JP2017070295A - Pdx1発現背側及び腹側前腸内胚葉 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国特許仮出願第60/730,917号(表題「PDX1発現背側及び腹側前腸内胚葉(PDX1-EXPRESSING DORSAL AND VENTRAL FOREGUT ENDODERM)」、2005
年10月27日提出)(この記載内容は参照により本明細書中で完全に援用される)の本出願であり、そしてそれに対する優先権を主張する。
、Thomson、Reubinoff及びShamblottは、有糸分裂不活性化マウスフィーダー層を用いた
ヒトES及びEG細胞の連続培養を確立した(Reubinoff他、2000;Shamblott他、1998;Thomson他、1998)。
率的に膵島/β−細胞株に向けることが有益である。
択されるマーカーを実質的に発現しない。
る抗体、リガンド又は他の分子を用いることにより、細胞集団中の他の細胞から分離される。本発明の他の実施の形態は、PDX1陽性背側偏向前腸内胚葉細胞を富化、単離、及び/又は精製する方法に関する。このような実施の形態では、PDX1陽性背側偏向前腸内胚葉細胞は、表3から選択される細胞表面分子、或いは表4から選択される細胞表面分子のようなPDX1陽性背側偏向前腸内胚葉細胞の細胞表面上で発現される分子と結合する抗体、リガンド又は他の分子を用いることにより、細胞集団中の他の細胞から分離される。本発明のさらに他の実施の形態は、PDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞を富化、単離、及び/又は精製する方法に関する。このような実施の形態では、PDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞は、表3から選択される細胞表面分子のようなPDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞の細胞表面で発現される分子と結合する抗体、リガンド又は他の分子を用いることにより、細胞集団中の他の細胞から分離される。
ト細胞を含む細胞集団中のヒトPDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞の分化を促進し得る分化因子を同定する方法に関する。この方法は、ヒトPDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞を含む細胞集団を得る工程、細胞集団に候補分化因子を供給する工程、第1の時点での細胞集団中の表3から選択されるマーカーのようなマーカーの発現を確定する工程、そして第2の時点での細胞集団中の同一マーカーの発現を確定する工程を包含する。このような実施の形態では、第2の時点は第1の時点の後であり、そして第2の時点は候補分化因子を細胞集団に供給した後である。第2の時点での細胞集団中のマーカーの発現が第1の時点での細胞集団中のマーカーの発現と比較して増大又は低減される場合には、候補分化因子はヒトPDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞の分化を促進し得る。
、段落1の細胞培養物。
る、段落1の細胞培養物。
ある、段落18の細胞培養物。
ある、段落18の細胞培養物。
落49の方法。
胚体内胚葉細胞を含む細胞集団を得る工程、及び表3から選択される少なくとも1つのマーカーを発現するPDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞への当該PDX1陰性胚体内胚葉細胞集団の少なくとも一部の分化を促進するのに十分な量でFGFファミリー増殖因子を当該細胞集団に供給する工程であって、当該PDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞が腹側膵芽の細胞に分化し得る複能性細胞である工程を包含する方法。
のに十分な量でレチノイドを当該細胞集団に供給すること(当該PDX1陽性背側偏向前腸内胚葉細胞は背側膵芽の細胞に分化し得る複能性細胞である)、そしてPDX1陽性背側偏向前腸内胚葉細胞が形成されるのに十分な時間を与えることをさらに包含し、当該PDX1陽性背側偏向前腸内胚葉細胞が形成されるのに十分な時間が当該細胞集団中のPDX1陽性背側偏向前腸内胚葉細胞の存在を検出することにより確定される、段落98の方法。
らに包含し、当該PDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞が形成されるのに十分な時間が当該細胞集団中のPDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞の存在を検出することにより確定される、段落109の方法。
時点での当該細胞集団中のマーカーの発現と比較した場合に増大又は低減されるかを判定する工程であって、当該細胞集団中の当該マーカーの発現の増大又は低減は当該候補分化因子がヒトPDX1陽性背側偏向前腸内胚葉細胞の分化を促進し得ることを示す工程を包含する方法。
る、段落136の方法。
確定される、段落154の方法。
第60/566,293号(表題「PDX1発現内胚葉(PDX1 EXPRESSING ENDODERM)」、2004年4月27日出願)、米国特許仮出願第60/586,566号(表題「胚体内胚葉の単離のためのケモカイン細胞表面受容体(CHEMOKINE CELL SURFACE RECEPTOR FOR THE ISOLATION OF DEFINITIVE ENDODERM)」、2004年7月9日出願)、米国特許仮出願第60/587,942号(表題「胚体内胚葉の単離のためのケモカイン細胞表面受容体(CHEMOKINE CELL SURFACE RECEPTOR FOR THE ISOLATION OF DEFINITIVE ENDODERM)」、2004年7月14日出願)、米国特許出願第11/021,618号(表題「胚体内胚葉(DEFINITIVE ENDODERM)」、2004年12月23日出願)、及び米国特許出願
第11/115,868号(表題「PDX1発現内胚葉(PDX1 EXPRESSING ENDODERM)」、2005年4月26日出願)、米国特許出願第11/165,305号(表題「胚体内胚葉を分化させるための因子の同定方法(METHODS FOR IDENTIFYING FACTORS FOR DIFFERENTIATING DEFINITIVE ENDODERM)」、2005年6月23日出願)(これらの開示は参
照により本明細書に完全に援用される)にも見出され得る。
原腸形成と呼ばれる初期ヒト発達におけるきわめて重大な段階は、受精後2〜3週間で起こる。原腸形成は、3つの一次胚葉が最初に特定化され、そして器官形成されるのがこの時期であるため、非常に有意である(Lu他、2001;Schoenwolf and Smith, 2000)。外胚葉は、身体の外被及び全神経系の終局的形成に関与するが、一方、心臓、血液、骨、骨格筋及び他の結合組織は中胚葉に由来する。胚体内胚葉は、食道、胃並びに小腸及び大腸を含む全腸管、並びに腸管に由来する器官、例えば肺、肝臓、胸腺、上皮小体及び甲状腺、胆嚢及び膵臓の形成に関与する胚葉として定義される(Grapin-Botton and Melton, 2000;Kimelman and Griffin, 2000;Tremblay他、2000;Wells and Melton, 1999;Wells and Melton, 2000)。非常に重要な区別は、胚体内胚葉と原始内胚葉と呼ばれる細胞の完全に別個の系統との間でなされるべきである。原始内胚葉は主として、胚体外組織、主に胎盤卵黄嚢の壁側内胚葉部分及び臓側内胚葉部分、並びにライヘルト膜の細胞外マトリックス物質の形成に関与する。
PDX1(STF−1、IDX−1、IPF−1、IUF−1及びGSFとも呼ばれる)は、膵臓及び吻側十二指腸の発生のために必要とされる転写因子である。PDX1は、後前腸内胚葉から生じる膵臓性内胚葉中で最初に発現され、そしてマウスではE8.5から出発して、外分泌細胞及び内分泌細胞の両方を生じる。その後、PDX1はベータ細胞及びいくつかのデルタ細胞に制限されるようになる。この発現パターンは、成人で保持される。PDX1は、発生の早期に十二指腸製内胚葉で(形成中の膵臓に隣接する)、次に十二指腸性腸細胞並びに腸内分泌細胞、洞性胃で、並びに総胆管、胆嚢管及び胆管でも発現される。発現のこの領域も、膵臓発現が主に吻側十二指腸に制限されるようになる時点で、限定されるようになる。
J.他, Nature, 606-609, 1994;Offield, MF,他, Devel. 983-995, 1996;Stoffers, D.
A.他 Nature Genetics, 106-110, 1997)。PDX1は、インスリン及びソマトスタチン
膵臓内分泌細胞の最終的分化中にも必要とされ、そしてヒトにおける単一対立遺伝子の機能的崩壊はMODY4型(青年の成人発症型糖尿病)及び後期開始II型糖尿病の重症膵臓機能不全に関連する(Stoffers D.A.他, Nature Genetics 138-139, 1997)。
23からなる群からから選択されるFGFファミリー増殖因子であるが、これらに限定されない。
本発明の実施形態は、PDX1陰性内胚葉細胞の産生のための新規の確立したプロセスであって、PDX1陰性内胚葉細胞が腸管の前腸/中腸領域(PDX1陰性前腸/中腸内胚葉)由来の細胞、組織又は器官に分化し得る複能性細胞であるプロセスに関する。本明細書中で用いる場合、「複能性」又は「複能性細胞」とは、限定数の他の特定細胞型を生じ得るが、3つの一次胚細胞株(内胚葉、外胚葉及び中胚葉)すべてを生じ得るわけではない細胞型を指す。本明細書中で用いる場合、「前腸/中腸」は、腸管の前部分の細胞並びに腸管の中央部分の細胞(前腸/中腸接合部の細胞を含む)を指す。
本発明の実施形態は、PDX1陰性内胚葉細胞の産生のための新規の確立したプロセスであって、PDX1陽性内胚葉細胞が腸管の前腸/中腸領域(PDX1陽性前腸/中腸内胚葉)由来の細胞、組織又は器官に分化し得る複能性細胞であるプロセスに関する。本発明の他の実施形態は、PDX1陽性内胚葉細胞の産生のための新規の確立したプロセスであって、PDX1陽性内胚葉細胞が腸管の前腸/中腸領域(PDX1陽性前腸/中腸内胚葉)由来の細胞、組織又は器官に分化し得る複能性細胞であるプロセスに関する。本明細書中で用いる場合、「複能性」又は「複能性細胞」とは、限定数の他の特定細胞型を生じ得るが、3つの一次胚細胞株(内胚葉、外胚葉及び中胚葉)すべてを生じ得るわけではない細胞型を指す。本明細書中で用いる場合、「前腸/中腸」は、腸管の前部分の細胞並びに腸管の中央部分の細胞(前腸/中腸接合部の細胞を含む)を指す。いくつかの実施形態は、PDX1陽性内胚葉細胞は背側前腸内胚葉細胞である。他の実施形態では、PDX1陽性内胚葉細胞は腹側前腸内胚葉細胞である。
は参照により本明細書中で完全に援用される)に記載されている。
ーに、並びにこのようなマーカーの発現を検出し、確定するための方法に関する。 本明細書中で用いる場合、「発現」とは、材料又は物質の産生、及び材料又は物質の産生のレベル又は量を指す。したがって特定マーカーの発現の確定は、発現されるマーカーの相対量若しくは絶対量の検出、又は単にマーカーの存在若しくは非存在の検出のいずれかを指す。本明細書中で用いる場合、「マーカー」とは、観察され得るか又は検出され得る任意の分子を指す。例えばマーカーとしては、核酸、例えば特定遺伝子の転写体、遺伝子のポリペプチド産物、非遺伝子産物ポリペプチド、糖タンパク質、炭水化物、糖脂質、脂質、リポタンパク質又は小分子(例えば10,000amu未満の分子量を有する分子)が挙げられるが、これらに限定されない。
又は複数のマーカーは、Q−PCR及び/又は免疫組織化学により検出される。他の実施形態では、背側PDX1陽性前腸内胚葉細胞中で選択的に、特異的に又は独自的に発現されるマーカー、例えば表4から選択される1つ又は複数のマーカーは、Q−PCR及び/
又は免疫組織化学により検出される。
PDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物及び/又は細胞集団は、PDX1陰性胚体内胚葉(「胚体内胚葉」とも呼ばれる)を先ず産生することにより、多能性細胞から産生される。胚体内胚葉を含む細胞培養物及び富化細胞集団を産生するように多能性細胞を分化させるプロセスは、以下に簡潔に、また米国特許第11/021,618号(表題「胚体内胚葉(DEFINITIVE ENDODERM)」、2004年12月23日出願)(その開示は参
照により本明細書に完全に援用される)に詳細に記載されている。これらのプロセスのいくつかでは、出発材料として使用される多能性細胞は、幹細胞である。或る特定のプロセスでは、胚体内胚葉細胞を含む胚体内胚葉細胞培養物及び富化細胞集団は、胚性幹細胞から産生される。本明細書中で用いる場合、「胚性」とは、単一接合体で始まり、発生した配偶子細胞以外には多能性又は全能性細胞を含まない多細胞構造で終わる生物体の一連の発生段階を指す。配偶子融合により得られる胚のほかに、「胚性」という用語は、体細胞核移入により得られる胚を指す。胚体内胚葉細胞を派生させる好ましい方法は、胚体内胚葉産生のための出発材料として、ヒト胚性幹細胞を利用することである。このような多能性細胞は、桑実胚に由来する細胞、胚の内部細胞塊又は胚の生殖腺隆起に由来する細胞であり得る。ヒト胚性幹細胞は、当該技術分野で既知の方法を使用して、実質的な分化無しで多能性状態で培養物中で維持されることができる。このような方法は、例えば米国特許第5,453,357号、同第5,670,372号、同第5,690,926号、同第5,843,780号、同第6,200,806号及び同第6,251,671号に(その開示は参照により本明細書に完全に援用される)記載されている。
内胚葉細胞への幹細胞の少なくとも一部の分化を促進するのに十分な濃度で増殖因子が培養物中に存在するように、上記増殖因子が細胞に供給される。いくつかのプロセスでは、上記増殖因子は、少なくとも約5ng/ml、少なくとも約10ng/ml、少なくとも約25ng/ml、少なくとも約50ng/ml、少なくとも約75ng/ml、少なくとも約100ng/ml、少なくとも約200ng/ml、少なくとも約300ng/ml、少なくとも約400ng/ml、少なくとも約500ng/ml、少なくとも約1000ng/ml、少なくとも約2000ng/ml、少なくとも約3000ng/ml、少なくとも約4000ng/ml、少なくとも約5000ng/ml又は約5000ng/mlより高い濃度で細胞培養物中に存在する。
胚体内胚葉へのhESC培養の進行は、胚体内胚葉に特徴的なマーカーの発現を確定することによりモニタリングされ得る。いくつかのプロセスでは、或る特定のマーカーの発現は、マーカーの存在又は非存在を検出することにより確定される。代替的には或る特定のマーカーの発現は、マーカーが細胞培養物又は細胞集団の細胞中に存在するレベルを測定することにより確定され得る。このようなプロセスでは、マーカー発現の測定は、定性的又は定量的であり得る。マーカー遺伝子により産生されるマーカーの発現を定量する一方法は、定量的PCR(Q−PCR)の使用による。Q−PCRを実施する方法は、当該技術分野で既知である。マーカー遺伝子発現を定量するために、当該技術分野で既知である他の方法も用いられ得る。例えばマーカー遺伝子産物の発現は、対象のマーカー遺伝子産物に特異的な抗体を用いることにより検出され得る。或る特定のプロセスでは、胚体内胚葉に特徴的なマーカー遺伝子の発現並びにhESC及び他の細胞型に特徴的なマーカー遺伝子の有意な発現の欠如が確定される。
ベルよりも高いレベルでSOX17マーカー遺伝子を発現する(表1を参照)ため、いくつかのプロセスでは、SOX17及びSOX7の両方の発現がモニタリングされる。他のプロセスでは、hESCに特有のSOX17マーカー遺伝子及びOCT4マーカー遺伝子の両方の発現がモニタリングされる。さらに、胚体内胚葉細胞は、AFP、SPARC又はトロンボモジュリン(TM)マーカー遺伝子のレベルよりも高いレベルでSOX17マーカー遺伝子を発現するため、これらの遺伝子の発現もまたモニタリングされ得る。
]により実施される広範囲の一連の研究では、ケモカイン受容体CXCR4及びその特有のリガンドであるSDF−1[Kim, C., and Broxmyer, H., J. Leukocyte Biol. 65, 6-15 (1999)]の発現は、マウスにおいて初期発達及び成体期中に示された。発達における
CXCR4/SDF1相互作用は、いずれかの遺伝子がトランスジェニックマウスで崩壊される[Nagasawa他, Nature, 382, 635-638 (1996), Ma, Q.他, Immunmity, 10, 463-471 (1999)]場合、それが後期胚致死性をもたらしたことが実証された際に明らかとなってきた。McGrath他は、CXCR4は、RNアーゼ保護及びin situハイブリッド形
成方法論の組合せを使用して初期原腸形成胚(E7.5)中に検出される最も豊富なケモカイン受容体メッセンジャーRNAであることを実証した。原腸形成胚では、CXCR4/SDF−1シグナル伝達は、原始線条胚葉細胞を遊走することに主に関与されるようであり、この時期に存在する胚体内胚葉、中胚葉及び胚体外中胚葉上で発現される。E7.2−7.8マウス胚では、CXCR4及びα−フェトプロテインは、相互排他的であり、臓側内胚葉における発現の欠如を示している[McGrath, K.E.他, Dev. Biology 213, 442-456 (1999)]。
上述のプロセスのいずれかにより産生される胚体内胚葉細胞は、このような細胞に特異的である親和性タグを使用することにより、富化、単離及び/又は精製することができる
。胚体内胚葉細胞に特異的な親和性タグの例は、胚体内胚葉細胞の細胞表面上に存在するが、本明細書中に記載する方法により産生される細胞培養物中に見出されるであろう他の細胞型上に実質的に存在するマーカー分子(例えば、ポリペプチド)に特異的である抗体、リガンド又は他の結合剤である。いくつかのプロセスでは、CXCR4に結合する抗体は、胚体内胚葉細胞の富化、単離又は精製用の親和性タグとして使用される。他のプロセスでは、ケモカインSDF−1又はSDF−1に基づく他の分子もまた、親和性タグとして使用され得る。このような分子としては、SDF−1フラグメント、SDF−1融合体又はSDF−1擬似体が挙げられるが、これらに限定されない。
産生に関する。本明細書中に記載する方法を使用して、細胞集団又は細胞培養物は、未処理の細胞集団又は細胞培養物と比較した場合、少なくとも約2〜約1000倍、胚体内胚葉含有量が富化され得る。
上記の方法により産生される細胞組成物としては、胚体内胚葉を含む細胞培養物、並びに胚体内胚葉に富んだ細胞集団が挙げられる。例えば、培養物中の細胞の少なくとも約50〜80%が胚体内胚葉細胞である胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物が産生され得る。分化プロセスの効率は、或る特定のパラメーター、例えば細胞増殖条件、増殖因子濃度及び培養工程の時機(これらに限定されない)を修正することにより調整され得るため、本明細書中に記載される分化手法は、胚体内胚葉への多能性細胞の約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、又は約95%より多い転換を生じ得る。胚体内胚葉細胞の単離が用いられるプロセスでは、例えばCXCR4受容体と結合する親和性試薬を用いることにより、実質的に純粋な胚体内胚葉細胞集団が回収され得る。
胚体内胚葉細胞は、これらの細胞のさらなる分化により膵臓分化に向けて特殊化されて、PDX1陰性前腸内胚葉細胞を産生し得る。本明細書中に記載される分化プロセスのいくつかでは、胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物並びに富化又は精製された細胞集団は、PDX1陰性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物及び/又は富化細胞集団へのさらなる分化のために用いられ得る。
F10及び/又はFGF7の代わりに、又はそれらに加えて供給され得ることが理解されよう。例えば、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22及び/又はFGF23から成る群から選択されるFGFファミリーの増殖因子が供給され得る。このような実施形態では、FGFファミリーの増殖因子及び/又はFGFファミリーの増殖因子類似体若しくは模倣体が、少なくとも約10ng/ml、少なくとも約25ng/ml、少なくとも約50ng/ml、少なくとも約75ng/ml、少なくとも約100ng/ml、少なくとも約200ng/ml、少なくとも約300ng/ml、少なくとも約400ng/ml、少なくとも約500ng/ml、又は少なくとも約1000ng/mlの濃度で存在するように、細胞培養物の細胞に供給される。
とも約0.1μM、少なくとも約0.2μM、少なくとも約0.3μM、少なくとも約0.4μM、少なくとも約0.5μM、少なくとも約0.6μM、少なくとも約0.7μM、少なくとも約0.8μM、少なくとも約0.9μM、少なくとも約1μM、少なくとも約1.1μM、少なくとも約1.2 μM、少なくとも約1.3μM、少なくとも約1.
4μM、少なくとも約1.5μM、少なくとも約1.6μM、少なくとも約1.7μM、少なくとも約1.8μM、少なくとも約1.9μM、少なくとも約2μM、少なくとも約2.1μM、少なくとも約2.2μM、少なくとも約2.3μM、少なくとも約2.4μM、少なくとも約2.5μM、少なくとも約2.6μM、少なくとも約2.7μM、少なくとも約2.8μM、少なくとも約2.9μM、少なくとも約3μM、少なくとも約3.5μM、少なくとも約4μM、少なくとも約4.5μM、少なくとも約5μM、少なくとも約10μM、少なくとも約20μM、少なくとも約30μM、少なくとも約40μM又は少なくとも約50μMの濃度で供給され得る。
%(v/v)未満又は約20%(v/v)未満であり得る。本明細書中に記載された或る特定のプロセスでは、分化の培地は、血清、又は血清代替物又はインスリン若しくはインスリン様増殖因子を含む任意のサプリメントを含まない。
CA)から入手可能である。十分な容量の成長培地へこのストック溶液を十分量添加することにより、所望の量のB27を補充した培地が生じる。例えば、成長培地90mlへ50倍B27ストック溶液10mlを添加することにより、5倍B27を補充した成長培地が生じる。培地中のB27サプリメントの濃度は、約0.1倍、約0.2倍、約0.3倍、約0.4倍、約0.5倍、約0.6倍、約0.7倍、約0.8倍、約0.9倍、約1倍、約1.1倍、約1.2倍、約1.3倍、約1.4倍、約1.5倍、約1.6倍、約1.7倍、約1.8倍、約1.9倍、約2倍、約2.5倍、約3倍、約3.5倍、約4倍、約4.5倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約11倍、約12倍、約13倍、約14倍、約15倍、約16倍、約17倍、約18倍、約19倍、約20倍及び約20倍以上であり得る。
なくとも約0.02μM、少なくとも約0.04μM、少なくとも約0.08μM、少なくとも約0.1μM、少なくとも約0.2μM、少なくとも約0.3μM、少なくとも約0.4μM、少なくとも約0.5μM、少なくとも約0.6μM、少なくとも約0.7μM、少なくとも約0.8μM、少なくとも約0.9μM、少なくとも約1μM、少なくとも約1.1μM、少なくとも約1.2μM、少なくとも約1.3μM、少なくとも約1.4μM、少なくとも約1.5μM、少なくとも約1.6μM、少なくとも約1.7μM、少なくとも約1.8μM、少なくとも約1.9μM、少なくとも約2μM、少なくとも約2.1μM、少なくとも約2.2μM、少なくとも約2.3μM、少なくとも約2.4μM、少なくとも約2.5μM、少なくとも約2.6μM、少なくとも約2.7μM、少なくとも約2.8μM、少なくとも約2.9μM、少なくとも約3μM、少なくとも約3.5μM、少なくとも約4μM、少なくとも約4.5μM、少なくとも約5μM、少なくとも約10μM、少なくとも約20μM、少なくとも約30μM、少なくとも約40μM又は少なくとも約50μMの濃度で存在するように、細胞培養物の細胞へ供給される。このような実施形態では、レチノイドは、約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、約7日、約8日、約9日、約10日又は約10日超で細胞に供給され、その後胚体内胚葉細胞培養物でのTGFβスーパーファミリー増殖因子シグナル伝達が低滅又は除かれる。好ましい実施形態では、約0.05μM RA〜約2μM RAが、約2〜3日、PDX−1陰性前腸内胚葉細胞培養物に供給され、その後TGFβスーパーファミリー増殖因子シグナル伝達が低滅又は除去される。
本発明のいくつかの実施形態は、PDX1陰性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような細胞組成物に関し、ここでPDX1陰性前腸内胚葉細胞は、腸管の前部分に由来する細胞、組織又は器官へ分化することができる多分化能細胞である。或る特定の実施形態によれば、PDX1陰性前腸内胚葉は哺乳類細胞であり、好ましい実施形態では、そのような細胞はヒト細胞である。
少なくとも約70%、少なくとも約69%、少なくとも約68%、少なくとも約67%、少なくとも約66%、少なくとも約65%、少なくとも約64%、少なくとも約63%、少なくとも約62%、少なくとも約61%、少なくとも約60%、少なくとも約59%、少なくとも約58%、少なくとも約57%、少なくとも約56%、少なくとも約55%、少なくとも約54%、少なくとも約53%、少なくとも約52%、少なくとも約51%又は少なくとも約50%のPDX1陰性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物及び/又は細胞集団を産生する。好ましい実施形態では、この細胞培養物又は細胞集団の細胞は、ヒト細胞から成る。他の実施形態では、本明細書中に記載するプロセスは、少なくとも約50%、少なくとも約45%、少なくとも約40%、少なくとも約35%、少なくとも約30%、少なくとも約25%、少なくとも約24%、少なくとも約23%、少なくとも約22%、少なくとも約21%、少なくとも約20%、少なくとも約19%、少なくとも約18%、少なくとも約17%、少なくとも約16%、少なくとも約15%、少なくとも約14%、少なくとも約13%、少なくとも約12%、少なくとも約11%、少なくとも約10%、少なくとも約9%、少なくとも約8%、少なくとも約7%、少なくとも6%、少なくとも5%、少なくとも4%、少なくとも約3%、少なくとも約2%又は少なくとも約1%のPDX1陰性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物及び/又は細胞集団を産生する。好ましい実施形態では、この細胞培養物又は細胞集団の細胞は、ヒト細胞から成る。いくつかの実施形態では、細胞培養物又は細胞集団中のPDX1陰性前腸内胚葉細胞のパーセントは、培養物中に存在するフィーダー細胞を考慮せずに算出される。
のPDX1陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約100,000個のPDX1陰性前腸内胚葉細胞及び約1個のPDX1陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約1,000,000個のPDX1陰性前腸内胚葉細胞を含む組成物が意図される。
本明細書中に記載されるPDX1陽性前腸内胚葉細胞を含むPDX1陽性前腸内胚葉細胞培養物及び細胞集団は、上記のような多能性細胞から生じるPDX1陰性胚体内胚葉細胞から産生される。好ましい方法は、出発物質としてヒト胚性幹細胞を利用する。一実施形態では、hESCは先ずPDX1陰性胚体内胚葉細胞に転換され、これは次に、PDX1陽性前腸内胚葉細胞に転換される。しかしながら、PDX1陽性前腸内胚葉の産生のための出発物質は、多能性細胞分化方法を用いて産生される胚体内胚葉細胞に限定されないと理解されたい。むしろ、任意のPDX1陰性胚体内胚葉細胞が、それらの起源と関係なく、本明細書中に記載される方法に用いられ得る。
くつかの実施形態では、約1%〜約20%の血清濃度を含む培地中で分化多能性細胞を増殖させるか又は保持させることにより、培地は状態調節される。他の実施形態では、約1ng/ml〜約1000ng/mlのアクチビンAを含む培地中で分化多能性細胞を増殖させるか又は保持させることにより、培地は状態調節される。さらに他の実施形態では、約1ng/ml〜約1000ng/mlのBMP4を含む培地中で分化多能性細胞を増殖させるか又は保持させることにより、培地は状態調節される。好ましい実施形態では、約25ng/mlのアクチビンA及び約2μMのRAを含むRPMIのような培地中で24時間、分化hESCを増殖させるか又は保持させることにより、馴化培地は調製される。
とも約1.1μM、少なくとも約1.2μM、少なくとも約1.3μM、少なくとも約1.4μM、少なくとも約1.5μM、少なくとも約1.6μM、少なくとも約1.7μM、少なくとも約1.8μM、少なくとも約1.9μM、少なくとも約2μM、少なくとも約2.1μM、少なくとも約2.2μM、少なくとも約2.3μM、少なくとも約2.4μM、少なくとも約2.5μM、少なくとも約2.6μM、少なくとも約2.7μM、少なくとも約2.8μM、少なくとも約2.9μM、少なくとも約3μM、少なくとも約3.5μM、少なくとも約4μM、少なくとも約4.5μM、少なくとも約5μM、少なくとも約10μM、少なくとも約20μM、少なくとも約30μM、少なくとも約40μM又は少なくとも約50μMの濃度で存在するように細胞培養物の細胞に供給される。本明細書で用いられるように、「レチノイド」は、レチノール、レチナール又はレチノイン酸、及び任意のこれらの化合物の誘導体を表す。好ましい実施形態では、レチノイドはレチノイン酸である。
クチビンAを含む低血清RPMI中で約5日間分化されている。別の好ましい実施形態では、アクチビンB及び/又はFGF−10はさらにまた、それぞれ25ng/ml及び50ng/mlで培養中に存在する。
v)、約0.3%(v/v)、約0.4%(v/v)、約0.5%(v/v)、約0.6%(v/v)、約0.7%(v/v)、約0.8%(v/v)、約0.9%(v/v)、約1%(v/v)、約2%(v/v)、約3%(v/v)、約4%(v/v)、約5%(v/v)、約6%(v/v)、約7%(v/v)、約8%(v/v)、約9%(v/v)、約10%(v/v)、約15%(v/v)又は約20%(v/v)である。代替的には、添加するB27サプリメントの濃度を、市販のB27ストック溶液の濃度の位数単位で調整することができる。例えば、B27は50倍ストック溶液としてInvitrogen(Carlsbad, CA)で市販されている。このストック溶液を十分量、十分量の成長培地に添加することで、所望量のB27を添加した培地が作られる。例えば、50倍B27ストック溶液10mlを成長培地90mlに加えることで、5倍B27を添加した成長培地が作られる。培地中のB27サプリメントの濃度は、約0.1倍、約0.2倍、約0.3倍、約0.4倍、約0.5倍、約0.6倍、約0.7倍、約0.8倍、約0.9倍、約1倍、約1.1倍、約1.2倍、約1.3倍、約1.4倍、約1.5倍、約1.6倍、約1.7倍、約1.8倍、約1.9倍、約2倍、約2.5倍、約3倍、約3.5倍、約4倍、約4.5倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約11倍、約12倍、約13倍、約14倍、約15倍、約16倍、約17倍、約18倍、約19倍、約20倍及び約20倍超であり得る。
本明細書中に記載される背側PDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む背側PDX1陽性前腸内胚葉細胞培養物及び細胞集団は、上記のような多能性細胞から生じるPDX1陰性胚体内胚葉から産生される。さらに、上記のように、好ましい方法は出発材料としてヒト胚性幹細胞を利用する。一実施形態では、hESCは先ずPDX1陰性胚体内胚葉細胞に転換され、これは次に、背側PDX1陽性前腸内胚葉細胞に転換される。しかしながら、背側
PDX1陽性前腸内胚葉細胞の産生のための出発材料は、多能性細胞分化方法を用いて産生される胚体内胚葉細胞に限定されないと理解される。むしろ、任意のPDX1陰性胚体内胚葉細胞は、それらの起源にかかわらず、本明細書中に記載される方法に用いられ得る。
くとも約0.1μM、少なくとも約0.2μM、少なくとも約0.3μM、少なくとも約0.4μM、少なくとも約0.5μM、少なくとも約0.6μM、少なくとも約0.7μM、少なくとも約0.8μM、少なくとも約0.9μM、少なくとも約1μM、少なくとも約1.1μM、少なくとも約1.2μM、少なくとも約1.3μM、少なくとも約1.4μM、少なくとも約1.5μM、少なくとも約1.6μM、少なくとも約1.7μM、少なくとも約1.8μM、少なくとも約1.9μM、少なくとも約2μM、少なくとも約2.1μM、少なくとも約2.2μM、少なくとも約2.3μM、少なくとも約2.4μM、少なくとも約2.5μM、少なくとも約2.6μM、少なくとも約2.7μM、少なくとも約2.8μM、少なくとも約2.9μM、少なくとも約3μM、少なくとも約3.5μM、少なくとも約4μM、少なくとも約4.5μM、少なくとも約5μM、少なくとも約10μM、少なくとも約20μM、少なくとも約30μM、少なくとも約40μM又は少なくとも約50μMの濃度で存在するように細胞培養物の細胞に供給される。
本明細書中に記載される腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞培養物及び細胞集団は、上記のような多能性細胞から生じるPDX1陰性胚体内胚葉から産生される。さらに、上記のように、好ましい方法は出発材料としてヒト胚性幹細胞を利用する。一実施形態では、hESCは先ずPDX1陰性胚体内胚葉細胞に転換され、これは次に、腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞に転換される。しかしながら、腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞の産生のための出発材料は、多能性細胞分化方法を用いて産生される胚体内胚葉細胞に限定されないと理解される。むしろ、任意のPDX1陰性胚体内胚葉細胞は、それらの起源にかかわらず、本明細書中に記載される方法に用いられ得る。
つかの実施形態では、FGFファミリー増殖因子或いはFGFファミリー増殖因子類似体又は模倣物は、ヘッジホッグ阻害剤及び/又はConnaught Medical Research Labs培地(
CRML培地)(Invitrogen, Carlsbad, CA)と一緒に用いられる。特に好ましい実施形態では、FGF−10及び/又はKAAD−シクロパミンは、RA又は他のレチノイドの非存在下でPDX1陰性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物に供給される。或る特定の実施形態では、BMP4は、RA又は他のレチノイドの非存在下でFGF−10及び/又はKAAD−シクロパミン中に含まれ得る。FGFファミリー増殖因子類似体又は模倣物及び/又はヘッジホッグ阻害剤の添加後約1日〜約10日後、レチノイド、例えばRA、又はレチノイド含有サプリメント、例えばB27が供給されて、PDX1の発現を誘導する。好ましい実施形態では、RAは、FGFファミリー増殖因子類似体又は模倣物及び/又はヘッジホッグ阻害剤の添加後約2日、約3日、約4日又は約5日目に供給される。他の実施形態では、B27は、FGFファミリー増殖因子類似体又は模倣物及び/又はヘッジホッグ阻害剤を供給するのとほぼ同時に供給される。
.08μM、少なくとも約0.1μM、少なくとも約0.2μM、少なくとも約0.3μM、少なくとも約0.4μM、少なくとも約0.5μM、少なくとも約0.6μM、少なくとも約0.7μM、少なくとも約0.8μM、少なくとも約0.9μM、少なくとも約1μM、少なくとも約1.1μM、少なくとも約1.2 μM、少なくとも約1.3μM
、少なくとも約1.4μM、少なくとも約1.5μM、少なくとも約1.6μM、少なくとも約1.7μM、少なくとも約1.8μM、少なくとも約1.9μM、少なくとも約2μM、少なくとも約2.1μM、少なくとも約2.2μM、少なくとも約2.3μM、少なくとも約2.4μM、少なくとも約2.5μM、少なくとも約2.6μM、少なくとも約2.7μM、少なくとも約2.8μM、少なくとも約2.9μM、少なくとも約3μM、少なくとも約3.5μM、少なくとも約4μM、少なくとも約4.5μM、少なくとも約5μM、少なくとも約10μM、少なくとも約20μM、少なくとも約30μM、少なくとも約40μM又は少なくとも約50μMの濃度で供給され得る。
(Carlsbad, CA)で市販されている。このストック溶液を十分量、十分量の成長培地に添加することで、所望量のB27を添加した培地が作られる。例えば、50倍B27ストック溶液10mlを成長培地90mlに加えることで、5倍B27を添加した成長培地が作られる。培地中のB27サプリメントの濃度は、約0.1倍、約0.2倍、約0.3倍、約0.4倍、約0.5倍、約0.6倍、約0.7倍、約0.8倍、約0.9倍、約1倍、約1.1倍、約1.2倍、約1.3倍、約1.4倍、約1.5倍、約1.6倍、約1.7倍、約1.8倍、約1.9倍、約2倍、約2.5倍、約3倍、約3.5倍、約4倍、約4.5倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約11倍、約12倍、約13倍、約14倍、約15倍、約16倍、約17倍、約18倍、約19倍、約20倍及び約20倍超であり得る。B27が供給されるいくつかの実施形態では、PDX1陰性細胞の腹側PDX1陽性前腸内胚葉への分化を達成するために、レチノイドが供給されない。
多能性細胞からの胚体内胚葉細胞の分化に関するのと同様に、PDX1陰性、SOX17陽性胚体内胚葉からPDX1陽性前腸内胚葉細胞への分化の進行は、これらの細胞型に特徴的なマーカーの発現を確定することによりモニタリングされ得る。このようなモニタリングは、種々の条件下での、例えば1つ又は複数の分化因子濃度及び環境条件下での所望量のPDX1陽性前腸内胚葉の産生のために十分である時間の量を確定させ得る。好ましい実施形態では、所望量のPDX1陽性前腸内胚葉の産生のために十分である時間の量は、PDX1の発現を検出することにより確定される。本発明のいくつかの実施形態では、或る特定のマーカーの発現は、マーカーの存在又は非存在を検出することにより確定される。代替的には、或る特定のマーカーの発現は、マーカーが細胞培養物又は細胞集団の細胞中に存在するレベルを測定することにより確定され得る。このような実施形態では、マーカー発現の測定は、定性的又は定量的であり得る。上記のように、マーカー遺伝子により産生される発現マーカーを定量する好ましい方法は、Q−PCRの使用による。特定の実施形態では、Q−PCRは、PDX1陽性前腸内胚葉に特徴的なマーカー遺伝子の発現を、並びに他の細胞型に特徴的なマーカー遺伝子の発現の欠如を定量することにより、PDX1陽性前腸内胚葉細胞へのPDX1陰性、SOX17陽性胚体内胚葉培養の細胞の進行をモニタリングするために用いられる。当該技術分野で既知である他の方法も、マーカー遺伝子発現を定量するために用いられ得る。例えばマーカー遺伝子産物の発現は、対象となる当該マーカー遺伝子産物に特異的な抗体を用いることにより検出され得る。本発明のいくつかの実施形態では、PDX1陽性前腸内胚葉に特徴的なマーカー遺伝子の発現並びにPDX1陰性胚体内胚葉、hESC及び他の細胞型に特徴的なマーカー遺伝子の有意の発現の欠如が確定される。
側内胚葉及び/又は神経細胞を実質的に含有しない。
以下の実施例中の表3及び/又は表4に記載される1つ又は複数のマーカーの発現は、背側PDX1陽性内胚葉へのPDX1陰性胚体内胚葉の分化をモニタリングするために、上記の方法、例えばQ−PCR及び/又は免疫細胞化学を用いて検出及び/又は定量され得る。背側偏向及び腹側偏向PDX1陽性前腸内胚葉細胞の両方に関連したマーカーは、表3に記載されている。これらのマーカーのうち、CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2及びSLC27A2から成る群から選択されるマーカーは、細胞表面マーカーである。背側PDX1陽性前腸内胚葉の産生をモニタリングするための表3に列挙されるいくつかの好ましいマーカーは、SERPINF2、DUSP9、CDH6及びSOX9から成る群から選択される。背側偏向前腸内胚葉に関連したマーカーは、表4に記載されている。表4マーカーの各々は、他のPDX1陽性細胞と比較して、背側PDX1陽性前腸内胚葉細胞中で選択的に、特異的に又は独自的に発現される。これらのマーカーのうち、ADORA2A、CD47、EPB41L1、MAG、SFRP5、SLC16A10、SLC16A2、SLC1A3、SLC30A4、SLICK、SLITRK4及びXPR1から成る群から選択されるマーカーは、細胞表面マーカーである。背側PDX1陽性前腸内胚葉の産生をモニタリングするための表4に列挙されるいくつかの好ましいマーカーは、HOXA1、PDE11A、FAM49A及びWNT5Aから成る群から選択される。
前節に記載されたように、背側偏向及び腹側偏向PDX1陽性前腸内胚葉細胞に関連したマーカーは、表3に記載されている。このようなものとして、表3に記載されるマーカーのうちの1つ又は複数の発現は、上記の方法、例えばQ−PCR及び/又は免疫細胞化学を用いて検出及び/又は定量されて、腹側PDX1陽性内胚葉へのPDX1陰性胚体内胚葉の分化をモニタリングし得る。表3に記載されるマーカーのうち、CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2及びSLC27A2から成る群から選択されるマーカーは、細胞表面マーカーである。腹側PDX1陽性前腸内胚葉の産生をモニタリングするための表3に列挙されるいくつかの好ましいマーカーは、SERPINF2、DUSP9、CDH6及びSOX9から成る群から選択される。さらに、表4に記載されるマーカーは、背側偏向前腸内胚葉中で選択的に、特異的に又は独自的に発現されるため、これらのマーカーのうちの1つ又は複数の、背側PDX1陽性前腸内胚葉中での発現と比較した場合の、発現の欠如又は発現低減を検出することは、腹側PDX1陽性前腸内胚葉へのPDX1陰性胚体内
胚葉の分化をモニタリングするために有用でもある。表4マーカーのうち、ADORA2A、CD47、EPB41L1、MAG、SFRP5、SLC16A10、SLC16A2、SLC1A3、SLC30A4、SLICK、SLITRK4及びXPR1から成る群から選択されるマーカーは、細胞表面マーカーである。背側PDX1陽性前腸内胚葉の産生をモニタリングするための表4に列挙されるいくつかの好ましいマーカーは、HOXA1、PDE11A、FAM49A及びWNT5Aから成る群から選択される。このようなものとして、表3から選択される1つ又は複数のマーカーを発現するPDX1陽性細胞中のこれらのマーカーの非存在又は微量の発現は、腹側PDX1陽性ということを示す。
上記のプロセスのいずれかにより産生されるPDX1陽性前腸内胚葉細胞、例えば背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、このような細胞に特異的である親和性タグを用いることにより、富化され、単離され、及び/又は精製され得る。背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞に特異的な親和性タグの例は、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞の細胞表面に存在するが、本明細書中に記載される方法により産生される細胞培養物中に見出される他の細胞型上には実質的に存在しないマーカー分子(例えばポリペプチド)に特異的な抗体、リガンド又は他の結合作因である。いくつかのプロセスでは、CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2、SLC27A2、ADORA2A、CD47、EPB41L1、MAG、SFRP5、SLC16A10、SLC16A2、SLC1A3、SLC30A4、SLICK、SLITRK4及びXPR1から成る群から選択される細胞表面マーカーと結合する抗体が、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞の富化、単離又は精製のための親和性タグとして用いられる。
腸内胚葉細胞が培養中の他の細胞から一旦物理的に分離されると、抗体結合は崩壊され、そして細胞は適切な組織培養培地中に再び平板培養される。
性前腸内胚葉細胞は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して少なくとも約5〜約500倍富化され得る。他の実施形態では、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して少なくとも約10〜約200倍富化され得る。さらに他の実施形態では、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して少なくとも約20〜約100倍富化され得る。さらに他の実施形態では、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して少なくとも約40〜約80倍富化され得る。或る特定の実施形態では、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して少なくとも約2〜約20倍富化され得る。
本発明の付加的態様に関して、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、富化され、単離され、及び/又は精製され得る。本発明のいくつかの実施形態では、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞に関して富化される細胞集団は、細胞培養物からこのような細胞を単離することにより産生される。
するよう指図される。いくつかの好ましい富化、単離及び/又は精製方法は、ヒト胚性幹細胞からの背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞のin vitro産生に関する。
本発明のいくつかの実施形態は、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞組成物、例えば細胞培養物又は細胞集団であって、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞が背側膵芽及び/又は腹側膵芽のような腸管の前部分に由来する細胞、組織又は器官に分化し得る複能性細胞である細胞組成物に関する。或る特定の実施形態によれば、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞は哺乳類の細胞であり、好ましい実施形態では、このような細胞はヒト細胞である。
%、少なくとも約75%、少なくとも約74%、少なくとも約73%、少なくとも約72%、少なくとも約71%、少なくとも約70%、少なくとも約69%、少なくとも約68%、少なくとも約67%、少なくとも約66%、少なくとも約65%、少なくとも約64%、少なくとも約63%、少なくとも約62%、少なくとも約61%、少なくとも約60%、少なくとも約59%、少なくとも約58%、少なくとも約57%、少なくとも約56%、少なくとも約55%、少なくとも約54%、少なくとも約53%、少なくとも約52%、少なくとも約51%、又は少なくとも約50%の背側及び/又は腹側のPDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物及び/又は細胞集団を産生する。好ましい実施形態では、この細胞培養物又は細胞集団の細胞は、ヒト細胞を含む。他の実施形態では、本明細書で記載されるプロセスは、少なくとも約50%、少なくとも約45%、少なくとも約40%、少なくとも約35%、少なくとも約30%、少なくとも約25%、少なくとも約24%、少なくとも約23%、少なくとも約22%、少なくとも約21%、少なくとも約20%、少なくとも約19%、少なくとも約18%、少なくとも約17%、少なくとも約16%、少なくとも約15%、少なくとも約14%、少なくとも約13%、少なくとも約12%、少なくとも約11%、少なくとも約10%、少なくとも約9%、少なくとも約8%、少なくとも約7%、少なくとも約6%、少なくとも約5%、少なくとも約4%、少なくとも約3%、少なくとも約2%、又は少なくとも約1%の背側及び/又は腹側のPDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物及び/又は細胞集団を産生する。好ましい実施形態では、この細胞培養物又は細胞集団の細胞は、ヒト細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養物又は細胞集団中の背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞のパーセンテージは、培養物中に残存するフィーダー細胞と関係なく算定される。
葉細胞、約1個のPDX1陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約20個の背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞、約1個のPDX1陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約50個の背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞、約1個のPDX1陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約100個の背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞、約1個のPDX1陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約1000個の背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞、約1個のPDX1陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約10,000個の背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞、約1個のPDX1陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約100,000個の背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞、約1個のPDX1陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約1,000,000個の背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む組成物が意図される。
、SOX1、ZIC1及び/又はNFMマーカーの発現より大きい。いくつかの実施形態では、SOX17、HOXA13及びHOXC6から成る群から選択される1つ又は複数のマーカーの発現がAFP、SOX7、SOX1、ZIC1及び/又はNFMマーカーの発現より大きい細胞培養物又は細胞集団中のヒト細胞のパーセンテージは、フィーダー細胞を考慮せずに算定される。
も約30%で、ヒト細胞の少なくとも約35%で、ヒト細胞の少なくとも約40%で、ヒト細胞の少なくとも約45%で、ヒト細胞の少なくとも約50%で、ヒト細胞の少なくとも約55%で、ヒト細胞の少なくとも約60%で、ヒト細胞の少なくとも約65%で、ヒト細胞の少なくとも約70%で、ヒト細胞の少なくとも約75%で、ヒト細胞の少なくとも約80%で、ヒト細胞の少なくとも約85%で、ヒト細胞の少なくとも約90%で、ヒト細胞の少なくとも約95%で、又はヒト細胞の少なくとも約98%で、AFP、SOX7、SOX1、ZIC1及び/又はNFMマーカーの発現よりも大きい。このような実施形態では、表4から選択されるマーカーは、背側PDX1陽性前腸内胚葉細胞中の同一マーカーの発現と比較して、実質的に発現されない。いくつかの実施形態では、表3から選択されるマーカーの発現がAFP、SOX7、SOX1、ZIC1及び/又はNFMマーカーの発現よりも大きく、そして表4から選択されるマーカーが背側PDX1陽性前腸内胚葉細胞中の同一マーカーの発現と比較して、実質的に発現されない細胞培養物又は集団中のヒト細胞のパーセンテージは、フィーダー細胞を考慮せずに算定される。
細胞集団中の細胞に関して、「〜を実質的に含有しない」という用語は、その細胞培養物又は細胞集団が含有しない特殊化細胞型が、細胞培養物又は細胞集団中に存在する細胞の総数の約5%未満の量で存在するということを意味する。本発明のいくつかの実施形態では、本明細書中に記載される方法により産生される背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞集団又は細胞培養物は、AFP、SOX7、SOX1、ZIC1及び/又はNFMマーカー遺伝子を有意に発現する細胞を実質的に含有しない。
本発明のいくつかの態様は、SOX17陽性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団中でのPDX1遺伝子産物の発現を増大する方法に関する。このような実施形態では、SOX17陽性胚体内胚葉細胞は、PDX1遺伝子産物の発現を増大するために十分である量で分化因子と接触される。分化因子と接触されるSOX17陽性胚体内胚葉細胞は、PDX1陰性又はPDX1陽性のいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、分化因子はレチノイドである。或る特定の実施形態では、SOX17陽性胚体内胚葉細胞は、約0.01μM〜約50μMの範囲の濃度でレチノイドと接触される。好ましい実施形態では、レチノイドはRAである。
に、このような方法は、腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞中での表3から選択される1つ又は複数のマーカーの発現を増大するために用いられ得る。
本発明の付加的態様は、PDX1陽性前腸内胚葉細胞へのPDX1陰性胚体内胚葉細胞の分化を促進し得る1つ又は複数の分化因子を同定する方法に関する。このような方法では、PDX1陰性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団が得られ、そして細胞培養物又は細胞集団中でのPDX1の発現が確定される。PDX1の発現を確定した後、細胞培養物又は細胞集団の細胞は、候補分化因子と接触される。いくつかの実施形態では、PDX1の発現は、細胞と候補分化因子との接触時、又は接触直後に、確定される。PDX1発現は次に、細胞と候補分化因子との接触後の1つ又は複数の時点で確定される。候補分化因子との接触前のPDX1発現と比較して、PDX1の発現が候補分化因子との接触後に増大された場合、候補分化因子は、PDX1陽性前腸内胚葉細胞へのPDX1陰性胚体内胚葉細胞の分化を促進し得ると同定される。
後約9日、細胞と候補分化因子との接触後約10日、又は細胞と候補分化因子との接触後約10日以後に確定され得る。
本明細書中に記載される或る特定のスクリーニング方法は、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進し得る少なくとも1つの分化因子を同定するための方法に関する。これらの方法のいくつかの実施形態では、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞、例えばヒト背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞集団が得られる。次に細胞集団は、候補分化因子を供給される。候補分化因子を供給される前又はそれとほぼ同時である第1の時点で、マーカーの発現が確定される。代替的には、マーカーの発現は、候補分化因子の供給後に確定され得る。第1の時点の後、そして細胞集団に候補分化因子を供給する工程の後である第2の時点で、同一マーカーの発現が再び確定される。候補分化因子が背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進し得るか否かは、第1の時点でのマーカーの発現を第2の時点でのマーカーの発現と比較することにより確定される。第2の時点でのマーカーの発現が、第1の時点でのマーカーの発現と比較して増大されるか又は低減された場合には、候補分化因子は、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進し得る。好ましい実施形態では、マーカーの発現は、Q−PCRにより確定される。
以上が、ヒト背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞である。本明細書中に記載される他の実施形態では、細胞集団は、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、又は少なくとも85%以上がヒト背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞であるヒト細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞集団は、非ヒト細胞、例えば非ヒトフィーダー細胞を含む。他の実施形態では、細胞集団は、ヒトフィーダー細胞を含む。このような実施形態では、上記フィーダー細胞以外のヒト細胞の少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%又は少なくとも約95%以上がヒト背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞である。
又は複数の型の細胞に関する分化因子であることが既知である分子を含む。代替的実施形態では、候補分化因子は、細胞分化を促進することが既知でない分子を含む。好ましい実施形態では、候補分化因子は、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進することが既知でない分子を含む。
、骨形成タンパク質8(造骨タンパク質(osteogeneic protein)2)、骨形成タンパク
質6、骨形成タンパク質7、結合組織増殖因子(CTGF)、CGI−149タンパク質(神経内分泌分化因子)、サイトカインA3(マクロファージ炎症性タンパク質1−α)、膠芽腫(Gliablastoma)細胞分化関連タンパク質(GBDR1)、肝細胞癌由来増殖因子、ニューロメジンU−25前駆体、血管内皮増殖因子(VEGF)、血管内皮増殖因子B(VEGF−B)、T細胞特異的RANTES前駆体、胸腺樹状細胞誘導因子1、トランスフェリン、インターロイキン1(IL1)、インターロイキン2(IL2)、インターロイキン3(IL3)、インターロイキン4(IL4)、インターロイキン5(IL5)、インターロイキン6(IL6)、インターロイキン7(IL7)、 インターロイキ
ン8(IL8)、インターロイキン9(IL9)、インターロイキン10(IL10)、インターロイキン11(IL11)、インターロイキン12(IL12)、インターロイキン13(IL13)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)、エリスロポイエチン、トロンボポイエチン、ビタミンD3、上皮細胞増殖因子(EGF)、脳由来神経栄養因子、白血病抑制因子、甲状腺ホルモン、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、aFGF、FGF−4、FGF−6、ケラチノサイト増殖因子(KGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、血小板由来増殖因子−BB、β神経増殖因子、アクチビンA、形質転換増殖因子β1(TGF−β1)、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、バースト促進活性(Burst promoting activity)(BPA)、赤血球促進活性(EPA)、PGE2、インスリン増殖因子1(IGF−1)、IGF−II、ニュートロフィン増殖因子(NGF)、ニュートロフィン3、ニュートロフィン4/5、毛様体神経栄養因子、神経膠由来ネキシン、デキサメタゾン、β−メルカプトエタノール、レチノイン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、5−アザシチジン、アンホテリシンB、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩(Ascrorbate)、イソブチルキサンチン、インドメタシン、β−グリセロールホスフェート、ニコチンアミド、DMSO、チアゾリジンジオン、TWS119、オキシトシン、バソプレシン、メラニン細胞刺激ホルモン、コルチコトロピン(corticortropin)、リポトロピン、チロトロピン、成長ホルモン、プロラクチン、黄体形成ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、コルチコトロピン放出因子、ゴナドトロピン放出因子、プロラクチン放出因子、プロラクチン阻害因子、成長ホルモン放出因子、ソマトスタチン、チロトロピン放出因子、カルシトシン遺伝子関連ペプチド、副甲状腺ホルモン、グルカゴン様ペプチド1、グルコース依存性インスリン分泌促進ポリペプチド、ガストリン、セクレチン、コレシストキシン、モチリン、血管活性腸管ペプチド、物質P、膵臓ポリペプチド、ペプチドチロシンチロシン、神経ペプチドチロシン、インスリン、グルカゴン、胎盤性ラクトゲン、リラキシン、アンジオテンシンII、カルシトリオール(calctriol)、心
房性ナトリウム利尿ペプチド、及びメラトニン、チロキシン、トリヨードチロニン、カルシトニン、エストラジオール、エストロン、プロゲステロン、テストステロン、コルチゾール、コルチコステロン、アルドステロン、エピネフィン、ノルエピネフリン(norepinepherine)、アンドロスチエン(androstiene)、カルシトリオール、コラーゲン、デキサメタゾン、β−メルカプトエタノール、レチノイン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、5−アザシチジン、アンホテリシンB、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩(Ascrorbate)、イソブチルキサンチン、インドメタシン、β−グリセロールホスフェート、ニコチンアミド、DMSO、チアゾリジンジオン、及びTWS119から成る群から選択される1つ又は複数の増殖因子を含む。
因子は、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度が約0.1ng/ml〜約10mg/mlの範囲であるよう、細胞集団に供給される。いくつかの実施形態では、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度は、約1ng/ml〜約1mg/mlの範囲である。他の実施形態では、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度は、約10ng/ml〜約100μg/mlの範囲である。さらに他の実施形態では、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度は、約100ng/ml〜約10μg/mlの範囲である。好ましい実施形態では、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度は、約5ng/ml、約25ng/ml、約50ng/ml、約75ng/ml、約100ng/ml、約125ng/ml、約150ng/ml、約175ng/ml、約200ng/ml、約225ng/ml、約250ng/ml、約275ng/ml、約300ng/ml、約325ng/ml、約350ng/ml、約375ng/ml、約400ng/ml、約425ng/ml、約450ng/ml、約475ng/ml、約500ng/ml、約525ng/ml、約550ng/m
l、約575ng/ml、約600ng/ml、約625ng/ml、約650ng/ml、約675ng/ml、約700ng/ml、約725ng/ml、約750ng/ml、約775ng/ml、約800ng/ml、約825ng/ml、約850ng/ml、約875ng/ml、約900ng/ml、約925ng/ml、約950ng/ml、約975ng/ml、約1μg/ml、約2μg/ml、約3μg/ml、約4μg/ml、約5μg/ml、約6μg/ml、約7μg/ml、約8μg/ml、約9μg/ml、約10μg/ml、約11μg/ml、約12μg/ml、約13μg/ml、約14μg/ml、約15μg/ml、約16μg/ml、約17μg/ml、約18μg/ml、約19μg/ml、約20μg/ml、約25μg/ml、約50μg/ml、約75μg/ml、約100μg/ml、約125μg/ml、約150μg/ml、約175μg/ml、約200μg/ml、約250μg/ml、約300μg/ml、約350μg/ml、約400μg/ml、約450μg/ml、約500μg/ml、約550μg/ml、約600μg/ml、約650μg/ml、約700μg/ml、約750μg/ml、約800μg/ml、約850μg/ml、約900μg/ml、約950μg/ml、約1000μg/ml又は約1000μ/ml超である。
を細胞集団に供給することと、第2の時点でのマーカー発現を確定することとの間に十分な時間を経過させる。候補分化因子を細胞集団に供給することと第2の時点でのマーカーの発現を確定することとの間の十分な時間は、約1時間という短い時間から、約10日間という長い時間までであり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのマーカーの発現が、細胞集団に候補分化因子を供給した後で複数回確定される。いくつかの実施形態では、十分な時間は、少なくとも約1時間、少なくとも約6時間、少なくとも約12時間、少なくとも約18時間、少なくとも約24時間、少なくとも約30時間、少なくとも約36時間、少なくとも約42時間、少なくとも約48時間、少なくとも約54時間、少なくとも約60時間、少なくとも約66時間、少なくとも約72時間、少なくとも約78時間、少なくとも約84時間、少なくとも約90時間、少なくとも約96時間、少なくとも約102時間、少なくとも約108時間、少なくとも約114時間、少なくとも約120時間、少なくとも約126時間、少なくとも約132時間、少なくとも約138時間、少なくとも約144時間、少なくとも約150時間、少なくとも約156時間、少なくとも約162時間、少なくとも約168時間、少なくとも約174時間、少なくとも約180時間、少なくとも約186時間、少なくとも約192時間、少なくとも約198時間、少なくとも約204時間、少なくとも約210時間、少なくとも約216時間、少なくとも約222時間、少なくとも約228時間、少なくとも約234時間、又は少なくとも約240時間である。
れる。
ヒトES細胞
内胚葉発達についての研究のために、本発明者等は、多能性であり、そして正常核型を保持しながら培養中に外見上無限に分裂し得るヒト胚性幹細胞を用いた。単離のために免疫学的又は機械的方法を用いて、5日齢胚内部細胞塊からES細胞を得た。特にヒト胚性幹細胞株hESCyt−25を、患者によるインフォームドコンセント後に、体外受精周期からの過剰凍結胚から得た。解凍の直後に、ES培地(DMEM、20%FBS、非必須アミノ酸、β−メルカプトエタノール、ITSサプリメント)中のマウス胚線維芽細胞(MEF)上に孵化胚盤胞を平板培養した。胚が培養皿に接着し、そして約2週間後、未分化hESCの領域を、MEFとともに新たな皿に移した。機械的に切断し、ディスパーゼで手短に消化し、その後、細胞クラスターを機械的に取り出して、洗浄し、再度平板培養することにより移動を成し遂げた。誘導以来、hESCyt−25を、100回にわたって逐次継代した。胚体内胚葉の産生のための出発物質として、hESCyt−25ヒト胚性幹細胞株を用いた。
hESCyt−25特性化
ヒト胚性幹細胞株hESCyt−25は、培養中に18ヶ月にわたって、正常な形態特性、核型特性、増殖特性及び自己再生特性を保持した。この細胞株は、OCT4、SSEA−4及びTRA−1−60抗原(これらはすべて、未分化hESCに特有である)に対する強免疫反応性を示し、そしてアルカリ性ホスファターゼ活性、並びに他の確立されたhESC株と同一の形態を示す。さらにヒト幹細胞株hESCyt−25は、懸濁液中で培養される場合、胚様体(EB)も容易に形成する。その多能性の実証として、hESCyT−25は、3つの主要胚葉を表わす種々の細胞型に分化する。ZIC1に関するQ−PCR、並びにネスチン及びより成熟したニューロンマーカーに関する免疫細胞化学(ICC)により、外胚葉産生を実証した。β−IIIチューブリンに関する免疫細胞化学染色を、初期ニューロンに特徴的な伸長細胞のクラスター中で観察した。予め、レチノイン酸で懸濁液中のEBを処理して、臓側内胚葉(VE)、胚体外系統への多能性幹細胞の分化を誘導した。処理された細胞は、高レベルのα−フェトプロテイン(AFP)及びSOX7(VEの2つのマーカー)を54時間の処理により発現した。単層中で分化された細胞は、免疫細胞化学染色により実証されるように、散在性パッチ中でAFPを発現した。以下で記載するように、hESCyT−25細胞株は、AFP発現の非存在下でのSOX17に関する実時間定量的ポリメラーゼ連鎖反応(Q−PCR)及び免疫細胞化学により立証されるように、胚体内胚葉も形成し得た。中胚葉への分化を実証するために、分化中のEBを、いくつかの時点でのブラキュリ遺伝子発現に関して分析した。ブラキュリ発現は、実験経過中に漸進的に増大した。上記に鑑みて、三胚葉を表わす細胞を形成する能力
により示されるように、hESCyT−25株は多能性である。
SOX17抗体の産生
hESC培養物における胚体内胚葉の同定に対する主要な妨害は、適切なツールの欠如である。したがって、本発明者等は、ヒトSOX17タンパク質に対する抗体の産生に着手した。
るG型肝炎ウイルス粒子の同定(Identification of hepatitis G virus particles in human serum by E2-specific monoclonal antibodides generated by DNA immunization), J. Virol. 72: 4541-4545、Krasemann他(1999) 異例の核酸ベースの免疫化戦略を用いた
タンパク質に対するモノクローナル抗体の生成(Generation of monoclonal antibodides against proteins with an unconventional nucleic acid-based immunization strategy), J. Biotechnol. 73: 119-129、及びUlivieri他(1996) DNA免疫化によるヘリコバクター・ピロリ細胞空胞化毒素の規定部分に対するモノクローナル抗体の生成(Generation of a monoclonal antibody to a defined portion of the Heliobacter pylori vacuolat
ing cytotoxin by DNA immunization), J. Biotechnol. 51: 191-194(その開示は参照により本明細書に完全に援用される)に見出すことができる。
6(Invitrogen, Carlsbad, CA)及びpEGFP−N1(Clonetech, Palo Alto, CA)であった。タンパク質産生に関して、テロメラーゼ不死化MDXヒト線維芽細胞を、リポフェクタミン2000(Invitrogen, Carlsbad, CA)の存在下で、スーパーコイルDNAで一過的にトランスフェクトした。総細胞溶解産物は、トランスフェクションの36時間後に、プロテアーゼ阻害剤のカクテル(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)を含
有する50mM TRIS−HCl(pH8)、150mM NaCl、0.1% SDS、0.5%デオキシコール酸中で回収した。NuPAGE(4〜12%グラジエントポリアクリルアミド、Invitrogen, Carlsbad, CA)上でのSDS−PAGEにより分離され
、且つPDVF膜(Hercules, CA)上へのエレクトロブロッティングにより移入された細胞タンパク質100μgのウェスタンブロット分析は、10mM TRIS−HCl(pH8)、150mM NaCl、10%BSA、0.05%Tween−20(Sigma, St. Louis, MO)中のラットSOX17抗血清の1000倍希釈で、続いてアルカリホスファターゼ結合抗ラットIgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)でプ
ロービングして、ベクターブラックアルカリホスファターゼ染色(Vector Laboratories, Burlingame, CA)により明らかにした。使用されるタンパク質サイズ標準物質は、広範囲
の色彩マーカー(Sigma, St. Louis, MO)であった。
胚体内胚葉のマーカーとしてのSOX17抗体の確証
部分的に分化させたhESCをSOX17及びAFP抗体で同時標識して、SOX17抗体がヒトSOX17タンパク質に特異的であり、さらに胚体内胚葉をマークすることを実証した。SOX17、SOX7(これは、SOX遺伝子ファミリーサブグループFの密接に関連する成員である(図3))及びAFPはそれぞれ、臓側内胚葉で発現されることが実証されている。しかしながら、AFP及びSOX7は、ICCにより検出可能なレベルでは、胚体内胚葉細胞では発現されず、したがってそれらは、真正(bonifide)の胚体内胚葉細胞に関する陰性マーカーとして用いることができる。SOX17抗体は、細胞の別個の分類として存在するか、或いはAFP陽性細胞と混合される細胞の集団を標識する
ことが示された。特に、図5Aは、少数のSOX17細胞がAFPで同時標識されることを示すが、SOX17+細胞の区域においてAFP+細胞がほとんど存在しないか、或いは全く存在しない領域も見られた(図5B)。同様に、壁側内胚葉は、SOX17を発現することが報告されているため、壁側マーカーSPARC及び/又はトロンボモジュリン(TM)と共にSOX17による抗体の同時標識を使用して、壁側内胚葉であるSOX17+細胞を同定することができる。図6A〜図6Cに示されるように、トロンボモジュリン
及びSOX17同時標識された壁側内胚葉細胞は、hES細胞の無作為分化により産生された。
ット(95%を超える標識細胞)並びにSOX17及びAFP(臓側内胚葉)に関して同時標識する少量パーセント(5%未満)の細胞を認識した。アクチビンによるhESC培養物の処理は、SOX17遺伝子発現並びにSOX17標識細胞の顕著な増大をもたらし、AFP mRNAの発現及びAFP抗体で標識した細胞の数を劇的に抑制した。
Q−PCR遺伝子発現アッセイ
以下の実験では、リアルタイム定量的RT−PCR(Q−PCR)が、hESC分化に対する様々な処理の影響をスクリーニングするのに使用される主要なアッセイであった。
特に、遺伝子発現のリアルタイム測定は、Q−PCRにより多数の時点で多数のマーカー遺伝子に関して分析した。細胞集団の全体的な動態のより良好な理解を得るために、所望の細胞型並びに望ましくない細胞型のマーカー遺伝子の特徴を評価した。Q−PCR分析の長所として、ゲノム配列が容易に入手可能である場合、その極度の感度及び必要なマーカーを開発することが比較的容易であることが挙げられる。さらに、Q−PCRの極めて高い感度により、相当大きな集団内での比較的少数の細胞からの遺伝子発現の検出が可能となる。さらに、非常に低レベルの遺伝子発現を検出する能力は、集団内の「分化の偏り」に関する指標を提供する。これらの細胞の表現型の顕在的な分化に先立つ特定の分化経路に対する偏りは、免疫細胞化学的技法を使用して認知することはできない。このため、Q−PCRは、分化処理の成功をスクリーニングするための少なくとも補完的であり且つ免疫組織化学的技法よりも潜在的に相当優れている分析の方法を提供する。さらに、Q−PCRは、半ハイスループットスケール(semi-high throughput scale)の分析にて定量的方式で分化プロトコルの成功を評価するメカニズムを提供する。
ークにより示された。さらに、逆転写酵素無しで実施される反応は、陰性対照として役立ち、増幅しない。
発現され、したがって、胚体内胚葉におけるSOX17発現と相関する(表1)。表1に記載するマーカー遺伝子が、様々なサンプル間でどのように互いに相関するかを実証し、したがって、胚体内胚葉及び胚体外内胚葉への、並びに中胚葉及び神経細胞型への分化の特異的パターンを示す代表的な実験を図11〜図14に示している。
胚体内胚葉へのヒトES細胞の定方向分化
ヒトES細胞培養物は、それらの未分化状態を能動的に維持しない条件下で培養される場合に、無作為に分化する。この不均一分化は、壁側内胚葉及び臓側内胚葉の両方から構成される胚体外内胚葉細胞(AFP、SPARC及びSOX7発現)並びにZIC1及びネスチン(外胚葉)及びブラキュリ(中胚葉)発現によりマークされるような初期外胚葉誘導体及び中胚葉誘導体の産生をもたらす。胚体内胚葉細胞出現は、ES細胞培養物における特異的抗体マーカーの欠如に関して検査又は特定されていない。それ自体で、また初期状態で、ES細胞培養物における初期胚体内胚葉産生は、十分研究されていない。胚体内胚葉細胞に関する満足のいく抗体試薬が入手不可能であったため、特性化の大部分が、外胚葉及び胚体外内胚葉に焦点を当ててきた。概して、無作為に分化されたES細胞培養物においてSOX17hi胚体内胚葉細胞と比較して、有意により多数の胚体外細胞型及び神経外胚葉細胞型が存在する。
クチビン処理培養物に関するSOX17、AFP及びTM抗体を使用した三重標識により、AFP及びTMに関しても陰性であるSOX17陽性細胞のクラスターが観察された(図16A〜図16D)。これらは、分化hESC培養物におけるSOX17陽性胚体内胚葉細胞の第1の細胞標示である(図16A〜図16D及び図17)。
した。図22は、SOX17陽性細胞の相対数もまた、用量応答性であったことを示す。100ng/ml以上のアクチビンA用量は、SOX17遺伝子発現及び細胞数を強く誘導することが可能であった。
されるように培養物中で分裂することを実証した。矢印は、PCNA/DAPI標識有糸分裂プレートパターン及び位相差有糸分裂プロファイルにより明らかなように有糸分裂中であるSOX17/PCNA/DAPIで標識された細胞を示す。
ケモカイン受容体4(CXCR4)発現は、胚体内胚葉に関するマーカーと相関し、中胚葉、外胚葉又は臓側内胚葉に関するマーカーとは相関しない
上述したように、hESCは、TGFβファミリー、より具体的にはアクチビン/ノーダルサブファミリーのサイトカインの適用により、胚体内胚葉の胚葉へ分化するように誘導することができる。さらに、本発明者等は、分化培養培地におけるウシ胎児血清(FBS)の比率が、hESCからの胚体内胚葉分化の効率に影響を及ぼすことを示している。この影響は、培地においてアクチビンAの所定濃度で、より高いレベルのFBSが胚体内胚葉への最大限の分化を阻害するようなものである。外因性アクチビンAの非存在下では、胚体内胚葉系統へのhESCの分化は、非常に非効率であり、FBS濃度は、hESCの分化プロセスに対して相当穏やかに影響する。
、CXCR4もまた胚体内胚葉のマーカーであることを実証する。
数もまた確定した。hESCは、高用量アクチビンA及び低FBS濃度(0.5%〜2.0%)の存在下で分化させた場合、SOX17+細胞は、培養物全体にわたって遍在的に
分布した。高用量アクチビンAを使用したが、FBSは10%(v/v)で包含された場合、SOX17+細胞は、相当低い頻度で出現し、培養物全体にわたって均一に分布され
るのではなく、常に単離クラスターに出現した(図29A及び図29C、並びに図29B及び図29E)。外因性アクチビンAが使用されなかった場合に、SOX17+細胞のさ
らなる減少が観察された。これらの条件下では、SOX17+細胞はまたクラスターに出
現し、これらのクラスターは、高アクチビンA低FBS処理で見出されるものよりも小さく、且つ相当稀であった(図29C及び図29F)。これらの結果は、CXCR4発現パターンが、各条件下で胚体内胚葉遺伝子発現に対応するだけでなく、胚体内胚葉細胞の数にも対応することを実証している。
胚体内胚葉に関して富化する分化条件は、CXCR4陽性細胞の比率を増大させる
アクチビンAの用量はまた、胚体内胚葉をhESCから得ることができる効率に影響を及ぼす。本実施例は、アクチビンAの用量を増大させることにより培養物におけるCXCR4+細胞の比率が増大することを実証する。
号ab10403−100)を添加して、標識を氷上で45分間進めた。細胞は、2%ヒト血清を含有するPBS(緩衝液)5mlを添加することにより洗浄して、ペレット化した。緩衝液5mlによる2回目の洗浄を完了させた後、細胞は、105個の細胞当たり緩
衝液50μl中に再懸濁させた。二次抗体(FITC結合ロバ抗マウス、Jackson ImmunoResearch、カタログ番号715−096−151)を最終濃度5μg/mlで添加して、30分間標識させた後、上述のように緩衝液中で2回洗浄を行った。細胞は、緩衝液中に5×106個の細胞/mlで再懸濁させて、フローサイトメトリーの中心的な施設(The Scripps Research Institute)にてスタッフによりFACS Vantage(Beckton Dickenson)を使用して分析及び選別した。細胞は、これに続くリアルタイム定量的PCRによる遺伝子発現分析用の総RNAの単離のために、RLT溶解緩衝液(Qiagen)に直接回収した。
の用量が分化培養培地中で増大されると、劇的に増加することが観察された(図30A〜図30C)。CXCR4+細胞は、R4ゲート内に納まるものであり、このゲートは、事
象の0.2%がR4ゲートに位置される二次抗体のみの対照を使用して設定された。CXCR4+細胞数の劇的な増大は、アクチビンA用量が増大される場合に、胚体内胚葉遺伝
子発現における強固な増大と相関する(図31A〜図31D)。
CXCR4陽性細胞の単離は、胚体内胚葉遺伝子発現に関して富化し、また中胚葉、外胚葉及び臓側内胚葉のマーカーを発現する細胞を激減させる
上記実施例8で同定されるCXCR4+細胞及びCXCR4-細胞を回収して、相対遺伝子発現に関して分析し、母集団の遺伝子発現を同時に確定した。
相関した(図30A〜図30C)。また、各集団からのCXCR4+細胞の単離は、この
集団中のほぼすべてのCXCR4遺伝子発現を占めたことも明らかである。これは、これらの細胞を回収するためのFACS方法の効率を実証している。
るだけでなく、CXCR4+細胞はまた、胚体内胚葉の他のマーカーに関する遺伝子発現
も含有することが明らかとなった。図31A〜図31Dに示されるように、CXCR4+
細胞はさらに、SOX17、GSC、HNF3B及びMIXL1に関してA100母集団を上回って富化した。さらに、CXCR4-分画は、これらの胚体内胚葉マーカーに関し
て非常に少ない遺伝子発現を含有した。さらに、CXCR4+及びCXCR4-集団は、中胚葉、外胚葉及び胚体外内胚葉のマーカーに関して逆パターンの遺伝子発現を示した。図33A〜図33Dは、CXCR4+細胞が、A100母集団に対してブラキュリ、MOX
1、ZIC1及びSOX7の遺伝子発現に関して激減したことを示す。このA100母集団は、低用量条件又はアクチビンA無しの条件に対して、これらのマーカーの発現がすでに低かった。これらの結果は、高アクチビンAの存在下で分化されるhESCからのCXCR4+細胞の単離は、胚体内胚葉に関して高度に富化され、且つ実質的に純粋な胚体内
胚葉である集団を生じることを示す。
CXCR4を使用した細胞集団中の胚体内胚葉細胞の定量
本明細書中ですでに確定されるような、及び2003年12月23日に出願された「胚体内胚葉(DEFINITIVE ENDODERM)」と題する米国仮特許出願第60/532,004号で
確定されるような細胞培養物又は細胞集団中に存在する胚体内胚葉細胞の比率の定量を確
認するために、CXCR4及び胚体内胚葉の他のマーカーを発現する細胞をFACSにより分析した。
胚体内胚葉細胞のさらなるマーカー
以下の実験では、精製胚体内胚葉及びヒト胚性幹細胞集団からRNAを単離した。続いて、遺伝子発現は、各精製集団由来のRNAの遺伝子チップ分析により分析した。Q−PCRも実施して、胚体内胚葉に関するマーカーとして、胚体内胚葉では発現されるが、胚性幹細胞では発現されない遺伝子の潜在性をさらに研究した。
してはCXCR4(R&D Systems、カタログ番号FAB170P)を使用して達成された
。細胞は、トリプシン/EDTA(Invitrogen、カタログ番号25300−054)を使用して解離させて、2%ヒト血清を含有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で洗浄して、氷上で10分間100%ヒト血清中に再懸濁させて、非特異的結合をブロックした。染色は、ヒト血清800μl中で5×106個の細胞にフィコエリトリン結合抗体200
μlを添加することにより氷上で30分間実施した。細胞をPBS緩衝液8mlで2度洗浄して、同1ml中に再懸濁させた。FACS単離は、FACS Vantage(BD Biosciences)を使用して、The Scripps Research Instituteの中心的な施設により実施された。細胞は、RLT溶解緩衝液に直接回収して、RNAは、製造業者の指示書に従ってRNeasy(Qiagen)により単離した。
なわちhESCと胚体内胚葉との間で差次的に発現する遺伝子を同定する群の比較である。hESCに見出される発現レベルを上回る強固な上方変化を示す遺伝子は、胚体内胚葉の高度に特性化される新たな候補マーカーとして選択された。選択遺伝子は、上述のようにQ−PCRによりアッセイして、遺伝子チップ上に見られる遺伝子発現変化を確証し、また経時的なhESC分化のこれらの遺伝子の発現パターンを研究した。
性が高いこと、及びそれらが胚体外内胚葉細胞で有意に発現されないことを示す。
レチノイン酸及びFGF−10は、胚体内胚葉培養物において特異的にPDX1を誘導する
以下の実験は、RA及びFGF−10が胚体内胚葉細胞においてPDX1の発現を誘導することを実証する。
FGF−10は、RA単独を上回るPDX1発現のさらなる増大を提供する
本実施例は、RA及びFGF−10の組合せが、RA単独よりも大いにPDX1発現を誘導することを示す。
レチノイン酸用量は、in vitroで前方−後方(A−P)位置に影響を及ぼす
RAの用量がin vitro細胞培養物のA−P位置に影響を及ぼすかどうかを判定するために、以下の実験を実施した。
B27サプリメントの使用は、PDX1の発現を増強する
胚体内胚葉におけるPDX1発現は、多数の因子の使用及び細胞増殖/分化状態により影響を与え得る。以下の実験では、本発明者等はB27サプリメントの使用が胚体内胚葉細胞においてPDX1の発現を増強することを示す。
た(+B27)。二重反復細胞サンプルを各点に関して採取して、総RNAを単離して、上述のようにQ−PCRへ付した。
PDX1の誘導を増強するためのアクチビンBの使用
本実施例は、アクチビンBの使用が、in vitro細胞培養物においてPDX1陽性細胞へのPDX1陰性細胞の分化を増強することを示す。
PDX1の誘導を増強するための血清用量の使用
胚体内胚葉細胞におけるPDX1の発現は、分化プロセス全体にわたって細胞培養物中に存在する血清の量により影響を受ける。以下の実験は、PDX1陰性胚体内胚葉へのhESCの分化中の培養物における血清のレベルが、PDX1陽性内胚葉へのこれらの細胞のさらなる分化中のPDX1の発現に影響することを示す。
PDX1の誘導を増強するための条件培地の使用
また、胚体内胚葉細胞におけるPDX1の発現に影響を与える他の因子及び成長条件を研究した。以下の実験は、PDX1陽性内胚葉細胞へのPDX1陰性胚体内胚葉細胞の分化に対する条件培地の影響を示す。
PDX1へ結合する抗体の確証
PDX1へ結合する抗体は、細胞集団中のPDX1発現の誘導をモニタリングするための有用なツールである。本実施例は、PDX1に対するウサギポリクローナル抗体及びIgY抗体を使用して、このタンパク質の存在を検出することができることを示す。
α−PDX1)抗体をウェスタンブロット分析により確証した。この分析で、MDX1
2ヒト線維芽細胞又はPDX1発現ベクターで予め24時間トランスフェクトしたMDX12細胞由来の総細胞溶解産物50μgへのIgY α−PDX1抗体の結合を比較した。細胞溶解産物は、SDS−PAGEにより分離して、エレクトロブロッティングにより膜へ転写して、その後IgY α−PDX1一次抗血清で、それに続いてアルカリホスファターゼ結合ウサギ抗IgY(Rb α−IgY)二次抗体でプロービングした。一次抗体及び二次抗体の種々の希釈は、細長い膜(strips of the membrane)を分離するために以下の組合せで適用した:A(500倍一次希釈、10,000倍二次希釈)、B(2,000倍、10,000倍)、C(500倍、40,000倍)、D(2,000倍、40,000倍)、E(8,000倍、40,000倍)。
ヒト膵臓組織の免疫組織化学
本実施例は、PDX1に対する特異性を有する抗体を使用して、免疫組織化学によりヒトPDX1陽性細胞を同定することができることを示す。
レチノイン酸処理細胞からのPDX1の免疫沈降 RAの存在下で分化させた胚体内胚葉細胞におけるPDX1発現、及びRAを用いて分化させなかった胚体内胚葉細胞における
PDX1の欠如をさらに確認するために、ウサギ抗PDX1(Rb α−PDX1)抗体を使用して、RA分化させた胚体内胚葉細胞及び未分化の胚体内胚葉細胞の両方からPDX1を免疫沈降させた。免疫沈降させたRAは、IgY α−PDX1抗体を使用してウェスタンブロット分析により検出した。
PDX1プロモーター−EGFPトランスジェニックhESC系の生成
細胞単離に関してPDX1マーカーを使用するために、本発明者等は、PDX1陽性前腸内胚葉細胞を発現可能なレポーター遺伝子で遺伝的にタグ付けした。本実施例は、PDX1調節領域の制御下でレポーター遺伝子を含有するレポーターカセットを含むベクターの構築について記載する。本実施例はまた、このベクターでトランスフェクトした細胞(例えば、ヒト胚性幹細胞)、並びにそのゲノムに組み込まれたこのレポーターカセットを有する細胞の調製について記載する。
における選択の10〜14日後に、未分化のトランスジェニックhESCクローンを単離及び拡大させた。
PDX1陽性前腸内胚葉の単離
以下の実施例は、PDX1プロモーター/EGFPカセットを含むhESCがPDX1陽性内胚葉細胞へ分化され、これに続いて蛍光活性化細胞選別器(FACS)により単離され得ることを実証する。
FACS Diva上でRNA溶解緩衝液又はPBSへ直接選別した。単一の生細胞のサンプルが、EGFPに関してゲーティングすることなく採取され(Live)、単一の生細胞は、EGFP陽性(GFP)及びGFP陰性(Neg)集団へゲーティングされた。一実験では、EGFP陽性分画は、蛍光強度に従って2つの同様のサイズの集団に分離された(Hi及びLo)。
PDX1陽性背側前腸内胚葉及びPDX1陽性腹側前腸内胚葉の産生 本実施例は、PDX1陽性背側偏向前腸内胚葉の産生、並びにPDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉の産生を記
載する。
PDX1陽性腹側前腸内胚葉細胞の産生は胚体内胚葉形成によっている
本実施例は、種々の量の胚体内胚葉細胞を含む培養物からのPDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉の産生を記載する。胚体内胚葉を有しない培養物は、PDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉の極めて少ない産生を示す。胚体内胚葉細胞の初期量が増大するように、腹側偏向前腸内胚葉の産生も増大する。
0.5μMのKAAD−シクロパミンとともに6日間、インキュベートした。
BMP4はPDX1陽性腹側前腸内胚葉に必要でない
本実施例は、BMP4の非存在下でのPDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉の産生を記載する。
〔実施例27〕
PDX1陽性背側前腸内胚葉及びPDX1陽性腹側前腸内胚葉の同定のためのマーカー
Analysis(Durham, NC)によるAffymetrixのU133プラス2.0高密度オリゴヌクレ
オチドアレイを用いて、遺伝子発現プロファイルを確定した。手動検査による、並びに階層的クラスター分析によるこれら7つの条件/時点全体の遺伝子発現のパターンを評価した。腹側分化パラダイム及び背側分化パラダイムの両方で発現される新規の遺伝子を見出すためにPDX1発現(背側及び腹側)の一過性パターンを整合させる遺伝子発現のパターンを調べた。
PDX1陰性前腸内胚葉の産生
本実施例は、PDX1陰性前腸内胚葉の産生を記載する。
(50ng/ml)及びKAAD-シクロパミン(0.5μM)を含有する2%FBSを
伴う新鮮なRPMI中での2日分化から成る。
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Claims (20)
- 膵臓−十二指腸ホメオボックス因子−1(PDX1)陽性前腸内胚葉細胞であるヒト細胞を含む、細胞培養物。
- 前記PDX1陽性前腸内胚葉細胞が、NKX2.2、Glut2、KRT19、HNF4α、及びHNF3からなる群より選択される少なくとも1つのマーカーを発現する、請求項1に記載の細胞培養物。
- 前記ヒト細胞の少なくとも7%がPDX1陽性前腸内胚葉細胞である、請求項2に記載の細胞培養物。
- 前記ヒト細胞の少なくとも20%がPDX1陽性前腸内胚葉細胞である、請求項3に記載の細胞培養物。
- レチノイン酸をさらに含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の細胞培養物。
- レチノイン酸及びアクチビンAをさらに含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の細胞培養物。
- 前記PDX1陽性前腸内胚葉細胞が、アルブミン及びHHEXからなる群より選択される少なくとも1つのマーカーを発現する、請求項1に記載の細胞培養物。
- PDX1の発現がHB9の発現よりも大きい、請求項1または7に記載の細胞培養物。
- FGF10をさらに含む、請求項1、7または8のいずれか1項に記載の細胞培養物。
- BMP4をさらに含む、請求項9に記載の細胞培養物。
- KAAD−シクロパミンをさらに含む、請求項9または10に記載の細胞培養物。
- (a) 外因性TGFβスーパーファミリー増殖因子の存在下で多能性ヒト細胞を培養するステ
ップ、及び
(b) ステップ(a)により得られた細胞を、外因性レチノイン酸の存在下培養し、PDX
1−陽性前腸内胚葉細胞を産生するステップ、
を含む、PDX1陽性前腸内胚葉細胞を産生する方法。 - アクチビンAをさらに含む、請求項12に記載の方法。
- FGF10をさらに含む、請求項12または13に記載の方法。
- (a) 外因性TGFβスーパーファミリー増殖因子の存在下で多能性ヒト細胞を培養するステ
ップ、及び
(b) ステップ(a)により得られた細胞を、外因性FGF−ファミリー増殖因子の存在下
培養し、PDX1−陽性前腸内胚葉細胞を産生するステップ、
を含む、PDX1陽性前腸内胚葉細胞を産生する方法。 - 前記PDX1陽性前腸内胚葉細胞が、アルブミン及びHHEXからなる群より選択される少なくとも1つのマーカーを発現する、請求項15に記載の方法。
- 前記FGF−ファミリー増殖因子がFGF10である、請求項15または16に記載の方法。
- ステップ(b)がBMP4をさらに含む、請求項15〜17のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(b)がKAAD−シクロパミンをさらに含む、請求項15〜18のいずれか1項
に記載の方法。 - ステップ(b)がレチノイン酸をさらに含む、請求項15に記載の方法。
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