JP6110048B2 - 内分泌前駆細胞、膵臓ホルモン発現細胞及びそれらの製造方法 - Google Patents
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- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
Description
本出願は、米国特許仮出願第60/852,878号(表題「NCAMを使用する、内分泌前駆細胞、未熟膵島細胞及び成熟膵島細胞の濃縮(ENRICHMENT OF ENDOCRINE PRECURSOR CELLS, IMMATURE PANCREATIC ISLET CELLS AND MATURE PANCREATIC ISLET CELLS USING NCAM)」、2006年10月18日出願)に対する米国特許法第119条(e)に基づく優先権を主張し、且つ米国特許仮出願第60/833,633号(表題「インスリン産生細胞及び産生方法(INSULIN-PRODUCING CELLS AND METHOD OF PRODUCTION)」、2006年7月26日出願)に対する米国特許法第119条(e)に基づく優先権を主張し、且つ米国特許仮出願第60/778,649号(表題「インスリン産生細胞及び産生方法(INSULIN-PRODUCING CELLS AND METHOD OF PRODUCTION)」、2006年3月2日出願)に対する米国特許法第119条(e)に基づく優先権を主張する正規の出願である。上に列記した優先権出願それぞれの開示内容全体が、参照により本明細書中に援用される。
〜約80%の範囲であり得る。或る特定の実施の形態において、ヒト内分泌前駆細胞は、ニューロゲニン3(NEUROG3又はNGN3)、ペアードボックス4(PAX4)及びNKX2転写因子関連遺伝子座2(NKX2.2)から成る群から選択されるマーカーを発現する。
おいて、未熟膵島ホルモン発現細胞のさらなる濃縮は、NCAM陽性細胞集団をCD133と結合する第2の試薬に接触させること、及びそれから第2の試薬と結合する細胞を細胞集団から除去することによって達成することができる。
複合体の試薬は、抗NCAM抗体、及び抗NCAM抗体断片、又はNCAMリガンド等の分子を含み得る。
vitro細胞培養物及びin vitro細胞集団に関する。本明細書に包含される他の態様は、酪酸ナトリウム又は他のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の非存在下で内分泌前駆細胞培養物若しくは細胞集団、及び/又は膵臓ホルモン発現細胞培養物若しくは細胞集団を産生する方法に関する。このような態様において、hESCは、酪酸ナトリウム又は他のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の非存在下で胚体内胚葉細胞、並びに胚体内胚葉、例えば内分泌前駆細胞及び膵臓ホルモン発現細胞から誘導される細胞型に分化する。
vitro細胞培養物。
落63の方法。
腸管の前部から誘導される、細胞、組織又は器官に分化することができる多能性細胞であるヒトPDX1陽性膵臓内胚葉細胞の集団を得る工程と、
γ−セクレターゼ阻害剤をヒトPDX1陽性膵臓内胚葉細胞の当該集団に供給し、それによりヒト内分泌前駆細胞の集団を産生する工程を含む、段落50の方法。
腸管の前部から誘導される、細胞、組織又は器官に分化することができるPDX1陰性多能性細胞であるヒト前腸内胚葉細胞の集団を得る工程と、
レチノイドをヒト前腸内胚葉細胞の当該集団に供給し、それによりヒトPDX1陽性膵臓内胚葉細胞の集団を産生する工程を含む、段落70の方法。
腸管の細胞又はそれから誘導される器官に分化することができる多能性細胞であるヒト胚体内胚葉細胞の集団を得る工程と、
線維芽細胞増殖因子10(FGF−10)及びヘッジホッグ経路阻害剤をヒト胚体内胚葉細胞の当該集団に供給し、それによりヒト前腸内胚葉細胞の集団を産生する工程を含む、段落73の方法。
(a)多能性ヒト胚性幹細胞の集団を得る工程と、
(b)前記TGF−βスーパーファミリーの少なくとも1つの増殖因子を多能性ヒト胚性幹細胞の前記集団に供給し、それによりヒト胚体内胚葉細胞の集団を産生する工程と、
(c)少なくとも1つの線維芽細胞増殖因子をヒト胚体内胚葉細胞の前記集団に供給し、それによりヒト前腸内胚葉細胞の集団を産生する工程と、
(d)レチノイドをヒト前腸内胚葉細胞の前記集団に供給し、それによりヒトPDX1陽性膵臓内胚葉細胞の集団を産生する工程と、
(e)γ−セクレターゼ阻害剤をヒトPDX1陽性膵臓内胚葉細胞の前記集団に供給し、それによりヒト内分泌前駆細胞を含む集団を産生する工程と、
(f)ヒト膵島ホルモン発現細胞が形成されるのに十分な時間、培養培地でヒト内分泌前駆細胞の前記集団をインキュベートする工程を含む、
ヒト膵島ホルモン発現細胞を製造する方法。
(a)多能性ヒト胚性幹細胞の集団を得る工程と、
(b)前記TGF−βスーパーファミリーの少なくとも1つの増殖因子を多能性ヒト胚性幹細胞の前記集団に供給し、それによりヒト胚体内胚葉細胞の集団を産生する工程と、
(c)レチノイドをヒト胚体内胚葉細胞の前記集団に供給し、それによりヒトPDX1陽性膵臓内胚葉細胞の集団を産生する工程と、
(d)ヒト膵島ホルモン発現細胞が形成されるのに十分な時間、レチノイドの存在下でヒトPDX1陽性膵臓内胚葉細胞の前記集団をインキュベートする工程を含む、ヒト膵島ホルモン発現細胞を製造する方法。
は器官に分化することができるPDX1陰性多能性細胞である)と、レチノイドをヒト前腸内胚葉細胞の当該集団に供給し、それによりヒトPDX1陽性膵臓内胚葉細胞の集団を産生する工程とを含む、段落130の方法。
vitroヒト内分泌前駆細胞集団。
前駆細胞の前記細胞集団に供給される、段落197の方法。
、段落209の方法。
駆細胞の前記細胞集団に供給される、段落269の方法。
外から加えられた因子を回収することをさらに含む、段落284の方法。
多能性細胞、及び当該NCAMと結合する試薬である、NCAMを発現するヒト内分泌前駆細胞を含むex vivo試薬−細胞複合体。
(a)前記TGF−βスーパーファミリーの少なくとも1つの増殖因子を多能性ヒト胚性幹細胞(hESC)の集団に供給し、それによりヒト胚体内胚葉細胞の集団を産生する工程と、(b)少なくとも1つの線維芽細胞増殖因子をヒト胚体内胚葉細胞の前記集団に供給し、それによりヒト前腸内胚葉細胞の集団を産生する工程と、(c)ノギンをヒト前腸内胚葉細胞の前記集団に供給し、それによりヒト内分泌前駆細胞を含む集団を産生する工程と、(d)ヒト膵島ホルモン発現細胞が形成されるのに十分な時間、培養培地でヒト内分泌前駆細胞の前記集団をインキュベートする工程(当該ヒト膵島ホルモン発現細胞が形成されるのに十分な時間は、前記細胞集団におけるヒト膵臓ホルモン発現細胞の存在を検出することによって求められている)とを含む、ヒト膵臓ホルモン発現細胞を製造する方法。
段落340の方法。
、2004年4月27日出願)、米国特許仮出願第60/586,566号(表題「胚体内胚葉の単離のためのケモカイン細胞表面受容体(CHEMOKINE CELL SURFACE RECEPTOR FOR THE ISOLATION OF DEFINITIVE ENDODERM)」、2004年7月9日出願)、米国特許仮出願第60/587,942号(表題「胚体内胚葉の単離のためのケモカイン細胞表面受容体(CHEMOKINE CELL SURFACE RECEPTOR FOR THE ISOLATION OF DEFINITIVE ENDODERM)」、2004年7月14日出願)、米国特許出願第11/021,618号(表題「胚体内胚葉(DEFINITIVE ENDODERM)」、2004年12月23日出願)、米国特許出願第11/115,868号(表題「PDX1発現内胚葉(PDX1 EXPRESSING ENDODERM)」、2005年4月26日出願)、米国特許出願第11/165,305号(表題「胚体内胚葉を分化させるための因子の同定方法(METHODS FOR IDENTIFYING FACTORS FOR DIFFERENTIATING DEFINITIVE ENDODERM)」、2005年6月23日出願)、米国特許仮出願第60/730,917号(表題「PDX1を発現する背側及び腹側の前腸内胚葉(PDX1−EXPRESSING DORSAL AND VENTRAL FOREGUT ENDODERM)」、2005年10月27日出願)、米国特許仮出願第60/736,598号(表題「胚体内胚葉のマーカー(MARKERS OF DEFINITIVE ENDODERM)」、2005年11月14日出願)、米国特許仮出願第60/778,649号(表題「インスリン産生細胞及び産生方法(INSULIN-PRODUCING CELLS AND METHOD OF PRODUCTION)」、2006年3月2日出願)、米国特許仮出願第60/833,633号(表題「インスリン産生細胞及び産生方法(INSULIN-PRODUCING CELLS AND METHOD OF PRODUCTION)」、2006年7月26日出願)、及び米国特許仮出願第60/852,878号(表題「NCAMを使用する、内分泌前駆細胞、未熟膵島細胞及び成熟膵島細胞の濃縮(ENRICHMENT OF ENDOCRINE PRECURSOR CELLS, IMMATURE PANCREATIC ISLET CELLS AND MATURE PANCREATIC ISLET CELLS USING NCAM)」、2006年10月18日出願)(これらの開示内容全体が、参照により本明細書中に援用される)にも見出され得る。
受胎後(post conception)(p.c.)約41日〜45日で膵頭後部及び鉤状突起と呼ばれる領域を形成するより小さい腹側芽と融合する(Bocian-Sobkowska, J., et al. Histochem. Cell Biol. 112, 147-153, (1999))。ヒトのこの領域は主に、島細胞を産生する膵臓ポリペプチドから成る(Rahier J., et al., Cell Tissue Res. 200 (3), 359-366,(1979)、Malaisse-Langae F., et al., Diabetologia 17(6), 361-365,(1979)、Fiocca R., et al., Histochemistry 77(4), 511-523,(1983)、Stefan Y., et al., Diabetologica 23(2), 141-142,(1982))。背側膵芽は、ヒトにおいては膵頭前部、膵体及び膵尾を形成する。このことによって、全ての膵臓ホルモン産生細胞が作製される。カエル(アフリカツメガエル(Xenopus))及びサカナ(ゼブラフィッシュ(zebrafish))では、背側芽細胞だけが、インスリン産生島細胞を作製する(Kelly, O.G. and Melton, D. A., Dev. Dyn. 218, 615-627,(2000)、Chen, Y., et al., Dev. Biol. 271(1), 144-160,(2004)、Field, H. A., et al., Dev. Biol. 263, 197- 208(2003))。同様に、ヒトでは腹側芽は主に、インスリンの排除のために、膵臓ポリペプチド発現島細胞を作製すると考えられる(Rahier J., et al., Cell Tissue Res. 200 (3), 359-366,(1979)、Malaisse-Langae F., et al., Diabetologia 17(6), 361-365,(1979)、Fiocca R., et al., Histochemistry 77(4), 511-523, (1983)、Stefan Y., et al., Diabetologica 23(2), 141-142, (1982))。これに対して、ウサギ及びマウスでは、腹側芽及び背側芽の両方がインスリン産生細胞を作製する(Spooner, B. S., et al., J. Cell Biology, 47, 235- 246,(1970)、Li, H., et al., Nature 23, 67-70,(1999))。
本明細書で表される数値域は記載された端点を含み、規定の数値域の端点間の全整数を記載することが理解される。
用語は、0ではない任意量の細胞培養物又は細胞集団を意味し、これは単一の細胞から細胞培養物又は細胞集団全体の範囲である。好ましい実施形態において、「部」という用語は、細胞培養物及び細胞集団の、少なくとも5%、少なくとも6%、少なくとも7%、少なくとも8%、少なくとも9%、少なくとも10%、少なくとも11%、少なくとも12%、少なくとも13%、少なくとも14%、少なくとも15%、少なくとも16%、少なくとも17%、少なくとも18%、少なくとも19%、少なくとも20%、少なくとも21%、少なくとも22%、少なくとも23%、少なくとも24%、少なくとも25%、少なくとも26%、少なくとも27%、少なくとも28%、少なくとも29%、少なくとも30%、少なくとも31%、少なくとも32%、少なくとも33%、少なくとも34%、少なくとも35%、少なくとも36%、少なくとも37%、少なくとも38%、少なくとも39%、少なくとも40%、少なくとも41%、少なくとも42%、少なくとも43%、少なくとも44%、少なくとも45%、少なくとも46%、少なくとも47%、少なくとも48%、少なくとも49%、少なくとも50%、少なくとも51%、少なくとも52%、少なくとも53%、少なくとも54%、少なくとも55%、少なくとも56%、少なくとも57%、少なくとも58%、少なくとも59%、少なくとも60%、少なくとも61%、少なくとも62%、少なくとも63%、少なくとも64%、少なくとも65%、少なくとも66%、少なくとも67%、少なくとも68%、少なくとも69%、少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%又は少なくとも95%を意味する。
of)」という用語は、細胞培養物又は細胞集団が含まない特定の細胞型の存在量が、細胞培養物又は細胞集団中に存在する全細胞数の、約10%未満、約9%未満、約8%未満、約7%未満、約6%未満、約5%未満、約4%未満、約3%未満、約2%未満、又は約1%未満であることを意味する。
ルビン、ジェルビン類似体、ヘッジホッグ経路遮断抗体及び当業者に既知のヘッジホッグ経路機能の任意の他の阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。
トドメイン、ファミリー成員1(HNF6);HLXB9 − ホメオボックスB9(HB9);TCF2 − 転写因子2、肝臓(HNF1b);FOXA1 − フォークヘッドボックスA1;HGF − 肝細胞増殖因子;IGF1 − インスリン様増殖因子1;POU5F1 − POUドメイン、5群、転写因子1(OCT4);NANOG − Nanogホメオボックス;SOX2 − SRY(性決定領域Y)−ボックス2;CDH1 − カドヘリン1、1型、E−カドヘリン(ECAD);T − ブラキュリホモログ(BRACH);FGF4 − 線維芽細胞増殖因子4;WNT3 − ウイングレス型MMTV組込部位ファミリー、成員3;SOX17 − SRY(性決定領域Y)−ボックス17;GSC − グースコイド;CER1 − (ケルベロス1、システインノットスーパーファミリー、ホモログ(CER);CXCR4 − ケモカイン(C−X−Cモチーフ)受容体4;FGF17 − 線維芽細胞増殖因子17;FOXA2 − フォークヘッドボックスA2;SOX7 − SRY(性決定領域Y)−ボックス7;SOX1 − SRY(性決定領域Y)−ボックス1;AFP − α−フェトプロテイン;SPARC − 分泌タンパク質、酸性、システインリッチ(オステオネクチン);及びTHBD − トロンボモジュリン(TM)、NCAM − 神経細胞接着分子;SYP − シナプトフィジン;ZIC1 − Zicファミリー成員1;NEF3 −
神経フィラメント3(NFM);SST − ソマトスタチン;MAFA − v−maf筋腱膜繊維肉腫癌遺伝子ホモログA;MAFB − v−maf筋腱膜繊維肉腫癌遺伝子ホモログB;SYP − シナプトフィジン;CHGA − クロモグラニンA(副甲状腺分泌タンパク質1)。
ニコチンアミド及びDAPT − N−[N−(3,5−ジフルオロフェナセチル)−L−アラニル]−S−フェニルグリシンt−ブチルエステル;RA − レチノイン酸;RPMI − ロズウェルパーク記念研究所(Roswell Park Memorial Institute)培地;CMRL − コノート医学研究所(Connaught Medical Research Labs)培地;FBS − ウシ胎児血清;NBP10 − NCAM結合タンパク質10;PTF1a −
膵臓特異的転写因子1a。
胚体内胚葉細胞、最終的には、内分泌前駆細胞及び/又は膵島ホルモン発現細胞を誘導させる好ましい方法は、ヒト胚性幹細胞を出発材料として利用する。このような多能性細胞は、桑実胚に由来する細胞、胚の内部細胞塊又は胚の生殖隆起から得られる細胞であり得る。ヒト胚性幹細胞は、当該技術分野において既知の方法を使用して、実質的な分化なしに多能性状態で培養物中で維持され得る。このような方法は、例えば、米国特許第5,453,357号、同第5,670,372号、同第5,690,926号、同第5,843,780号、同第6,200,806号及び同第6,251,671号(これらの開示内容全体が、参照により本明細書中に援用される)に記載されている。
幾つかのプロセスにおいて、胚体内胚葉への分化は、胚体内胚葉への分化を促進するのに十分な量で、TGFβスーパーファミリーの増殖因子を幹細胞培養物に供給することによって達成される。胚体内胚葉の産生に有用であるTGFβスーパーファミリーの増殖因子は、ノーダル/アクチビン又はBMPサブグループから選択される。幾つかの好ましい分化プロセスにおいて、増殖因子は、ノーダル、アクチビンA、アクチビンB及びBMP4から成る群から選択される。また、増殖因子Wnt3a及び他のWntファミリー成員は、胚体内胚葉細胞の産生に有用である。或る特定の分化プロセスでは、上述の増殖因子のいずれかの組合せが使用され得る。
ng/mlより高い濃度で細胞培養物中に存在する。
本明細書に記載されたプロセスの幾つかの実施形態において、胚体内胚葉細胞は、さらなる分離の前に濃縮、単離及び/又は精製される。このような実施形態において、胚体内胚葉細胞は、任意の既知の方法を用いて濃縮、単離及び/又は精製することができる。好ましい実施形態において、胚体内胚葉細胞は、米国特許出願第11/021,618号(表題「胚体内胚葉(DEFINITIVE ENDODERM)」、2004年12月23日提出)及び米国特許仮出願第60/736,598号(表題「胚体内胚葉のマーカー(MARKERS OF DEFINITIVE ENDODERM)」、2005年11月14日提出)(それらの開示内容全体が参照により本明細書に援用される)で記載された1つ又は複数の方法を用いて濃縮、単離及び/又は精製される。
前記の方法によって産生された細胞組成物には、胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物、及び胚体内胚葉細胞が濃縮された細胞集団が含まれる。例えば、胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物及び/又は細胞集団を産生することができ、細胞培養物及び/又は細胞集団における細胞の少なくとも約50%〜99%が胚体内胚葉細胞である。分化プロセスの効率が、細胞増殖条件、増殖因子の濃度及び培養工程のタイミングを含む(が、これらに限定されない)或る特定のパラメータを変更することによって調節することができるので、本明細書に記載された分化手順によって、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約98%、約99%又は約99%超の多能性細胞が胚体内胚葉に変換され得る。胚体内胚葉細胞の単離が利用されるプロセスでは、例えばCXCR4受容体と結合する親和性試薬を用いることによって、実質的に純粋な胚体内胚葉細胞集団を回収することができる。細胞培養物又は細胞集団がヒトフィーダー細胞を含む実施形態において、細胞培養物又は細胞集団におけるヒトフィーダー細胞を考慮せずに、前記の割合が算出される。
胚体内胚葉細胞は、これらの細胞のさらなる分化によって膵臓分化へと特異化し、PDX1陽性前腸内胚葉細胞を産生し得る。本明細書に記載された幾つかの分化プロセスでは、胚体内胚葉細胞を含む、細胞培養物及び濃縮又は精製された細胞集団は、PDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む、細胞培養物及び/又は濃縮された細胞集団へのさらなる分化に用いることができる。
とも約1.4μM、少なくとも約1.5μM、少なくとも約1.6μM、少なくとも約1.7μM、少なくとも約1.8μM、少なくとも約1.9μM、少なくとも約2μM、少なくとも約2.1μM、少なくとも約2.2μM、少なくとも約2.3μM、少なくとも約2.4μM、少なくとも約2.5μM、少なくとも約2.6μM、少なくとも約2.7μM、少なくとも約2.8μM、少なくとも約2.9μM、少なくとも約3μM、少なくとも約3.5μM、少なくとも約4μM、少なくとも約4.5μM、少なくとも約5μM、少なくとも約10μM、少なくとも約20μM、少なくとも約30μM、少なくとも約40μM、又は少なくとも約50μMの濃度で存在するように、細胞培養物の細胞に供給される。
約日超で、胚体内胚葉細胞に供給される。好ましいプロセスにおいて、分化因子及び/又はCRML培地は、hESCからの分化の開始後約5日目に胚体内胚葉細胞に供給される。
許出願第11/115,868号(表題「PDX1発現内胚葉(PDX1 EXPRESSING ENDODERM)」、2005年4月26日提出)(その開示内容全体が参照により本明細書に援用される)で見出すことができる。
本明細書に記載されたプロセスの幾つかの実施形態において、PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、さらなる分離の前に濃縮、単離及び/又は精製される。このような実施形態において、PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、任意の既知の方法を用いて濃縮、単離及び/又は精製することができる。好ましい実施形態において、PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、米国特許出願第11/115,868号(表題「PDX1発現内胚葉(PDX1 EXPRESSING ENDODERM)」、2005年4月26日提出)及び米国特許仮出願第60/730,917号(表題「PDX1を発現する腹側及び背側の前腸内胚葉(PDX1-EXPRESSING DORSAL AND VENTRAL FOREGUT ENDODERM)」、2005年10月27日提出)(それらの開示内容全体が参照により本明細書に援用される)で記載された1つ又は複数の方法を用いて濃縮、単離及び/又は精製される。
前記の方法によって生成された細胞組成物には、PDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物、及びPDX1陽性前腸内胚葉細胞が濃縮された細胞集団が含まれる。例えば、PDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物及び/又は細胞集団を産生することができ、細胞培養物及び/又は細胞集団における細胞の少なくとも約50%〜99%がPDX1陽性前腸内胚葉細胞である。分化プロセスの効率が、細胞増殖条件、増殖因子の濃度及び培養工程のタイミングを含む(が、これらに限定されない)或る特定のパラメータを変更することによって調節することができるので、本明細書に記載された分化手順によって、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約98%、約99%又は約99%超の多能性細胞がPDX1陽性前腸内胚葉に変換され得る。PDX1陽性前腸内胚葉細胞の単離が利用されるプロセスでは、実質的に純粋なPDX1陽性前腸内胚葉細胞集団を回収することができる。細胞培養物又は細胞集団がヒトフィーダー細胞を含む実施形態において、細胞培養物又は細胞集団におけるヒトフィーダー細胞を考慮せずに、前記の割合が算出される。
本発明の幾つかの実施形態は、hESCから始まる内分泌前駆細胞の産生方法に関する。前記のように、内分泌前駆細胞は、初めにhESCを分化して、胚体内胚葉細胞を産生した後に、さらに胚体内胚葉細胞を分化して、PDX1陽性前腸内胚葉細胞を産生することによって産生することができる。このような実施形態において、PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、複能性の内分泌前駆細胞にさらに分化し、これはヒト膵島ホルモン発現細胞に分化することができる。
くとも約1.5μM、少なくとも約1.6μM、少なくとも約1.7μM、少なくとも約1.8μM、少なくとも約1.9μM、少なくとも約2μM、少なくとも約2.1μM、少なくとも約2.2μM、少なくとも約2.3μM、少なくとも約2.4μM、少なくとも約2.5μM、少なくとも約2.6μM、少なくとも約2.7μM、少なくとも約2.8μM、少なくとも約2.9μM、少なくとも約3μM、少なくとも約3.5μM、少なくとも約4μM、少なくとも約4.5μM、少なくとも約5μM、少なくとも約10μM、少なくとも約20μM、少なくとも約30μM、少なくとも約40μM、少なくとも約50μM、少なくとも約60μM、少なくとも約70μM、少なくとも約80μM、少なくとも約90μM、少なくとも約100μM、少なくとも約250μM、少なくとも約500μM、少なくとも約750μM、又は少なくとも約1000μMの濃度で細胞培養物又は細胞集団に存在する。
しいプロセスでは、2μMのRAの存在下でPDX1陽性前腸内胚葉細胞の細胞培養物又は細胞集団に3μMのDAPT及び40ng/mlのエキセンジン4を供給する。
PDX1陽性内胚葉細胞の内分泌前駆細胞への発達は、内分泌前駆細胞に特有のマーカーの発現を求めることによってモニタリングすることができる。幾つかのプロセスでは、或る特定のマーカーの発現は、マーカーの有無を検出することによって求められる。代替的に、或る特定のマーカーの発現は、細胞培養物又は細胞集団の細胞に存在するマーカーのレベルを測定することによって求めることができる。このようなプロセスでは、マーカー発現の測定は定性的であっても定量的であってもよい。マーカー遺伝子によって作製されるマーカーの発現を定量する1つの方法は、定量的PCR(Q−PCR)を利用するものである。Q−PCRを行う方法は当該技術分野で既知である。当該技術分野で既知の他の方法を用いても、マーカー遺伝子の発現を定量することができる。例えば、マーカー遺伝子産物の発現は、対象のマーカー遺伝子産物に特異的な抗体を用いることによって検出することができる。或る特定のプロセスでは、内分泌前駆細胞に特有のマーカー遺伝子の発現、並びにhESC、胚体内胚葉、PDX1陽性前腸内胚葉、胚体外内胚葉、中胚葉、外肺葉、未熟膵島ホルモン発現細胞又は成熟膵島ホルモン発現細胞及び/又は他の細胞型に特有のマーカー遺伝子の有意な発現の欠失が求められる。
のプロセスでは、未熟膵島ホルモン発現細胞及び/又は成熟膵島ホルモン発現細胞を示す遺伝子の発現もモニタリングされる。例えば、幾つかの実施形態において、MAFB、SYP、CHGA、INS、GCG、SST、GHRL、及びPAX6の発現がモニタリングされる。
本発明のさらなる態様に関して、内分泌前駆細胞は濃縮、単離及び/又は精製することができる。本発明の幾つかの実施形態において、内分泌前駆細胞に対して濃縮、単離及び/又は精製した細胞集団は、このような細胞を細胞培養物から単離することによって産生される。
できる。1つのプロセスでは、NCAMと結合する抗体は、電磁ビーズに付着した後、細胞間及び基質の接着を低減するように酵素的に処理された細胞培養物において内分泌前駆細胞と結合される。それから、細胞/抗体/ビースの複合体は、ビーズ結合内分泌前駆細胞を非結合細胞から単離するのに用いられる移動性の磁界(movable magnetic field)に曝される。内分泌前駆細胞が培養物中で他の細胞から物理的に単離されると、抗体結合が破壊され、細胞が適切な組織培養培地に再び平板培養される。必要に応じて、単離細胞組成物は、代替的な親和性に基づいた方法によって、又は内分泌前駆細胞に特異的な同一の若しくは異なるマーカーを用いたさらなる一連の濃縮によってさらに精製することができる。
別々に回収され、それによって内分泌前駆体が単離される。必要に応じて、単離細胞組成物は、内分泌前駆細胞に特異的な同一の若しくは異なるマーカーを用いたさらなる一連の選別によってさらに精製することができる。
本発明の幾つかの実施形態は、内分泌前駆細胞を含む、細胞培養物又は細胞集団等の細胞組成物に関し、この内分泌前駆細胞は、内分泌系の細胞、例えば膵島ホルモン発現細胞に分化することができる多能性細胞である。或る特定の実施形態によれば、内分泌前駆細胞は哺乳類細胞であり、好ましい実施形態において、このような細胞はヒト細胞である。
確に分化する細胞は、培養物中の全細胞の約90%未満、約85%未満、約80%未満、約75%未満、約70%未満、約65%未満、約60%未満、約55%未満、約50%未満、約45%未満、約40%未満、約35%未満、約30%未満、約25%未満、約20%未満、約15%未満、約12%未満、約10%未満、約8%未満、約6%未満、約5%未満、約4%未満、約3%未満、約2%未満、又は約1%未満である。
成物に関する。幾つかの実施形態において、本明細書中に記載されるプロセスは、内分泌前駆細胞を少なくとも約99%、少なくとも約98%、少なくとも約97%、少なくとも約96%、少なくとも約95%、少なくとも約94%、少なくとも約93%、少なくとも約92%、少なくとも約91%、少なくとも約90%、少なくとも約89%、少なくとも約88%、少なくとも約87%、少なくとも約86%、少なくとも約85%、少なくとも約84%、少なくとも約83%、少なくとも約82%、少なくとも約81%、少なくとも約80%、少なくとも約79%、少なくとも約78%、少なくとも約77%、少なくとも約76%、少なくとも約75%、少なくとも約74%、少なくとも約73%、少なくとも約72%、少なくとも約71%、少なくとも約70%、少なくとも約69%、少なくとも約68%、少なくとも約67%、少なくとも約66%、少なくとも約65%、少なくとも約64%、少なくとも約63%、少なくとも約62%、少なくとも約61%、少なくとも約60%、少なくとも約59%、少なくとも約58%、少なくとも約57%、少なくとも約56%、少なくとも約55%、少なくとも約54%、少なくとも約53%、少なくとも約52%、少なくとも約51%、又は少なくとも約50%含む細胞培養物及び/又は細胞集団を産生する。好ましい実施形態において、細胞培養物又は細胞集団の細胞はヒト細胞を含む。他の実施形態において、本明細書中に記載されるプロセスは、内分泌前駆細胞を少なくとも約50%、少なくとも約45%、少なくとも約40%、少なくとも約35%、少なくとも約30%、少なくとも約25%、少なくとも約24%、少なくとも約23%、少なくとも約22%、少なくとも約21%、少なくとも約20%、少なくとも約19%、少なくとも約18%、少なくとも約17%、少なくとも約16%、少なくとも約15%、少なくとも約14%、少なくとも約13%、少なくとも約12%、少なくとも約11%、少なくとも約10%、少なくとも約9%、少なくとも約8%、少なくとも約7%、少なくとも約6%、少なくとも約5%、少なくとも約4%、少なくとも約3%、少なくとも約2%、又は少なくとも約1%含む細胞培養物及び/又は細胞集団を産生する。好ましい実施形態において、細胞培養物又は細胞集団の細胞はヒト細胞を含む。幾つかの実施形態において、細胞培養物又は細胞集団中の内分泌前駆細胞の割合は、培養物中に残存するフィーダー細胞を考慮せずに算出される。
とも約50個の内分泌前駆細胞、約1個のPDX1陽性前腸内胚葉細胞毎に少なくとも約100個の内分泌前駆細胞、約1個のPDX1陽性前腸内胚葉細胞毎に少なくとも約1000個の内分泌前駆細胞、約1個のPDX1陽性前腸内胚葉細胞毎に少なくとも約10000個の内分泌前駆細胞、約1個のPDX1陽性前腸内胚葉細胞毎に少なくとも約100000個の内分泌前駆細胞、及び約1個のPDX1陽性前腸内胚葉細胞毎に少なくとも約1000000個の内分泌前駆細胞を含む組成物が考慮される。
される。或る特定の他の実施形態において、ヒト多能性細胞は、胚形成期後に発生した、多細胞構造を有する生殖腺組織又は胚組織から誘導される。
in vitroで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約5%で、in vitroで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約10%で、in vitroで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約15%で、in vitroで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約20%で、in vitroで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約25%で、in vitroで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約30%で、in vitroで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約35%で、in vitroで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約40%で、in vitroで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約45%で、in vitroで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約50%で、in vitroで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約55%で、in vitroで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約60%で、in vitroで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約65%で、in vitroで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約70%で、in vitroで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約75%で、in vitroで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約80%で、in vitroで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約85%で、in vitroで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約90%で、in vitroで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約95%で、又はin vitroで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約98%で、AFP、SOX7、SOX1、ZIC1、NFM、MAFA、SYP、CHGA、INS、GCG、SST、GHRL及び/又はPAX6マーカーの発現よりも大きい。
本明細書中に記載される或る特定のスクリーニング方法は、内分泌前駆細胞の分化を促
進することが可能な少なくとも1つの分化因子を同定する方法に関する。
増殖因子であり得るが、これらに限定されない。好ましいポリペプチドとしては、増殖因子が挙げられる。
ト、ニコチンアミド、DMSO、チアゾリジンジオン、及びTWS119から成る群から選択される1つ又は複数の増殖因子を含む。
ーカーの発現が第1の時点及び第2の時点の両方で求められる。幾つかの実施形態において、マーカー発現は、それぞれが第1の時点の後であり、それぞれが候補分化因子を細胞集団に供給した後である複数の時点で求められる。或る特定の実施形態において、マーカー発現はQ−PCRによって求められる。他の実施形態において、マーカー発現は免疫細胞化学法によって求められる。
、少なくとも約30倍、少なくとも約40倍、少なくとも約50倍、少なくとも約60倍、少なくとも約70倍、少なくとも約80倍、少なくとも約90倍、少なくとも約100倍、又は少なくとも約100倍超である。幾つかの実施形態において、減少量は2倍未満である。
本発明の実施形態は、hESCから始まる未熟膵島ホルモン発現細胞を産生する方法に関する。前記のように、未熟膵島ホルモン発現細胞は、最初にhESCを分化し胚体内胚葉細胞を産生して、胚体内胚葉細胞を分化し前腸内胚葉細胞を産生して、前腸内胚葉を分化しPDX1陽性前腸内胚葉細胞を産生した後に、PDX1陽性前腸内胚葉細胞をさらに分化し内分泌前駆細胞を産生することによって、産生することができる。幾つかの実施形態において、このプロセスは、内分泌前駆細胞を未熟膵島ホルモン発現細胞にさらに分化させることによって継続される。
、少なくとも約75mM、少なくとも約80mM、少なくとも約85mM、少なくとも約90mM、少なくとも約95mM、少なくとも約100mM、少なくとも約250mM、少なくとも約500mM、又は少なくとも約1000mMの濃度で細胞培養物又は細胞集団中に存在する。
20ng/ml、少なくとも約25ng/ml、少なくとも約30ng/ml、少なくとも約35ng/ml、少なくとも約40ng/ml、少なくとも約45ng/ml、少なくとも約50ng/ml、少なくとも約55ng/ml、少なくとも約60ng/ml、少なくとも約65ng/ml、少なくとも約70ng/ml、少なくとも約75ng/ml、少なくとも約80ng/ml、少なくとも約85ng/ml、少なくとも約90ng/ml、少なくとも約95ng/ml、少なくとも約100ng/ml、少なくとも約110ng/ml、少なくとも約120ng/ml、少なくとも約130ng/ml、少なくとも約140ng/ml、少なくとも約150ng/ml、少なくとも約160ng/ml、少なくとも約170ng/ml、少なくとも約180ng/ml、少なくとも約190ng/ml、少なくとも約200ng/ml、少なくとも約250ng/ml、少なくとも約300ng/ml、少なくとも約350ng/ml、少なくとも約400ng/ml、少なくとも約450ng/ml、少なくとも約500ng/ml、少なくとも約750ng/ml、又は少なくとも約1000ng/mlの濃度で細胞培養物又は細胞集団中に存在する。
内分泌前駆細胞の未熟膵島ホルモン発現細胞への発達は、遺伝子マーカー及び表現型マーカーを含む未熟膵島ホルモン発現細胞に特有のマーカーの発現、例えば膵島ホルモンの発現、並びにプロインスリンのインスリン及びCペプチドへの過程を求めることによってモニタリングすることができる。幾つかのプロセスでは、マーカーの有無を検出することによって或る特定のマーカーの発現が求められる。代替的には、或る特定のマーカーの発現は、細胞培養物又は細胞集団の細胞に存在するマーカーのレベルを測定することによって求めることができる。或る特定のプロセスでは、未熟膵島ホルモン発現細胞に特有のマーカーの発現、並びにhESC、胚体内胚葉、前腸内胚葉、PDX1陽性前腸内胚葉、内分泌前駆体、胚体外内胚葉、中胚葉、外肺葉、成熟膵島ホルモン発現細胞及び/又は他の細胞型に特有のマーカーの有意な発現の欠失が求められる。
。
倍、少なくとも約10倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約40倍、少なくとも約80倍、少なくとも約100倍、少なくとも約150倍、少なくとも約200倍、少なくとも約500倍、少なくとも約750倍、少なくとも約1000倍、少なくとも約2500倍、少なくとも約5000倍、少なくとも約7500倍、又は少なくとも約10000倍低い。幾つかの実施形態において、NGN3及び/又はPAX4マーカーは、未熟膵島ホルモン発現細胞又は細胞集団において実質的に発現しない。
少なくとも約250pmol/細胞DNA 1μg、C−ペプチド(インスリン) 少なくとも約300pmol/細胞DNA 1μg、C−ペプチド(インスリン) 少なくとも約350pmol/細胞DNA 1μg、C−ペプチド(インスリン) 少なくとも約400pmol/細胞DNA 1μg、C−ペプチド(インスリン) 少なくとも約450pmol/細胞DNA 1μg、C−ペプチド(インスリン) 少なくとも約500pmol/細胞DNA 1μg、C−ペプチド(インスリン) 少なくとも約550pmol/細胞DNA 1μg、C−ペプチド(インスリン) 少なくとも約600pmol/細胞DNA 1μg、C−ペプチド(インスリン) 少なくとも約650pmol/細胞DNA 1μg、C−ペプチド(インスリン) 少なくとも約700pmol/細胞DNA 1μg、C−ペプチド(インスリン) 少なくとも約750pmol/細胞DNA
1μg、C−ペプチド(インスリン) 少なくとも約800pmol/細胞DNA 1μg、C−ペプチド(インスリン) 少なくとも約850pmol/細胞DNA 1μg、C−ペプチド(インスリン) 少なくとも約900pmol/細胞DNA 1μg、C−ペプチド(インスリン) 少なくとも約950pmol/細胞DNA 1μg、又はC−ペプチド(インスリン) 少なくとも約1000pmol/細胞DNA 1μgを分泌する。好ましい実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞は、単一種の膵島細胞ホルモンを分泌する細胞(例えば、インスリンのみを分泌する細胞)である。或る特定の好ましい実施形態において、インスリンはグルコースに応答して分泌される。他の実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞は、1つ又は複数の膵島細胞ホルモン、例えば、ソマトスタチン、グルカゴン及び/又はグレリンに加えて、インスリンを分泌する細胞である
。
A 1μgを分泌する。好ましい実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞は、単一種の膵島細胞ホルモンを分泌する細胞(例えば、ソマトスタチンのみを分泌する細胞)である。他の実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞は、1つ又は複数の膵島細胞ホルモン、例えば、グレリン、グルカゴン及びインスリンに加えて、ソマトスタチンを分泌する細胞である。
少なくとも約250pmol/細胞DNA 1μg、グレリン 少なくとも約300pmol/細胞DNA 1μg、グレリン 少なくとも約350pmol/細胞DNA 1μg、グレリン 少なくとも約400pmol/細胞DNA 1μg、グレリン 少なくとも約450pmol/細胞DNA 1μg、グレリン 少なくとも約500pmol/細胞DNA 1μg、グレリン 少なくとも約550pmol/細胞DNA 1μg、グレリン 少なくとも約600pmol/細胞DNA 1μg、グレリン 少なくとも約650pmol/細胞DNA 1μg、グレリン 少なくとも約700pmol/細胞DNA 1μg、グレリン 少なくとも約750pmol/細胞DNA 1μg、グレリン 少なくとも約800pmol/細胞DNA 1μg、グレリン 少なくとも約850pmol/細胞DNA 1μg、グレリン 少なくとも約900pmol/細胞DNA 1μg、グレリン 少なくとも約950pmol/細胞DNA 1μg、又はグレリン 少なくとも約1000pmol/細胞DNA 1μgを分泌する。好ましい実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞は、単一種の膵島細胞ホルモンを分泌する細胞(例えば、グレリンのみを分泌する細胞)である。他の実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞は、1つ又は複数の膵島細胞ホルモンに加えて、グレリンを分泌する細胞である。
任意の前記プロセスによって産生される未熟膵島ホルモン発現細胞は、内分泌前駆細胞の濃縮、単離及び/又は精製に関連して記載される方法を用いて、このような細胞に特異的である親和性タグを用いることによって、濃縮、単離及び/又は精製することができる。未熟膵島ホルモン発現細胞に特異的な親和性タグの例は、抗体、リガンド、又は未熟膵島ホルモン発現細胞の細胞表面上に存在するが、本明細書に記載される方法によって産生される細胞培養物で見出される他の細胞型には実質的に存在しないマーカー分子、例えばポリペプチドに特異的である他の結合剤である。未熟膵島ホルモン発現細胞の濃縮、単離及び/又は精製のための親和性タグの好ましい例は、NCAMに対する抗体である。抗NCAM抗体は、例えばAbcam(Cambridge, MA)で市販されている。未熟膵島ホルモン発現細胞の濃縮、単離及び/又は精製のための親和性タグの別の例は、シナプトフィジン(SYP)に対する抗体である。抗シナプトフィジン抗体は、Dako(Glostrup, Denmark)で市販されている。他のプロセスでは、NCAMリガンドNBP10又は現在知られているか、又は将来発見される任意の他のNCAMリガンドも、親和性タグと結合させるのに用いることができる(Ronn, L., 2002)。このような分子としては、NBP10融合物及びNBP10模倣物が挙げられるが、これらに限定されない。
液を解析及び選別する。抗体結合蛍光細胞を非結合非蛍光細胞とは別に回収し、それによってこのような細胞型が単離される。
未熟膵島ホルモン発現細胞は、未処理又はあまり明確に分化しない細胞集団又は細胞培養物に比べて少なくとも約5倍〜約500倍まで濃縮することができる。他の実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞は、未処理又はあまり明確に分化しない細胞集団又は細胞培養物に比べて少なくとも約10倍〜約200倍まで濃縮することができる。さらに別の実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞は、未処理又はあまり明確に分化しない細胞集団又は細胞培養物に比べて少なくとも約20倍〜約100倍まで濃縮することができる。さらに別の実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞は、未処理又はあまり明確に分化しない細胞集団又は細胞培養物に比べて少なくとも約40倍〜約80倍まで濃縮することができる。或る特定の実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞は、未処理又はあまり明確に分化しない細胞集団又は細胞培養物に比べて少なくとも約2倍〜約20倍まで濃縮することができる。
本発明の幾つかの実施形態は、未熟膵島ホルモン発現細胞を含む、細胞培養物又は細胞集団等の細胞組成物に関し、この未熟膵島ホルモン発現細胞は、in vitroでヒト多能性細胞から誘導され、1つ又は複数の膵臓ホルモンを発現し、ヒト膵島細胞の少なくとも幾つかの機能を有する細胞である。或る特定の実施形態によれば、未熟膵島ホルモン発現細胞は哺乳動物細胞であり、好ましい実施形態において、このような細胞はヒト細胞である。
未満、約3%未満、約2%未満、又は約1%未満である。或る特定の実施形態において、PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、培養物中の全細胞の約90%未満、約85%未満、約80%未満、約75%未満、約70%未満、約65%未満、約60%未満、約55%未満、約50%未満、約45%未満、約40%未満、約35%未満、約30%未満、約25%未満、約20%未満、約15%未満、約12%未満、約10%未満、約8%未満、約6%未満、約5%未満、約4%未満、約3%未満、約2%未満、又は約1%未満である。他の実施形態において、内分泌前駆細胞は、培養物中の全細胞の約90%未満、約85%未満、約80%未満、約75%未満、約70%未満、約65%未満、約60%未満、約55%未満、約50%未満、約45%未満、約40%未満、約35%未満、約30%未満、約25%未満、約20%未満、約15%未満、約12%未満、約10%未満、約8%未満、約6%未満、約5%未満、約4%未満、約3%未満、約2%未満、又は約1%未満である。さらに他の実施形態において、中胚葉細胞は、培養物中の全細胞の約90%未満、約85%未満、約80%未満、約75%未満、約70%未満、約65%未満、約60%未満、約55%未満、約50%未満、約45%未満、約40%未満、約35%未満、約30%未満、約25%未満、約20%未満、約15%未満、約12%未満、約10%未満、約8%未満、約6%未満、約5%未満、約4%未満、約3%未満、約2%未満、又は約1%未満である。
物を含む、細胞培養物又は細胞集団等の組成物に関する。例えば、約95個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約5個の未熟膵島ホルモン発現細胞を含む細胞培養物又は細胞集団を産生することができる。他の実施形態において、約5個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約95個の未熟膵島ホルモン発現細胞を含む細胞培養物又は細胞集団を産生することができる。さらに、未熟膵島ホルモン発現細胞と内分泌前駆細胞とを他の比率で含む細胞培養物又は細胞集団が考慮される。例えば、約1000000個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約1個の未熟膵島ホルモン発現細胞、約100000個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約1個の未熟膵島ホルモン発現細胞、約10000個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約1個の未熟膵島ホルモン発現細胞、約1000個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約1個の未熟膵島ホルモン発現細胞、約500個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約1個の未熟膵島ホルモン発現細胞、約100個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約1個の未熟膵島ホルモン発現細胞、約10個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約1個の未熟膵島ホルモン発現細胞、約5個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約1個の未熟膵島ホルモン発現細胞、約4個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約1個の未熟膵島ホルモン発現細胞、約2個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約1個の未熟膵島ホルモン発現細胞、約1個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約1個の未熟膵島ホルモン発現細胞、約1個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約2個の未熟膵島ホルモン発現細胞、約1個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約4個の未熟膵島ホルモン発現細胞、約1個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約5個の未熟膵島ホルモン発現細胞、約1個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約10個の未熟膵島ホルモン発現細胞、約1個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約20個の未熟膵島ホルモン発現細胞、約1個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約50個の未熟膵島ホルモン発現細胞、約1個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約100個の未熟膵島ホルモン発現細胞、約1個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約1000個の未熟膵島ホルモン発現細胞、約1個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約10000個の未熟膵島ホルモン発現細胞、約1個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約100000個の未熟膵島ホルモン発現細胞、及び約1個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約1000000個の未熟膵島ホルモン発現細胞を含む組成物が考慮される。
くとも約95%で、又はヒト細胞の少なくとも約98%で、NGN3、MAFA、MOX1、CER、POU5F1、AFP、SOX7、SOX1、ZIC1及び/又はNFMマーカーの発現よりも大きい。幾つかの実施形態において、MAFB、SYP、CHGA、NKX2.2、ISL1、PAX6、NEUROD、PDX1、HB9、GHRL、IAPP、INS、GCG、SST、PP及び/又はC−ペプチドマーカーの発現が、NGN3、MAFA、MOX1、CER、POU5F1、AFP、SOX7、SOX1、ZIC1及び/又はNFMマーカーの発現よりも大きい、細胞培養物又は細胞集団中のヒト細胞の割合は、フィーダー細胞を考慮せずに算出される。
vitroで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約80%で、in vitroで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約85%で、in vitroで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約90%で、in vitroで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約95%で、又はin vitroで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約98%で、NGN3、MAFA、MOX1、CER、POU5F1、AFP、SOX7、SOX1、ZIC1及び/又はNFMマーカーの発現よりも大きい。
少なくとも約350pmol/細胞DNA 1μg、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはC−ペプチド 少なくとも約400pmol/細胞DNA 1μg、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはC−ペプチド 少なくとも約450pmol/細胞DNA 1μg、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはC−ペプチド 少なくとも約500pmol/細胞DNA 1μg、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはC−ペプチド 少なくとも約550pmol/細胞DNA 1μg、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはC−ペプチド 少なくとも約600pmol/細胞DNA 1μg、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはC−ペプチド 650pmol/細胞DNA 1μg、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはC−ペプチド 少なくとも約700pmol/細胞DNA 1μg、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはC−ペプチド 少なくとも約750pmol/細胞DNA 1μg、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはC−ペプチド 少なくとも約800pmol/細胞DNA 1μg、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはC−ペプチド 少なくとも約850pmol/細胞DNA 1μg、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはC−ペプチド 少なくとも約900pmol/細胞DNA 1μg、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはC−ペプチド 少なくとも約950pmol/細胞DNA 1μg、又はグレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはC−ペプチド 少なくとも約1000pmol/細胞DNA 1μgである。
る。さらにより好ましい実施形態において、膵島インスリン発現細胞はグルコースに応答性がある。他の実施形態において、in vitroで分化したヒト膵島インスリン発現細胞は、in vivoでヒト膵臓の膵臓β細胞によって分泌されるインスリン量と同程度又はそれを超える量のインスリンを分泌する。
本発明の実施形態は、hESCから始まる成熟膵島ホルモン発現細胞を産生する方法に関する。前記のように、膵島ホルモン発現細胞は、最初にhESCを分化し胚体内胚葉細胞を産生して、胚体内胚葉細胞を分化しPDX1陽性前腸内胚葉細胞を産生して、PDX1陽性前腸内胚葉細胞を分化し内分泌前駆細胞を産生した後、さらに内分泌前駆細胞を分化し未熟膵島ホルモン発現細胞を産生することによって産生することができる。幾つかの実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞をさらに成熟膵島ホルモン発現細胞に分化させることによって、このプロセスを終わらせる。
細胞への分化とほぼ同時に、1つ又は複数の前記の因子が細胞培養物に供給され、少なくとも大部分の細胞が成熟膵島ホルモン発現細胞に分化するまで、細胞培養物に存在したままである。本発明の幾つかの実施形態において、1つ又は複数の前記の因子が、分化プロセスの開始時に、例えばhESC段階で供給され、成熟膵島ホルモン発現細胞への分化の間、細胞培養物に維持される。
とも約45ng/ml、少なくとも約50ng/ml、少なくとも約55ng/ml、少なくとも約60ng/ml、少なくとも約65ng/ml、少なくとも約70ng/ml、少なくとも約75ng/ml、少なくとも約80ng/ml、少なくとも約85ng/ml、少なくとも約90ng/ml、少なくとも約95ng/ml、少なくとも約100ng/ml、少なくとも約110ng/ml、少なくとも約120ng/ml、少なくとも約130ng/ml、少なくとも約140ng/ml、少なくとも約150ng/ml、少なくとも約160ng/ml、少なくとも約170ng/ml、少なくとも約180ng/ml、少なくとも約190ng/ml、少なくとも約200ng/ml、少なくとも約250ng/ml、少なくとも約300ng/ml、少なくとも約350ng/ml、少なくとも約400ng/ml、少なくとも約450ng/ml、少なくとも約500ng/ml、少なくとも約750ng/ml、又は少なくとも約1000ng/mlの濃度で細胞培養物又は細胞集団中に存在する。
内分泌前駆細胞及び未熟膵島ホルモン発現細胞の成熟膵島ホルモン発現細胞への発達は、膵島ホルモン発現細胞に特有のマーカーの発現を求めることによってモニタリングすることができる。幾つかのプロセスでは、マーカーの有無を検出することによって或る特定のマーカーの発現が求められる。代替的には、或る特定のマーカーの発現は、細胞培養物又は細胞集団の細胞に存在するマーカーのレベルを測定することによって求めることができる。或る特定のプロセスでは、成熟膵島ホルモン発現細胞に特有のマーカーの発現、並びにhESC、胚体内胚葉、PDX1陽性前腸内胚葉、内分泌前駆細胞、未熟膵島ホルモン発現細胞、胚体外内胚葉、中胚葉、外肺葉及び/又は他の細胞型に特有のマーカーの有
意な発現の欠失が求められる。
00倍、少なくとも約500倍、少なくとも約750倍、少なくとも約1000倍、少なくとも約2500倍、少なくとも約5000倍、少なくとも約7500倍、又は少なくとも約10000倍高い。幾つかの実施形態において、成熟膵島ホルモン発現細胞又は細胞集団におけるGHRL、IAPP、INS、GCG、NKX6.1、SST、PP、SYP、GCK、CHGA及び/又はC−ペプチドマーカーの発現は、非膵島ホルモン発現細胞又は細胞集団、例えば多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、PDX1陽性前腸内胚葉細胞、内分泌前駆細胞、胚体外内胚葉細胞、中胚葉細胞及び/又は外肺葉細胞におけるGHRL、IAPP、INS、GCG、NKX6.1、SST、PP、SYP、GCK、CHGA及び/又はC−ペプチドマーカーの発現よりもはるかに高い。
、ソマトスタチン放出及び/又はグレリン放出の量をモニタリングすることができる。好ましい実施形態において、グルコース応答性インスリン分泌(GSIS)の量が測定される。さらに別の実施形態において、分泌の途絶又は成熟膵島ホルモン発現細胞によって産生される副産物、例えばC−ペプチド及び膵島アミロイドタンパク質がモニタリングされ得る。
少なくとも約250pmol/細胞DNA 1μg、グレリン 少なくとも約300p
mol/細胞DNA 1μg、グレリン 少なくとも約350pmol/細胞DNA 1μg、グレリン 少なくとも約400pmol/細胞DNA 1μg、グレリン 少なくとも約450pmol/細胞DNA 1μg、グレリン 少なくとも約500pmol/細胞DNA 1μg、グレリン 少なくとも約550pmol/細胞DNA 1μg、グレリン 少なくとも約600pmol/細胞DNA 1μg、グレリン 少なくとも約650pmol/細胞DNA 1μg、グレリン 少なくとも約700pmol/細胞DNA 1μg、グレリン 少なくとも約750pmol/細胞DNA 1μg、グレリン 少なくとも約800pmol/細胞DNA 1μg、グレリン 少なくとも約850pmol/細胞DNA 1μg、グレリン 少なくとも約900pmol/細胞DNA 1μg、グレリン 少なくとも約950pmol/細胞DNA 1μg、又はグレリン 少なくとも約1000pmol/細胞DNA 1μgを分泌する。好ましい実施形態において、成熟膵島ホルモン発現細胞は、単一種の膵島細胞ホルモンを分泌する細胞(例えば、グレリンのみを分泌する細胞)である。他の実施形態において、成熟膵島ホルモン発現細胞は、1つ又は複数の膵島細胞ホルモンに加えて、グレリンを分泌する細胞である。
任意の前記プロセスによって産生される成熟膵島ホルモン発現細胞は、このような細胞に特異的である親和性タグを用いることによって、濃縮、単離及び/又は精製することができる。成熟膵島ホルモン発現細胞に特異的な親和性タグの例は、抗体、リガンド、又は成熟膵島ホルモン発現細胞の細胞表面上に存在するが、本明細書に記載される方法によって産生される細胞培養物で見出される他の細胞型には実質的に存在しないマーカー分子、例えばポリペプチドに特異的である他の結合剤である。幾つかのプロセスでは、ヒト膵島細胞上で細胞表面の抗原と結合する抗体は、in vitro方法、例えば本明細書で記載される方法によって産生される成熟膵島ホルモン発現細胞の濃縮、単離又は精製のための親和性タグとして用いられる。このような抗体は既知であり、市販されている。例えば、ヒト膵島細胞で細胞表面マーカーに非常に特異的であるモノクローナル抗体は、USBiological(Swampscott, MA)(カタログ番号P2999−40)で市販されている。他の例には、Srikanta, et al.,(1987)Endocrinology, 120:2240-2244(その開示内容全体が参照により本明細書に援用される)で記載されている、膵島細胞の表面上に位置する糖タンパク質に対して非常に特異的なモノクローナル抗体が含まれる。成熟膵島ホルモン発現細胞、例えばin vitroでヒト多能性細胞から誘導されるものに対する親和性タグの好ましい例はNCAMである。NCAMに対する抗体は、例えばAbcam(Cambridge, MA)で市販されている。
成熟膵臓ホルモン発現細胞を含む細胞集団由来のNCAM陰性細胞からNCAM陽性成熟膵臓ホルモン発現細胞を単離する。NCAM陽性である細胞を単離するのに再びFACSを用いて、NCAM陽性細胞を選別することによって、この細胞型に特有のマーカー(NKX6.1、MAFA、ISL1又はPAX6を含む)を発現する成熟膵臓ホルモン発現細胞に対して細胞集団を濃縮させる。他の実施形態において、FACS選別を用いて、成熟膵島ホルモン発現細胞以外の細胞集団におけるほとんどの細胞に存在するマーカーに関して陰性選別することによって細胞を分離する。このような陰性選別の例は、1回目の濃縮の後では、NCAM陽性細胞集団における成熟膵島ホルモン発現細胞の表面上で実質的に発現しないが、この細胞集団における多くの他のNCAM陽性細胞では発現するマーカーであるCD133の使用である。
、単離及び/又は精製された集団を、in vitroで、少なくとも幾つかの成熟膵島ホルモン発現細胞を産生するのに十分な分化を受けた、多能性細胞培養物又は細胞集団、例えば幹細胞培養物又は集団から産生することができる。好ましい方法では、主に細胞は成熟膵島ホルモン発現細胞に分化することに向けられる。幾つかの好ましい濃縮、単離及び/又は精製の方法は、ヒト胚性幹細胞からの成熟膵島ホルモン発現細胞のin vitro産生に関する。
本発明の幾つかの実施形態は、成熟膵島ホルモン発現細胞を含む、細胞培養物又は細胞集団等の細胞組成物に関し、この成熟膵島ホルモン発現細胞は、in vitroでヒト多能性細胞から誘導され、1つ又は複数の膵臓ホルモンを発現し、ヒト膵島細胞の少なくとも幾つかの機能を有する細胞である。或る特定の実施形態によれば、膵島ホルモン発現細胞は哺乳動物細胞であり、好ましい実施形態において、このような細胞はヒト細胞である。
は約1%未満である。さらに他の実施形態において、胚体内胚葉細胞は、培養物中の全細胞の約90%未満、約85%未満、約80%未満、約75%未満、約70%未満、約65%未満、約60%未満、約55%未満、約50%未満、約45%未満、約40%未満、約35%未満、約30%未満、約25%未満、約20%未満、約15%未満、約12%未満、約10%未満、約8%未満、約6%未満、約5%未満、約4%未満、約3%未満、約2%未満、又は約1%未満である。さらに他の実施形態において、PDX1陰性前腸内胚葉細胞は、培養物中の全細胞の約90%未満、約85%未満、約80%未満、約75%未満、約70%未満、約65%未満、約60%未満、約55%未満、約50%未満、約45%未満、約40%未満、約35%未満、約30%未満、約25%未満、約20%未満、約15%未満、約12%未満、約10%未満、約8%未満、約6%未満、約5%未満、約4%未満、約3%未満、約2%未満、又は約1%未満である。或る特定の実施形態において、PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、培養物中の全細胞の約90%未満、約85%未満、約80%未満、約75%未満、約70%未満、約65%未満、約60%未満、約55%未満、約50%未満、約45%未満、約40%未満、約35%未満、約30%未満、約25%未満、約20%未満、約15%未満、約12%未満、約10%未満、約8%未満、約6%未満、約5%未満、約4%未満、約3%未満、約2%未満、又は約1%未満である。他の実施形態において、内分泌前駆細胞は、培養物中の全細胞の約90%未満、約85%未満、約80%未満、約75%未満、約70%未満、約65%未満、約60%未満、約55%未満、約50%未満、約45%未満、約40%未満、約35%未満、約30%未満、約25%未満、約20%未満、約15%未満、約12%未満、約10%未満、約8%未満、約6%未満、約5%未満、約4%未満、約3%未満、約2%未満、又は約1%未満である。さらに他の実施形態において、中胚葉細胞は、培養物中の全細胞の約90%未満、約85%未満、約80%未満、約75%未満、約70%未満、約65%未満、約60%未満、約55%未満、約50%未満、約45%未満、約40%未満、約35%未満、約30%未満、約25%未満、約20%未満、約15%未満、約12%未満、約10%未満、約8%未満、約6%未満、約5%未満、約4%未満、約3%未満、約2%未満、又は約1%未満である。
なくとも約56%、少なくとも約55%、少なくとも約54%、少なくとも約53%、少なくとも約52%、少なくとも約51%、又は少なくとも約50%含む細胞培養物及び/又は細胞集団を産生する。好ましい実施形態において、細胞培養物又は細胞集団の細胞はヒト細胞を含む。他の実施形態において、本明細書中に記載されるプロセスは、成熟膵島ホルモン発現細胞を少なくとも約50%、少なくとも約45%、少なくとも約40%、少なくとも約35%、少なくとも約30%、少なくとも約25%、少なくとも約24%、少なくとも約23%、少なくとも約22%、少なくとも約21%、少なくとも約20%、少なくとも約19%、少なくとも約18%、少なくとも約17%、少なくとも約16%、少なくとも約15%、少なくとも約14%、少なくとも約13%、少なくとも約12%、少なくとも約11%、少なくとも約10%、少なくとも約9%、少なくとも約8%、少なくとも約7%、少なくとも約6%、少なくとも約5%、少なくとも約4%、少なくとも約3%、少なくとも約2%、又は少なくとも約1%含む細胞培養物及び/又は細胞集団を産生する。好ましい実施形態において、細胞培養物又は細胞集団の細胞はヒト細胞を含む。幾つかの実施形態において、細胞培養物又は細胞集団中の成熟膵島ホルモン発現細胞の割合は、培養物中に残存するフィーダー細胞を考慮せずに算出される。
島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約10000個の成熟膵島ホルモン発現細胞、1個の内分泌前駆細胞及び/又は未熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約100000個の成熟膵島ホルモン発現細胞、並びに約1個の内分泌前駆細胞及び/又は未熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約1000000個の成熟膵島ホルモン発現細胞を含む組成物が考慮される。
葉から分化した細胞の少なくとも約50%で、in vitroで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約55%で、in vitroで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約60%で、in vitroで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約65%で、in vitroで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約70%で、in vitroで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約75%で、in vitroで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約80%で、in vitroで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約85%で、in vitroで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約90%で、in vitroで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約95%で、又はin vitroで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約98%で、AFP、SOX7、SOX1、ZIC1、NFM、NGN3及び/又はPAX4マーカーの発現よりも大きい。
少なくとも約350pmol/細胞DNA 1μg、グレリン、インスリン、ソマトス
タチン、グルカゴン若しくはC−ペプチド 少なくとも約400pmol/細胞DNA 1μg、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはC−ペプチド 少なくとも約450pmol/細胞DNA 1μg、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはC−ペプチド 少なくとも約500pmol/細胞DNA 1μg、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはC−ペプチド 少なくとも約550pmol/細胞DNA 1μg、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはC−ペプチド 少なくとも約600pmol/細胞DNA 1μg、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはC−ペプチド 少なくとも約650pmol/細胞DNA 1μg、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはC−ペプチド 少なくとも約700pmol/細胞DNA 1μg、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはC−ペプチド 少なくとも約750pmol/細胞DNA 1μg、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはC−ペプチド 少なくとも約800pmol/細胞DNA 1μg、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはC−ペプチド 少なくとも約850pmol/細胞DNA 1μg、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはC−ペプチド 少なくとも約900pmol/細胞DNA 1μg、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはC−ペプチド 少なくとも約950pmol/細胞DNA 1μg、又はグレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはC−ペプチド 少なくとも約1000pmol/細胞DNA 1μgである。
本明細書に記載される或る特定のスクリーニング方法は、未熟及び/又は成熟膵島ホルモン発現細胞(共に膵島ホルモン発現細胞と称される)の少なくとも1つの膵臓機能に影響を与えることができる少なくとも1つの化合物を同定する方法に関する。
は供給するのとほぼ同時である第1の時点で、所望の膵臓機能の活性が求められる。代替的に、候補化合物を供給した後に、所望の膵臓機能の活性を求めることができる。第1の時点の後であり、候補化合物を細胞集団に供給する工程の後である第2の時点で再び、所望の膵臓機能の活性が求められる。候補化合物が膵島ホルモン発現細胞の少なくとも1つの膵臓機能に影響を与えることができるか否かは、第1の時点での所望の膵臓機能の活性を第2の時点での所望の膵臓機能の活性と比較することによって求められる。第2の時点での所望の膵臓機能の活性が第1の時点での所望の膵臓機能の活性に比べて増減する場合、候補化合物は膵島ホルモン発現細胞の膵臓機能の活性に影響を与えることができる。
或る特定の実施形態において、所望の膵臓機能の活性はQ−PCRによって求められる。他の実施形態において、所望の膵臓機能の活性は免疫細胞化学法によって求められる。
表1は、hESC培養物から少なくとも幾つかの膵島ホルモン発現細胞を産生するのに用いることができる因子の8つの例示的な組合せを示す。特に、分化プロセスで用いられ
るそれぞれの因子の濃度、分化プロセス中のそれぞれの因子の添加及び/又は除去のタイミング、分化プロセス中の分化培地、例えば血清中の成分濃度は、胚体細胞系統を経て、最終的に膵島ホルモン発現細胞に分化するhESCの集団に有意に影響を与えることが理解される。
本発明の幾つかの態様は、1つ又は複数の試薬と結合した1つ又は複数の内分泌前駆細胞又は未熟膵島ホルモン発現細胞の複合体(試薬−細胞複合体)を含む、細胞培養物及び/又は細胞集団等の組成物に関する。例えば、試薬−細胞複合体を含む、細胞培養物及び/又は細胞集団であって、培養物中の内分泌前駆細胞の少なくとも約5%〜少なくとも約100%が試薬−細胞複合体の形態である、細胞培養物及び/又は細胞集団が産生され得る。他の実施形態において、試薬−細胞複合体を少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、又は少なくとも約100%含む細胞培養物及び/又は細胞集団が産生され得る。幾つかの実施形態において、試薬−細胞複合体は、NCAMと結合する1つ又は複数の抗体と結合した1つ又は複数の内分泌前駆細胞を含む。さらに他の実施形態において、試薬−細胞複合体は、NBP10等の、NCAMと結合する1つ又は複数のリガンドと結合した1つ又は複数の内分泌前駆細胞を含む。
複合体の両方を含む、細胞培養物及び/又は細胞集団等の組成物に関する。幾つかの実施形態において、この組成物には、多能性細胞、例えば胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞、PDX1陽性膵臓内胚葉細胞も含まれる。例えば、本明細書に記載される方法を用いて、hESC及び/又は胚体内胚葉細胞と、内分泌前駆細胞の試薬−細胞複合体との混合物を含む組成物を産生することができる。さらに、本明細書に記載される方法を用いて、hESC、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び/又はPDX1陽性膵臓内胚葉細胞と、内分泌前駆細胞の試薬−細胞複合体及び/又は未熟膵島ホルモン発現細胞の試薬−細胞複合体との混合物を含む組成物を産生することができる。幾つかの実施形態において、約95個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び/又はPDX1陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約5個の試薬−細胞複合体を含む組成物が提供される。他の実施形態において、約5個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び/又はPDX1陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約95個の試薬−細胞複合体を含む組成物が提供される。さらに、試薬−細胞複合体細胞と多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び/又はPDX1陽性膵臓内胚葉細胞とを他の比率で含む組成物が考慮される。例えば、約1000000個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び/又はPDX1陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約1個の試薬−細胞複合体、約100000個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び/又はPDX1陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約1個の試薬−細胞複合体、約10000個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び/又はPDX1陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約1個の試薬−細胞複合体、約1000個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び/又はPDX1陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約1個の試薬−細胞複合体、約500個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び/又はPDX1陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約1個の試薬−細胞複合体、約100個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び/又はPDX1陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約1個の試薬−細胞複合体、約10個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び/又はPDX1陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約1個の試薬−細胞複合体、約5個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び/又はPDX1陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約1個の試薬−細胞複合体、約2個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び/又はPDX1陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約1個の試薬−細胞複合体、約1個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び/又はPDX1陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約個の試薬−細胞複合体、約1個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び/又はPDX1陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約5個の試薬−細胞複合体、約1個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び/又はPDX1陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約10個の胚体内胚葉細胞、約1個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び/又はPDX1陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約20個の試薬−細胞複合体、約1個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び/又はPDX1陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約50個の試薬−細胞複合体、約1個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び/又はPDX1陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約個の試薬−細胞複合体、約1個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び/又はPDX1陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約1000個の試薬−細胞複合体、約1個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び/又はPDX1陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約10000個の試薬−細胞複合体、約1個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び/又はPDX1陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約100000個の試薬−細胞複合体、並びに約1個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び/又はPDX1陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約1000000個の試薬−細胞複合体を含む組成物が考慮される。本発明の幾つかの実施形態において、多能性細胞はヒト多能性幹細胞である。或る特定の実施形態において、幹細胞は、桑実胚、胚の内部細胞塊又は胚の生殖隆起から誘導される。或る特定の実施形態において、多能性細胞は、胚形成期を越えて発達した多細胞構造の性腺組織又は胚組織から誘導される。
あまり分化しない細胞型から膵臓ホルモン発現細胞を分化する方法が前記されている。これらの方法は、適切な分化段階で分化培地にノギンを添加することによって高めることができる。幾つかの実施形態において、ノギンによって、レチノイドを追加せずに前腸内胚葉細胞の分化を容易にすることができる。しかし、ノギンがレチノイドと併せて用いられる場合、一般的に膵臓ホルモン発現細胞の産生が増大する。hESC細胞の膵臓ホルモン発現細胞への分化におけるノギンの使用を記載している特定のプロトコルが、以下の実施例18及び実施例19に記載される。以下の段落で、どのようにしてノギンを分化プロセスで用いることができるかの一般的な記載が与えられる。以下の開示は、前記で、及び参照により本明細書に援用されている米国特許出願で既に完全に記載された方法を組み込むことを理解するべきである。このように、これまでに既に記載された方法の工程の開示は、以下の段落に適用される。
レターゼ阻害剤は、約1μMの濃度で細胞集団に供給される。
μM、少なくとも約1.6μM、少なくとも約1.7μM、少なくとも約1.8μM、少なくとも約1.9μM、少なくとも約2μM、少なくとも約2.1μM、少なくとも約2.2μM、少なくとも約2.3μM、少なくとも約2.4μM、少なくとも約2.5μM、少なくとも約2.6μM、少なくとも約2.7μM、少なくとも約2.8μM、少なくとも約2.9μM、少なくとも約3μM、少なくとも約3.5μM、少なくとも約4μM、少なくとも約4.5μM、少なくとも約5μM、少なくとも約10μM、少なくとも約20μM、少なくとも約30μM、少なくとも約40μM、少なくとも約50μM、少なくとも約75μM、又は少なくとも約100μMの濃度で供給される。好ましい実施形態において、レチノイドはレチノールである。このような実施形態において、レチノールは、B27サプリメントに含まれるものであり得る。さらに好ましい実施形態において、レチノイドはレチノイン酸である。
本明細書に挙げられる本発明の幾つかの実施形態は、任意の発達段階の間の相当期間、相当量の酪酸ナトリウム又は他のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下で培養及び/又は分化しなかったと本明細書に記載されたようなin vitro細胞培養物及びin vitro細胞集団に関する。酪酸ナトリウム又は他のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下で培養及び/又は分化する細胞に関して、「相当量」は、酪酸ナトリウム又は他のヒストンデアセチラーゼ阻害剤が、細胞培養物又は細胞集団におけるヒト細胞の約半数でヒストンデアセチラーゼへの阻害効果を媒介するのに十分な任意の量を意味する。酪酸ナトリウム又は他のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下で培養及び/又は分化する細胞に関して、「相当期間」は、酪酸ナトリウム又は他のヒストンデアセチラーゼ阻害剤が、細胞培養物又は細胞集団におけるヒト細胞の約半数でヒストンデアセチラーゼへの阻害効果を媒介するのに十分な任意の期間を意味する。したがって、酪酸ナトリウム又は他のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の濃度、及びそれが細胞培養物に存在する時間の両方が、阻害効果の程度に影響を与える。例えば相当量は、約1nM〜約100mMの範囲であり得る。幾つかの実施形態において、相当量は、約1nM、約2nM、約5nM、約10nM、約20nM、約30nM、約40nM、約50nM、約75nM、約100nM、約250nM、約500nM、約750nM、約1μM、約10μM、約25μM、約50μM、約75μM、約100μM、約250μM、約500μM、約750μM、約1mM
、約10mM、約25mM、約50mM、約75mM、約100mM、又は約100mM超である。幾つかの実施形態において、相当期間は、約10分、約30分、約1時間、約2時間、約4時間、約8時間、約12時間、約16時間、約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、又は約5日超であり得る。例えば、酪酸ナトリウム又は別のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下で培養及び/又は分化しなかった細胞型としては、hESC、ヒト胚体内胚葉細胞、ヒト前腸内胚葉細胞、ヒトPDX1陽性前腸内胚葉細胞、ヒト内分泌前駆細胞、ヒト未熟膵臓ホルモン発現細胞及び成熟膵臓ホルモン発現細胞が挙げられる。本発明の幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるようなin vitro細胞培養物及びin vitro細胞集団が、それらの発達段階の間の1つ又は複数の時点で酪酸ナトリウム又は他のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の完全な非存在下で培養及び/又は分化される。
本発明のさらなる実施形態は、hESC、ヒト胚体内胚葉細胞、ヒト前腸内胚葉細胞、ヒトPDX1陽性前腸内胚葉細胞、ヒト内分泌前駆細胞、ヒト未熟膵臓ホルモン発現細胞及び成熟膵臓ホルモン発現細胞から選択される1つ又は複数の細胞型を含む非組み換え細胞培養物及び非組み換え細胞集団に関する。非組み換え細胞培養物及び非組み換え細胞集団の幾つかの実施形態において、少なくとも1つの細胞型が非組み換え細胞型である。好ましい実施形態において、細胞培養物又は細胞集団における全ての細胞型が非組み換え細胞型である。「非組み換え」とは、細胞が、1つ又は複数の外因性の遺伝子産物、或いは1つ又は複数の外因性の遺伝子、特に選択及び/又はスクリーニングに用いることができる外因性のマーカー遺伝子を含む(が、これらに限定されない)外因性のマーカー遺伝子の機能部分の産物を発現するように遺伝子操作されていないことを意味する。外因性のマーカー遺伝子の具体的な例としては、緑色蛍光タンパク質(GFP)、励起緑色蛍光タンパク質(EGFP)、ルシフェラーゼ及び細胞選別に有用な任意の他のマーカーをコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。他の例示的な外因性のマーカー遺伝子には、抗生物質抵抗性遺伝子が含まれる。幾つかの実施形態において、非組み換え細胞には、外因性又は外来の遺伝子を含有するように遺伝子操作されなかった細胞が含まれる。幾つかの実施形態において、本明細書に記載される細胞培養物及び細胞集団は核型的に(kaiyotypically)正常である。
ヒトES細胞
膵島ホルモン発現細胞の発生についての研究のために、本発明者らは、多能性であり、且つ正常核型を維持しながら培養中に外見上無限に分裂し得るヒト胚性幹細胞を利用した。単離のための免疫学的方法又は機械的方法のいずれかを使用して、5日齢胚内部細胞塊からES細胞を誘導した。特に、ヒト胚性幹細胞株hESCyt−25を、患者によるインフォームドコンセント後に、体外受精周期からの過剰凍結胚から誘導した。解凍の直後に、ES培地(DMEM、20% FBS、非必須アミノ酸、β−メルカプトエタノール、及びFGF2)中のマウス胚線維芽細胞(MEF)上で孵化胚盤胞を平板培養した。胚が培養皿に接着し、約2週間後、未分化hESCの領域を、MEFを含む新たな皿に移した。機械的に切断し、ディスパーゼで簡単に消化した後、細胞クラスターを機械的に採取し出し、洗浄し、再度平板培養することによって移動を達成した。誘導以来、hESCyt−25を100回にわたって連続継代した。本発明者らは、内分泌前駆細胞、及びその後膵島ホルモン発現細胞を産生するための出発材料として、hESCyt−25ヒト胚性幹細胞株を利用した。さらに、本発明者らは、本発明者ら及び他者の両方によって開発された他のhESC株、例えば、限定するものではないが、Cyt−49、Cyt−203、BG01、BG02、及びBG03を使用した。
hESCyt−25特性化
ヒト胚性幹細胞株hESCyt−25は、培養中18ヶ月にわたって、正常な形態特性、核型特性、増殖特性及び自己再生特性を維持した。この細胞株は、OCT4、SSEA−4及びTRA−1−60抗原(これらはすべて、未分化hESCに特徴的である)に対して強い免疫反応性を示し、且つアルカリホスファターゼ活性、及び他のhESC株化細胞と同一の形態を示す。さらに、ヒト幹細胞株hESCyt−25は、懸濁液中で培養される場合、胚様体(EB)も容易に形成する。その多能性の実証として、hESCyT−25は、3つの主要胚葉を表す各種細胞型に分化する。ZIC1に関するQ−PCR、並びにネスチン及びより成熟した神経細胞マーカーに関する免疫細胞化学(ICC)によって外胚葉産生を実証した。β−IIIチューブリンに関する免疫細胞化学染色を、初期ニューロンに特徴的な伸長細胞のクラスターにおいて観察した。予め、レチノイン酸で懸濁液中のEBを処理して、多能性幹細胞の胚体外系統である臓側内胚葉(VE)への分化を誘導した。処理細胞は、54時間処理することによって、高レベルのα−フェトプロテイン(AFP)及びSOX7(VEの2つのマーカー)を発現した。単層中で分化した細胞は、免疫細胞化学染色によって実証されるように、散在性パッチ中でAFPを発現した。以下に記載するように、hESCyT−25細胞株は、AFP発現がない場合のSOX17に関するリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応(Q−PCR)及び免疫細胞化学によって立証されるように、胚体内胚葉も形成可能であった。中胚葉への分化を実証するために、分化するEBを、幾つかの時点でのブラキュリ遺伝子発現に関して分析した。ブラキュリ発現は、実験を通して漸進的に増加した。前記に鑑みて、3つの胚葉を表す細胞を形成する能力によって示されるように、hESCyT−25株は多能性である。
膵臓ホルモンを発現する細胞の産生における中間体としての胚体内胚葉細胞
ヒト胚性幹細胞を4工程のプロトコルによって21日間分化させることにより、膵島ホルモン発現細胞を得た。第1工程に関しては3つの異なる条件を使用して、その後はすべてのプレートに同一の処理を施した。第1工程は、下記条件のうち1つの下での5日間の分化を含んだ:i)アクチビンA(100ng/ml)(それによりDEを強く産生する)(D'Amour, K., et al., Nature Biotechnology 23, 1534-1541(2005))、ii)外因性増殖因子を含まない2% FBS(それにより中胚葉及び胚体外内胚葉を産生する)、又はiii)フォリスタチン(50ng/ml)及びノギン(100ng/ml)(それにより神経外胚葉を産生する)。第2工程は、FGF10(50ng/mL)及びKAAD−シクロパミン(1μM)を含有する、2% FBSを含むRPMI中での3日間の分化を含んだ。第3工程は、FGF10(50ng/mL)、KAAD−シクロパミン(1μM)、レチノイン酸(2μM)及びDAPT(1μM)を含有する、B27サプリメント(1:100)を含むCMRL中での5日間の分化を含んだ。第4工程は、ニコチンアミド(10mM)、エキセンジン4(40ng/mL)、肝細胞増殖因子(HGF−25ng/mL)及びインスリン様増殖因子(IGF)−1(50ng/mL)を含有する、B27サプリメント(1:100)を含むDMEM中での8日間の分化から成っていた。複製試料を複数の時点で各プレートから採取し、遺伝子発現をリアルタイム定量的PCRによって分析した。
生された。因子(2NF)なしの処理及びホリスタチン/ノギン処理でのSOX17及びCXCR4の発現の相対的欠失によって、ほとんど又は少しのDEも、これらの条件下では産生されないことが示された。これに対して、因子なしの処理によって、胚体外内胚葉のマーカーであるSOX7、及び様々な中胚葉集団で発現されるISL1の強い発現が誘導された。ホリスタチン及びノギンによる処理によって神経外肺葉への強い分化を示す、SOX1及びPAX6の強い発現が誘導された。図2G〜図2Nで示されるように、本発明者らは、膵臓内胚葉マーカーPDX1、並びに膵臓内分泌転写因子(NGN3、NKX2.2、NKX6.1)及び内分泌ホルモンの発現がDEの産生の後に起こることを見出した。これらの細胞の効率的な産生は、DEの効率的な産生に対応している。胚体外内胚葉/中胚葉又は初期神経外胚葉の系統がDEの代わりに誘導される場合、膵臓内胚葉又は膵臓内分泌マーカーは、DEが濃縮された培養物に適用されると膵島ホルモン遺伝子の発現が生じる同一の培養条件による処理の後にこれらの細胞ではあまり発現しない。しかし、hESCのDEへの前特異化(pre-specification)は、PDX1、NGN3、インスリン、及びグルカゴンの発現を特徴とする成熟膵臓表現型を達成するのに十分である。
インスリン/IGFシグナル伝達はPDX1タンパク質の翻訳を促進する
ヒト胚性幹細胞を、アクチビンA(100ng/ml)を含有するRPMI培地中で5日間分化させた。FBS濃度は、0%(最初の24時間)、続く0.2%(次の24時間)から、その後2%(残りの3日間)へと変化した。次の4日間、プレートを異なる培地条件に付した。i)2% FBS及びアクチビンA(100ng/ml)を含むRPMI、ii)2% FBS、アクチビンA(25ng/ml)及びレチノイン酸を含むRPMI、iii)0.2% FBS及びB27サプリメント(1:100)、アクチビンA(25ng/ml)及びレチノイン酸を含むCMRL、並びにiv)0.2% FBS及びB27サプリメント(1:100)、アクチビンA(25ng/ml)、レチノイン酸及びエキセンジン(40ng/ml)を含むCMRLのいずれかの中でインキュベートした。レチノイン酸の濃度は、2μM(48時間)、続く1μM(24時間)から、0.2μM(最後の24時間)へと変化した。7、8及び9日目に、タンパク質及びmRNAの分析用に細胞を回収した。
レチノイン酸はhESCの膵臓インスリン発現表現型への分化を促進する
ヒト胚性幹細胞を4工程のプロトコルによって17日間分化させることにより、膵島ホルモン発現細胞を得た。第1工程は、アクチビンA(100ng/mL)(それによりDEを強く産生する)(D'Amour, K., et al., Nature Biotechnology 23, 1534-1541(2005))中での5日間の分化を含んだ。第2工程は、FGF10(50ng/mL)及びKAAD−シクロパミン(1μM)を含有する、2% FBSを含むRPMI中での2日間の分化、その後DAPT(1μM)も含有させてのさらに2日の分化を含んだ。第3工程は、FGF10(50ng/mL)、KAAD−シクロパミン(1μM)、DAPT(1μM)を含有し、且つレチノイン酸(1μM)添加又は無添加のいずれかで、B27サプリメント(1:100)を含むCMRL中での5日間の分化を含んだ。第4工程は、ニコチンアミド(10mM)、エキセンジン4(50ng/mL)、肝細胞増殖因子(HGF
25ng/mL)及びインスリン様増殖因子(IGF)−1(50ng/mL)を含有する、B27サプリメント(1:100)を含むCMRL中での4日間の分化を含んだ。複製試料を複数の時点で各プレートから採取し、遺伝子発現をリアルタイム定量的PCRによって分析した。
γ−セクレターゼ阻害は内分泌前駆細胞及びホルモン発現細胞の効率的な誘導を促進する
ヒト胚性幹細胞を5工程のプロトコルによって19日間分化させることにより、膵島ホルモン発現細胞を得た。第1工程は、アクチビンA(100ng/mL)(それによりDEを強く産生する)(D'Amour, K., et al., Nature Biotechnology 23, 1534-1541(2005))中での5日間の分化を含んだ。第2工程は、FGF10(50ng/mL)及びKAAD−シクロパミン(0.5μM)を含有する、2% FBSを含むRPMI中での2日間の分化を含んだ。第3工程は、FGF10(50ng/mL)、KAAD−シクロパミン(0.2μM)及びレチノイン酸(1μM)を含有する、B27サプリメント(1:100)を含むCMRL中での4日間の分化を含んだ。第4工程は、エキセンジン4(40ng/mL)を含有し、且つ各種濃度のγ−セクレターゼ阻害剤DAPT(0μM、1μM、3μM、又は10μM)を含む、B27サプリメント(1:100)を含むCMRLでの2日間の処理を含んだ。最終工程は、ニコチンアミド(10mM)、エキセンジン4(40ng/mL)及びインスリン様増殖因子(IGF)−1(50ng/mL)を含有する、B27サプリメント(1:100)を含むDMEM中での6日間の分化を含んだ。複製試料を各プレートから採取し、遺伝子発現をリアルタイム定量的PCRによって分析した。
胚体内胚葉は内分泌ホルモン発現を達成するために一連の連続工程を通じて分化し得る
ヒト胚性幹細胞を4工程又は5工程のプロトコルによって16日間分化させることにより、膵島ホルモン発現細胞を得た。第1工程は、アクチビンA(100ng/mL)(それによりDEを強く産生する)(D'Amour, K., et al., Nature Biotechnology 23, 1534-1541(2005))中での3日間の分化を含んだ。第2工程は、FGF10(50ng/m
L)及びKAAD−シクロパミン(0.2μM)を含有する、2% FBSを含むRPMI中での3日間の分化を含んだ。4工程のプロトコルにおいて、第3工程は、FGF10(50ng/mL)、KAAD−シクロパミン(0.2μM)、レチノイン酸(2μM)及びDAPT(1μM)を含有する、B27サプリメント(1:100)を含むCMRL中での4日間の分化を含んだ。5工程のプロトコルでは、この4日の期間を、同一基本培地中での2つの別個の処理に分けた。2日間は、培地はFGF10(50ng/mL)、KAAD−シクロパミン(0.2μM)及びレチノイン酸(2μM)を含有した。続く2日間は、FGF10を除去し、γ−セクレターゼ阻害剤DAPT(1μM)を添加した。両方のプロトコルの最終工程は、ニコチンアミド(10mM)、エキセンジン4(40ng/mL)、肝細胞増殖因子(HGF 25ng/mL)及びインスリン様増殖因子(IGF)−1(50ng/mL)を含有する、B27サプリメント(1:100)を含むDMEM中での6日間の分化を含んだ。複製試料を複数の時点で各プレートから採取し、遺伝子発現をリアルタイム定量的PCRによって分析した。
膵臓内分泌ホルモンの発現
ヒト胚性幹細胞は、実施例3及び実施例4で示されたように、この実験で分化し、それから免疫細胞化学法で処理して膵島抗原を検出した。室温で15分間、PBS中の4%(w/v)パラホルムアルデヒドで培養物を固定し、TBSで数回洗浄して、TBS++(3%正常なロバ血清(Jackson ImmunoResearch Laboratories)と0.25%(w/v)トリトンX−100(Sigma)とを含有するTBS)で30分間遮断した。一次抗体及び二次抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories)をTBS++中で希釈し、それぞれ4℃で24時間又は室温で2時間、インキュベートした。
連続分化(ES/ME/DE/FE/膵臓E/膵臓内分泌細胞/膵島ホルモン)後に、インスリン、グルカゴン及びソマトスタチン細胞が個々に産生された。さらに、図8Dで示されるように、二重及び三重に標識したホルモン含有細胞も産生された。ヒト膵臓の初期の胎児発達中、初めに複数のホルモンを産生する細胞が豊富に存在し、これは時間とともに単一のホルモンを産生する細胞と分離される。本明細書に記載される方法によって産生された典型的な細胞クラスターにおいて、本発明者らは、約32%インスリン、約20%ソマトスタチン、約10%グルカゴン及び約38%二重陽性細胞の比で、単一、二重及び三重の陽性細胞を同時に観察した。
C−ペプチド/インスリン放出及びグルコース応答性の(stimulated)C−ペプチド/インスリン分泌(GSIS)
ヒト胚性幹細胞は、初めにDE産生のために、及び最終的には膵島ホルモン発現のために実施例3に記載されたように分化した。細胞には毎日新しい培地を供給し、培地のサンプルは、連日、分化の工程4後にプレートから回収した。これらの培地サンプルにおけるC−ペプチドのレベルをELISAで測定した(図9A、図9Bを参照されたい)。
さらなるヒト胚性幹細胞株の膵島ホルモン発現細胞への分化
2つのさらなるヒト胚性幹細胞株を5工程のプロトコルによって15日間又は16日間分化させることにより、膵島ホルモン発現細胞を得た。第1工程は、アクチビンA(100ng/ml)(それによりDEを強く産生する)(D'Amour, K., et al., Nature Biotechnology 23, 1534-1541(2005))での3日間の分化を含んだ。第2工程は、FGF1
0(50ng/mL)及びKAAD−シクロパミン(0.5μM)を含有する、2% FBSを含むRPMI中での3日間の分化を含んだ。第3工程は、FGF10(50ng/mL)、KAAD−シクロパミン(0.5μM)及びレチノイン酸(2μM)を含有する、B27サプリメント(1:100)を含むCMRL中での3日間の分化を含んだ。第4工程は、DAPT(1μM)及びエキセンジン4(40ng/mL)を含有する、B27サプリメント(1:100)を含むDMEM(BG02)又はCMRL(BG01)中での3日間の分化を含んだ。第5工程は、エキセンジン4(40ng/mL)を含有する、B27サプリメント(1:100)を含むCMRL(BG02)又はDMEM(BG01)中での4日間の分化(BG02)又は5日間の分化(BG01)を含んだ。複製試料を複数の時点で各プレートから採取し、遺伝子発現をリアルタイム定量的PCRによって分析した。
分化条件の比較
本発明者らは、hESCから膵島ホルモン発現細胞を産生するのに最小限十分であり得る中核となる分化条件を明らかにしている。最も単純な形式では、分化方法は、TGFβ増殖因子をhESCに適用し、胚体内胚葉の分化を誘導した後(D'Amour, K., et al., Nature Biotechnology 23, 1534-1541, (2005))、内胚葉細胞においてレチノイドシグナル伝達を活性化する、適用することを含んでいた。この中核となる条件を構築する際、様々な他の増殖因子が外因的に添加され、hESCとインスリン発現細胞との間の1つ又は複数の工程で分化の有効性が増大した。表2は、中核となる条件(処理番号1)、及びホルモン発現膵島細胞の産生が増大した様々な修飾を記載している。
ヒト胚性幹細胞に由来する未熟膵島ホルモン発現細胞の産生及び特性化
また、ヒト胚性幹細胞(hESC)を5工程のプロトコルによって25日間分化させることにより、未熟膵島ホルモン発現細胞を得た。第1工程は、無血清培地中のWnt3a(25ng/ml)、アクチビンA(100ng/ml)での1日間の分化、その後の0.2% FBSを補充した培地中のアクチビンA(100ng/ml)(それによりDEを強く産生する)(D'Amour, K., et al., Nature Biotechnology 23, 1534-1541(2005))での2日間の分化を含んだ。第2工程は、FGF10(50ng/ml)及びKAAD−シクロパミン(0.25μM)を含有する、2% FBSを含むDMEM中での3日間の分化を含んだ。第3工程は、外から加えたKAAD−シクロパミン(0.2μM)、FGF10(50ng/ml)及びレチノイン酸(2μM)を含む、B27サプリメント(1:100)を含むDMEM中での2日間の分化を含んだ。第4工程は、外から加えたKAAD−シクロパミン(0.2μM)及びFGF10(50ng/ml)を含む、B27サプリメント(1:100)を含むDMEMでの6日間の処理を含んだ。第5工程は、エキセンジン4(50ng/ml)及びグルカゴン様ペプチド1、アミノ酸1〜37(50ng/mL)を含有する、B27サプリメント(1:100)を含むDMEMでの11日間の処理を含んだ。
ヒト胚性幹細胞から誘導された膵臓ホルモン発現細胞によるシナプトフィジンの発現
シナプトフィジン(SYP)は、in vivo供給源由来の内分泌細胞に対する既知のマーカーである(Protela-Gomez et al, 2004)。hESCからの内分泌細胞の産生を確認するために、以下のプロトコルを用いて、hESCを分化し、SYP及びNKX2.2の発現に関して免疫細胞化学法で解析した。
フローサイトメトリを使用する、NCAM標識したhESC由来未熟膵島ホルモン発現細胞の分析
ヒト胚性幹細胞(hESC)を5工程のプロトコルによって18日間分化させることにより、未熟膵島ホルモン発現細胞を得た。第1工程は、無血清培地中のWnt3a(25ng/ml)、アクチビンA(100ng/ml)での1日間の分化、その後の0.2%
FBSを補充した培地中のアクチビンA(100ng/ml)での1日間の分化、及び2.0% FBSを補充した培地中のアクチビンA(100ng/ml)(それによりDEを強く産生する)(D'Amour, K., et al., Nature Biotechnology 23, 1534-1541(2005))での1日間の分化を含んだ。第2工程は、FGF10(50ng/ml)及びKA
AD−シクロパミン(0.25μM)を含有する、2% FBSを含むDMEM中での3日間の分化を含んだ。第3工程は、外から加えたKAAD−シクロパミン(0.2μM)及びレチノイン酸(2μM)を含む、B27サプリメント(1:100)を含むDMEM中での4日間の分化を含んだ。第4工程は、外から加えたKAAD−シクロパミン(0.2μM)及びエキセンジン4(50ng/ml)を含む、B27サプリメント(1:100)を含むDMEMでの3日間の処理を含んだ。第5工程は、エキセンジン4(50ng/ml)を含有する、B27サプリメント(1:100)を含むDMEMでの5日間の処理を含んだ。
A21206)の二次抗体のいずれかとインキュベートした。
NCAM陽性hESC由来未熟膵島ホルモン発現細胞集団の選別により、未熟膵島ホルモン発現細胞に関する集団が濃縮される
実験の第2セットにおいて、hESCを6工程のプロトコルによって19日間分化させることにより、未熟膵島ホルモン発現細胞を得た。第1工程は、無血清培地中のWnt3a(25ng/ml)、アクチビンA(100ng/ml)での1日間の分化、その後の0.2% FBSを補充した培地中のアクチビンA(100ng/ml)単独での1日間の分化、及び2.0% FBSを補充した培地中のアクチビンA(100ng/ml)(それによりDEを強く産生する)(D'Amour, K., et al., Nature Biotechnology 23, 1534-1541(2005))での1日間の分化を含んだ。第2工程は、FGF10(50ng/mL)及びKAAD−シクロパミン(0.25μM)を含有する、2% FBSを含むDMEM中での3日間の分化を含んだ。第3工程は、外から加えたKAAD−シクロパミン(0.2μM)及びレチノイン酸(2μM)を含む、B27サプリメント(1:100)を含むDMEM中での4日間の分化を含んだ。第4工程は、外から加えたKAAD−シクロ
パミン(0.2μM)及びグルカゴン様ペプチド1、アミノ酸1〜37(50ng/ml)を含む、B27サプリメント(1:100)を含むDMEMでの1日間の処理を含んだ。第5工程は、外から加えたエキセンジン4(50ng/mL)及びグルカゴン様ペプチド1、アミノ酸1〜37(50ng/ml)を含む、B27サプリメント(1:100)を含むDMEMでの3日間の処理を含んだ。第6工程は、エキセンジン4(50ng/ml)を含有する、B27サプリメント(1:100)を含むDMEMでの5日間の処理を含んだ。
ソフトウェア(Becton Dickinson)を用いて解析した。
CD133に対する陰性選択を使用する、NCAM陽性/SYP陽性hESC由来未熟膵島ホルモン発現細胞集団の濃縮
実験の第3セットにおいて、hESCを6工程のプロトコルによって19日間分化させることにより、未熟膵島ホルモン発現細胞を得た。第1工程は、無血清培地中のWnt3a(25ng/ml)、アクチビンA(100ng/ml)での1日間の分化、その後の
0.2% FBSを補充した培地中のアクチビンA(100ng/ml)単独での1日間の分化、及び2.0% FBSを補充した培地中のアクチビンA(100ng/ml)(それによりDEを強く産生する)(D'Amour, K., et al., Nature Biotechnology 23, 1534-1541(2005))での1日間の分化を含んだ。第2工程は、FGF10(50ng/mL)及びKAAD−シクロパミン(0.25μM)を含有する、2% FBSを含むDMEM中での3日間の分化を含んだ。第3工程は、外から加えたKAAD−シクロパミン(0.2μM)、レチノイン酸(2μM)及びエキセンジン4(50ng/ml)を含む、B27サプリメント(1:100)を含むDMEM中での3日間の分化を含んだ。第4工程は、外から加えたKAAD−シクロパミン(0.2μM)及びエキセンジン4(50ng/ml)を含む、B27サプリメント(1:100)を含むDMEMでの1日間の処理を含んだ。第5工程は、エキセンジン4(50ng/ml)を含有する、B27サプリメント(1:100)を含むDMEMでの9日間の処理を含んだ。
hESCの内分泌前駆細胞及び未熟膵島ホルモン発現細胞への分化
hESCを6工程のプロトコルによって19日間分化させることにより、未熟膵島ホルモン発現細胞を得た。第1工程は、無血清培地中のWnt3a(25ng/ml)、アクチビンA(100ng/ml)での1日間の分化、その後の0.2% FBSを補充した培地中のアクチビンA(100ng/ml)単独での1日間の分化、及び2.0% FBSを補充した培地中のアクチビンA(100ng/ml)(それによりDEを強く産生する)(D'Amour, K., et al., Nature Biotechnology 23, 1534-1541(2005))での1日間の分化を含んだ。第2工程は、FGF10(50ng/mL)及びKAAD−シクロパミン(0.25μM)を含有する、2% FBSを含むDMEM中での3日間の分化を含んだ。第3工程は、外から加えたKAAD−シクロパミン(0.2μM)、レチノイン酸(2μM)、グルカゴン様ペプチド1、アミノ酸1〜37(50ng/ml)及びノギン(50ng/ml)を含む、B27サプリメント(1:100)を含むDMEM中での4日間の分化を含んだ。第4工程は、B27サプリメント(1:100)及びグルカゴン様ペプチド1、アミノ酸1〜37(50ng/ml)を含むDMEMでの3日間の処理を含んだ。第5工程は、エキセンジン4(50ng/ml)を含有する、B27サプリメント(1:100)を含むDMEMでの6日間の処理を含んだ。12日目、15日目及び1919日目に、実施例14に記載のFACSを使用して細胞を選別することにより、NCAM陽性細胞とNCAM陰性細胞とを分離した。選別前の細胞の複製試料、NCAM陽性細胞及びNCAM陰性細胞を各培養物から採取し、遺伝子発現をリアルタイム定量的PCR
によって分析した。
外因性レチノイドなしでノギンを用いてインスリン発現細胞を得る方法
この実施例によって、B27等の培地サプリメントに存在し得る外因性レチノイド供給源、例えばレチノール(ビタミンA)を添加しないでノギン処理を用いて、hESCをインスリン発現細胞に分化する代替方法が示される。
ンAあり又はなし)から成り、さらなる因子を含まなかった。培養物を、分化の3日目、6日目、9日目、12日目、15日目及び19日目に繰り返してサンプリングし、リアルタイムPCRを使用して膵臓マーカーの発現について分析した。
ノギンとレチノイン酸との組合せを用いてインスリン発現細胞を得る方法
この実施例によって、ノギン及びレチノイン酸を併せて用いて、hESCをインスリン発現細胞に分化することができること、並びに特にレチノイン酸が低濃度で用いられる場合のレチノイン酸へのノギンの添加がレチノイン酸の作用を促進することが示される。
膵臓上皮のin vivo成熟
hESC由来材料が、機能的なインスリン産生細胞にさらに分化する能力をさらに研究するために、本発明者らは、in vitro分化細胞を免疫不全マウス(SCID/Bg)に移植した。これを達成するために、改良したマキルベン組織チョッパーを用いて、様々な分化プロセスの段階でのコンフルエント(confluent)細胞を機械的にスコア付けし(Joannides et al., (2006). Stem Cells 24:230-235(その開示内容全体が参照に
より本明細書に援用される)を参照されたい)、その後培養のために非接着プレートに移した。得られた集合体をゼラチンスポンジ足場(Gelfoam、Pharmacia)上にピペッティングし、マトリゲル(BD)で被覆した。それぞれ直径8mm×2mmの足場に集合体25μl〜40μlを入れた。続いて、2つのこれらの組織構築物をそれぞれのマウスの精巣上体脂肪体に移植した。
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Claims (5)
- ヒト細胞を含むin vitro細胞培養物であって、該ヒト細胞の少なくとも5%が、神経細胞接着分子(NCAM)を発現するヒト内分泌前駆細胞であり、前記NCAMを発現するヒト内分泌前駆細胞はニューロゲニン3(NEUROG3)及びペアードボックス4(PAX4)を実質的に発現し、前記内分泌前駆細胞はグレリン、インスリン、ソマトスタチン及びグルカゴン並びにシナプトフィジンを実質的に発現しない、細胞培養物。
- ヒト細胞を含むin vitro細胞培養物であって、該ヒト細胞の少なくとも5%が、神経細胞接着分子(NCAM)を発現するヒト内分泌前駆細胞であり、前記内分泌前駆細胞はシナプトフィジンを実質的に発現しない、細胞培養物。
- 前記ヒト細胞の少なくとも10%が、NCAMを発現するヒト内分泌前駆細胞である、請求項1または2に記載のin vitro細胞培養物。
- 前記ヒト細胞の少なくとも50%が、NCAMを発現するヒト内分泌前駆細胞である、請求項1または2に記載のin vitro細胞培養物。
- 前記NCAMを発現するヒト内分泌前駆細胞が非組み換え細胞である、請求項1〜4の何れか1項に記載のin vitro細胞培養物。
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