a1) the step of dispersing the cell aggregates before cell separation by enzymatic treatment (described later (4.2)).
  • (a2) may include a step of shredding the cell aggregates before cell separation or physically incising the cell aggregates before cell separation (described later).
  • (4.2)) may optionally include the step of (a-1) treating the cell aggregates with a ROCK inhibitor before cell separation. When this step is performed, it is preferably performed first in the step of obtaining a population of single cells ((4.1) described later).
  • a step (C) of culturing the obtained cells on a culture vessel coated with laminin or fragments thereof may be performed (described later (4.3).
  • the step (a2) of dispersing by enzymatic treatment (B) the step of separating EpCAM-expressing cells (the step of separating EpCAM-expressing cells from EpCAM-not expressing cells) is performed (described later (4.4)).
  • a step (D) of reaggregating the obtained cells may optionally be performed (described later (4.5)).
  • the reaggregation step (D) includes (d1) seeding the obtained cells in a culture vessel for adhesion culture, and/or (d2) seeding the obtained cells in a culture vessel. It can be carried out by floating culture.
  • ROCK inhibitors examples include Y-27632 ((+)-(R)-trans-4-(1-aminoethyl)-N-(4-pyridyl)cyclohexanecarboxamide dihydrochloride) and the like.
  • the concentration of the ROCK inhibitor used in the treatment is a concentration capable of suppressing cell death of pluripotent stem cells induced by subsequent dispersal of cell aggregates.
  • concentrations are usually about 0.1-200 ⁇ M, preferably about 2-50 ⁇ M.
  • the concentration of the ROCK inhibitor may be varied during the period of addition, eg, the concentration can be halved later in the period.
  • any of steps (4.2) to (4.5) described below it is preferable to use a solution containing a similar concentration of the ROCK inhibitor as the solution to be brought into contact with the cells.
  • the medium used in the second culture step is the cell aggregate obtained in the third culture step.
  • the medium used in the third culture step can be used.
  • the pretreatment step is not necessary.
  • Enzymes for dispersal are not particularly limited as long as they can disperse cells, but include, for example, EDTA;
  • a mixture of Preferred enzymes include collagenase, more preferably collagenase type I.
  • the enzyme treatment conditions can be appropriately set depending on the enzyme used.
  • the cell aggregates are physically shredded (eg, scalpel, scissors, etc.), or the cell aggregates are physically chopped (eg, scalpel, scissors, etc.). ) may be cut.
  • the enzymatic treatment can also be performed with the enzymes described above, and preferred enzymes include EDTA; trypsin, more preferably EDTA; trypsin and deoxyribonuclease. Also, EDTA; a commercial product such as TrypLE (Invitrogen) may be used instead of trypsin.
  • the enzyme treatment conditions (temperature, time, etc.) can be appropriately set depending on the enzyme used.
  • a single cell suspension can be prepared by the above series of enzymatic treatments. In addition, when preparing the single cell suspension, dead cells may be removed by a method known per se.
  • the step (4.3) is preferably performed after the step (4.2) of dispersing the cell aggregates.
  • the laminin or fragment used in step (4.3) is not particularly limited as long as it has at least a high affinity for the integrin ⁇ 3 ⁇ 1 complex.
  • the effect of cell autofluorescence (fluorescence emitted by the cells themselves, independent of CD49c expression) caused the increase in CD49c.
  • Fluorescent staining alone may result in poor population separation of CD49c-positive cells and CD49c-negative cells based on fluorescence intensity.
  • the fluorescence intensity range of CD49c-negative cells is determined by simultaneously labeling undifferentiated cells contained in CD49c-negative cells with another fluorescent dye. Cells with fluorescence intensity higher than the fluorescence intensity range of CD49c-negative cells thus determined are treated as CD49c-positive cells.
  • Methods for labeling undifferentiated cells with a fluorescent dye include a method of labeling with a fluorescent dye via an antibody against SSEA5, which is a surface antigen of undifferentiated cells.
  • High expression is sometimes expressed as High and Bright.
  • SSEA5 high-expressing cells are sometimes referred to as SSEA5 High cells or SSEA5 Bright cells.
  • High expression can be determined based on charts obtained by flow cytometry.
  • the positions appearing on the chart may vary depending on the voltage setting, sensitivity setting, antibody clone used, staining conditions, dye used, etc., but a person skilled in the art can identify the cell population recognized as a group in the obtained chart. A line can be appropriately drawn so as not to cut into pieces.
  • the separated cell population may be seeded in a culture vessel and adherently cultured, for example, as a cell sheet. It is good also as a cell aggregate mass.
  • the cell population may be maintained and cultured until use as it is, or may be further induced to differentiate into desired cells according to the state of differentiation of the separated cells.
  • the method described in the above-mentioned third culture step may be performed as it is, or if necessary, it may be performed by appropriately modifying a method known per se.
  • the adherent culture when the adherent culture is performed, the adherent culture itself can be performed by a method known per se, and the contents described in the above-mentioned third culture step (eg, medium composition, etc.) may be used as appropriate. . Also, in the case of adherent culture, it is preferable to coat the culture vessel with an extracellular matrix or the like (eg, laminin, collagen, etc.).
  • an extracellular matrix or the like eg, laminin, collagen, etc.
  • pituitary hormone-producing cells Uses of the isolated pituitary hormone-producing cells, their progenitor cells, and tissues containing the cells Pituitary hormone-producing cells and their progenitor cells obtained by the isolation method or production method of the present invention, and the cells are included.
  • Cell aggregates and cell sheets are used for transplantation medicine (in other words, as a transplantation therapeutic agent). can be done.
  • the pituitary tissue may contain hypothalamic cells.
  • pituitary hormone-producing cells obtained by the method of the present invention can be used.
  • pituitary hormone-producing cells By transplanting pituitary hormone-producing cells, their progenitor cells and/or pituitary tissue obtained according to the present invention to a patient with a disease based on glandular pituitary disorder or a state of damaged glandular pituitary gland, Diseases based on hypopituitary disorders, or damaged conditions of the glandular pituitary can be treated.
  • the transplantation site is not particularly limited as long as the transplanted pituitary hormone-producing cells, their progenitor cells and/or pituitary tissue can function as a substitute for the damaged glandular pituitary gland. be able to.
  • adenohypophysial injury states include the adenohypophysial state of the patient after adenohypophysectomy, the adenohypophysial state of the patient after irradiation of the pituitary tumor, Trauma to the pituitary gland.
  • the term "substantially identical" means that the HLA genotypes match the transplanted cells to the extent that an immunosuppressive agent can suppress an immune reaction. and HLA-DR 3 loci or 4 loci including HLA-C are somatic cells that have the same HLA type.
  • HLA-DR 3 loci or 4 loci including HLA-C are somatic cells that have the same HLA type.
  • cells in which HLA genes have been modified by genetic engineering techniques may be used. Examples of such methods include a method of selectively removing the HLA gene portion on one side of the chromosome in general HLA heterozygous donor-derived iPS cells to create HLA pseudo-homozygotes, and a method of suppressing the reaction of NK cells. Another method is to leave HLA-C on one side of the chromosome and disrupt the HLA-A and HLA-B genes.
  • the pituitary hormone-producing cells and their progenitor cells and pituitary tissue obtained by the method of the present invention can be used for drug screening and evaluation. Specifically, for example, it can be applied to screening for substances that suppress or promote the production of pituitary hormones, side effects/toxicity tests of pharmaceuticals, and the like. The screening, testing, etc.
  • a method for producing pituitary hormone-producing cells, their progenitor cells and/or pituitary tissue comprising the step of isolating cells expressing CD49c from .
  • CD49c can be expressed on the surface of pituitary hormone-producing cells and their progenitor cells and hypothalamic cells, but CD49c cannot be expressed on the surface of undifferentiated cells and cyst-forming cells. Therefore, using CD49c as a marker, pituitary hormone-producing cells and their progenitor cells, hypothalamic cells, undifferentiated cells and cyst-forming cells can be separated.
  • EpCAM can be expressed on the surface of pituitary hormone-producing cells and their progenitor cells, but EpCAM cannot be expressed on the surface of hypothalamic cells. Therefore, using CD49c and EpCAM as markers, pituitary hormone-producing cells and their progenitor cells can be separated from hypothalamic cells. Therefore, in another embodiment of the production method of the present invention, cells expressing CD49c and EpCAM are separated from cell aggregates containing glandular pituitary gland and/or its progenitor tissue and optionally further containing hypothalamic neuroepithelial tissue.
  • a method for isolating pituitary hormone-producing cells and/or their progenitor cells comprising the step of:
  • the step of isolating cells expressing CD49c and EpCAM can typically be performed by isolating CD49c and EpCAM co-positive cells.
  • cells expressing CD49c or EpCAM are isolated from a glandular pituitary gland and/or its progenitor tissue, optionally from hypothalamic neuroepithelial tissue, and then EpCAM or CD49c is isolated from a cell population containing the isolated cells. It may be done by isolating the expressing cells.
  • a cell population e.g., 80 % or more, preferably 85% or more, more preferably 90%, even more preferably 95% or more, even more preferably 99% or more, most preferably 100%).
  • the production method of the present invention can include a step of isolating cells that do not express at least one of the negative markers of the present invention. Such a step may be performed simultaneously with the step of isolating cells expressing CD49c from cell aggregates containing glandular pituitary gland and/or its progenitor tissue, or may be performed before or after said step. When performed at the same time, typically, it can be performed by separating cells that are CD49c positive and negative for the negative marker of the present invention. CD90 is particularly preferred as the negative marker of the present invention.
  • the production method of the present invention from the reaggregated cell aggregates, by selecting a cell population with less proliferation based on the area of the cell population, a cell population with a higher therapeutic effect, A transplanted tissue (cell aggregate, cell sheet, etc.) can also be produced.
  • a transplanted tissue cell aggregate, cell sheet, etc.
  • cells that proliferate early become string-like morphology after proliferation, and cells that proliferate later undergo proliferation and cyst enlargement is observed.
  • Cell populations can also be sorted.
  • the production method of the present invention may include a step of removing SSEA5-positive (especially SSEA5 strongly positive) cells.
  • the step of removing cells expressing CD49c and/or EpCAM and/or cells expressing the negative marker of the present invention and/or SSEA5 from the cell aggregates before cell separation is performed as described above. All the contents of the steps described in "Outline of the separation process of the present invention” can be used. In addition, all of the contents of (4.1) to (4.5) above can be used for each step.
  • the pituitary hormone-producing cells and/or their progenitor cells produced by the method of the present invention may be maintained and cultured until use.
  • culture eg, a third culture step
  • pituitary hormone-producing cells, their progenitor cells, and/or pituitary tissue produced by the method of the present invention are directly transplanted into a subject in need of treatment or the like with the cell population or tissue.
  • it may be further purified (purified) by a method known per se and then transplanted to the subject.
  • the purified cells may be seeded in a culture vessel and adherently cultured as described in (4.5) above, for example, may be shaped like a cell sheet, seeded in a culture vessel and suspended cultured. By doing so, it may be reaggregated.
  • a cell sheet or cell aggregate obtained through the adherent culture or suspension culture may be transplanted to the subject.
  • the adherent culture or suspension culture may be performed for a short period of time (eg, 3 to 6 days) or for a long period of time (eg, 7 to 30 days).
  • all of the above-mentioned "(1) pluripotent stem cells” and "(5) use of isolated pituitary hormone-producing cells, their progenitor cells, and tissues containing the cells” can be used.
  • Reagent for separating pituitary hormone-producing cells and/or their progenitor cells and hypothalamic cells A reagent for separating lower cells (hereinafter sometimes referred to as "the reagent of the present invention") is provided.
  • the reagent of the present invention may further contain an antibody against EpCAM.
  • the reagent of the present invention can also be used as a reagent for separating pituitary hormone-producing cells and/or their progenitor cells by containing an antibody against EpCAM.
  • the reagent of the invention contains two or more antibodies
  • the reagent can be provided as a reagent kit containing each antibody in a separate reagent.
  • Antibodies contained in the reagents of the present invention can be provided in the form bound to, for example, fluorescent dyes, metal isotopes, or beads (eg, magnetic beads), depending on the separation means used in the methods of the present invention.
  • the reagent of the present invention may further contain antibodies against each of one or more surface antigens selected from the group consisting of CD90, CD29, CD44, CD58, CD166 and SSEA5.
  • Example 1 Screening of Cell Surface Antigens Human iPS cells (strain 201B7) were isolated from the adenohypophysis by a known method described in WO 2016/013669 or Cell Reports, 30, 18-24, January 7, 2020. Or differentiation was induced into a cell aggregate containing its progenitor tissue. Human iPS cells (strain 201B7) were differentiated, and cell aggregates on day 47 were treated with Accumax (Innovative Cell Technologies, #AM105) at 37°C for 5 to 10 minutes to disperse them to prepare a single cell suspension.
  • Accumax Innovative Cell Technologies, #AM105
  • Example 2 Immunohistochemistry A cell mass cultured for 152 days or more after initiation of differentiation induction, or a cell mass cultured for 7 days or more after reaggregation after iMatrix-511 adhesion treatment or FACS purification was used. After fixing the cell aggregates with 4% paraformaldehyde solution, sucrose replacement was performed by stepwise immersion in 10, 20, and 30% sucrose solutions. Then, they were embedded with an OCT compound, and cryosections with a thickness of 4 to 10 ⁇ m were prepared with a cryostat and attached to anti-peeling coated slide glasses (PLATINUM PRO; Matsunami Glass).
  • Example 3 Separation of Floating Cell Fraction and Adherent Cell Fraction by iMatrix-511 Adhesion Treatment
  • Cell aggregates 110 to 490 days after initiation of differentiation induction were enzymatically dispersed and used for iMatrix-511 adhesion treatment. The procedure is shown below.
  • Y27632 (Wako, #034-24024) was added to the medium at a final concentration of 20 ⁇ M at least 1 hour before the start of the procedure to remove cell clumps. pretreated. For subsequent manipulations, 20 ⁇ M Y27632 was added to all solutions to which cells were exposed (except PBS).
  • the supernatant containing the floating cells was transferred to a new 15 ml tube, and the remaining cell aggregates were washed with PBS (the washing solution was also collected in the same tube as the supernatant).
  • the 15 ml tube from which the supernatant was collected was centrifuged at 4°C and 1000 rpm for 5 minutes to pellet floating cells.
  • the pellet in the 15 ml tube was pipetted about 20 times with a P1000 micropipette to loosen cell clumps.
  • the cells were centrifuged at 4°C and 1000 rpm for 5 minutes.
  • a single cell suspension was prepared by the above operation.
  • Y27632 (Wako, #034-24024) was added to the medium at a final concentration of 20 ⁇ M at least 1 hour before the start of the procedure to remove cell clumps. pretreated. For subsequent manipulations, 20 ⁇ M Y27632 was added to all solutions to which cells were exposed (except PBS).
  • the supernatant containing the floating cells was transferred to a new 15 ml tube, and the remaining cell aggregates were washed with PBS (the washing solution was also collected in the same tube as the supernatant).
  • the 15 ml tube from which the supernatant was collected was centrifuged at 4°C and 1000 rpm for 5 minutes to pellet floating cells.
  • the cells were combined with the pellet and pipetted about 20 times with a P1000 micropipette to loosen cell clumps. After suspending in 10 ml of gfCDM + 20% KSR (medium for cell cluster differentiation and maintenance) to neutralize 10 ⁇ TrypLE Select, the cells were centrifuged at 4°C and 1000 rpm for 5 minutes. Add 1 ml of gfCDM + 20% KSR + 10 ⁇ g/ml DNase I to the cell pellet after centrifugation, vigorously pipette about 30 times with a P1000 micropipette to disperse the cell clumps, and strain the clumps through a 70 ⁇ m cell strainer. Removed. A single cell suspension was prepared by the above operation.
  • CD49c-positive cells were suspended in MACS buffer (PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA) and stained with PE-labeled anti-CD49c antibody (BioLegend, #343803).
  • CD49c positive cells were then labeled with magnetic beads by treatment with anti-PE-microbeads (Miltenyi, #130-105-639).
  • the cells were passed through a magnetic column (LS column; Miltenyi, #130-042-401) to separate and collect magnetic bead-labeled cells (CD49c-positive cells) and unlabeled cells (CD49c-negative cells).
  • Example 5 Purification of CD49c-positive cells or CD49c-positive/EpCAM-positive cells by fluorescence-activated cell sorting (FACS) Cell aggregates 110 to 490 days after initiation of differentiation induction were enzymatically dispersed and subjected to FACS. used for The procedure is shown below.
  • FACS fluorescence-activated cell sorting
  • Y27632 (Wako, #034-24024) was added to the medium at a final concentration of 20 ⁇ M at least 1 hour before the start of the procedure to remove cell clumps. pretreated. For subsequent manipulations, 20 ⁇ M Y27632 was added to all solutions to which cells were exposed (except PBS).
  • the supernatant containing the floating cells was transferred to a new 15 ml tube, and the remaining cell aggregates were washed with PBS (the washing solution was also collected in the same tube as the supernatant).
  • the 15 ml tube from which the supernatant was collected was centrifuged at 4°C and 1000 rpm for 5 minutes to pellet floating cells.
  • the cells were combined with the pellet and pipetted about 20 times with a P1000 micropipette to loosen cell clumps. After suspending in 10 ml of gfCDM + 20% KSR (medium for cell cluster differentiation and maintenance) to neutralize 10 ⁇ TrypLE Select, the cells were centrifuged at 4°C and 1000 rpm for 5 minutes. Add 1 ml of gfCDM + 20% KSR + 10 ⁇ g/ml DNase I to the cell pellet after centrifugation, vigorously pipette about 30 times with a P1000 micropipette to disperse the cell clumps, and strain the clumps through a 70 ⁇ m cell strainer. Removed. A single cell suspension was prepared by the above operation.
  • CD49c-positive/EpCAM-positive cells After staining the cells with APC-labeled anti-CD49c antibody and PE-labeled anti-EpCAM antibody (Miltenyi, #130-098-115), use the above cell sorter to sort CD49c-positive/EpCAM-positive cells. EpCAM-positive cells and CD49-positive/EpCAM-negative cells were separated and collected.
  • Example 6 Reaggregation Culture of Purified Cells
  • Each purified cell population iMatrix-511 adherent cells, CD49c positive cells, CD49c negative cells, CD49c positive/EpCAM positive cells, CD49c positive/EpCAM negative cells
  • low adhesion V They were plated in bottom 96-well plates (PrimeSurface plate 96V; Sumitomo Bakelite, #MS-9096V) and allowed to reaggregate. 15,000 cells in 200 ⁇ l medium (gfCDM + 20% KSR + 30 ⁇ M Y27632) were seeded per well. Thereafter, half of the medium was replaced with a medium not containing Y27632 every 3 days.
  • Example 7 Quantification of each index (1) Percentage of EpCAM-positive cells and CD49c-positive cells in Rx::Venus-positive cells , #130-113-822) or APC-labeled anti-CD49c antibody (BioLegend, #343808), followed by flow cytometry (experimental method for quantitative analysis based on the fluorescence intensity of cells). The percentages of EpCAM-positive cells and CD49c-positive cells in the positive cell fraction were measured.
  • Proportion of cells in the floating cell fraction and adherent cell fraction in the iMatrix-511 adhesion treatment process Disperse the cell aggregates to prepare a single cell suspension, and then coat it with iMatrix-511. After culturing in an incubator, adherent cells and floating cells were collected and counted using a hemocytometer.
  • Example 8 ACTH secretion test (CRH stimulation test) Cell aggregates that had been reaggregated and cultured for 8 days or more after purification by MACS or FACS were used. One or five cell aggregates were kept at a predetermined temperature for a predetermined period of time using a predetermined medium or the like, and then the medium or the like was collected. The ACTH concentration in the recovered culture medium was measured by the ECLIA method used in clinical examinations. In addition, when confirming the effects of the secretion suppressing factor and the CRH receptor inhibitor, the cells were pretreated with a maintenance medium containing the secretion suppressing factor and the CRH receptor inhibitor for a predetermined period of time before measurement of secretion.
  • a maintenance medium containing the secretion suppressing factor and the CRH receptor inhibitor for a predetermined period of time before measurement of secretion.
  • the separation method and production method of the present invention use CD49c as a marker to efficiently separate and purify functional pituitary hormone-producing cells and/or their progenitor cells from differentiated tissues derived from pluripotent stem cells. available for In addition, since the isolated and purified pituitary hormone-producing cells and the like exhibit excellent pituitary hormone secretion ability by physiological stimulation of pituitary hormone secretion, the cells can be used for the treatment of diseases related to the pituitary gland. is.

Abstract

本発明は、腺性下垂体及び／又はその前駆組織、並びに視床下部神経上皮組織を含む細胞凝集塊から、CD49cを発現する細胞を分離する工程を含む、下垂体ホルモン産生細胞及び／又はその前駆細胞を分離する方法を提供する。

Description

細胞表面マーカーを用いた下垂体細胞および視床下部細胞の分離法
　本発明は、インビトロにおいて、多能性幹細胞から分化誘導した下垂体ホルモン産生細胞及びその前駆細胞、並びに視床下部細胞の分離・精製方法に関する。
　下垂体は、間脳の下部に接して存在する小さな内分泌器官であり、多様なホルモンの制御中枢として大きな役割を果たす。例えば、生命維持に必須の副腎皮質ホルモンの産生を促す副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）、子どもの成長を促す成長ホルモンなどをはじめとする多様な下垂体ホルモンを産生する。そのため、下垂体の機能不全は全身性の重篤な疾患を引き起こす。
　近年、ヒトES/iPS細胞から機能的な下垂体ホルモン産生細胞を含む腺性下垂体を分化誘導する方法が開発され、下垂体再生医療への応用が期待されている（特許文献１、非特許文献１及び２）。これらの方法では、三次元培養により視床下部-下垂体の複合組織が1つの細胞塊の中に形成される。当該複合組織において、腺性下垂体及びその前駆組織は、主に細胞塊の表層に位置し、これを剥離して下垂体摘出マウスの腎被膜下に移植することで、活動性・生存・体重減少の改善などの治療効果が確認されている（特許文献１、非特許文献１）。しかしながら、上記の方法では、剥離する腺性下垂体及びその前駆組織の識別は、形態に基づく実験者の主観的判断に依存していた。
国際公開第2016/013669号
Nature Communications, 7:10351, 2016 Cell Reports, 30, 18-24, January 7, 2020
　本発明者らは以前、客観的で信頼性のある下垂体ホルモン産生細胞及びその前駆細胞の分離を行うための細胞表面抗原として、EpCAMを同定した。EpCAMを指標とした細胞のソーティングにより、腺性下垂体及び／又はその前駆組織を含む細胞凝集塊から下垂体ホルモン産生細胞及びその前駆細胞を効果的に分離・精製し得ることを見出した。また、当該分離・精製した細胞は再凝集して維持培養が可能であり、さらに該維持培養を経ても、生理的な下垂体ホルモン分泌刺激により優れた下垂体ホルモンの分泌能を示し、機能的に生体の下垂体ホルモン産生細胞と同等の機能を発揮することを見出した。そこで、本発明は、前記細胞凝集塊から、下垂体ホルモン産生細胞及び／又は視床下部細胞を分離・精製し得るEpCAM以外の細胞表面抗原を同定し、かかる細胞表面抗原を指標とした目的細胞の分離方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、視床下部-下垂体の複合組織を構成する細胞群について表面抗原の発現解析を行ったところ、下垂体細胞および視床下部細胞に特異性の高い表面抗原として、CD49c（インテグリン α3）を同定することに成功した。鋭意検討の結果、該同定した表面抗原であるCD49cを指標としたソーティングにより、ヒト多能性幹細胞由来の細胞凝集塊から下垂体細胞および視床下部細胞を同時に分離できること、分離した細胞を再凝集させることで、生体の視床下部-下垂体系に相当するホルモン分泌能を有した培養組織を作製できることを見出した。さらに、下垂体表面抗原（EpCAM）とCD49cとを組み合わせたソーティングにより、下垂体細胞と視床下部細胞とを別々に分離できることも見出し、本発明を完成させるに至った。
［１］
　腺性下垂体及び／又はその前駆組織、並びに視床下部神経上皮組織を含む細胞凝集塊から、CD49cを発現する細胞を分離する工程を含む、下垂体ホルモン産生細胞及び／又はその前駆細胞、並びに視床下部細胞を分離する方法。
［２］
　腺性下垂体及び／又はその前駆組織を含む細胞凝集塊から、CD49c及びEpCAMを発現する細胞を分離する工程を含む、下垂体ホルモン産生細胞及び／又はその前駆細胞を分離する方法。
［３］
　CD49cを発現する細胞、又はCD49c及びEpCAMを発現する細胞を分離する工程が、以下の工程を含む、［１］又は［２］に記載の方法。
（１）該細胞凝集塊を細胞集団に分散させる第一工程、
（２）第一工程で得られた細胞集団を、ラミニン又はその断片でコーティングした培養器上で培養する第二工程、及び
（３）第二工程で得られた細胞集団から、CD49cを発現する細胞、又はCD49c及びEpCAMを発現する細胞を分離する第三工程
［４］
　CD90、CD29、CD44、CD58及びCD166からなる群から選択される少なくとも１つの細胞表面抗原が陰性の細胞を分離する工程を含む、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
　細胞凝集塊が、多能性幹細胞を分化誘導することにより得られる細胞凝集塊である、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
　前記前駆組織が、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢である、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］
　腺性下垂体及び/又はその前駆組織、並びに視床下部神経上皮組織を含む細胞凝集塊から、CD49cを発現する細胞を分離する工程を含む、下垂体ホルモン産生細胞及び/又はその前駆細胞、並びに視床下部細胞の製造方法。
［８］
　腺性下垂体及び/又はその前駆組織を含む細胞凝集塊から、CD49c及びEpCAMを発現する細胞を分離する工程を含む、下垂体ホルモン産生細胞及び/又はその前駆細胞の製造方法。
［９］
　以下の工程：
（Ａ）腺性下垂体及び／又はその前駆組織、並びに視床下部神経上皮組織を含む細胞凝集塊から、CD49cを発現する細胞を分離する工程、及び
（Ｂ）前記（Ａ）で得られる集団を、再凝集させる工程
を含む、下垂体ホルモン産生細胞及び／又はその前駆細胞、並びに視床下部細胞を含む細胞凝集塊又は細胞シートを製造する方法。
［１０］
　以下の工程：
（ａ）腺性下垂体及び／又はその前駆組織を含む細胞凝集塊から、CD49c及びEpCAMを発現する細胞を分離する工程、及び
（ｂ）前記（ａ）で得られる集団を、再凝集させる工程
を含む、下垂体ホルモン産生細胞及び／又はその前駆細胞を含む細胞凝集塊又は細胞シートを製造する方法。
［１１］
　CD49cを発現する細胞、又はCD49c及びEpCAMを発現する細胞を分離する工程が、以下の工程を含む、［７］～［１０］のいずれかに記載の方法。
（１）該細胞凝集塊を細胞集団に分散させる第一工程、
（２）第一工程で得られた細胞集団を、ラミニン又はその断片でコーティングした培養器上で培養する第二工程、及び
（３）第二工程で得られた細胞集団から、CD49cを発現する細胞、又はCD49c及びEpCAMを発現する細胞を分離する第三工程
［１２］
　CD90、CD29、CD44、CD58及びCD166からなる群から選択される少なくとも１つの細胞表面抗原が陰性の細胞を分離する工程
をさらに含む、［７］～［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］
　前記下垂体ホルモン産生細胞が、成長ホルモン（GH）産生細胞、プロラクチン（PRL）産生細胞、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）産生細胞、甲状腺刺激ホルモン（TSH）産生細胞、卵胞刺激ホルモン（FSH）産生細胞、黄体化ホルモン（LH）産生細胞からなる群から選択される少なくとも1種である、［７］～［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］
　［９］～［１３］のいずれかに記載の方法により製造された細胞凝集塊又は細胞シート。
［１５］
　［９］～［１３］のいずれかに記載の方法により製造された細胞凝集塊又は細胞シートを含む、移植療法剤。
［１６］
　腺性下垂体の障害に基づく疾患及び／又は腺性下垂体の損傷状態を治療するための、［１５］に記載の移植療法剤。
［１７］
　前記腺性下垂体の障害に基づく疾患が、汎下垂体機能低下症、下垂体性小人症、副腎皮質機能低下症、部分的下垂体機能低下症及び下垂体前葉ホルモン単独欠損症からなる群から選択される、［１６］に記載の移植療法剤。
［１８］
　［９］～［１３］のいずれかに記載の方法により製造された細胞凝集塊又は細胞シートを含有してなる、腺性下垂体の障害に基づく疾患又は腺性下垂体の損傷状態の治療薬。
［１９］
　［９］～［１３］のいずれかに記載の方法により製造された細胞凝集塊又は細胞シートの有効量を、移植を必要とする対象に移植することを含む、腺性下垂体の障害に基づく疾患又は腺性下垂体の損傷状態の治療方法。
［２０］
　腺性下垂体の障害に基づく疾患又は腺性下垂体の損傷状態の治療における使用のための［９］～［１３］のいずれかに記載の方法により製造された細胞凝集塊又は細胞シート。
［２１］
　［９］～［１３］のいずれかに記載の方法により製造された細胞凝集塊又は細胞シートを有効成分として含有する、医薬組成物。
［２２］
　腺性下垂体の障害に基づく疾患又は腺性下垂体の損傷状態の治療薬の製造における［９］～［１３］のいずれかに記載の方法により製造された細胞凝集塊又は細胞シートの使用。
　本発明によれば、CD49cを利用することで、多能性幹細胞由来の細胞凝集塊から機能的な下垂体ホルモン産生細胞及び／又はその前駆細胞、並びに視床下部細胞を含む細胞集団を効率的に分離・精製することができる。また、分離・精製した細胞集団は、生理的な下垂体ホルモン分泌刺激により優れた下垂体ホルモンの分泌能を示し、また視床下部細胞と協調して機能し得るため、該細胞集団を用いて下垂体に関する疾患の治療等を行うことができる。
ヒトES細胞（hESC）由来細胞塊(Day 152)の免疫染色の結果を示す。EpCAMは下垂体領域と嚢胞化領域に発現することが確認された。 hESC由来細胞塊(Day 152)の免疫染色の結果を示す。CD49cは下垂体領域と一部の非下垂体領域（主に視床下部神経組織と考えられる）に発現することが確認された。 hESC由来細胞塊(Day 152)の未分化領域における免疫染色の結果を示す。EpCAMは未分化細胞領域に発現するが、CD49cは発現しないことが確認された。 hESC由来細胞塊(Day 152)の未分化領域の連続切片における免疫染色の結果を示す。点線で囲った領域は、視床下部マーカー（Rx::Venus）及び／又は神経細胞マーカー（Tuj1, DCX）を発現していることから、視床下部細胞領域であると考えられる。この視床下部細胞領域において、EpCAMは発現しないが、CD49cは広範囲に発現することが確認された。 Ａ：フローサイトメトリーを用いて、Rx::Venus+視床下部細胞におけるEpCAMおよびCD49cの発現を解析した結果を示す。　Ｂ：図Ａの解析結果に基づき、Rx::Venus+視床下部細胞におけるEpCAMおよびCD49cの陽性率をn = 3で定量化した結果を示す。CD49cはRx::Venus+細胞に発現するが、EpCAMはほとんど発現しないことが確認された。 hESC由来細胞塊(Day 152)の免疫染色の結果を示す。CD29（インテグリン β1）は嚢胞化領域を除く組織全体に発現していることが確認された。図２と対比すると、CD49c（インテグリン α3）と二量体を形成していると考えられる（インテグリン α3/β1）。 hESC由来細胞塊(Day 161)を使用して、細胞外マトリックスであるLaminin 511の組み換え活性断片(製品名：iMatrix-511)の細胞接着性を利用して細胞分離する方法（「iMatrix-511接着処理」とも称する。）を示す。　Ａ：細胞凝集塊の酵素処理により分散した細胞を、iMatrix-511をコーティングした培養器で２～３時間培養することで、浮遊細胞画分に存在する細胞と接着細胞画分に存在する細胞に分かれることを示す。　Ｂ：浮遊細胞画分に存在する細胞と接着細胞画分に存在する細胞の存在割合を示す。　Ｃ：浮遊細胞画分に存在する細胞と接着細胞画分に存在する細胞の免疫染色の結果を示す。右側のグラフは、浮遊細胞画分と接着細胞画分における、CD49c陽性細胞及びRx::Venus陽性細胞の割合を示す。CD49c陽性細胞およびRx::Venus陽性細胞は、iMatrix-511接着細胞画分として回収されることが確認された。　Ｄ：浮遊細胞画分と接着細胞画分における細胞の生存率（viability）を示す。iMatrix-511接着細胞画分は浮遊細胞画分と比べて生存率が高いことが確認された。iMatrix-511接着処理により、死細胞を簡便に除去することができ、生存率の高い細胞のみをCD49cを指標としたソーティングに供することができる。 再凝集能を指標としたiMatrix-511接着処理による細胞生存率の向上を示す。　Ａ： Feeder-free分化法により誘導したhESC由来細胞塊(Day 448）を分散後、下記のMethod A又はMethod Bの方法のいずれかで処理し、15,000個ずつ再凝集して3日後に観察した。　　Method A:  MACS死細胞除去キットで生細胞を回収　　Method B:  iMatrix-511接着細胞画分を回収　点線が凝集塊の輪郭を示しており、凝集塊の周囲の細胞は大部分が死細胞であった。　Ｂ: 凝集塊の面積を測定した結果（n = 6-8）。Welch t検定を用いて平均値を比較したときのp値を示す。従来使用していたソーティング前処理法（Method A）と比較して、iMatrix-511接着細胞画分（Method B）では、死細胞が少なく、より大きな凝集塊を形成することが確認された。 iMatrix-511接着処理後の再凝集塊（Day 7）における免疫染色の結果を示す。再凝集塊において、下垂体マーカー（ACTH, Lhx3）および視床下部マーカー（Rx::Venus）を発現していること及びRx::Venus陽性細胞の多くは、神経細胞マーカー（Tuj1）を共発現していることが確認された。この結果より、下垂体細胞および視床下部細胞がiMatrix-511接着画分として回収されることが実証された。 iMatrix-511接着処理後の再凝集塊（Day 7）における免疫染色の結果を示す。再凝集塊において、細胞塊の外側は、増殖性の未分化細胞（Lin28a+/Oct4+/SSEA5+/Ki67+）で囲まれていることが確認された。Lin28a及びAP2αは嚢胞形成細胞（および表面外胚葉）のマーカーであるが、Lin28a陽性細胞はすべてOct4陽性かつSSEA5陽性の未分化細胞であり、AP2a陽性の細胞は存在しないことが確認された。上記結果から、未分化細胞はiMatrix-511接着細胞画分として回収されるが、嚢胞形成細胞は回収されないことが実証された。 iMatrix-511接着処理後の再凝集塊（Day 7）における免疫染色の結果を示す。Lin28a陽性領域（未分化細胞）ではCD49cを発現しないが、Lin28a陰性領域（下垂体細胞、視床下部細胞含む）ではCD49cを発現することが確認された。この結果より、iMatrix-511接着細胞画分からCD49c陽性細胞を分離することで、下垂体細胞および視床下部細胞を精製できると考えられる。 iMatrix-511接着処理後の再凝集塊のサイズを7日目(Day 7)と28日目（Day 28）の比較を示す。図10で示されているように細胞塊の外側は、増殖性の未分化細胞（Lin28a+/Oct4+/SSEA5+/Ki67+）で囲まれていることから未分化細胞が増殖することで再凝集塊が肥大化したと考えられる。 磁気細胞分離法（MACS）によってCD49c陽性細胞とCD49c陰性細胞を分離した後のACTH分泌能を示す。試験方法としては、hESCから分化させたサンプル（「hESCサンプル」とも称する。）からMACS精製後に再凝集させて8日間培養した細胞塊を使用した。細胞塊5個を1.5 mlマイクロチューブに移し、HBSS(+) (Wako, # 084-08965) 250 μl中で37℃, 10分保温後、HBSSを回収した。続いて、1 μg/ml CRH (Peptide Institute, #4136-s)を含むHBSS 250 μl中で37℃, 10分保温後、HBSSを回収した。回収したHBSS中のACTH濃度を臨床検査で使われているECLIA法によって測定した。　Ａ：MACSにより分離したCD49c陽性細胞とCD49c陰性細胞を再凝集させて7日目の画像を示す。　Ｂ：CRH刺激前後におけるACTH分泌量を測定した結果を示す。CD49c陽性細胞では、ACTHの基礎分泌が高く、生理的な分泌刺激因子であるCRHに反応してACTH分泌が増加する一方で、CD49c陰性細胞ではACTHの基礎分泌が低く、CRHにも反応しないことが確認された。このことからACTH細胞がCD49c陽性細胞に分離されていることが実証された。 蛍光活性化セルソーティング（FACS）によってCD49c陽性細胞とCD49c陰性細胞との蛍光強度範囲を決定し、CD49c陽性細胞とCD49c陰性細胞を分離し、再凝集塊のサイズを8日目(Day 8)と36日目（Day 36）で比較した結果を示す。　Ａ：FACSを実施した例を示す。細胞の自家蛍光のため、CD49cの蛍光染色のみではCD49c陽性細胞とCD49c陰性細胞と境界がわかりにくい。このため、CD49cと未分化細胞のマーカーであるSSEA5を同時に蛍光染色することでCD49c陰性細胞の蛍光強度範囲を決定するための指標としている。SSEA5を高発現する細胞集団（点線領域）が未分化細胞である。以後の実験では、未分化細胞が混入しないように、CD49c陽性細胞をソートすることで得られた細胞集団を用いた。　Ｂ：分離したCD49c陽性細胞の8日目(Day 8)における再凝集塊を示す。　Ｃ：再凝集塊のサイズ（面積）を定量化した結果を示す。CD49c陽性細胞では、未分化細胞をはじめとする増殖性細胞が除去されることで、細胞塊の肥大化が顕著に抑制されていることが確認された。なお、CD49c陽性細胞の36日目（Day 36）に一部面積の変化が大きい細胞塊が存在していることがわかる。これらは、増殖性細胞が残存した細胞塊と考えられるため、これらの細胞塊を面積若しくは形態を基準にして除去することで治療用細胞を精製することができる。 FACSによってCD49c陽性細胞を分離し、細胞を再凝集させた後のACTH分泌能を示す。　Ａ：CRH刺激前後における細胞塊1個当たりのACTH分泌量を測定した結果を示す。生理的な分泌刺激因子であるCRHに反応してACTH分泌が増加することが確認された。試験方法としては、hESCサンプルからFACS精製後に再凝集させて12日間培養した細胞塊を使用した。細胞塊を1個ずつ1.5 mlマイクロチューブに移し、標準グルコース培地（glucose-free DMEM + 5.56 mM D-glucose + 4.44 mM D-mannitol）250 μl中で37℃、30分保温後、培地を回収した。続いて、1 μg/ml CRH (Peptide Institute, #4136-s)を含む標準グルコース培地250 μl中で37℃、30分保温後、培地を回収した。回収した培地中のACTH濃度を臨床検査で使われているECLIA法によって測定した。　Ｂ：生理的な分泌抑制因子であるコルチゾール（Hydrocortisone）処理前後における細胞塊1個当たりのACTH分泌量を測定した結果を示す。コルチゾール（Hydrocortisone）処理によって、ACTH分泌が減少することが確認された。FACSによるソーティング後のCD49c陽性細胞塊において、ACTH細胞は生理的な分泌機能を維持することが実証された。試験方法としては、hESCサンプルからFACS精製後に再凝集させて13日間培養した細胞塊を使用した。分泌測定前にコルチゾール（Hydrocortisone, 20 μg/ml）またはコントロールとして同量の溶媒（0.1% DMSO）を含む維持培地（gfCDM + 20%KSR + 2 μM SAG）で3時間前処理を行った。前処理後の細胞塊を1個ずつ1.5 mlマイクロチューブに移し、標準グルコース培地（glucose-free DMEM + 5.56 mM D-glucose + 4.44 mM D-mannitol）250 μl中で37℃、30分保温後、培地を回収した。上記の標準グルコース培地にもコルチゾール又はDMSOは継続添加した。回収した培地中のACTH濃度を臨床検査で使われているECLIA法によって測定した。 試験方法として、hESCサンプルからFACS精製後に再凝集させて13-15日間培養した細胞塊を使用した。分泌測定前にアンタラルミン（Antalarmin, 10 μM）またはコントロールとして同量の溶媒（0.1% DMSO）を含む維持培地（gfCDM + 20%KSR + 2 μM SAG）で3時間前処理を行った。前処理後の細胞塊を1個ずつ1.5 mlマイクロチューブに移し、標準グルコース培地（glucose-free DMEM + 5.56 mM D-glucose + 4.44 mM D-mannitol）250 μl中で37℃、30分保温後、培地を回収した。続いて、低グルコース培地（glucose-free DMEM + 0.56 mM D-glucose + 9.44 mM D-mannitol）250 μl中で37℃、30分保温後、培地を回収した。上記の標準グルコース培地および低グルコース培地にもアンタラルミン又はDMSOは継続添加した。回収した培地中のACTH濃度を臨床検査で使われているECLIA法によって測定した結果を示す。標準グルコース条件（100 mg/dL）と比べて、低グルコース条件（10 mg/dL）ではACTH分泌量が増加することが確認された。このことから、生体に準じた調節が行われていることが実証された。また、Antalarmin（CRH受容体阻害剤）処理によって、標準グルコースおよび低グルコースの両条件でACTH分泌量が低下することが確認された。1つの細胞塊の中で、視床下部細胞由来のCRHを介して、下垂体細胞からのACTH分泌が調節されていると考えられる。したがって、CD49c陽性細胞の再凝集塊において、視床下部細胞と下垂体細胞の機能的結合が再構築される可能性を示唆している。 FACSを用いてCD49c陽性細胞/EpCAM陽性細胞及びCD49c陽性細胞/EpCAM陰性細胞となる蛍光強度範囲を示す。本研究結果及び本発明者らによる以前の研究結果から、CD49c陽性細胞/EpCAM陽性細細胞をソーティングすることで下垂体細胞が、CD49c陽性細胞/EpCAM陰性細胞をソーティングすることで視床下部細胞を分離できると推測される。 再凝集塊におけるRx::Venusの発現パターンを示す。Rx::Venus陽性細胞（＝視床下部細胞）は、CD49c陽性/EpCAM陰性-画分に濃縮されることが確認された。 FACS後の再凝集塊のACTH分泌能を示す。試験方法としては、hESCサンプルからFACS精製後に再凝集させて8日以上培養した細胞塊を使用した。細胞塊1個ずつを維持培地（gfCDM + 20%KSR + 2 μM SAG）250 μl中で37℃, 24時間培養後、培地を回収した。回収した培地中のACTH濃度を臨床検査で使われているECLIA法によって測定した。ACTH細胞は、CD49c陽性細胞/EpCAM陽性細胞画分に濃縮されることが確認された。 ヒトiPS細胞（hiPSC）から分化させたサンプル（「hiPSCサンプル」とも称する）での表面マーカー発現パターンを示す。これまでの実験はすべてhESCから分化させたサンプル（「hESCサンプル」とも称する。）で行ったものだが、図１４等と比較することでhiPSCサンプルでも同様の表面マーカーの発現パターンとなることが確認された。 hiPSCサンプルによるCRH刺激前後における細胞塊1個当たりのACTH分泌量を測定した結果を示す。試験方法としては、hiPSCサンプルからFACS精製後に再凝集させて21日間培養した細胞塊を使用した。細胞塊を1個ずつ1.5 mlマイクロチューブに移し、標準グルコース培地（glucose-free DMEM + 5.56 mM D-glucose + 4.44 mM D-mannitol）250 μl中で37℃、30分保温後、培地を回収した。続いて、1 μg/ml CRH (Peptide Institute, #4136-s)を含む標準グルコース培地250 μl中で37℃、30分保温後、培地を回収した。回収した培地中のACTH濃度を臨床検査で使われているECLIA法によって測定した。CD49c陽性細胞では、ACTHの基礎分泌が高く、生理的な分泌刺激因子であるCRHに反応してACTH分泌が増加する一方で、CD49c陰性細胞ではACTHの基礎分泌が低く、CRHにも反応しないことが確認された。このことからhiPSCサンプルにおいてもhESC由来細胞と同様にACTH細胞がCD49c陽性細胞に分離されていることが実証された。 剥離組織を用いた間葉系幹細胞様の増殖性細胞の表面マーカー検索結果を示す。該増殖性細胞は、培養中の細胞凝集塊から剥離組織として現れる。hiPSCサンプル由来の剥離組織を回収し、10×TrypLE selectで処理して分散させ（ほぼ完全にシングルセルとなった）、幹細胞系譜の表面マーカーを蛍光染色し、フローサイトメーターで陽性率を定量化した。検討した細胞表面マーカーのうち、剥離組織では、図に示す6種類のマーカーの発現が確認された。これらは間葉系幹細胞（MSC）で発現することが知られているものであり、特にCD90は、MSCに高発現する主要マーカーの1つである。この結果より、剥離組織中の増殖性細胞では、間葉系幹細胞と共通の表面抗原が発現することが確認された。特に、CD29, CD44, CD58, CD90, CD166は90%以上の細胞で発現することが確認された。 hiPSCサンプルの再凝集塊における免疫染色の結果を示す。図２２に示す表面抗原のうち、CD90、CD44が間葉系幹細胞様の増殖性細胞（Oct4 陽性細胞）に特異的に発現することが確認された。この結果より、該増殖性細胞を除去するための陰性マーカーとして、CD90、CD44が好ましいことが実証された。
　本発明は、腺性下垂体及び／又はその前駆組織を含み、任意により視床下部神経上皮組織をさらに含む細胞凝集塊（以下、「細胞分離前の細胞凝集塊」とも称することがある。）から、下垂体ホルモン産生細胞及び／又はその前駆細胞、任意によりさらに視床下部細胞を分離する方法（以下、「本発明の分離方法」と称することがある。）を提供する。本発明の分離方法は、CD49c及び／又はEpCAMの発現を指標として、上記細胞凝集塊から細胞を分離する工程を含むことを特徴とする。本発明の分離方法で用いる細胞凝集塊は、典型的には、多能性幹細胞の凝集塊を培養することにより取得することができる。
（1）多能性幹細胞
　「多能性幹細胞」とは、生体を構成するすべての細胞に分化しうる能力（分化多能性）と、細胞分裂を経て自己と同一の分化能を有する娘細胞を生み出す能力（自己複製能）とを併せ持つ細胞をいう。
　分化多能性は、評価対象の細胞を、ヌードマウスに移植し、三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）のそれぞれの細胞を含むテラトーマ形成の有無を試験することにより、評価することができる。
　多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ES細胞）、胚性生殖細胞（EG細胞）、人工多能性幹細胞（iPS細胞）、胚性腫瘍細胞（EC細胞）等を挙げることができるが、分化多能性及び自己複製能を併せ持つ細胞である限り、これに限定されない。本発明においては、ES細胞又はiPS細胞(より好ましくはヒトiPS細胞)が好適に用いられる。上記多能性幹細胞がES細胞又はヒト胚に由来する任意の細胞である場合、その細胞は胚を破壊して作製された細胞であっても、胚を破壊することなく作製された細胞であってもよいが、好ましくは、胚を破壊することなく作製された細胞である。本発明で用いるヒトES細胞は、受精１４日以内のヒト胚から樹立されたものである。
　ES細胞は、例えば、着床以前の初期胚、当該初期胚を構成する内部細胞塊、単一割球等を培養することによって樹立することができる（Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994)；Thomson, J. A. et al., Science, 282, 1145-1147 (1998)）。初期胚として、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を用いてもよい（Wilmut et al. (Nature, 385, 810 (1997))、Cibelli et al. (Science, 280, 1256 (1998))、入谷明ら（蛋白質核酸酵素, 44, 892 (1999)）、Baguisi et al. (Nature Biotechnology, 17, 456 (1999))、Wakayama et al. (Nature, 394, 369 (1998); Nature Genetics, 22, 127 (1999); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14984 (1999))、Rideout III et al. (Nature Genetics, 24, 109 (2000) 、Tachibana et al. (Human Embryonic Stem Cells Derived by Somatic Cell Nuclear Transfer, Cell (2013) in press)。初期胚として、単為発生胚を用いてもよいKim et al. （Science, 315, 482-486 (2007)）、Nakajima et al. （Stem Cells, 25, 983-985 (2007)）、Kim et al. （Cell Stem Cell, 1, 346-352 (2007)）、Revazova et al. （Cloning Stem Cells, 9, 432-449 (2007)）、Revazova et al. （Cloning Stem Cells, 10, 11-24 (2008)）。
　ES細胞と体細胞の細胞融合によって得られる融合ES細胞も、本発明の方法に用いられるES細胞に含まれる。
　ES細胞は、所定の機関より入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒトES細胞であるKhES-1、KhES-2及びKhES-3は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。
　EG細胞は、始原生殖細胞を、LIF, bFGF, SCFの存在下で培養すること等により樹立することができる（Matsui et al., Cell, 70, 841-847 (1992)、Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(23), 13726-13731 (1998)、Turnpenny et al., Stem Cells, 21(5), 598-609, (2003)）。
　iPS細胞とは、体細胞（例えば線維芽細胞、皮膚細胞、リンパ球等）へ核初期化因子を接触させることにより、人為的に分化多能性及び自己複製能を獲得した細胞をいう。iPS細胞は、体細胞（例えば線維芽細胞、皮膚細胞等）にOct3/4、Sox2、Klf4およびc-Mycからなる核初期化因子を導入する方法で初めて見出された（Cell, 126: p. 663-676, 2006）。その後、多くの研究者により、リプログラム因子の組み合わせや因子の導入法について様々な改良が進められており、多様なiPS細胞の製造法が報告されている。
　核初期化因子は、線維芽細胞等の体細胞から分化多能性および自己複製能を有する細胞を誘導することができる物質（群）であれば、タンパク性因子又はそれをコードする核酸（ベクターに組み込まれた形態を含む）、あるいは低分子化合物等のいかなる物質から構成されてもよい。核初期化因子がタンパク性因子又はそれをコードする核酸の場合、好ましくは以下の組み合わせが例示される（以下においては、タンパク性因子の名称のみを記載する）。
(1) Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc（ここで、Sox2はSox1, Sox3, Sox15, Sox17又はSox18で置換可能である。また、Klf4はKlf1, Klf2又はKlf5で置換可能である。さらに、c-MycはT58A（活性型変異体）, N-Myc, L-Mycで置換可能である。）
(2) Oct3/4, Klf4, Sox2
(3) Oct3/4, Klf4, c-Myc
(4) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28
(5) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28
(6) Oct3/4, Klf4, Sox2, bFGF
(7) Oct3/4, Klf4, Sox2, SCF
(8) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, bFGF
(9) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, SCF
　これらの組み合わせの中で、得られるiPS細胞を治療用途に用いることを念頭においた場合、(1)の4因子の組み合わせ、(2)の3因子の組み合わせ、および(5)の6因子が好ましい。なかでも、(1)の4因子の組み合わせ、および(2)の3因子の組み合わせがより好ましい。一方、iPS細胞を治療用途に用いることを念頭に置かない場合（例えば、創薬スクリーニング等の研究ツールとして用いる場合など）は、Oct3/4, Klf4, Sox2及びc-Mycの4因子か、それにLin28またはNanogを加えた5因子が好ましい。
　自家移植用途にはiPS細胞が好適に用いられる。
　染色体上の遺伝子を公知の遺伝子工学の手法を用いて改変した多能性幹細胞も、本発明において使用できる。多能性幹細胞は、公知の方法を用いて、分化マーカーをコードする遺伝子に標識遺伝子（例えばGFP等の蛍光タンパク質）をインフレームにノックインすることにより、標識遺伝子の発現を指標として対応する分化段階に達したことを識別可能とした細胞であってもよい。
　多能性幹細胞としては、例えば恒温動物、好ましくは哺乳動物の多能性幹細胞を使用できる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、オランウータン、チンパンジー等の霊長類を挙げることができる。多能性幹細胞は、好ましくは、げっ歯類（マウス、ラット等）又は霊長類（ヒト等）の多能性幹細胞であり、最も好ましくはヒト多能性幹細胞である。
　多能性幹細胞は、自体公知の方法により維持培養できる。例えば、臨床応用の観点では、多能性幹細胞は、KnockoutTMSerum Replacement（KSR）などの血清代替物を用いた無血清培養や、無フィーダー細胞培養により維持することが好ましい。
　本発明において使用される多能性幹細胞は、好ましくは単離されている。「単離」とは、目的とする細胞や成分以外の因子を除去する操作がなされ、天然に存在する状態を脱していることを意味する。「単離されたヒト多能性幹細胞」の純度（総細胞数に占めるヒト多能性幹細胞数の百分率）は、通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、更に好ましくは99％以上、最も好ましくは100％である。
（2）多能性幹細胞の凝集塊の形成
　多能性幹細胞の凝集塊を調製する方法に特に限定はなく、分散させた多能性幹細胞を、培養器に対して、非接着性の条件で培養（即ち浮遊培養）してもよいし、接着性の条件下で培養（即ち、接着培養）してもよい。
　好ましい一態様において、多能性幹細胞の凝集塊は、分散させた多能性幹細胞を、培養器に対して、非接着性の条件下で培養し（即ち、浮遊培養し）、複数の多能性幹細胞を集合させて凝集塊を形成させることにより、得ることができる。
　この凝集塊形成に用いる培養器としては、特に限定されないが、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルが挙げられる。非接着性の条件下での培養を可能とするため、培養器は、細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞非接着性となるように人工的に処理されているものや、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されていないもの等を使用することができる。
　凝集塊の形成時に用いられる培地は、哺乳動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、ハム培地、Ham's F-12培地、RPMI1640培地、Fischer's培地、Neurobasal培地およびこれらの混合培地（例：DMEM/F-12培地（DMEM培地：Ham's F-12培地＝1:1の混合培地）等）など、哺乳動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。一態様において、IMDM培地及びHam's F-12培地の混合培地が用いられる。混合比は、容量比で、例えば、IMDM：Ham's F-12＝0.8～1.2：1.2～0.8である。
　培養に用いる培地は、血清含有培地又は無血清培地であり得る。無血清培地とは、無調製又は未精製の血清を含まない培地を意味し、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地は無血清培地に該当するものとする。化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、本発明においては、無血清培地が好適に用いられる。
　凝集塊の形成時に用いられる培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール又は3’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものであり得る。かかる血清代替物は、例えば、WO98/30679記載の方法により調製できる。また、本発明の方法をより簡便に実施するために、血清代替物は市販のものを利用できる。かかる市販の血清代替物としては、例えば、KSR（knockout serum replacement）（Invitrogen社製）、Chemically-defined Lipid concentrated（Gibco社製）、Glutamax（Gibco社製）が挙げられる。
　凝集塊の形成に用いられる培地は、多能性幹細胞から、下垂体若しくはその部分組織、又はその前駆組織への分化誘導に、悪影響を与えない範囲で、他の添加物を含むことができる。添加物としては、例えば、インスリン、鉄源（例えばトランスフェリン等）、ミネラル（例えばセレン酸ナトリウム等）、糖類（例えばグルコース等）、有機酸（例えばピルビン酸、乳酸等）、血清蛋白質（例えばアルブミン等）、アミノ酸（例えばL-グルタミン等）、還元剤（例えば2-メルカプトエタノール等）、ビタミン類（例えばアスコルビン酸、d-ビオチン等）、抗生物質（例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、緩衝剤（例えばHEPES等）等が挙げられるが、これらに限定されない。
　また、凝集塊の形成に用いられる培地は、後述する、第1の培養工程において用いられる培地であってもよい。
　多能性幹細胞の凝集塊の形成に際しては、まず、多能性幹細胞を継代培養から回収し、これを、単一細胞、又はこれに近い状態にまで分散する。多能性幹細胞の分散は、適切な細胞解離液を用いて行われる。細胞解離液としては、例えば、EDTA；トリプシン、コラゲナーゼIV、メタロプロテアーゼ等のタンパク分解酵素等を単独で又は適宜組み合わせて用いることができる。なかでも細胞障害性が少ないものが好ましく、このような細胞解離液として、例えば、ディスパーゼ（エーディア）、TrypLE (Invitrogen)又はアキュターゼ(MILLIPORE)等の市販品が入手可能である。分散された多能性幹細胞は、上記培地中に懸濁される。
　分散により誘導される多能性幹細胞（特に、ヒト多能性幹細胞）の細胞死を抑制するために、Rho-associated coiled-coilキナーゼ（ROCK）の阻害剤を培養開始時から添加することが好ましい（特開2008-99662）。ROCK阻害剤を培養開始から例えば15日以内、好ましくは10日以内、より好ましくは6日以内添加する。ROCK阻害剤としては、Y-27632（(+)-(R)-trans-4-(1-aminoethyl)-N-(4-pyridyl)cyclohexanecarboxamide dihydrochloride）等を挙げることができる。浮遊培養に用いられるROCK阻害剤の濃度は、分散により誘導される多能性幹細胞の細胞死を抑制し得る濃度である。例えば、Y-27632について、このような濃度は、通常約0．1～200μM、好ましくは約2～50μMである。ROCK阻害剤の濃度を添加する期間内で変動させてもよく、例えば期間の後半で濃度を半減させることができる。
　分散された多能性幹細胞の懸濁液を、上記培養器中に播き、分散させた多能性幹細胞を、培養器に対して、非接着性の条件下で培養することにより、複数の多能性幹細胞を集合させて凝集塊を形成する。この際、分散された多能性幹細胞を、10cmディッシュのような、比較的大きな培養器に播種することにより、1つの培養コンパートメント中に複数の多能性幹細胞の凝集塊を同時に形成させてもよいが、こうすると凝集塊ごとの大きさや、中に含まれる多能性幹細胞の数に大きなばらつきが生じ、このばらつきが原因で、多能性幹細胞から、下垂体若しくはその部分組織、又はその前駆組織への分化の程度に、凝集塊間で差が生じ、結果として分化誘導の効率が低下してしまう。そこで、分散した多能性幹細胞を迅速に凝集させて、1つの培養コンパートメント中に1つの凝集塊を形成することが好ましい。このような分散した多能性幹細胞を迅速に凝集させる方法としては、例えば、以下の方法を挙げることができる：
1）比較的小さな体積（例えば、1ml以下、500μl以下、200μl以下、100μl以下）の培養コンパートメント中に、分散した多能性幹細胞を閉じ込め、該コンパートメント中に1個の凝集塊を形成する方法。好ましくは分散した多能性幹細胞を閉じ込めた後、培養コンパートメントを静置する。培養コンパートメントとしては、マルチウェルプレート（384ウェル、192ウェル、96ウェル、48ウェル、24ウェル等）、マイクロポア、チャンバースライド等におけるウェルや、チューブ、ハンギングドロップ法における培地の液滴等を挙げることができるが、これらに限定されない。該コンパートメントに閉じ込められた分散した多能性幹細胞が、重力にうながされて1箇所に沈殿し、あるいは細胞同士が接着することにより、1つの培養コンパートメントにつき、1つの凝集塊が形成される。マルチウェルプレート、マイクロポア、チャンバースライド、チューブ等の底の形状は、分散した多能性幹細胞が1箇所へ沈殿するのが容易となるように、U底又はV底とすることが好ましい。
2）遠心チューブに分散した多能性幹細胞を入れ、これを遠心し、1箇所に多能性幹細胞を沈殿させることにより、該チューブ中に1個の凝集塊を形成する方法。
　1つの培養コンパートメント中に播く多能性幹細胞の数は、1つの培養コンパートメントにつき1つの凝集塊が形成され、且つ本発明の方法によって、該凝集塊において、多能性幹細胞から、下垂体若しくはその部分組織、又はその前駆組織への分化誘導が可能であれば、特に限定されないが、1つの培養コンパートメントにつき、通常約1×103～約5×104 個、好ましくは約1×103～約2×104個、より好ましくは約2×103～約1．2×104個の多能性幹細胞を播く。そして、多能性幹細胞を迅速に凝集させることにより、1つの培養コンパートメントにつき、通常約1×103～約5×104個、好ましくは約1×103～約2×104個、より好ましくは約2×103～約1．2×104個の多能性幹細胞からなる細胞凝集塊が1個形成される。
　凝集塊形成までの時間は、1つのコンパートメントにつき1つの凝集塊が形成され、且つ本発明の方法によって、該凝集塊において、多能性幹細胞から、下垂体若しくはその部分組織、又はその前駆組織への分化誘導が可能な範囲で適宜決定可能であるが、この時間を短くすることにより、目的とする下垂体若しくはその部分組織、又はその前駆組織への効率よい分化誘導が期待できるため、この時間は短いほうが好ましい。好ましくは、24時間以内、より好ましくは12時間以内、さらに好ましくは6時間以内、最も好ましくは、2～3時間で、多能性幹細胞の凝集塊を形成する。この凝集塊形成までの時間は、細胞を凝集させる用具や、遠心条件などを調整することで当業者であれば適宜調節することが可能である。
　また凝集塊形成時の培養温度、CO2濃度等の他の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、特に限定されるものではないが、例えば約30～40℃、好ましくは約37℃である。また、CO2濃度は、例えば約1～10％、好ましくは約5％である。
　更に、同一培養条件の培養コンパートメントを複数用意し、各培養コンパートメントにおいて、1個の多能性幹細胞の凝集塊を形成させることにより、質的に均一な、多能性幹細胞の凝集塊の集団を得ることができる。多能性幹細胞の凝集塊が質的に均一であることは、凝集塊のサイズおよび細胞数、巨視的形態、組織染色解析による微視的形態およびその均一性、分化および未分化マーカーの発現およびその均一性、分化マーカーの発現制御およびその同期性、分化効率の凝集塊間の再現性などに基づき、評価することが可能である。一態様において、本発明の方法に用いる、多能性幹細胞の凝集塊の集団は、凝集塊中に含まれる多能性幹細胞の数が均一である。特定のパラメーターについて、多能性幹細胞の凝集塊の集団が「均一」とは、凝集塊の集団全体のうちの90％以上の凝集塊が、当該凝集塊の集団における当該パラメーターの平均値±10％の範囲内、好ましくは、平均値±5％の範囲内であることを意味する。
（3）腺性下垂体及び／又はその前駆組織の誘導
　一実施態様において、細胞分離前の細胞凝集塊は、多能性幹細胞の凝集塊を、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びソニック・ヘッジホッグ（Shh）シグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養することを含む方法にて取得することができる。
　本発明において、腺性下垂体とは、少なくとも1種の下垂体前葉又は中葉の下垂体ホルモン産生細胞を含む組織をいう。下垂体ホルモン産生細胞としては、成長ホルモン（GH）産生細胞、プロラクチン（PRL）産生細胞、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）産生細胞、甲状腺刺激ホルモン（TSH）産生細胞、卵胞刺激ホルモン（FSH）産生細胞、黄体化ホルモン（LH）産生細胞等の前葉を構成する細胞；メラニン細胞刺激ホルモン（MSH）産生細胞等の中葉を構成する細胞が挙げられる。これらの下垂体ホルモン産生細胞は、各細胞種に特異的な下垂体ホルモンの発現に加えて、EpCAMをマーカーとして発現し得る。一態様において、腺性下垂体は、GH産生細胞、PRL産生細胞、ACTH産生細胞、TSH産生細胞、FSH産生細胞、及びLH産生細胞からなる群から選択される少なくとも1種、好ましくは2種以上（2、3、4、5又は6種）の下垂体ホルモン産生細胞を含む。更なる態様において、腺性下垂体は、GH産生細胞、PRL産生細胞、及びACTH産生細胞からなる群から選択される少なくとも1種、好ましくは2種、より好ましくは3種の下垂体ホルモン産生細胞を含む。
　本発明において、組織とは、形態や性質が異なる複数種類の細胞が一定のパターンで立体的に配置した構造を有する細胞集団の構造体をいう。
　腺性下垂体の前駆組織としては、下垂体プラコード、ラトケ嚢等が挙げられる。下垂体プラコードとは、胚発生の過程で表皮外胚葉の領域（口腔外胚葉）に形成される肥厚した構造であって、下垂体前駆細胞マーカーであるEpCAM、及びLhx3又はPitx1を少なくとも発現し得、好ましくはEpCAM、Lhx3、及びPitx1の全てを発現し得るものをいう。ラトケ嚢とは、下垂体プラコードの陥入により形成される、袋状構造をいう。ラトケ嚢も下垂体プラコード同様、下垂体前駆細胞マーカーであるEpCAM、及びLhx3又はPitx1を少なくとも発現し得、好ましくはEpCAM、Lhx3、及びPitx1の全てを発現し得る。また、下垂体前駆細胞マーカーとしては、上記以外にIsl1/2、Cytokeratin等の発現を更に確認してもよい。本明細書において、下垂体前駆細胞マーカーであるEpCAM、及びLhx3又はPitx1を少なくとも発現し得る細胞を下垂体前駆細胞といい、当該前駆細胞は、好ましくはEpCAM、Lhx3、及びPitx1の全てを発現し得る。また、本明細書において、下垂体前駆細胞を、下垂体ホルモン産生細胞の前駆細胞ともいう。
　本明細書における「細胞分離前の細胞凝集塊」として、例えば、LHX3、NKX2.1、PITX1及びACTHから選択される少なくとも一つのマーカーが陽性である細胞凝集体が挙げられる。
　また、「細胞分離前の細胞凝集塊」として、例えば、LHX3、NKX2.1、PITX1及びACTH陽性である細胞凝集塊が挙げられる。
　本発明の分離方法及び製造方法において用いる、細胞分離前の細胞凝集塊は、以下のような方法により作製することができる。具体的には、該方法は、多能性幹細胞の凝集塊を、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養することにより、視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉（口腔外胚葉を含む）（以下、単に表皮外胚葉と略記する場合がある）を含む細胞凝集塊を得ること（第1の培養工程）、及び得られた視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉（口腔外胚葉を含む）を含む細胞凝集塊を、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で更に浮遊培養することにより、1）視床下部神経上皮組織、及び2）下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢を含む細胞凝集塊を得ること（第2の培養工程）を含む。第1の培養工程により、多能性幹細胞から、視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉（口腔外胚葉を含む）への分化が誘導され、得られた視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉（口腔外胚葉を含む）を含む細胞凝集塊を第2の培養工程に付すことにより、表皮外胚葉の領域（口腔外胚葉）から下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢への更なる分化が誘導される。
　本発明の分離方法及び製造方法において、細胞分離前の細胞凝集塊とは、第2の培養工程により得られる細胞凝集塊であってもよい。
（3．1）第1の培養工程
　第1の培養工程においては、多能性幹細胞の凝集塊を、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養する。
　多能性幹細胞の凝集塊を「浮遊培養する」とは、多能性幹細胞の凝集塊を、培地中において、培養器に対して非接着性の条件下で培養することをいう。これにより、従来困難であった腺性下垂体又はその前駆組織の効率的な誘導が可能になる。
　浮遊培養に用いられる培地は、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む。骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質の作用により、多能性幹細胞から視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉への分化が誘導される。
　本発明において、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質は、骨形成因子と受容体との結合によってシグナルが伝達される経路を活性化する任意の物質を意味する。骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質の例としてはBMP2、BMP4、BMP7、GDF5などが挙げられる。好ましくは、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質はBMP4である。以下、主にBMP4について記載するが、本発明において使用される骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質はBMP4に限定されない。BMP4は、公知のサイトカインであり、そのアミノ酸配列も公知である。本発明に用いるBMP4は、哺乳動物のBMP4である。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、オランウータン、チンパンジー等の霊長類を挙げることができる。BMP4は、好ましくは、げっ歯類（マウス、ラット等）又は霊長類（ヒト等）のBMP4であり、最も好ましくはヒトBMP4である。ヒトBMP4とは、BMP4が、ヒトが生体内で天然に発現するBMP4のアミノ酸配列を有することを意味する。ヒトBMP4の代表的なアミノ酸配列としては、NCBIのアクセッション番号で、NP_001193.2（2013年6月15日更新）、NP_570911.2（2013年6月15日更新）、NP_570912.2（2013年6月15日更新）、これらのアミノ酸配列のそれぞれからN末端シグナル配列（1-24）を除いたアミノ酸配列（成熟型ヒトBMP4アミノ酸配列）等を例示することができる。
　本発明において、Shhシグナル経路作用物質としては、Shhにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。Shhシグナル経路作用物質としては、例えば、Hedgehogファミリーに属する蛋白又はそのフラグメント（例えば、Shh、Ihh、Shh(C24II) N-Terminus、Shh(C25II) N-Terminus）、Shh受容体、Shh受容体アゴニスト、Purmorphamine、Smoothened Agonist (SAG)（3-Chloro-N-[trans-4-(methylamino)cyclohexyl]-N-[[3-(4-pyridinyl)phenyl]methyl]- benzo[b]thiophene-2-carboxamide）などが挙げられるが、これらに限定されない。なかでも、SAGが好ましい。
　好ましい骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質とShhシグナル経路作用物質の組み合わせは、BMP4及びSAGである。
　培地中の骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質の濃度は、細胞凝集塊において、多能性幹細胞から視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉への分化を誘導可能な範囲で、適宜設定することができるが、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質としてBMP4を用いる場合、その濃度は、通常0.01 nM以上、好ましくは、0.1 nM以上、より好ましくは1 nM以上である。視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉への分化に悪影響がない限り、上限値は特にないが、培養コストの観点から、通常1000 nM以下、好ましくは、100 nM以下、より好ましくは10 nM以下である。一態様において、培地中のBMP4濃度は、通常0.01～1000 nM、好ましくは0.1～100 nM、より好ましくは1～10 nM（例、5 nM）である。外因性の骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質は、特に、1）表皮外胚葉を積極的に形成させること、及び2）大脳ではなく視床下部の神経上皮組織を細胞凝集塊内に分化誘導すること、に寄与するので、これらの効果を達成し得る濃度で培地に含まれる。
　骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質は、第1の培養工程の全ての期間に亘り培地に含まれていなくてもよい。例えば、多能性幹細胞の凝集塊の浮遊培養の開始から2～4日間（例、3日間）は培地に骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質を添加せず、その後、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質を培地へ添加してもよい。
　培地中のShhシグナル経路作用物質の濃度は、細胞凝集塊において、多能性幹細胞から視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉への分化を誘導可能な範囲で、適宜設定することができるが、Shhシグナル経路作用物質としてSAGを用いる場合、その濃度は、通常1 nM以上、好ましくは、10 nM以上、より好ましくは100 nM以上である。視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉への分化に悪影響がない限り、上限値は特にないが、培養コストの観点から、通常1000 μM以下、好ましくは、100 μM以下、より好ましくは10 μM以下である。一態様において、培地中のSAG濃度は、通常1 nM～1000 μM、好ましくは10 nM～100 μM、より好ましくは100 nM～10 μM（例、2 μM）である。外因性のShhシグナル経路作用物質は、特に、神経網膜ではなく視床下部（好ましくは腹側視床下部）の神経上皮組織を細胞凝集塊内に分化誘導する役割を果たすので、この効果を達成し得る濃度で培地に含まれる。
　Shhシグナル経路作用物質は、第1の培養工程の全ての期間に亘り培地に含まれていなくてもよい。例えば、多能性幹細胞の凝集塊の浮遊培養の開始から5～7日間（例、6日間）は培地にShhシグナル経路作用物質を添加せず、その後、Shhシグナル経路作用物質を培地へ添加してもよい。
　一態様において、多能性幹細胞の凝集塊を、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含まない培地中で2～4日間浮遊培養し、次に得られた凝集塊を、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質を含みShhシグナル経路作用物質を含まない培地中で2～4日間浮遊培養し、更に得られた凝集塊を骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で、視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉が誘導されるまで培養する。
　本発明において使用されるBMP4等の骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質は、好ましくは単離されている。「単離」とは、目的とする成分や細胞以外の因子を除去する操作がなされ、天然に存在する状態を脱していることを意味する。従って、「単離されたタンパク質X」には、培養対象の細胞や組織から産生された内在性のタンパク質Xは包含されない。「単離されたタンパク質X」の純度（総タンパク質重量に占めるタンパク質Xの重量の百分率）は、通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、更に好ましくは99％以上、最も好ましくは100％である。浮遊培養に用いられる培地に含まれる単離された骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質は、培地中へ外因的に添加されたものである。従って、一態様において、本発明は、第1の培養工程に用いる培地中へ、単離された骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質を外因的に添加する工程を含む。
　第1の培養工程に用いる培地は、分散により誘導される多能性幹細胞（特に、ヒト多能性幹細胞）の細胞死を抑制するために、Rho-associated coiled-coilキナーゼ（ROCK）の阻害剤を培養開始時から添加することが好ましい（特開2008-99662）。ROCK阻害剤を培養開始から例えば15日以内、好ましくは10日以内、より好ましくは6日以内添加する。ROCK阻害剤としては、Y-27632（（＋）-（R）-trans-4-（1-aminoethyl）-N-（4-pyridyl）cyclohexanecarboxamide dihydrochloride）等を挙げることができる。浮遊培養に用いられるROCK阻害剤の濃度は、分散により誘導される多能性幹細胞の細胞死を抑制し得る濃度である。例えば、Y-27632について、このような濃度は、通常約0．1～200μM、好ましくは約2～50μMである。ROCK阻害剤の濃度を添加する期間内で変動させてもよく、例えば期間の後半で濃度を半減させることができる。
　細胞凝集塊の浮遊培養に用いられる培地は、哺乳動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、ハム培地、Ham's F-12培地、RPMI1640培地、Fischer's培地、Neurobasal培地およびこれらの混合培地（例：DMEM/F-12培地（DMEM培地：Ham's F-12培地＝1:1の混合培地）等）など、哺乳動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。一態様において、IMDM培地及びHam's F-12培地の混合培地が用いられる。混合比は、容量比で、例えば、IMDM：Ham's F-12＝0.8～1.2：1.2～0.8である。
　培養に用いる培地は、血清含有培地又は無血清培地であり得る。化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、細胞凝集塊の浮遊培養に用いられる培地は、好ましくは、無血清培地である。
　細胞凝集塊の浮遊培養に用いられる培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール又は3'チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものであり得る。かかる血清代替物は、例えば、WO98/30679記載の方法により調製できる。また、本発明の方法をより簡便に実施するために、血清代替物は市販のものを利用できる。かかる市販の血清代替物としては、例えば、KSR（knockout serum replacement）（Invitrogen社製）、Chemically-defined Lipid concentrated（Gibco社製）、Glutamax（Gibco社製）が挙げられる。
　細胞凝集塊の浮遊培養に用いられる培地は、多能性幹細胞から、視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉への分化誘導に、悪影響を与えない範囲で、他の添加物を含むことができる。添加物としては、例えば、インスリン、鉄源（例えばトランスフェリン等）、ミネラル（例えばセレン酸ナトリウム等）、糖類（例えばグルコース等）、有機酸（例えばピルビン酸、乳酸等）、血清蛋白質（例えばアルブミン等）、アミノ酸（例えばL-グルタミン等）、還元剤（例えば2-メルカプトエタノール等）、ビタミン類（例えばアスコルビン酸、d-ビオチン等）、抗生物質（例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、緩衝剤（例えばHEPES等）等が挙げられるが、これらに限定されない。
　一態様において、細胞凝集塊の浮遊培養に用いられる培地は、視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉への分化誘導に悪影響を与えない観点から、本明細書において培地に含まれることが特に記載されたもの以外の成長因子を含まない化学合成培地（growth-factor-free Chemically Defined Medium; gfCDM）に、血清代替物（KSR等）を添加したものである。ここにいう「成長因子」には、Fgf；BMP；Wnt、Nodal、Notch、Shh等のパターン形成因子；インスリン及びLipid-rich albuminが包含される。成長因子を含まない化学合成培地としては、例えば、Wataya et al, Proc Natl Acad Sci USA, 105(33): 11796-11801, 2008に開示されたgfCDMを挙げることができる。
　細胞凝集塊の浮遊培養における培養温度、CO2濃度、O2濃度等の他の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30～40℃、好ましくは約37℃である。CO2濃度は、例えば約1～10％、好ましくは約5％である。O2濃度は、例えば約20％である。
　好ましい態様において、質的に均一な、多能性幹細胞の凝集塊の集団を、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養する。質的に均一な、多能性幹細胞の凝集塊の集団を用いることにより、腺性下垂体又はその前駆組織への分化の程度についての凝集塊間での差を最小限に抑制し、目的とする分化誘導の効率を向上することができる。質的に均一な、多能性幹細胞の凝集塊の集団の浮遊培養には、以下の態様が包含される。
1）複数の培養コンパートメントを用意し、1つの培養コンパートメントに1つの多能性幹細胞の凝集塊が含まれるように、質的に均一な、多能性幹細胞の凝集塊の集団を播く。（例えば、96ウェルプレートの各ウェルに1つずつ、多能性幹細胞の凝集塊を入れる。）そして、各培養コンパートメントにおいて、1つの多能性幹細胞の凝集塊を骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養する。
2）1つの培養コンパートメントに複数の多能性幹細胞の凝集塊が含まれるように、質的に均一な、多能性幹細胞の凝集塊の集団を1つの培養コンパートメントに播く。（例えば、10cmディッシュに、複数の多能性幹細胞の凝集塊を入れる。）そして、該コンパートメントにおいて、複数の多能性幹細胞の凝集塊を骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養する。
　本発明の方法を通じて、上記1）及び2）のいずれの態様を採用してもよく、また、培養の途中で態様を変更してもよい（1）の態様から2）の態様へ、あるいは2）の態様から1）の態様へ）。一態様において、第1の培養工程においては1）の態様を採用し、第2の培養工程において2）の態様を採用する。
　第1の培養工程は、多能性幹細胞から視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉への分化が誘導されるのに十分な期間実施される。視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉への分化は、例えば、RT-PCRや、視床下部神経上皮組織や表皮外胚葉のマーカー特異的抗体を用いた免疫組織化学により検出することができる。例えば、培養中の細胞凝集塊のうち10％以上、好ましくは30％以上、より好ましくは50％以上の細胞凝集塊が視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉を含むまで実施される。培養期間は、多能性幹細胞の動物種や、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質の種類に応じて変動し得るので、一概に特定することは出来ないが、例えば、ヒト多能性幹細胞を用いた場合、第1の培養工程は、通常15～20日（例、18日）である。
　第1の培養工程を行うことにより、視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉（口腔外胚葉を含む）を含む細胞凝集塊を得ることができる。
　視床下部神経上皮組織とは、視床下部マーカーを発現する神経上皮組織であって、視床下部を構成する細胞（例えば、ニューロン、グリア細胞など）に分化可能であり、かつ自己複製能を有する視床下部前駆細胞、および分化によって自己複製能を失ったニューロン、グリア細胞などを含む組織をいう。本明細書において、視床下部を構成する細胞を「視床下部細胞」とも称し、かかる細胞としては、例えば、視床下部前駆細胞、ニューロン、グリア細胞などが挙げられる。前記視床下部神経上皮を構成する細胞視床下部神経上皮組織における視床下部前駆細胞とその分化細胞の割合は分化の程度によるが、多能性幹細胞を腺性下垂体が分化するまで長期培養した細胞塊では、視床下部前駆細胞の多くは視床下部ニューロンへと分化していることが確認されている（Cell Reports, 30, 18-24, January 7, 2020）。視床下部には、腹側視床下部及び背側視床下部が包含される。視床下部マーカーとしては、NKx2.1（腹側視床下部マーカー）、Pax6（背側視床下部マーカー）等が挙げられる。一態様において、腹側視床下部神経上皮組織は、Rx陽性、Chx10陰性、Pax6陰性、且つNkx2．1陽性の神経上皮組織である。一態様において、背側視床下部神経上皮組織は、Rx陽性、Chx10陰性、Nkx2.1陰性、且つPax6陽性の神経上皮組織である。第1の培養工程において得られる細胞凝集塊に含まれる視床下部神経上皮組織は、好ましくは、腹側視床下部神経上皮組織である。上記いずれの視床下部神経上皮組織においても、EpCAMは発現しておらず、このことは、視床下部神経上皮組織を構成する全ての細胞（視床下部前駆細胞のみならず、分化し、自己複製能を失ったニューロン、グリア細胞などにおいても）においてEpCAMは発現していないことを示す。
　表皮外胚葉とは、胚発生において、胚の表層に形成される外胚葉細胞層である。表皮外胚葉マーカーとしては、pan-cytokeratinが挙げられる。表皮外胚葉は、一般的には、下垂体前葉、皮膚、口腔上皮、歯のエナメル質、皮膚腺等へ分化し得る。一態様において、表皮外胚葉は、E-cadherin陽性且つpan-cytokeratin陽性の細胞層である。
　好適には、第1の培養工程において得られる細胞凝集塊においては、視床下部神経上皮組織がその細胞凝集塊の内部を占めており、単層の表皮外胚葉の細胞がその細胞凝集塊の表面を構成する。表皮外胚葉は、その一部に肥厚した表皮プラコードを含んでいてもよい。
（3．2）第2の培養工程
　第2の培養工程においては、第1の培養工程で得られた視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉（口腔外胚葉を含む）を含む細胞凝集塊を、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で更に浮遊培養することにより、1）視床下部神経上皮組織、及び2）下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢を含む細胞凝集塊を得る。骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質の作用により、表皮外胚葉から下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢への分化が誘導される。
　骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質の定義は、第1の培養工程の説明において述べた通りである。
　好適には、第2の培養工程において用いる骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質は、第1の培養工程と同様にBMP4である。好適には、第2の培養工程において用いるShhシグナル経路作用物質は、第1の培養工程と同様にSAGである。
　好ましい骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質とShhシグナル経路作用物質の組み合わせは、BMP4及びSAGである。
　培地中の骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質の濃度は、細胞凝集塊において、表皮外胚葉から下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢への分化を誘導可能な範囲で、適宜設定することができるが、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質としてBMP4を用いる場合、その濃度は、通常0.01 nM以上、好ましくは、0.1 nM以上、より好ましくは1 nM以上である。表皮外胚葉から下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢への分化に悪影響がない限り、上限値は特にないが、培養コストの観点から、通常1000 nM以下、好ましくは、100 nM以下、より好ましくは10 nM以下である。一態様において、培地中のBMP4濃度は、通常0.01～1000 nM、好ましくは0.1～100 nM、より好ましくは1～10 nM（例、5 nM）である。骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質の濃度を添加する期間内で変動させてもよく、例えば第2の培養工程開始時に上述の濃度とし、2～4日間毎に半分の割合で、段階的に濃度を低下させることができる。
　培地中のShhシグナル経路作用物質の濃度は、細胞凝集塊において、表皮外胚葉から下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢への分化を誘導可能な範囲で、適宜設定することができるが、Shhシグナル経路作用物質としてSAGを用いる場合、その濃度は、通常1 nM以上、好ましくは、10 nM以上、より好ましくは100 nM以上である。下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢への分化に悪影響がない限り、上限値は特にないが、培養コストの観点から、通常1000 μM以下、好ましくは、100 μM以下、より好ましくは10 μM以下である。一態様において、培地中のSAG濃度は、通常1 nM～1000 μM、好ましくは10 nM～100 μM、より好ましくは100 nM～10 μM（例、2 μM）である。
　好ましい態様において、第2の培養工程に用いる培地は、FGF2を含む。FGF2は、表皮外胚葉から下垂体プラコードへの分化を促進する。
　FGF2は、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）とも呼ばれる、公知のサイトカインであり、そのアミノ酸配列も公知である。本発明に用いるFGF2は、通常哺乳動物のFGF2である。哺乳動物としては、上記のものを挙げることができる。FGF2は、多くの哺乳動物の種間で交差反応性を有するので、本発明の目的を達成し得る限り、いずれの哺乳動物のFGF2を用いてもよいが、好適には、培養する細胞と同一種の哺乳動物のFGF2が用いられる。例えば、げっ歯類（マウス、ラット等）又は霊長類（ヒト等）のFGF2が用いられる。ここで、マウスFGF2とは、FGF2が、マウスが生体内で天然に発現するFGF2のアミノ酸配列を有することを意味する。本明細書中、他のタンパク質等についても、同様に解釈する。マウスFGF2の代表的なアミノ酸配列としては、NCBIのアクセッション番号で、NP_032032.1（2014年2月18日更新）、このアミノ酸配列からN末端シグナル配列（1-9）を除いたアミノ酸配列（成熟型マウスFGF2アミノ酸配列）等を例示することができる。ヒトFGF2の代表的なアミノ酸配列としては、NCBIのアクセッション番号で、NP_001997.5（2014年2月18日更新）等を例示することができる。
　培地中における、FGF2の濃度は、表皮外胚葉から下垂体プラコードへの分化を促進し得るような濃度である限り特に限定されないが、通常1 ng/ml以上、好ましくは、10 ng/ml以上である。下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢への分化に悪影響がない限りFGF2濃度の上限値は特にないが、培養コストの観点から、通常1000 ng/ml以下、好ましくは、500 ng/ml以下である。一態様において、培地中のFGF2濃度は、通常1～1000 ng/ml、好ましくは10～100 ng/mlである。
　本発明において使用されるBMP4等の骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びFGF2は、好ましくは単離されている。第2の培養工程に用いられる培地に含まれる単離された骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及び単離されたFGF2は、培地中へ外因的に添加されたものである。従って、一態様において、本発明は、第2の培養工程に用いる培地中へ、単離された骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質（及び、任意に単離されたFGF2）を外因的に添加する工程を含む。
　第2の培養工程に用いられる培地は、第1の培養工程に用いられる培地と同様に、哺乳動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、ハム培地、Ham's F-12培地、RPMI1640培地、Fischer's培地、Neurobasal培地およびこれらの混合培地（例：DMEM/F-12培地（DMEM培地：Ham's F-12培地＝1:1の混合培地）等）など、哺乳動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。一態様において、IMDM培地及びHam's F-12培地の混合培地が用いられる。混合比は、容量比で、例えば、IMDM：Ham's F-12＝0.8～1.2：1.2～0.8である。
　培養に用いる培地は、血清含有培地又は無血清培地であり得る。化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、細胞凝集塊の浮遊培養に用いられる培地は、好ましくは、無血清培地である。
　細胞凝集塊の浮遊培養に用いられる培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール又は3'チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものであり得る。かかる血清代替物は、例えば、WO98/30679記載の方法により調製できる。また、本発明の方法をより簡便に実施するために、血清代替物は市販のものを利用できる。かかる市販の血清代替物としては、例えば、KSR（knockout serum replacement）（Invitrogen社製）、Chemically-defined Lipid concentrated（Gibco社製）、Glutamax（Gibco社製）が挙げられる。
　細胞凝集塊の浮遊培養に用いられる培地は、表皮外胚葉から下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢への分化誘導に、悪影響を与えない範囲で、他の添加物を含むことができる。添加物としては、例えば、インスリン、鉄源（例えばトランスフェリン等）、ミネラル（例えばセレン酸ナトリウム等）、糖類（例えばグルコース等）、有機酸（例えばピルビン酸、乳酸等）、血清蛋白質（例えばアルブミン等）、アミノ酸（例えばL-グルタミン等）、還元剤（例えば2-メルカプトエタノール等）、ビタミン類（例えばアスコルビン酸、d-ビオチン等）、抗生物質（例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、緩衝剤（例えばHEPES等）等が挙げられるが、これらに限定されない。
　一態様において、細胞凝集塊の浮遊培養に用いられる培地は、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢への分化誘導に悪影響を与えない観点から、本明細書において培地に含まれることが特に記載されたもの以外の成長因子を含まない化学合成培地（growth-factor-free Chemically Defined Medium; gfCDM）に、血清代替物（KSR等）を添加したものである。ここにいう「成長因子」には、Fgf；BMP；Wnt、Nodal、Notch、Shh等のパターン形成因子；インスリン及びLipid-rich albuminが包含される。成長因子を含まない化学合成培地としては、例えば、Wataya et al, Proc Natl Acad Sci USA, 105(33): 11796-11801, 2008に開示されたgfCDMを挙げることができる。
　第2の培養工程における浮遊培養は、好適には高酸素分圧条件下で行われる。高酸素分圧条件下で視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉を含む細胞凝集塊を更に浮遊培養することにより、細胞凝集塊内部への酸素の到達、及び細胞凝集塊の長期間の維持培養が達成され、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢への効率的な分化誘導が可能となる。
　高酸素分圧条件とは、空気中の酸素分圧（20％）を上回る酸素分圧条件を意味する。第2の培養工程における酸素分圧は、例えば、30～60％、好ましくは35～60％、より好ましくは38～60％である。
　第2の培養工程における培養温度、CO2濃度等の他の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30～40℃、好ましくは約37℃である。CO2濃度は、例えば約1～10％、好ましくは約5％である。
　第2の培養工程は、表皮外胚葉から下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢への分化が誘導されるのに十分な期間実施される。第2の培養工程を実施することにより、表皮外胚葉中（より具体的には、口腔外胚葉中）に下垂体プラコードが形成される。また、一部又は全部の下垂体プラコードは、細胞凝集塊の内部（即ち、隣接する視床下部神経上皮）へ向かって陥入し、ラトケ嚢を形成し得る。表皮外胚葉から下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢への分化には、表皮外胚葉と、視床下部神経上皮組織（好ましくは、腹側視床下部神経上皮組織）との相互作用が必須であるところ、本発明においては、第1の培養工程により、細胞凝集塊内に、視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉が同時に形成され、好ましい態様において、視床下部神経上皮組織が細胞凝集塊の内部を占め、単層の表皮外胚葉の細胞がその細胞凝集塊の表面を構成する。その結果、細胞凝集塊内において、互いに隣接する表皮外胚葉と視床下部神経上皮組織との良好な相互作用が可能となり、表皮外胚葉における下垂体プラコード形成、下垂体プラコードの陥入、ラトケ嚢の形成等の胚発生における下垂体の自己組織化の過程を、インビトロにおいて再現することができる。下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢への分化は、例えば、下垂体前駆細胞マーカー（例、EpCAM、Pitx1、Lhx3等）に対する特異的抗体を用いた免疫組織化学により、下垂体前駆細胞マーカー陽性のプラコードや袋状構造の形成を検出することにより、確認することができる。例えば、培養中の細胞凝集塊のうち10％以上、好ましくは30％以上、より好ましくは50％以上の細胞凝集塊が下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢を含むまで、第2の培養工程が実施される。培養期間は、多能性幹細胞の動物種や、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質の種類に応じて変動し得るので、一概に特定することは出来ないが、例えば、ヒト多能性幹細胞を用いた場合、第2の培養工程は、通常6日以上、例えば6～12日である。
　第2の培養工程を行うことにより、1）視床下部神経上皮組織、及び2）下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢を含む細胞凝集塊を得ることができる。本発明の分離方法及び製造方法において、細胞分離前の細胞凝集塊とは、第2の培養工程により得られる細胞凝集塊であってもよい。
（3．3）第3の培養工程
　第2の培養工程で得られた1）視床下部神経上皮組織、及び2）下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢を含む細胞凝集塊を、Shhシグナル経路作用物質を含む培地中で更に浮遊培養することにより、腺性下垂体を含む細胞凝集塊を得ることができる（第3の培養工程）。第3の培養工程により、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢から、下垂体ホルモン産生細胞への分化が誘導され、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢中に下垂体ホルモン産生細胞が生じ、腺性下垂体が形成される。
　本発明の分離方法及び製造方法において、細胞分離前の細胞凝集塊とは、第3の培養工程により得られる細胞凝集塊であってもよい。
　Shhシグナル経路作用物質の定義は、第1の培養工程の説明において述べた通りである。
　好適には、第3の培養工程において用いるShhシグナル経路作用物質は、第1及び第2の培養工程と同様にSAGである。
　培地中のShhシグナル経路作用物質の濃度は、細胞凝集塊において、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢から下垂体ホルモン産生細胞への分化を誘導可能な範囲で、適宜設定することができるが、Shhシグナル経路作用物質としてSAGを用いる場合、その濃度は、通常1 nM以上、好ましくは、10 nM以上、より好ましくは100 nM以上である。下垂体ホルモン産生細胞への分化に悪影響がない限り、上限値は特にないが、培養コストの観点から、通常1000 μM以下、好ましくは、100 μM以下、より好ましくは10 μM以下である。一態様において、培地中のSAG濃度は、通常1 nM～1000 μM、好ましくは10 nM～100 μM、より好ましくは100 nM～10 μM（例、2 μM）である。
　好ましい態様において、第3の培養工程に用いる培地は、FGF2を含む。FGF2は、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢から下垂体ホルモン産生細胞への分化を促進する。
　FGF2の定義は、第2の培養工程の説明において述べた通りである。
　培地中における、FGF2の濃度は、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢から、下垂体ホルモン産生細胞への分化を促進し得るような濃度である限り特に限定されないが、通常1 ng/ml以上、好ましくは、10 ng/ml以上である。下垂体ホルモン産生細胞への分化に悪影響がない限りFGF2濃度の上限値は特にないが、培養コストの観点から、通常1000 ng/ml以下、好ましくは、500 ng/ml以下である。一態様において、培地中のFGF2濃度は、通常1～1000 ng/ml、好ましくは10～100 ng/mlである。
　好ましい態様において、第3の培養工程に用いる培地は、Notchシグナル阻害剤を含む。Notchシグナル阻害剤は、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢から下垂体ホルモン産生細胞（特に、ACTH産生細胞）への分化を促進する。Notchシグナル阻害剤により、ACTH産生の上流制御をする転写因子Tbx19の発現が上昇する。
　Notchシグナル阻害剤は、Notchにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されない。Notchシグナル阻害剤としては、例えば、DAPT（N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-l-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester）、DBZ、MDL28170などの、ガンマセクレターゼ阻害剤が挙げられるが、なかでも、DAPTが好ましい。
　培地中における、Notchシグナル阻害剤の濃度は、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢から下垂体ホルモン産生細胞（特に、ACTH産生細胞）への分化を促進し得るような濃度である限り特に限定されないが、例えばDAPTの場合、通常0.1 μM以上、好ましくは、1μM以上である。下垂体ホルモン産生細胞への分化に悪影響がない限りDAPT濃度の上限値は特にないが、培養コストの観点から、通常1000 μM以下、好ましくは、100 μM以下である。一態様において、培地中のDAPT濃度は、通常0.1～1000 μM、好ましくは1～100 μM（例、10 μM）である。
　第3の培養工程においては、培地への骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質の添加は不要である。一態様において、第3の培養工程に用いられる培地は、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質を含まない。
　本発明において使用されるFGF2は、好ましくは単離されている。第3の培養工程に用いられる培地に含まれる単離されたFGF2は、培地中へ外因的に添加されたものである。従って、一態様において、本発明は、第2の培養工程に用いる培地中へ、単離されたFGF2を外因的に添加する工程を含む。
　第3の培養工程において、培地に副腎皮質ホルモン類を添加することにより、細胞凝集塊を副腎皮質ホルモン類により処理してもよい。副腎皮質ホルモン類処理により、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢からACTH産生細胞以外の下垂体ホルモン産生細胞（即ち、GH産生細胞、PRL産生細胞、TSH産生細胞、LH産生細胞、FSH産生細胞等）への分化が促進される。副腎皮質ホルモン類としては、ハイドロコルチゾン、酢酸コルチゾン、酢酸フルドロコルチゾン等の天然糖質コルチコイド；デキサメサゾン、ベタメタゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン等の人工的に合成された糖質コルチコイド等を挙げることができるが、これらに限定されない。
　培地中における、副腎皮質ホルモン類の濃度は、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢から、下垂体ホルモン産生細胞（但し、ACTH産生細胞を除く）への分化を促進し得る限り特に限定されず、また、副腎皮質ホルモン類の種類により適宜設定することができ、例えば、ハイドロコルチゾンの場合、通常100 ng/ml以上、好ましくは、1 μg/ml以上である。下垂体ホルモン産生細胞（但し、ACTH産生細胞を除く）への分化に悪影響がない限りハイドロコルチゾン濃度の上限値は特にないが、培養コストの観点から、通常1000 μg/ml以下、好ましくは100 μg/ml以下である。一態様において、培地中のハイドロコルチゾン濃度は、通常100 ng/ml～1000 μg/ml、好ましくは1～100 μg/mlである。副腎皮質ホルモン類として、デキサメサゾンを使用する場合、その培地中の濃度は、ハイドロコルチゾンの1/25程度とすることができる。
　第3の培養工程において、培地に副腎皮質ホルモン類を添加する時期は、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢から、下垂体ホルモン産生細胞（但し、ACTH産生細胞を除く）への分化を促進し得る限り特に限定されず、第3の培養工程開始時から培地に副腎皮質ホルモン類を添加してもよいし、第3の培養工程開始後、副腎皮質ホルモン類を添加しない培地中で一定期間培養後、培地に副腎皮質ホルモン類を添加してもよい。好適には、第3の培養工程を開始後、細胞凝集塊中に、ACTH産生細胞の出現が確認された段階で、培地に副腎皮質ホルモン類を添加する。即ち、細胞凝集塊中に、ACTH産生細胞の出現が確認されるまでは、細胞凝集塊を、副腎皮質ホルモン類を添加しない培地中で培養し、ACTH産生細胞の出現が確認された後に、副腎皮質ホルモン類を含む培地中で第3の培養工程を継続する。ACTH産生細胞の出現は、ACTHに対する抗体を用いて免疫組織学的染色により確認することが出来る。ヒト多能性幹細胞を用いた場合、一般的に、第3の培養工程開始から37日以降であれば、ACTH産生細胞の出現が期待できるので、一態様において、第3の培養工程開始から37日以降に、培地に副腎皮質ホルモン類を添加する。
　細胞凝集塊を副腎皮質ホルモン類で処理する期間は、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢から、下垂体ホルモン産生細胞（但し、ACTH産生細胞を除く）への分化を促進し得る限り特に限定されないが、通常、副腎皮質ホルモン類非処理群と比較して、副腎皮質ホルモン類処理群において、下垂体ホルモン産生細胞（但し、ACTH産生細胞を除く）への分化の促進が確認されるまで、細胞凝集塊を副腎皮質ホルモン類で処理する。処理期間は、通常、７日以上、好ましくは12日以上である。処理期間の上限値は、特に限定されないが、副腎皮質ホルモン類非処理群と比較して、副腎皮質ホルモン類処理群において、下垂体ホルモン産生細胞（但し、ACTH産生細胞を除く）への分化の促進が確認された段階で、培地から副腎皮質ホルモン類を除去してもよい。
　尚、培地への副腎皮質ホルモン類の添加は、ACTH産生細胞の分化誘導に対しては、フィードバック阻害により、抑制的に作用する。
　第3の培養工程に用いられる培地は、第1及び第2の培養工程に用いられる培地と同様に、哺乳動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、ハム培地、Ham's F-12培地、RPMI1640培地、Fischer's培地、Neurobasal培地およびこれらの混合培地（例：DMEM/F-12培地（DMEM培地：Ham's F-12培地＝1:1の混合培地）等）など、哺乳動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。一態様において、IMDM培地及びHam's F-12培地の混合培地が用いられる。混合比は、容量比で、例えば、IMDM：Ham's F-12＝0.8～1.2：1.2～0.8である。
　培養に用いる培地は、血清含有培地又は無血清培地であり得る。化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、細胞凝集塊の浮遊培養に用いられる培地は、好ましくは、無血清培地である。
　細胞凝集塊の浮遊培養に用いられる培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール又は3'チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものであり得る。かかる血清代替物は、例えば、WO98/30679記載の方法により調製できる。また、本発明の方法をより簡便に実施するために、血清代替物は市販のものを利用できる。かかる市販の血清代替物としては、例えば、KSR（knockout serum replacement）（Invitrogen社製）、Chemically-defined Lipid concentrated（Gibco社製）、Glutamax（Gibco社製）が挙げられる。
　細胞凝集塊の浮遊培養に用いられる培地は、多能性幹細胞から、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢、そして下垂体ホルモン産生細胞への分化誘導に、悪影響を与えない範囲で、他の添加物を含むことができる。添加物としては、例えば、インスリン、鉄源（例えばトランスフェリン等）、ミネラル（例えばセレン酸ナトリウム等）、糖類（例えばグルコース等）、有機酸（例えばピルビン酸、乳酸等）、血清蛋白質（例えばアルブミン等）、アミノ酸（例えばL-グルタミン等）、還元剤（例えば2-メルカプトエタノール等）、ビタミン類（例えばアスコルビン酸、d-ビオチン等）、抗生物質（例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、緩衝剤（例えばHEPES等）等が挙げられるが、これらに限定されない。
　一態様において、細胞凝集塊の浮遊培養に用いられる培地は、下垂体ホルモン産生細胞への分化誘導に悪影響を与えない観点から、本明細書において培地に含まれることが特に記載されたもの以外の成長因子を含まない化学合成培地（growth-factor-free Chemically Defined Medium; gfCDM）に、血清代替物（KSR等）を添加したものである。ここにいう「成長因子」には、Fgf；BMP；Wnt、Nodal、Notch、Shh等のパターン形成因子；インスリン及びLipid-rich albuminが包含される。成長因子を含まない化学合成培地としては、例えば、Wataya et al, Proc Natl Acad Sci USA, 105(33): 11796-11801, 2008に開示されたgfCDMを挙げることができる。
　第3の培養工程における浮遊培養は、好適には高酸素分圧条件下で行われる。高酸素分圧条件下で1）視床下部神経上皮組織、及び2）下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢を含む細胞凝集塊を更に浮遊培養することにより、細胞凝集塊内部への酸素の到達、及び細胞凝集塊の長期間の維持培養が達成され、下垂体ホルモン産生細胞への効率的な分化誘導が可能となる。
　高酸素分圧条件とは、空気中の酸素分圧（20％）を上回る酸素分圧条件を意味する。第3の培養工程における酸素分圧は、例えば、30～60％、好ましくは35～60％、より好ましくは38～60％である。
　第3の培養工程における培養温度、CO2濃度等の他の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30～40℃、好ましくは約37℃である。CO2濃度は、例えば約1～10％、好ましくは約5％である。
　第3の培養工程は、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢から下垂体ホルモン産生細胞への分化が誘導されるのに十分な期間実施される。第3の培養工程を実施することにより、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢から、下垂体ホルモン産生細胞への分化が誘導され、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢中に下垂体ホルモン産生細胞が生じることにより、腺性下垂体が形成される。下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢から誘導される下垂体ホルモン産生細胞としては、成長ホルモン（GH）産生細胞、プロラクチン（PRL）産生細胞、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）産生細胞が挙げられる。好ましい態様において、当該副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）産生細胞は、CRH刺激に応答してACTHを分泌し、当該ACTH分泌は、糖質コルチコイドによりフィードバック抑制される。一態様において、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢から、成長ホルモン（GH）産生細胞、プロラクチン（PRL）産生細胞、及び副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）産生細胞からなる群から選択される少なくとも1種、好ましくは2種、より好ましくは3種の下垂体ホルモン産生細胞への分化が誘導され、成長ホルモン（GH）産生細胞、プロラクチン（PRL）産生細胞、及び副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）産生細胞からなる群から選択される少なくとも1種、好ましくは2種、より好ましくは3種の下垂体ホルモン産生細胞を含む腺性下垂体が形成される。下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢からは、成長ホルモン（GH）産生細胞、プロラクチン（PRL）産生細胞、及び副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）産生細胞以外に、甲状腺刺激ホルモン（TSH）産生細胞、卵胞刺激ホルモン（FSH）産生細胞、黄体化ホルモン（LH）産生細胞、メラニン細胞刺激ホルモン（MSH）産生細胞等の他の下垂体ホルモン産生細胞が誘導され得る。即ち、第3の培養工程により形成される腺性下垂体は、成長ホルモン（GH）産生細胞、プロラクチン（PRL）産生細胞、及び副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）産生細胞からなる群から選択される少なくとも1種、好ましくは2種、より好ましくは3種に加えて、甲状腺刺激ホルモン（TSH）産生細胞、卵胞刺激ホルモン（FSH）産生細胞、黄体化ホルモン（LH）産生細胞、メラニン細胞刺激ホルモン（MSH）産生細胞等の他の下垂体ホルモン産生細胞を含み得る。下垂体ホルモン産生細胞への分化は、例えば、下垂体ホルモンに対する特異的抗体を用いた免疫組織化学により、下垂体ホルモン陽性細胞を検出することにより、確認することができる。例えば、培養中の細胞凝集塊のうち10％以上、好ましくは30％以上、より好ましくは50％以上の細胞凝集塊が下垂体ホルモン産生細胞を含むまで実施される。培養期間は、多能性幹細胞の動物種や、Shhシグナル経路作用物質の種類に応じて変動し得るので、一概に特定することはできないが、例えば、ヒト多能性幹細胞を用いた場合、第3の培養工程は、通常37日以上、例えば37～70日である。
　第3の培養工程を行うことにより、腺性下垂体を含む細胞凝集塊を得ることができる。
　本発明の製造方法を通じ、多能性幹細胞から腺性下垂体又はその前駆組織への分化誘導が可能な限り、フィーダー細胞の存在下／非存在下いずれの条件で凝集塊の浮遊培養を行ってもよいが、未決定因子の混入を回避する観点から、フィーダー細胞の非存在下で細胞凝集塊の浮遊培養を行うのが好ましい。
　本発明の製造方法において、細胞凝集塊の浮遊培養に用いる培養器としては、特に限定されないが、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルが挙げられる。非接着性の条件下での培養を可能とするため、培養器は、細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞非接着性となるように人工的に処理されているものや、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されていないもの等を使用することができる。
　細胞凝集塊の浮遊培養に用いる培養器として、酸素透過性のものを用いても良い。酸素透過性の培養器を用いることにより、細胞凝集塊への酸素の供給が向上し、細胞凝集塊の長期間の維持培養に寄与し得る。
　凝集塊の浮遊培養に際しては、凝集塊の培養器に対する非接着状態を維持できる限り、凝集塊を静置培養してもよいし、旋回培養や振とう培養により凝集塊を意識的に動かしてもよいが、本発明においては、旋回培養や振とう培養により凝集塊を意識的に動かす必要はない。即ち、一態様において、本発明の製造方法における浮遊培養は、静置培養により行われる。静置培養とは、凝集塊を意識的に移動させない状態で培養する培養法のことをいう。すなわち、例えば、局所的な培地温度の変化に伴って、培地が対流し、その流れによって、凝集塊が移動することがあるが、意識的に凝集塊を移動させていないことから、この様な場合も含めて、本発明では静置培養というものとする。浮遊培養の全期間を通じて静置培養を実施してもよいし、一部の期間のみ静置培養を実施してもよい。好ましい態様において、浮遊培養の全期間を通じて、静置培養を行う。静置培養は装置が不要であり、細胞塊のダメージも少ないことが期待され、培養液の量も少なくできる点で有利である。
（4）本発明の細胞表面マーカーによる下垂体ホルモン産生細胞等の分離方法
　本発明の分離方法の一態様において、腺性下垂体及び／又はその前駆組織、並びに視床下部神経上皮組織を含む細胞凝集塊から、CD49cを発現する細胞を分離する工程を含む、下垂体ホルモン産生細胞及び／又はその前駆細胞、並びに視床下部細胞（本明細書において、これら分離目的の細胞を「治療用細胞」と称することがある）を分離する方法が提供される。下垂体ホルモン産生細胞及びその前駆細胞、並びに視床下部細胞の表面にはCD49cが発現し得るが、未分化細胞及び嚢胞形成細胞の表面には、CD49cが発現し得ない。従って、CD49cをマーカーとして、下垂体ホルモン産生細胞及びその前駆細胞、並びに視床下部細胞と、未分化細胞及び嚢胞形成細胞とを分離することができる。また、本発明の細胞表面マーカーを用いて分離した細胞集団には、視床下部および下垂体系譜以外の細胞（未分化細胞など）を含み得るため、より治療効果の高い細胞集団や、移植組織（細胞凝集体、細胞シートなど）を製造するためには、治療用細胞を精製することが好ましい。
　本発明の分離方法により分離された細胞集団を再凝集させた場合に、増殖速度の異なる数種類の増殖性細胞が混入し得ることが確認された。即ち、本発明の分離方法により分離された細胞を再凝集後8日目の細胞集団の面積を基準として、21日目以降に3倍を超えて増殖した細胞集団と、28日目以降に3倍を超えて増速した細胞集団と、36日目まで面積の変化が少ない細胞集団が存在していることを見出した。前記増殖性細胞は、分離された細胞集団に未分化細胞や嚢胞形成細胞が一部残存して増殖した結果であると推測される。従って、再凝集させた細胞凝集塊の中から、細胞集団の面積を基準に、所定期間を経ても増殖の少ない細胞集団を選別することで、治療用細胞を精製することができる。また、典型的には、早期に増殖する細胞は、増殖を経てひも状の形態となり、遅れて増殖する細胞は増殖を経て嚢胞肥大が認められることから、細胞集団の形態を基準として、増殖の少ない細胞集団を選別することもできる。さらに、前記増殖性細胞の大部分はSSEA5を発現するため、本発明の分離方法では、SSEA5陽性（特にSSEA5強陽性）細胞を除去する工程を含んでいてもよい。かかる工程は、細胞分離前の細胞凝集塊から、CD49cを発現する細胞を分離する工程と同時に行ってもよく、該工程の前又は後に行ってもよい。同時に行う場合には、例えば、蛍光活性化セルソーティングを用いて、CD49cとSSEA5を同時に染色し、SSEA5（高）発現集団がゲートアウトされるように、CD49c陽性画分をゲートに設定することにより、行うことができるが、この方法に限定されない。
　また、下垂体ホルモン産生細胞及びその前駆細胞の表面にはEpCAMが発現し得るが、視床下部細胞の表面には、EpCAMが発現し得ないことを本発明者らは見出している。よって、CD49c及びEpCAMをマーカーとして、下垂体ホルモン産生細胞及びその前駆細胞と、視床下部細胞とを分離することができる。従って、本発明の分離方法の別の態様において、腺性下垂体及び／又はその前駆組織を含み、任意により視床下部神経上皮組織をさらに含む細胞凝集塊から、CD49c及びEpCAMを発現する細胞を分離する工程を含む、下垂体ホルモン産生細胞及び／又はその前駆細胞を分離する方法が提供される。CD49c及びEpCAMを発現する細胞を分離する工程は、典型的には、CD49c及びEpCAM共陽性（ダブルポジティブ）細胞を分離することにより行うことができる。あるいは、腺性下垂体及び／又はその前駆組織を含み、任意により視床下部神経上皮組織から、CD49c又はEpCAMを発現する細胞を分離した後、該分離した細胞を含む細胞集団から、EpCAM又はCD49cを発現する細胞を分離することにより行ってもよい。
　さらに、後述の実施例で示される通り、多能性幹細胞から分化誘導した細胞凝集塊において、間葉系幹細胞に類似する増殖性細胞が発生し、該増殖性細胞が、CD49cを指標として分離した細胞集団に混入する可能性がある。これらの増殖性細胞は、CD90、CD29、CD44、CD58及びCD166からなる群から選択される少なくとも１つの細胞表面抗原（本発明の陰性マーカーとも称することがある。）を発現し得るため、該細胞表面抗原を陰性マーカーとして、増殖性細胞を除去することができる。従って、本発明の分離方法は、本発明の陰性マーカーの少なくとも１つを発現しない細胞を分離する工程を含み得る。かかる工程は、細胞分離前の細胞凝集塊から、CD49c及び／又はEpCAMを発現する細胞を分離する工程と同時に行ってもよく、該工程の前又は後に行ってもよい。同時に行う場合には、典型的には、CD49c陽性であり、かつ本発明の陰性マーカー陰性である細胞を分離することにより行うことができる。本発明の陰性マーカーとして、特にCD90が好ましい。
　本発明の分離方法において用いる細胞分離前の細胞凝集塊は、第2の培養工程により得られる細胞凝集塊、及び第3の培養工程により得られる細胞凝集塊のいずれの細胞凝集塊を用いてもよい。上述の多能性幹細胞から、下垂体若しくはその部分組織、又はその前駆組織への分化誘導開始後の具体的な日数としては、例えば、30日～600日、好ましくは、90日～500日、より好ましくは、110～490日、さらに好ましくは、150日～400日、一層好ましくは、200日～350日である。本発明の分離方法は、以下の工程を含むものである。
・本発明の分離工程の概要
　本発明の分離方法は、（B）CD49c及び／又はEpCAMを発現する細胞を分離する工程の前に、（A）腺性下垂体及び／又はその前駆組織を含み、任意により視床下部神経上皮組織をさらに含む細胞凝集塊を分散させて、単一細胞の集団を得る工程を含み得る。本発明において、分離される細胞は、単一の細胞であってもよいが、典型的には、複数の細胞からなる細胞集団である。従って、本明細書において、特に断りのない限り、「細胞」には、「細胞集団」が含まれるものとする。細胞集団は、１種類の細胞から構成されていてもよく、２種類以上の細胞から構成されていてもよい。従って、CD49cを指標として細胞凝集塊から分離される「下垂体ホルモン産生細胞及び／又はその前駆細胞、並びに視床下部細胞」は、単一の又は複数の下垂体ホルモン産生細胞及び／又はその前駆細胞と、単一の又は複数の視床下部細胞とを含む細胞集団と読み替えることができる。
　当該細胞凝集塊を分散させて、単一細胞の集団を得る工程（A）は、具体的には、（a1）細胞分離前の細胞凝集塊を、酵素処理により分散させる工程を含み得る（後述する（4.2））。該酵素処理により分散させる工程の前に、（a2）細胞分離前の細胞凝集塊を細断するか、又は細胞分離前の細胞凝集塊に物理的に切れ込みを入れる工程を含んでもよい（後述する（4.2））。
　当該細胞凝集塊を分散させて、単一細胞の集団を得る工程（A）は、任意により、（a-1）細胞分離前の細胞凝集塊をROCK阻害剤で処理する工程を含んでもよい。該工程を行う場合、単一細胞の集団を得る工程の最初に行なうことが好ましい（後述する（4.1））。
　上記細胞の分離工程（B）前、任意により、(C)得られた細胞を、ラミニン又はその断片でコーティングした培養器上で培養する工程を行ってもよい（後述する(4.3)。
　酵素処理により分散させる工程（a2）後、（B）EpCAMを発現する細胞を分離する工程（EpCAMを発現する細胞と、EpCAMを発現しない細胞を分離する工程）を行う（後述する（4.4））。
　上記細胞の分離工程（B）後、任意により、（D）得られた細胞を、再凝集させる工程を行ってもよい（後述する（4.5））。当該再凝集工程（D）は、具体的には、（d1）得られた細胞を、培養器に播種して接着培養すること、及び／又は（d2）得られた細胞を、培養器に播種し浮遊培養することにより行い得る。
（4.1）ROCK阻害剤による前処理工程
　本発明の分離方法では、まず得られた細胞凝集塊のROCK阻害剤による前処理を行い得る。当該前処理は、以降の細胞凝集塊の分散により誘導される多能性幹細胞（特に、ヒト多能性幹細胞）の細胞死を抑制するために、ROCK阻害剤を、当該前処理開始前から添加することが好ましい。ROCK阻害剤は、例えば、当該処理開始の少なくとも24時間前、少なくとも12時間前、少なくとも6時間前、少なくとも3時間前、少なくとも2時間前、少なくとも1時間前に添加する。ROCK阻害剤としては、Y-27632（(+)-(R)-trans-4-(1-aminoethyl)-N-(4-pyridyl)cyclohexanecarboxamide dihydrochloride）等を挙げることができる。当該処理に際して用いられるROCK阻害剤の濃度は、以降の細胞凝集塊の分散により誘導される多能性幹細胞の細胞死を抑制し得る濃度である。例えば、Y-27632について、このような濃度は、通常約0.1～200μM、好ましくは約2～50μMである。ROCK阻害剤の濃度を添加する期間内で変動させてもよく、例えば期間の後半で濃度を半減させることができる。後述の（4.2）～（4.5）のいずれの工程においても、細胞と接触させる溶液については、ROCK阻害剤を同様の濃度で含む溶液を用いることが好ましい。
　当該前処理を行うための培地は、第2の培養工程により得られる細胞凝集塊を用いる場合、第2の培養工程において用いる培地を、第3の培養工程により得られる細胞凝集塊を用いる場合、第3の培養工程において用いる培地を用いることができる。なお、上記培地中に既に所望する濃度でROCK阻害剤が添加されている場合は、当該前処理工程を行う必要はない。
（4.2）細胞凝集塊の分散工程
　次に、上記前処理を行った細胞凝集塊を、酵素処理により分散させる。具体的には、まず、上記前処理を行った細胞凝集塊を、第2あるいは第3の培養工程に記載の培地（例：DMEM/F-12培地（DMEM培地：Ham's F-12培地＝1:1の混合培地）等）を含む培養器（例：チューブ等）に移し、同培地で洗浄する。分散のための酵素としては、細胞を分散し得る限り特に限定されないが、例えば、EDTA；トリプシン、コラゲナーゼ（コラゲナーゼ タイプI～VII）、メタロプロテアーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、ディスパーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ等の酵素やこれらの混合物が挙げられる。好ましい酵素としては、コラゲナーゼが挙げられ、より好ましくはコラゲナーゼ タイプIである。酵素処理の条件（温度、時間等）は、用いる酵素等により適宜設定し得る。また、当該酵素処理を促進させるために、当該処理前に、細胞凝集塊を物理的（例：メス、ハサミ等）に細断するか、あるいは細胞凝集塊に物理的（例：メス、ハサミ等）に切れ込みを入れる工程を行ってもよい。
　上記酵素処理後、浮遊細胞を回収し、再度、上記酵素処理を行う。当該酵素処理も、上述の酵素等で行うことができ、好ましい酵素としては、EDTA；トリプシンが挙げられ、より好ましくは、EDTA；トリプシンとデオキシリボヌクレアーゼである。また、EDTA；トリプシンの代わりに、TrypLE (Invitrogen)等の市販品を用いてもよい。酵素処理の条件（温度、時間等）は、用いる酵素等により適宜設定し得る。上記一連の酵素処理により単細胞懸濁液を調製し得る。また、単細胞懸濁液を調製する際に、自体公知の方法により、死細胞を除去してもよい。
（4.3）ラミニン又はその断片を用いた培養工程
　後述の実施例で示される通り、細胞凝集塊に含まれる細胞が発現する特定のインテグリン複合体を指標とすることで、この培養工程を経ることで、該細胞凝集塊から、死細胞を容易に除去できると共に、細胞生存率の高い下垂体細胞及び視床下部細胞を精製できることが示された。具体的には、下垂体細胞及び視床下部細胞で共通して発現するインテグリン α3β1（CD49c/CD29）複合体に対して高親和性を有するラミニン又はその断片をコーティングした培養器で細胞凝集塊を培養することで、該凝集塊に含まれるインテグリン α3β1複合体を発現しない細胞の一部（例として、嚢胞形成細胞）及び死細胞は浮遊細胞画分に存在し、下垂体細胞及び視床下部細胞を含む残りの細胞は接着細胞画分に存在することとなる。このため、前記浮遊細胞画分を除去することで、死細胞を容易に除去できる。また、かかる工程を行うことで、細胞生存率を向上させることもできる。工程(4.3)は、上記（4.2）細胞凝集塊の分散工程の後に行うことが好ましい。
　工程（4.3）で用いるラミニン又は断片としては、少なくともインテグリン α3β1複合体に対して高親和性を有する限り特に限定されないが、例えば、ラミニン-111及びそのE8領域を含む断片、ラミニン-211及びそのE8領域を含む断片（例：iMatrix-211）、ラミニン-121又はそのE8領域を含む断片、ラミニン-221又はそのE8領域を含む断片、ラミニン-332又はそのE8領域を含む断片、ラミニン-3A11又はそのE8領域を含む断片、ラミニン-411又はそのE8領域を含む断片（例：iMatrix-411）、ラミニン-421又はそのE8領域を含む断片、ラミニン-511又はそのE8領域を含む断片（例：iMatrix-511、iMatrix-511 silk）、ラミニン-521又はそのE8領域を含む断片、ラミニン-213又はそのE8領域を含む断片、ラミニン-423又はそのE8領域を含む断片、ラミニン-523又はそのE8領域を含む断片、ラミニン-212/222又はそのE8領域を含む断片、ラミニン-522又はそのE8領域を含む断片などが挙げられる。なかでも、ラミニン-511又はそのE8領域を含む断片が好ましい。当該工程を行う場合、接着培養自体は、自体公知の方法により行うことができ、適宜、上述の第2の培養工程及び第3の培養工程に記載の内容（例：培地組成等）を用いてもよい。
　ラミニン又はその断片をコーティングした培養器で細胞凝集塊を培養する具体的な期間としては、例えば、３０分～５時間、好ましくは１時間～３時間である。
　上記接着培養工程後、解離酵素処理を行うことで、接着細胞を剥離・回収し得る。解離酵素としては、所望する細胞を剥離・回収し得る限り特に限定されないが、動物由来成分を含有しない酵素で行うことが望ましく、好ましい酵素としては、TrypLE (Invitrogen)等の市販品が挙げられる。解離酵素処理の条件（温度、時間等）は、用いる酵素等により適宜設定し得る。
（4.4）CD49c及び／又はEpCAM陽性細胞の分離工程
　上記調製した単細胞懸濁液に含まれる細胞集団から、CD49c及び／又はEpCAMを発現する所望の細胞を分離する方法としては、フローサイトメトリーやマスサイトメトリーを用いた方法、磁気細胞分離法などが挙げられ、これらの方法は、自体公知の方法を用いて行うことができる。例えば、CD49c及び／又はEpCAMを発現する細胞は、当該細胞とCD49c又はEpCAM分子に特異的に結合する物質（例：抗体等）とを接触させる工程を含む方法により分離することができる。上記物質には、それ自体に検出可能な標識（例：GFP、PE）が付加されているもの、およびそれ自体には標識が付加されていないものも含まれる。上記物質が、それ自体に標識が付加されていないものである場合、当該物質を直接または間接的に認識する検出可能な標識が付加された物質をさらに使用することで前記分離が可能となる。例えば、前記物質が抗体である場合には、蛍光色素、金属同位体又はビーズ（例：磁気ビーズ）を当該抗体に直接的又は間接的に担持させ、それにより細胞表面のマーカーを標識することが可能であり、当該標識に基づいて細胞を分離することが可能である。この際用いる抗体は、1種類のみ、又は2種類以上の抗体であってもよい。
　フローサイトメトリーを用いて、蛍光色素で標識したCD49c陽性細胞と、CD49c陰性細胞を分離する際に、細胞の自家蛍光（CD49cの発現とは無関係に細胞自身が発する蛍光）の影響により、CD49cの蛍光染色のみでは蛍光強度に基づくCD49c陽性細胞とCD49c陰性細胞の集団分離が悪い場合がある。このような場合には、後述の実施例で示される通り、CD49c陰性細胞に含まれる未分化細胞を別の蛍光色素を同時に用いて標識することで、CD49c陰性細胞の蛍光強度範囲を決定する。このようにして決定したCD49c陰性細胞の蛍光強度範囲より蛍光強度の強い細胞をCD49c陽性細胞として取り扱うものとする。未分化細胞を蛍光色素で標識する方法としては、未分化細胞の表面抗原であるSSEA5に対する抗体を介して蛍光色素で標識する方法が挙げられる。
　本明細書において、「陽性」には、高発現性である場合（「強陽性」とも称する。）が含まれる。高発現性であることは、High、Brightと表されることがある。例えば、SSEA5高発現細胞は、SSEA5High細胞又はSSEA5Bright細胞と表されることがある。
　高発現性は、フローサイトメトリー法により得られるチャートに基づき、判断することができる。チャートに現れる位置は、機器の電圧設定、感度設定、使用抗体クローン、染色条件、使用色素等により変動することがあるが、当業者であれば、得られたチャートにおいて一群と認められる細胞集団を切り分けないように適宜線引きすることができる。
（4.5）分離した細胞集団の再凝集培養工程
　分離した細胞集団は、培養器に播種して接着培養して、例えば、細胞シートとしてもよく、培養器に播種し浮遊培養することで、再凝集させて、細胞凝集塊としてもよい。該細胞集団は、そのまま使用まで維持培養してもよく、分離した細胞の分化状態に合わせて、所望する細胞へと更に分化誘導させてもよい。該維持培養や更なる分化誘導を行う場合、上述の第3の培養工程に記載の方法をそのまま行ってもよく、必要に応じて、適宜、自体公知の方法により修正して行ってもよい。また、該接着培養を行う場合も、接着培養自体は、自体公知の方法により行うことができ、適宜、上述の第3の培養工程に記載の内容（例：培地組成等）を用いてもよい。また、接着培養に際しては、培養器を細胞外マトリックス等（例：ラミニン、コラーゲン等）でコーティングすることが好ましい。
（5）分離された下垂体ホルモン産生細胞、その前駆細胞及び該細胞を含む組織の用途
　本発明の分離方法又は製造方法により得られた下垂体ホルモン産生細胞及びその前駆細胞、並びに該細胞を含む細胞凝集体及び細胞シート（該細胞凝集体と細胞シートとを、「下垂体組織」と総称することがある。）は、移植医療のために（換言すれば、移植療法剤として）使用することができる。下垂体組織には、視床下部細胞が含まれていてもよい。例えば、腺性下垂体（前葉又は中葉、好ましくは前葉）の障害に基づく疾患の治療薬として、あるいは腺性下垂体（前葉又は中葉、好ましくは前葉）の損傷状態において、該当する損傷部分を補充するために、本発明の方法により得られた下垂体ホルモン産生細胞、その前駆細胞及び／又は下垂体組織を用いることができる。腺性下垂体の障害に基づく疾患、又は腺性下垂体の損傷状態の患者に、本発明により得られた下垂体ホルモン産生細胞、その前駆細胞及び／又は下垂体組織を移植することにより、腺性下垂体の障害に基づく疾患、又は腺性下垂体の損傷状態を治療することができる。移植部位は、移植した下垂体ホルモン産生細胞、その前駆細胞及び／又は下垂体組織が、障害された腺性下垂体の代替として機能し得る限り特に限定されないが、例えば、腎被膜下等を挙げることができる。腺性下垂体の障害に基づく疾患としては、汎下垂体機能低下症、下垂体性小人症、副腎皮質機能低下症、部分的下垂体機能低下症、下垂体前葉ホルモン単独欠損症などが挙げられる。さらに、これら腺性下垂体の損傷状態としては、腺性下垂体摘出後の患者の腺性下垂体の状態、下垂体腫瘍への放射線照射後の患者の腺性下垂体の状態、腺性下垂体の外傷が挙げられる。
　移植医療においては、組織適合性抗原の違いによる拒絶がしばしば問題となるが、移植のレシピエントの体細胞から樹立した多能性幹細胞（例、iPS細胞）を用いることで当該問題を克服できる。即ち、好ましい態様において、本発明の方法において、多能性幹細胞として、レシピエントの体細胞から樹立した多能性幹細胞（例、iPS細胞）を用いることにより、当該レシピエントについて免疫学的自己の腺性下垂体又はその前駆組織、あるいは下垂体ホルモン産生細胞を製造し、これが当該レシピエントに移植される。あるいは、移植先の個体のHLA遺伝子型が同一若しくは実質的に同一である体細胞から樹立したiPS細胞を用いることも好ましい。ここで、「実質的に同一」とは、移植した細胞に対して免疫抑制剤により免疫反応が抑制できる程度にHLA遺伝子型が一致していることであり、例えば、HLA-A、HLA-B及びHLA-DRの3遺伝子座あるいはHLA-Cを加えた4遺伝子座が一致するHLA型を有する体細胞である。さらには、拒絶を抑制するため、HLA遺伝子を遺伝工学的手法により、改変した細胞を用いてもよい。かかる方法としては、一般的なHLAヘテロ接合体ドナー由来iPS細胞において、染色体の片側のHLA遺伝子部分を選択的に除去して、HLA擬似ホモ接合体を作る方法や、NK細胞の反応を抑えるために、染色体片側のHLA-Cを残し、HLA-AとHLA-B遺伝子を破壊する方法などが挙げられる。
　さらに、本発明の方法により得られた下垂体ホルモン産生細胞及びその前駆細胞、並びに下垂体組織は、薬物のスクリーニングや評価のために使用することができる。具体的には、例えば、下垂体ホルモンの産生を抑制又は促進するような物質のスクリーニングや、医薬品の副作用・毒性試験などに適用することができる。上記スクリーニングや試験等は、例えば、下垂体ホルモン産生細胞及び／又はその前駆細胞を含む細胞集団又は下垂体組織を被検物質の存在下又は非存在下（ネガティブコントロール）で培養する工程と、被検物質で処理した細胞集団又は下垂体組織における目的のホルモンの産生量をネガティブコントロールのものと比較する工程、及び下垂体ホルモンの産生を抑制又は促進した被検物質を、候補物質として、選択する工程を含んでもよい。
（6）本発明の下垂体ホルモン産生細胞、その前駆細胞及び／又は下垂体組織の製造方法
　本発明は、腺性下垂体及び／又はその前駆組織、並びに視床下部神経上皮組織を含む細胞凝集塊から、CD49cを発現する細胞を分離する工程を含む、下垂体ホルモン産生細胞、その前駆細胞及び／又は下垂体組織を製造する方法を提供する。下垂体ホルモン産生細胞及びその前駆細胞、並びに視床下部細胞の表面にはCD49cが発現し得るが、未分化細胞及び嚢胞形成細胞の表面には、CD49cが発現し得ない。従って、CD49cをマーカーとして、下垂体ホルモン産生細胞及びその前駆細胞、並びに視床下部細胞と、未分化細胞及び嚢胞形成細胞とを分離することができる。該分離工程を用いることで、下垂体ホルモン産生細胞、その前駆細胞及び／又は下垂体組織、あるいは下垂体ホルモン産生細胞、その前駆細胞及び／又は下垂体細胞を高い純度で含む細胞集団（例：細胞集団の80％以上、好ましくは85％以上、より好ましくは90％、更に好ましくは95％以上、なお一層好ましくは99％以上、最も好ましくは100％）を製造することができる。
　また、前述の通り、下垂体ホルモン産生細胞及びその前駆細胞の表面にはEpCAMが発現し得るが、視床下部細胞の表面には、EpCAMが発現し得ない。よって、CD49c及びEpCAMをマーカーとして、下垂体ホルモン産生細胞及びその前駆細胞と、視床下部細胞とを分離することができる。従って、本発明の製造方法の別の態様において、腺性下垂体及び／又はその前駆組織を含み、任意により視床下部神経上皮組織をさらに含む細胞凝集塊から、CD49c及びEpCAMを発現する細胞を分離する工程を含む、下垂体ホルモン産生細胞及び／又はその前駆細胞を分離する方法が提供される。CD49c及びEpCAMを発現する細胞を分離する工程は、典型的には、CD49c及びEpCAM共陽性細胞を分離することにより行うことができる。あるいは、腺性下垂体及び／又はその前駆組織を含み、任意により視床下部神経上皮組織から、CD49c又はEpCAMを発現する細胞を分離した後、該分離した細胞を含む細胞集団から、EpCAM又はCD49cを発現する細胞を分離することにより行ってもよい。該分離工程を用いることで、下垂体ホルモン産生細胞、その前駆細胞及び／又は下垂体組織、あるいは下垂体ホルモン産生細胞及び／又はその前駆細胞を高い純度で含む細胞集団（例：細胞集団の80％以上、好ましくは85％以上、より好ましくは90％、更に好ましくは95％以上、なお一層好ましくは99％以上、最も好ましくは100％）を製造することができる。
　さらに、前述の通り、多能性幹細胞から分化誘導した細胞凝集塊において、間葉系幹細胞に類似する増殖性細胞が発生し、該増殖性細胞が、CD49cを指標として分離した細胞集団に混入する可能性がある。これらの増殖性細胞は、本発明の陰性マーカーを指標として除去することができる。従って、本発明の製造方法は、本発明の陰性マーカーの少なくとも１つを発現しない細胞を分離する工程を含み得る。かかる工程は、腺性下垂体及び／又はその前駆組織を含む細胞凝集塊から、CD49cを発現する細胞を分離する工程と同時に行ってもよく、該工程の前又は後に行ってもよい。同時に行う場合には、典型的には、CD49c陽性であり、かつ本発明の陰性マーカー陰性である細胞を分離することにより行うことができる。本発明の陰性マーカーとして、特にCD90が好ましい。
　前述の通り、本発明の製造方法において、再凝集させた細胞凝集塊の中から、細胞集団の面積を基準に、増殖の少ない細胞集団を選別することで、より治療効果の高い細胞集団や、移植組織（細胞凝集体、細胞シートなど）を製造することもできる。また、典型的には、早期に増殖する細胞は増殖を経てひも状の形態となり、遅れて増殖する細胞は増殖を経て嚢胞肥大が認められることから、細胞集団の形態を基準として、増殖の少ない細胞集団を選別することもできる。さらに、前記増殖性細胞の大部分はSSEA5を発現するため、本発明の製造方法では、SSEA5陽性（特にSSEA5強陽性）細胞を除去する工程を含んでいてもよい。
　本発明の製造方法に含まれる、細胞分離前の細胞凝集塊から、CD49c及び／又はEpCAMを発現する細胞並びに／又は本発明の陰性マーカー及び／又はSSEA5を発現する細胞を除去する工程は、上述の「・本発明の分離工程の概要」に記載の工程等の内容を全て援用することができる。また、各工程に関しても、上述の（4.1）～（4.5）の内容を全て援用することができる。
　本発明の方法により製造した下垂体ホルモン産生細胞及び／又はその前駆細胞等は、上記（4.1）に記載したように、そのまま使用まで維持培養してもよく、分離した細胞の分化状態に合わせて、適宜、培養（例：第3の培養工程）を行い、所望する細胞へと更に分化誘導させてもよい。具体的には、例えば、本発明の方法により製造した下垂体ホルモン産生細胞、その前駆細胞、及び／又は下垂体組織を、そのまま該細胞集団又は組織による治療等を必要とする対象に移植してもよく、さらに自体公知の方法によりさらに純度を高めた（精製した）上で、該対象に移植してもよい。また、該精製した細胞を、上記（4.5）にて記載したように、培養器に播種して接着培養し、例えば、細胞シートのような形状にしてもよく、培養器に播種し浮遊培養することで、再凝集させてもよい。該接着培養又は浮遊培養を経て得られる細胞シートや細胞凝集塊を上記対象に移植してもよい。また、該接着培養又は浮遊培養は、短期間（例：3～6日間）行ってもよく、長期間（例：7～30日間）行ってもよい。本発明の製造方法においては、上述の「（1）多能性幹細胞」から「（5）分離された下垂体ホルモン産生細胞、その前駆細胞及び該細胞を含む組織の用途」に関する内容の全てを援用し得る。
（7）下垂体ホルモン産生細胞及び／又はその前駆細胞、並びに視床下部細胞の分離用試薬
　本発明はまた、CD49cに対する抗体を含んでなる、下垂体ホルモン産生細胞及び／又はその前駆細胞、並びに視床下部細胞の分離用試薬（以下、「本発明の試薬」と称することがある。）を提供する。
　また、本発明の試薬には、EpCAMに対する抗体をさらに含んでいてもよい。本発明の試薬は、EpCAMに対する抗体を含むことで、下垂体ホルモン産生細胞及び／又はその前駆細胞の分離用試薬として用いることもできる。本発明の試薬が２種以上の抗体を含む場合、該試薬は、各抗体を別個の試薬中に含む試薬キットとして提供され得る。本発明の試薬に含まれる抗体は、本発明の方法に用いられる分離手段に応じて、例えば、蛍光色素、金属同位体又はビーズ（例：磁気ビーズ）に結合した形態で提供され得る。さらに、本発明の試薬には、CD90、CD29、CD44、CD58、CD166及びSSEA5からなる群から選択される１種以上の表面抗原の各々に対する抗体をさらに含んでいてもよい。
　以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
　実施例1：細胞表面抗原のスクリーニング
　ヒトiPS細胞（201B7株）を、国際公開第2016/013669又はCell Reports, 30, 18-24, January 7, 2020に記載の公知の方法により、腺性下垂体又はその前駆組織を含む細胞凝集塊に分化誘導した。ヒトiPS細胞（201B7株）から分化誘導して47日目の細胞塊をAccumax (Innovative Cell Technologies, #AM105)で37℃、5～10分処理して分散し、単細胞懸濁液を調製した。BioLegend社製のヒト表面抗原用PE標識抗体パネル（LEGENDScreen Human PE Kit, #700007）で細胞を染色後、IntraStain (Dako, #K2311)を用いて細胞の固定および膜透過処理を行った。続いてFITC標識抗Cytokeratin抗体（Miltenyi, #130-080-101）による細胞内Cytokeratinの染色、Hoechst 33342による核染色、HCS CellMask Deep Red Stain (Invitrogen, #H32721)による細胞質の染色を行った。染色後の細胞について、ParkinElmer社製のイメージングアナライザー（Opera Phenix）で画像取得・解析を行い、Cytokeratin陽性細胞に共存率の高い表面抗原を探索した。その結果、CD49cで下垂体前駆細胞を識別できる可能性が示唆された。
　実施例2：免疫組織化学
　分化誘導開始後152日以上培養した細胞塊、又はiMatrix-511接着処理やFACSによる精製後に再凝集させて7日以上培養した細胞塊を使用した。細胞塊を4%パラホルムアルデヒド溶液で固定後、10, 20, 30%スクロース溶液に段階的に浸してスクロース置換を行った。続いてOCTコンパウンドで包埋し、クリオスタットで4～10 μm厚の凍結切片を作製して、剥離防止コートスライドグラス（PLATINUM PRO; Matsunami Glass）に貼り付けた。切片をPBSで洗浄後、ブロッキング溶液（5%正常ロバ血清＋0.1% TritonX-100 in PBS）で室温30～60分ブロッキング処理を行った。次に、ブロッキング溶液で希釈した一次抗体で4℃、一晩反応を行った。続いて、蛍光標識二次抗体およびDAPI（核染色剤）で室温1時間反応を行った。染色後の切片は、Fluoromount (Diagnostic BioSystems, #K024)で封入後、共焦点レーザー顕微鏡LSM-710 (Zeiss)で蛍光観察を行った。
　実施例3：iMatrix-511接着処理による浮遊細胞画分と接着細胞画分の分離
　分化誘導開始後110～490日の細胞塊を酵素的に分散し、iMatrix-511接着処理に使用した。以下に手順を示す。
　（1）Y27632による前処理
　分散処理による細胞死を抑制するために、作業開始の1時間以上前にY27632 (Wako, #034-24024)を終濃度20 μMで培地に添加して、細胞塊を前処理した。以降の操作では、細胞が曝されるすべての溶液（PBSは除く）に20 μM Y27632を添加した。
　（2）細胞塊の分散
　酵素処理による分散を促進するために、細胞塊をメスで細断または切込みを入れた。次に細胞塊を50 mlチューブに移して、DMEM/F12 (Wako, #042-30555)で洗浄した。次にコラゲナーゼ溶液1～3 mlを加えて、37℃で40分旋回振盪（140-150 rpm）した。コラゲナーゼ溶液の組成は、上記のDMEM/F12に0.2～0.3%コラゲナーゼtype I (Wako, #031-17601)および0.1% BSA (Sigma, #A9418)を添加したものである。
　コラゲナーゼ処理終了後、浮遊細胞を含む上清を新しい15 mlチューブに移し、残りの細胞塊をPBSで洗浄した（洗浄液も上清と同じチューブに回収）。上清を回収した15 mlチューブを4℃、1000 rpm, 5分遠心して浮遊細胞をペレットにした。50 mlチューブの細胞塊に 10×TrypLE Select (Gibco, #25200072) + 0.2 mg/ml DNase I (Roche, #11284932001)を1 ml加えて、37℃で10分旋回振盪（140-150 rpm）後、15 mlチューブのペレットと合わせてP1000マイクロピペットで約20回ピペッティングして細胞塊をほぐした。gfCDM + 20%KSR（細胞塊の分化および維持用培地）10 mlで懸濁して10×TrypLE Selectを中和後、4℃、1000 rpm, 5分遠心した。遠心後の細胞ペレットにgfCDM + 20%KSR + 10 μg/ml DNase Iを1 ml加えて、P1000マイクロピペットで約30回激しくピペッティングして細胞塊を分散し、70 μmセルストレイナーを通して凝集塊を取り除いた。以上の操作により、単細胞懸濁液を調製した。
　（3）iMatrix-511接着処理
　分散した細胞を、iMatrix-511をコーティングした10 cm dishに播種して37℃で2時間培養した。培養後、培養液とともに浮遊細胞を回収することで、浮遊細胞画分を得た。次に、PBSをdishに添加して、接着細胞の表面を洗浄した。PBSを除去後、10×TrypLE Select + 0.2 mg/ml DNase Iを1 ml加えて、37℃で5分保温した。gfCDM + 20%KSR 2 mlを加えてP1000マイクロピペットでピペッティングして細胞を剥離し、細胞懸濁液をコニカルチューブに回収した。この時点で、剥離していない接着細胞がdishに残っている場合には、上記の剥離工程を再度繰り返すことで、接着細胞をすべて回収した。以上の剥離工程により接着細胞画分を得た。
　実施例4：磁気細胞分離法（Magnetic-Activated Cell Sorting; MACS）によるCD49c陽性細胞の精製
　分化誘導開始後110～490日の細胞塊を酵素的に分散し、MACSに使用した。以下に手順を示す。
　（1）Y27632による前処理
　分散処理による細胞死を抑制するために、作業開始の1時間以上前にY27632 (Wako, #034-24024)を終濃度20 μMで培地に添加して、細胞塊を前処理した。以降の操作では、細胞が曝されるすべての溶液（PBSは除く）に20 μM Y27632を添加した。
　（2）細胞塊の分散
　酵素処理による分散を促進するために、細胞塊をメスで細断または切込みを入れた。次に細胞塊を50 mlチューブに移して、DMEM/F12 (Wako, #042-30555)で洗浄した。次にコラゲナーゼ溶液1～3 mlを加えて、37℃で40分旋回振盪（140-150 rpm）した。コラゲナーゼ溶液の組成は、上記のDMEM/F12に0.2～0.3%コラゲナーゼtype I (Wako, #031-17601)および0.1% BSA (Sigma, #A9418)を添加したものである。
　コラゲナーゼ処理終了後、浮遊細胞を含む上清を新しい15 mlチューブに移し、残りの細胞塊をPBSで洗浄した（洗浄液も上清と同じチューブに回収）。上清を回収した15 mlチューブを4℃、1000 rpm, 5分遠心して浮遊細胞をペレットにした。50 mlチューブの細胞塊に10×TrypLE Select (Gibco, #25200072)+ 0.2 mg/ml DNase I (Roche, #11284932001)を1 ml加えて、37℃で5～10分保温後、15 mlチューブのペレットと合わせてP1000マイクロピペットで約20回ピペッティングして細胞塊をほぐした。gfCDM + 20%KSR（細胞塊の分化および維持用培地）10 mlで懸濁して10×TrypLE Selectを中和後、4℃、1000 rpm, 5分遠心した。遠心後の細胞ペレットにgfCDM + 20%KSR + 10 μg/ml DNase Iを1 ml加えて、P1000マイクロピペットで約30回激しくピペッティングして細胞塊を分散し、70 μmセルストレイナーを通して凝集塊を取り除いた。以上の操作により、単細胞懸濁液を調製した。
　（3）iMatrix-511接着処理
　分散した細胞を、iMatrix-511をコーティングした10 cm dishに播種して37℃で2時間培養した。培養後、培養液とともに浮遊細胞を廃棄後、PBSをdishに添加して、接着細胞の表面を洗浄した。PBS を除去後、10×TrypLE Select + 0.2 mg/ml DNase Iを1 ml加えて、37℃で5分保温した。gfCDM + 20%KSR 2 mlを加えてP1000マイクロピペットでピペッティングして細胞を剥離し、細胞懸濁液をコニカルチューブに回収した。この時点で、剥離していない接着細胞がdishに残っている場合には、上記の剥離工程を再度繰り返すことで、接着細胞をすべて回収した。以上の剥離工程により接着細胞画分を得た。
　（4）MACSによるCD49c陽性細胞の分離
　iMatrix-511接着処理により回収した細胞をMACS buffer (PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA)に懸濁し、PE標識抗CD49c抗体（BioLegend, #343803）で染色後、抗PE-マイクロビーズ（Miltenyi, #130-105-639）で処理することにより、CD49c陽性細胞を磁気ビーズで標識した。次に細胞を磁気カラム（LSカラム; Miltenyi, #130-042-401）に通すことで、磁気ビーズ標識細胞（CD49c陽性細胞）と未標識細胞（CD49c陰性細胞）を分離・回収した。
　実施例5：蛍光活性化セルソーティング（Fluorescence-Activated Cell Sorting; FACS）によるCD49c陽性細胞又はCD49c陽性/EpCAM陽性細胞の精製
　分化誘導開始後110～490日の細胞塊を酵素的に分散し、FACSに使用した。以下に手順を示す。
　（1）Y27632による前処理
　分散処理による細胞死を抑制するために、作業開始の1時間以上前にY27632 (Wako, #034-24024)を終濃度20 μMで培地に添加して、細胞塊を前処理した。以降の操作では、細胞が曝されるすべての溶液（PBSは除く）に20 μM Y27632を添加した。
　（2）細胞塊の分散
　酵素処理による分散を促進するために、細胞塊をメスで細断または切込みを入れた。次に細胞塊を50 mlチューブに移して、DMEM/F12 (Wako, #042-30555)で洗浄した。次にコラゲナーゼ溶液1～3 mlを加えて、37℃で40分旋回振盪（140-150 rpm）した。コラゲナーゼ溶液の組成は、上記のDMEM/F12に0.2～0.3%コラゲナーゼtype I (Wako, #031-17601)および0.1% BSA (Sigma, #A9418)を添加したものである。
　コラゲナーゼ処理終了後、浮遊細胞を含む上清を新しい15 mlチューブに移し、残りの細胞塊をPBSで洗浄した（洗浄液も上清と同じチューブに回収）。上清を回収した15 mlチューブを4℃、1000 rpm, 5分遠心して浮遊細胞をペレットにした。50 mlチューブの細胞塊に10×TrypLE Select (Gibco, #25200072)+ 0.2 mg/ml DNase I (Roche, #11284932001)を1 ml加えて、37℃で5～10分保温後、15 mlチューブのペレットと合わせてP1000マイクロピペットで約20回ピペッティングして細胞塊をほぐした。gfCDM + 20%KSR（細胞塊の分化および維持用培地）10 mlで懸濁して10×TrypLE Selectを中和後、4℃、1000 rpm, 5分遠心した。遠心後の細胞ペレットにgfCDM + 20%KSR + 10 μg/ml DNase Iを1 ml加えて、P1000マイクロピペットで約30回激しくピペッティングして細胞塊を分散し、70 μmセルストレイナーを通して凝集塊を取り除いた。以上の操作により、単細胞懸濁液を調製した。
　（3）iMatrix-511接着処理
　分散した細胞を、iMatrix-511をコーティングした10 cm dishに播種して37℃で2時間培養した。培養後、培養液とともに浮遊細胞を廃棄後、PBSをdishに添加して、接着細胞の表面を洗浄した。PBS を除去後、10×TrypLE Select + 0.2 mg/ml DNase Iを1 ml加えて、37℃で5分保温した。gfCDM + 20%KSR 2 mlを加えてP1000マイクロピペットでピペッティングして細胞を剥離し、細胞懸濁液をコニカルチューブに回収した。この時点で、剥離していない接着細胞がdishに残っている場合には、上記の剥離工程を再度繰り返すことで、接着細胞をすべて回収した。以上の剥離工程により接着細胞画分を得た。
　（4）FACSによるCD49c陽性細胞又はCD49c陽性/EpCAM陽性細胞の分離
　iMatrix-511接着処理により回収した細胞をFACS buffer (PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA)に懸濁した。CD49c陽性細胞を分離する場合には、APC標識抗CD49c抗体（BioLegend, #343808）及びPE標識抗SSEA5抗体（BioLegend, #355203）で細胞を染色後、Beckman Coulter社製のセルソーター（MoFlo Astrios）を用いて、CD49c陽性細胞とCD49c陰性細胞を分離・回収した。CD49c陽性/EpCAM陽性細胞を分離する場合には、APC標識抗CD49c抗体及びPE標識抗EpCAM抗体（Miltenyi, #130-098-115）で細胞を染色後、上記のセルソーターを用いて、CD49c陽性/EpCAM陽性細胞とCD49陽性/EpCAM陰性細胞を分離・回収した。
　実施例6：精製した細胞の再凝集培養
　精製したそれぞれの細胞集団（iMatrix-511接着細胞、CD49c陽性細胞、CD49c陰性細胞、CD49c陽性/EpCAM陽性細胞、CD49c陽性/EpCAM陰性細胞）を低接着V底96ウェルプレート（PrimeSurface plate 96V; Sumitomo Bakelite, #MS-9096V）に播種して再凝集させた。1ウェル当たり、15,000細胞 in 200 μl培地（gfCDM + 20% KSR + 30 μM Y27632）で播種した。以降は3日ごとにY27632を含まない培地で半量交換した。
　実施例7：各指標の定量化
　（1）Rx::Venus陽性細胞におけるEpCAM陽性細胞及びCD49c陽性細胞の割合
　細胞凝集塊を分散して単細胞懸濁液を調製し、APC標識抗EpCAM抗体（Miltenyi, #130-113-822）又はAPC標識抗CD49c抗体（BioLegend, #343808）で染色後に、フローサイトメトリー（細胞の蛍光強度に基づき、定量的な解析を行う実験手法）により、Rx::Venus陽性細胞画分におけるEpCAM陽性細胞及びCD49c陽性細胞の割合をそれぞれ測定した。
　（2）iMatrix-511接着処理工程における浮遊細胞画分に存在する細胞と接着細胞画分に存在する細胞の存在割合
　細胞凝集塊を分散して単細胞懸濁液を調製し、iMatrix-511をコーティングした培養器で培養した後に、接着細胞、浮遊細胞をそれぞれ回収し、血球計算盤でカウントした。
　（3）iMatrix-511接着処理工程における浮遊細胞画分と接着細胞画分における、CD49c陽性細胞及びRx::Venus陽性細胞の割合
　細胞凝集塊を分散して単細胞懸濁液を調製し、iMatrix-511をコーティングした培養器で培養した後に、PE標識抗CD49c抗体（BioLegend, #343803）で染色を行い、蛍光顕微鏡（Leica DMI6000B）で画像を取得した。画像解析ソフトImage JのCell counterツールを用いて、CD49c陽性細胞及びRx::Venus陽性細胞をカウントし、全細胞におけるそれぞれの割合を計算した。
　(4) iMatrix-511接着処理工程における浮遊細胞画分と接着細胞画分における細胞の生存率（viability）
　細胞凝集塊を分散して単細胞懸濁液を調製し、iMatrix-511をコーティングした培養器で培養した後に、APC標識Annexin V（BioLegend, #640919）及びPropidium iodide（PI）で染色を行い、フローサイトメトリー）により生細胞（Annexin V陰性/PI陰性細胞）の割合を算出した。
　(5) 剥離組織を用いた間葉系幹細胞様の増殖性細胞の表面マーカー検索結果における陽性率の定量化
　hiPSCサンプル由来の剥離組織を回収し、10×TrypLE selectで処理して分散させ、幹細胞系譜の表面マーカーを蛍光染色し、フローサイトメーターで陽性率を算出した。
　(6)iMatrix-511接着処理による細胞生存率
　Feeder-free分化法により誘導したhESC由来細胞塊(Day 448）を分散後、Method A（MACS死細胞除去キットで生細胞を回収）及びMethod B（iMatrix-511接着細胞画分を回収）の各方法で回収した細胞を15,000個ずつ再凝集して3日後に観察した。画像解析ソフトImageJを用いて、凝集塊をn = 6-8にて、二次元画像上で面積を測定した。
　(7)iMatrix-511接着処理後の再凝集塊のサイズ
　iMatrix-511接着処理によりCD49c及び／又はEpCAM陽性細胞を分離・回収後に再凝集して、7日目(Day 7)と28日目（Day 28）に観察した。画像解析ソフトImageJを用いて、凝集塊をn = 9にて、二次元画像上で面積を測定した。
　(8) iMatrix-511接着処理後にFACSによるCD49c陽性細胞とCD49c陰性細胞との分離を行った後における再凝集塊サイズ
　iMatrix-511接着処理後にFACSを用いてCD49c陽性細胞を分離・回収後に再凝集して、8日目(Day 8)と36日目（Day 36）に観察した。画像解析ソフトImageJを用いて、凝集塊を二次元画像上で面積を測定した。
　実施例8：ACTH分泌試験（CRH刺激試験）
　MACS又はFACSによる精製後に再凝集させて8日以上培養した細胞塊を使用した。細胞塊1個又は5個を、所定の培地等を用いて所定温度・所定時間保温後に培地等を回収した。回収した培地等の中のACTH濃度を臨床検査で使われているECLIA法によって測定した。なお、分泌抑制因子、CRH受容体阻害剤の影響を確認する場合には、分泌測定前に分泌抑制因子、CRH受容体阻害剤を含む維持培地で所定時間前処理を行った。
　本発明の分離方法及び製造方法は、CD49cをマーカーとして利用することで、多能性幹細胞由来の分化組織から機能的な下垂体ホルモン産生細胞及び／又はその前駆細胞を効率的に分離・精製することに利用可能である。また、分離・精製した下垂体ホルモン産生細胞等は、生理的な下垂体ホルモン分泌刺激により優れた下垂体ホルモンの分泌能を示すため、該細胞を用いた下垂体に関する疾患の治療等に利用可能である。
　本出願は、日本で出願された特願２０２１－１５８４０６（出願日：２０２１年９月２８日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

 

Claims (21)

  1. 　腺性下垂体及び／又はその前駆組織、並びに視床下部神経上皮組織を含む細胞凝集塊から、CD49cを発現する細胞を分離する工程を含む、下垂体ホルモン産生細胞及び／又はその前駆細胞、並びに視床下部細胞を分離する方法。
  2. 　腺性下垂体及び／又はその前駆組織を含む細胞凝集塊から、CD49c及びEpCAMを発現する細胞を分離する工程を含む、下垂体ホルモン産生細胞及び／又はその前駆細胞を分離する方法。
  3. 　CD49cを発現する細胞、又はCD49c及びEpCAMを発現する細胞を分離する工程が、以下の工程を含む、請求項１又は２に記載の方法。
    （１）該細胞凝集塊を細胞集団に分散させる第一工程、
    （２）第一工程で得られた細胞集団を、ラミニン又はその断片でコーティングした培養器上で培養する第二工程、及び
    （３）第二工程で得られた細胞集団から、CD49cを発現する細胞、又はCD49c及びEpCAMを発現する細胞を分離する第三工程
  4. 　CD90、CD29、CD44、CD58及びCD166からなる群から選択される少なくとも１つの細胞表面抗原が陰性の細胞を分離する工程を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　細胞凝集塊が、多能性幹細胞を分化誘導することにより得られる細胞凝集塊である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　前記前駆組織が、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　腺性下垂体及び/又はその前駆組織、並びに視床下部神経上皮組織を含む細胞凝集塊から、CD49cを発現する細胞を分離する工程を含む、下垂体ホルモン産生細胞及び/又はその前駆細胞、並びに視床下部細胞の製造方法。
  8. 　腺性下垂体及び/又はその前駆組織を含む細胞凝集塊から、CD49c及びEpCAMを発現する細胞を分離する工程を含む、下垂体ホルモン産生細胞及び/又はその前駆細胞の製造方法。
  9. 　以下の工程：
    （Ａ）腺性下垂体及び／又はその前駆組織、並びに視床下部神経上皮組織を含む細胞凝集塊から、CD49cを発現する細胞を分離する工程、及び
    （Ｂ）前記（Ａ）で得られる集団を、再凝集させる工程
    を含む、下垂体ホルモン産生細胞及び／又はその前駆細胞、並びに視床下部細胞を含む細胞凝集塊又は細胞シートを製造する方法。
  10. 　以下の工程：
    （ａ）腺性下垂体及び／又はその前駆組織を含む細胞凝集塊から、CD49c及びEpCAMを発現する細胞を分離する工程、及び
    （ｂ）前記（ａ）で得られる集団を、再凝集させる工程
    を含む、下垂体ホルモン産生細胞及び／又はその前駆細胞を含む細胞凝集塊又は細胞シートを製造する方法。
  11. 　CD49cを発現する細胞、又はCD49c及びEpCAMを発現する細胞を分離する工程が、以下の工程を含む、請求項７～１０のいずれか一項に記載の方法。
    （１）該細胞凝集塊を細胞集団に分散させる第一工程、
    （２）第一工程で得られた細胞集団を、ラミニン又はその断片でコーティングした培養器上で培養する第二工程、及び
    （３）第二工程で得られた細胞集団から、CD49cを発現する細胞、又はCD49c及びEpCAMを発現する細胞を分離する第三工程
  12. 　CD90、CD29、CD44、CD58及びCD166からなる群から選択される少なくとも１つの細胞表面抗原が陰性の細胞を分離する工程
    をさらに含む、請求項７～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 　前記下垂体ホルモン産生細胞が、成長ホルモン（GH）産生細胞、プロラクチン（PRL）産生細胞、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）産生細胞、甲状腺刺激ホルモン（TSH）産生細胞、卵胞刺激ホルモン（FSH）産生細胞、黄体化ホルモン（LH）産生細胞からなる群から選択される少なくとも1種である、請求項７～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 　請求項９～１３のいずれか一項に記載の方法により製造された細胞凝集塊又は細胞シート。
  15. 　請求項９～１３のいずれか一項に記載の方法により製造された細胞凝集塊又は細胞シートを含む、移植療法剤。
  16. 　腺性下垂体の障害に基づく疾患及び／又は腺性下垂体の損傷状態を治療するための、請求項１５に記載の移植療法剤。
  17. 　前記腺性下垂体の障害に基づく疾患が、汎下垂体機能低下症、下垂体性小人症、副腎皮質機能低下症、部分的下垂体機能低下症及び下垂体前葉ホルモン単独欠損症からなる群から選択される、請求項１６に記載の移植療法剤。
  18. 　請求項９～１３のいずれか一項に記載の方法により製造された細胞凝集塊又は細胞シートを含有してなる、腺性下垂体の障害に基づく疾患又は腺性下垂体の損傷状態の治療薬。
  19. 　請求項９～１３のいずれか一項に記載の方法により製造された細胞凝集塊又は細胞シートの有効量を、移植を必要とする対象に移植することを含む、腺性下垂体の障害に基づく疾患又は腺性下垂体の損傷状態の治療方法。
  20. 　腺性下垂体の障害に基づく疾患又は腺性下垂体の損傷状態の治療における使用のための請求項９～１３のいずれか一項に記載の方法により製造された細胞凝集塊又は細胞シート。
  21. 　請求項９～１３のいずれか一項に記載の方法により製造された細胞凝集塊又は細胞シートを有効成分として含有する、医薬組成物。
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