JP5968270B2 - Pdx1発現背側及び腹側前腸内胚葉 - Google Patents
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Description
本出願は、米国特許仮出願第60/730,917号(表題「PDX1発現背側及び腹側前腸内胚葉(PDX1-EXPRESSING DORSAL AND VENTRAL FOREGUT ENDODERM)」、2005年10月27日提出)(この記載内容は参照により本明細書中で完全に援用される)の本出願であり、そしてそれに対する優先権を主張する。
的に膵島/β−細胞株に向けることが有益である。
抗体、リガンド又は他の分子を用いることにより、細胞集団中の他の細胞から分離される。本発明の他の実施の形態は、PDX1陽性背側偏向前腸内胚葉細胞を富化、単離、及び/又は精製する方法に関する。このような実施の形態では、PDX1陽性背側偏向前腸内胚葉細胞は、表3から選択される細胞表面分子、或いは表4から選択される細胞表面分子のようなPDX1陽性背側偏向前腸内胚葉細胞の細胞表面上で発現される分子と結合する抗体、リガンド又は他の分子を用いることにより、細胞集団中の他の細胞から分離される。本発明のさらに他の実施の形態は、PDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞を富化、単離、及び/又は精製する方法に関する。このような実施の形態では、PDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞は、表3から選択される細胞表面分子のようなPDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞の細胞表面で発現される分子と結合する抗体、リガンド又は他の分子を用いることにより、細胞集団中の他の細胞から分離される。
細胞を含む細胞集団中のヒトPDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞の分化を促進し得る分化因子を同定する方法に関する。この方法は、ヒトPDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞を含む細胞集団を得る工程、細胞集団に候補分化因子を供給する工程、第1の時点での細胞集団中の表3から選択されるマーカーのようなマーカーの発現を確定する工程、そして第2の時点での細胞集団中の同一マーカーの発現を確定する工程を包含する。このような実施の形態では、第2の時点は第1の時点の後であり、そして第2の時点は候補分化因子を細胞集団に供給した後である。第2の時点での細胞集団中のマーカーの発現が第1の時点での細胞集団中のマーカーの発現と比較して増大又は低減される場合には、候補分化因子はヒトPDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞の分化を促進し得る。
、段落1の細胞培養物。
外のヒト細胞の少なくとも約2%がPDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞である、段落18の細胞培養物。
選択される少なくとも1つのマーカーを発現するヒトPDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞であり、当該PDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞が腹側膵芽の細胞に分化し得る複能性細胞である細胞集団。
細胞集団に供給する工程であって、当該PDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞が腹側膵芽の細胞に分化し得る複能性細胞である工程を包含する方法。
。
化集団。
であって、当該細胞集団中のマーカーの発現の増大又は低減は、当該候補分化因子が、当該ヒトPDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞の分化を促進することができることを示す工程を含む方法。
原腸形成と呼ばれる初期ヒト発達におけるきわめて重大な段階は、受精後2〜3週間で起こる。原腸形成は、3つの一次胚葉が最初に特定化され、そして器官形成されるのがこの時期であるため、非常に有意である(Lu他、2001;Schoenwolf and Smith, 2000)。外胚葉は、身体の外被及び全神経系の終局的形成に関与するが、一方、心臓、血液、骨、骨格筋及び他の結合組織は中胚葉に由来する。胚体内胚葉は、食道、胃並びに小腸及び大腸を含む全腸管、並びに腸管に由来する器官、例えば肺、肝臓、胸腺、上皮小体及び甲状腺、胆嚢及び膵臓の形成に関与する胚葉として定義される(Grapin-Botton and Melton, 2000;Kimelman and Griffin, 2000;Tremblay他、2000;Wells and Melton, 1999;Wells and Melton, 2000)。非常に重要な区別は、胚体内胚葉と原始内胚葉と呼ばれる細胞の完全に別個の系統との間でなされるべきである。原始内胚葉は主として、胚体外組織、主に胎盤卵黄嚢の壁側内胚葉部分及び臓側内胚葉部分、並びにライヘルト膜の細胞外マトリックス物質の形成に関与する。
PDX1(STF−1、IDX−1、IPF−1、IUF−1及びGSFとも呼ばれる)は、膵臓及び吻側十二指腸の発生のために必要とされる転写因子である。PDX1は、後前腸内胚葉から生じる膵臓性内胚葉中で最初に発現され、そしてマウスではE8.5から出発して、外分泌細胞及び内分泌細胞の両方を生じる。その後、PDX1はベータ細胞及びいくつかのデルタ細胞に制限されるようになる。この発現パターンは、成人で保持される。PDX1は、発生の早期に十二指腸性内胚葉で(形成中の膵臓に隣接する)、次に十二指腸性腸細胞並びに腸内分泌細胞、洞性胃で、並びに総胆管、胆嚢管及び胆管でも発現される。発現のこの領域も、膵臓発現が主に吻側十二指腸に制限されるようになる時点で、限定されるようになる。
本発明の実施形態は、PDX1陰性内胚葉細胞の産生のための新規の確立したプロセスであって、PDX1陰性内胚葉細胞が腸管の前腸/中腸領域(PDX1陰性前腸/中腸内胚葉)由来の細胞、組織又は器官に分化し得る複能性細胞であるプロセスに関する。本明細
書中で用いる場合、「複能性」又は「複能性細胞」とは、限定数の他の特定細胞型を生じ得るが、3つの一次胚細胞株(内胚葉、外胚葉及び中胚葉)すべてを生じ得るわけではない細胞型を指す。本明細書中で用いる場合、「前腸/中腸」は、腸管の前部分の細胞並びに腸管の中央部分の細胞(前腸/中腸接合部の細胞を含む)を指す。
本発明の実施形態は、PDX1陰性内胚葉細胞の産生のための新規の確立したプロセスであって、PDX1陽性内胚葉細胞が腸管の前腸/中腸領域(PDX1陽性前腸/中腸内胚葉)由来の細胞、組織又は器官に分化し得る複能性細胞であるプロセスに関する。本発明の他の実施形態は、PDX1陽性内胚葉細胞の産生のための新規の確立したプロセスであって、PDX1陽性内胚葉細胞が腸管の前腸/中腸領域(PDX1陽性前腸/中腸内胚葉)由来の細胞、組織又は器官に分化し得る複能性細胞であるプロセスに関する。本明細書中で用いる場合、「複能性」又は「複能性細胞」とは、限定数の他の特定細胞型を生じ得るが、3つの一次胚細胞株(内胚葉、外胚葉及び中胚葉)すべてを生じ得るわけではない細胞型を指す。本明細書中で用いる場合、「前腸/中腸」は、腸管の前部分の細胞並びに腸管の中央部分の細胞(前腸/中腸接合部の細胞を含む)を指す。いくつかの実施形態は、PDX1陽性内胚葉細胞は背側前腸内胚葉細胞である。他の実施形態では、PDX1陽性内胚葉細胞は腹側前腸内胚葉細胞である。
PDX1、SOX17、SOX7、SOX1、ZIC1、NFM、α−フェトプロテイン(AFP)、ホメオボックスA13(HOXA13)、ホメオボックスC6(HOXC6)、及び/又は本明細書中に記載される他のマーカーにより産生される転写体の量が、定量的Q−PCRにより確定される。他の実施形態では、免疫組織化学を用いて、上記遺伝子により発現されるタンパク質を検出する。さらに他の実施形態では、Q−PCR及び免疫組織化学的技法が、このようなマーカーの量又は相対的割合を同定すると共に確定するために用いられる。いくつかの実施形態では、背側及び腹側の両方のPDX1陽性前腸内胚葉細胞に共通であるマーカー、例えばPDX1、及び/又は表3から選択される1つ又は複数のマーカーは、Q−PCR及び/又は免疫組織化学により検出される。他の実施形態では、背側PDX1陽性前腸内胚葉細胞中で選択的に、特異的に又は独自的に発現されるマーカー、例えば表4から選択される1つ又は複数のマーカーは、Q−PCR及び/又は免疫組織化学により検出される。
PDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物及び/又は細胞集団は、PDX1陰性胚体内胚葉(「胚体内胚葉」とも呼ばれる)を先ず産生することにより、多能性細胞から産生される。胚体内胚葉を含む細胞培養物及び富化細胞集団を産生するように多能性細胞を分化させるプロセスは、以下に簡潔に、また米国特許第11/021,618号(表題「胚体内胚葉(DEFINITIVE ENDODERM)」、2004年12月23日出願)(その開示は参照により本明細書に完全に援用される)に詳細に記載されている。これらのプロセスのいくつかでは、出発材料として使用される多能性細胞は、幹細胞である。或る特定のプロセスでは、胚体内胚葉細胞を含む胚体内胚葉細胞培養物及び富化細胞集団は、胚性幹細胞から産生される。本明細書中で用いる場合、「胚性」とは、単一接合体で始まり、発生した配偶子細胞以外には多能性又は全能性細胞を含まない多細胞構造で終わる生物体の一連の発
生段階を指す。配偶子融合により得られる胚のほかに、「胚性」という用語は、体細胞核移入により得られる胚を指す。胚体内胚葉細胞を派生させる好ましい方法は、胚体内胚葉産生のための出発材料として、ヒト胚性幹細胞を利用することである。このような多能性細胞は、桑実胚に由来する細胞、胚の内部細胞塊又は胚の生殖腺隆起に由来する細胞であり得る。ヒト胚性幹細胞は、当該技術分野で既知の方法を使用して、実質的な分化無しで多能性状態で培養物中で維持されることができる。このような方法は、例えば米国特許第5,453,357号、同第5,670,372号、同第5,690,926号、同第5,843,780号、同第6,200,806号及び同第6,251,671号に(その開示は参照により本明細書に完全に援用される)記載されている。
、約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、約7日、約8日、約9日、又は約10日以内に除去され得る。好ましいプロセスでは、増殖因子は、それらの添加後約4日で除去される。
胚体内胚葉へのhESC培養の進行は、胚体内胚葉に特徴的なマーカーの発現を確定することによりモニタリングされ得る。いくつかのプロセスでは、或る特定のマーカーの発現は、マーカーの存在又は非存在を検出することにより確定される。代替的には或る特定のマーカーの発現は、マーカーが細胞培養物又は細胞集団の細胞中に存在するレベルを測定することにより確定され得る。このようなプロセスでは、マーカー発現の測定は、定性的又は定量的であり得る。マーカー遺伝子により産生されるマーカーの発現を定量する一方法は、定量的PCR(Q−PCR)の使用による。Q−PCRを実施する方法は、当該技術分野で既知である。マーカー遺伝子発現を定量するために、当該技術分野で既知である他の方法も用いられ得る。例えばマーカー遺伝子産物の発現は、対象のマーカー遺伝子産物に特異的な抗体を用いることにより検出され得る。或る特定のプロセスでは、胚体内胚葉に特徴的なマーカー遺伝子の発現並びにhESC及び他の細胞型に特徴的なマーカー遺伝子の有意な発現の欠如が確定される。
C., and Broxmeyer, H.J. Leukocyte Biol. 65, 6-15 (1999)]。CXCR4受容体はま
た、T細胞へのHIV−1の進入のための共受容体として機能する[Feng, Y.他, Science, 272, 872-877 (1996)]。[McGrath, K.E.他, Dev. Biology 213, 442-456 (1999)]により実施される広範囲の一連の研究では、ケモカイン受容体CXCR4及びその特有のリガンドであるSDF−1[Kim, C., and Broxmyer, H., J. Leukocyte Biol. 65, 6-15
(1999)]の発現は、マウスにおいて初期発達及び成体期中に示された。発達におけるCXCR4/SDF1相互作用は、いずれかの遺伝子がトランスジェニックマウスで崩壊される[Nagasawa他, Nature, 382, 635-638 (1996), Ma, Q.他, Immunmity, 10, 463-471 (1999)]場合、それが後期胚致死性をもたらしたことが実証された際に明らかとなってきた。McGrath他は、CXCR4は、RNアーゼ保護及びin situハイブリッド形成方法論の組合せを使用して初期原腸形成胚(E7.5)中に検出される最も豊富なケモカイン受容体メッセンジャーRNAであることを実証した。原腸形成胚では、CXCR4/SDF−1シグナル伝達は、原始線条胚葉細胞を遊走することに主に関与されるようであり、この時期に存在する胚体内胚葉、中胚葉及び胚体外中胚葉上で発現される。E7.2−7.8マウス胚では、CXCR4及びα−フェトプロテインは、相互排他的であり、臓側内胚葉における発現の欠如を示している[McGrath, K.E.他, Dev. Biology 213, 442-456
(1999)]。
上述のプロセスのいずれかにより産生される胚体内胚葉細胞は、このような細胞に特異的である親和性タグを使用することにより、富化、単離及び/又は精製することができる。胚体内胚葉細胞に特異的な親和性タグの例は、胚体内胚葉細胞の細胞表面上に存在するが、本明細書中に記載する方法により産生される細胞培養物中に見出されるであろう他の細胞型上に実質的に存在するマーカー分子(例えば、ポリペプチド)に特異的である抗体、リガンド又は他の結合剤である。いくつかのプロセスでは、CXCR4に結合する抗体は、胚体内胚葉細胞の富化、単離又は精製用の親和性タグとして使用される。他のプロセスでは、ケモカインSDF−1又はSDF−1に基づく他の分子もまた、親和性タグとして使用され得る。このような分子としては、SDF−1フラグメント、SDF−1融合体又はSDF−1擬似体が挙げられるが、これらに限定されない。
た後、細胞間接着及び基材接着を低減させるように酵素的に処理した細胞培養物において胚体内胚葉細胞へ結合させる。続いて、ビーズと結合された胚体内胚葉細胞と未結合細胞を分離するのに使用される可動性磁界へ細胞/抗体/ビーズ複合体を暴露させる。いったん胚体内胚葉細胞が培養物において他の細胞と物理的に分離されると、抗体結合は崩壊されて、細胞は、適切な組織培養培地中で再度平板培養される。
上記の方法により産生される細胞組成物としては、胚体内胚葉を含む細胞培養物、並びに胚体内胚葉に富んだ細胞集団が挙げられる。例えば、培養物中の細胞の少なくとも約50〜80%が胚体内胚葉細胞である胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物が産生され得る。分化プロセスの効率は、或る特定のパラメーター、例えば細胞増殖条件、増殖因子濃度及び培養工程の時機(これらに限定されない)を修正することにより調整され得るため、本明細書中に記載される分化手法は、胚体内胚葉への多能性細胞の約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%
、又は約95%より多い転換を生じ得る。胚体内胚葉細胞の単離が用いられるプロセスでは、例えばCXCR4受容体と結合する親和性試薬を用いることにより、実質的に純粋な胚体内胚葉細胞集団が回収され得る。
胚体内胚葉細胞は、これらの細胞のさらなる分化により膵臓分化に向けて特殊化されて、PDX1陰性前腸内胚葉細胞を産生し得る。本明細書中に記載される分化プロセスのいくつかでは、胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物並びに富化又は精製された細胞集団は、PDX1陰性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物及び/又は富化細胞集団へのさらなる分化のために用いられ得る。
は、添加するB27サプリメントの濃度は、市販のB27ストック溶液の濃度の倍数単位で調整され得る。例えば、B27は、50倍ストック溶液としてInvitrogen(Carlsbad, CA)から入手可能である。十分な容量の成長培地へこのストック溶液を十分量添加することにより、所望の量のB27を補充した培地が生じる。例えば、成長培地90mlへ50倍B27ストック溶液10mlを添加することにより、5倍B27を補充した成長培地が生じる。培地中のB27サプリメントの濃度は、約0.1倍、約0.2倍、約0.3倍、約0.4倍、約0.5倍、約0.6倍、約0.7倍、約0.8倍、約0.9倍、約1倍、約1.1倍、約1.2倍、約1.3倍、約1.4倍、約1.5倍、約1.6倍、約1.7倍、約1.8倍、約1.9倍、約2倍、約2.5倍、約3倍、約3.5倍、約4倍、約4.5倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約11倍、約12倍、約13倍、約14倍、約15倍、約16倍、約17倍、約18倍、約19倍、約20倍及び約20倍以上であり得る。
HNF1b及び/又はFOXA1の発現、並びにPDX1の発現の欠如は、Q−PCR及び/又は免疫細胞化学のような上記の方法を用いて検出され及び/又は定量されて、PDX1陰性前腸内胚葉へのPDX1陰性胚体内胚葉の分化をモニタリングする。上記のマーカーのほかに、本発明のいくつかの実施形態では、SOX17の発現も確定される。
を発現する細胞を実質的に含まない。或る特定の実施形態では、本明細書中に記載するプロセスにより産生されるPDX1陰性前腸内胚葉細胞培養物は、臓側内胚葉、壁側内胚葉及び/又は神経細胞を実質的に含まない。
本発明のいくつかの実施形態は、PDX1陰性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような細胞組成物に関し、ここでPDX1陰性前腸内胚葉細胞は、腸管の前部分に由来する細胞、組織又は器官へ分化することができる多分化能細胞である。或る特定の実施形態によれば、PDX1陰性前腸内胚葉は哺乳類細胞であり、好ましい実施形態では、そのような細胞はヒト細胞である。
なくとも約9%、少なくとも約8%、少なくとも約7%、少なくとも6%、少なくとも5%、少なくとも4%、少なくとも約3%、少なくとも約2%又は少なくとも約1%のPDX1陰性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物及び/又は細胞集団を産生する。好ましい実施形態では、この細胞培養物又は細胞集団の細胞は、ヒト細胞から成る。いくつかの実施形態では、細胞培養物又は細胞集団中のPDX1陰性前腸内胚葉細胞のパーセントは、培養物中に存在するフィーダー細胞を考慮せずに算出される。
X7、SOX1、ZIC1及び/又はNFMマーカーの発現よりも多い。他の実施形態では、SOX17、HNF1b及び/又はFOXA1マーカーの発現は、少なくとも約5%のヒト細胞において、少なくとも約10%のヒト細胞において、少なくとも約15%のヒト細胞において、少なくとも約20%のヒト細胞において、少なくとも約25%のヒト細胞において、少なくとも約30%のヒト細胞において、少なくとも約35%のヒト細胞において、少なくとも約40%のヒト細胞において、少なくとも約45%のヒト細胞において、少なくとも約50%のヒト細胞において、少なくとも約55%のヒト細胞において、少なくとも約60%のヒト細胞において、少なくとも約65%のヒト細胞において、少なくとも約70%のヒト細胞において、少なくとも約75%のヒト細胞のヒト細胞において、少なくとも約80%のヒト細胞において、少なくとも約85%のヒト細胞において、少なくとも約90%のヒト細胞において、少なくとも約95%のヒト細胞において、或いは少なくとも約98%のヒト細胞において、AFP、SOX7、SOX1、ZIC1及び/又はNFMマーカーの発現よりも多い。いくつかの実施形態では、細胞培養物又は細胞集団中のヒト細胞のパーセント(ここで、SOX17、HNF1b及び/又はFOXA1マーカーの発現は、AFP、SOX7、SOX1、ZIC1及び/又はNFMマーカーの発現よりも多い)は、フィーダー細胞を考慮せずに算出される。
本明細書中に記載されるPDX1陽性前腸内胚葉細胞を含むPDX1陽性前腸内胚葉細胞培養物及び細胞集団は、上記のような多能性細胞から生じるPDX1陰性胚体内胚葉細胞から産生される。好ましい方法は、出発物質としてヒト胚性幹細胞を利用する。一実施形態では、hESCは先ずPDX1陰性胚体内胚葉細胞に転換され、これは次に、PDX1陽性前腸内胚葉細胞に転換される。しかしながら、PDX1陽性前腸内胚葉の産生のための出発物質は、多能性細胞分化方法を用いて産生される胚体内胚葉細胞に限定されないと理解されたい。むしろ、任意のPDX1陰性胚体内胚葉細胞が、それらの起源と関係なく、本明細書中に記載される方法に用いられ得る。
分化される細胞である。分化因子、例えばアクチビンA及びBMP4は、約1ng/ml〜約1000ng/mlの濃度で供給される。本発明の或る特定の実施形態では、培地を状態調節するために用いられる細胞は、低血清RPMI中で約5日間に亘って、hESCから分化される。いくつかの実施形態によれば、低血清RPMIとは、低血清含有培地を指し、この場合、血清濃度は限定期間に亘って漸次増大される。例えば一実施形態では、低血清RPMIは、細胞増殖の第1日目に約0.2%のウシ胎児血清(FBS)、細胞増殖の第2日目に約0.5%FBS、そして細胞増殖の第5日目に約2%FBSを含む。別の実施形態では、低血清RPMIは、1日目に約0%、2日目に約0.2%、3〜6日目に約2%の濃度を含む。或る特定の好ましい実施形態では、低血清RPMIは、1つ又は複数の分化因子、例えばアクチビンA及びBMP4を供給される。培地を状態調節するために用いられる細胞を調製するに際しての使用のほかに、低血清RPMIは、PDX1陰性胚体内胚葉細胞からのPDX1陽性前腸内胚葉細胞の分化のための培地として用いられ得る。
少なくとも約50μMの濃度で存在するように細胞培養物の細胞に供給される。本明細書で用いられるように、「レチノイド」は、レチノール、レチナール又はレチノイン酸、及び任意のこれらの化合物の誘導体を表す。好ましい実施形態では、レチノイドはレチノイン酸である。
v/v)未満、約0.5%(v/v)未満、約0.6%(v/v)未満、約0.7%(v/v)未満、約0.8%(v/v)未満、約0.9%(v/v)未満、約1%(v/v)未満、約2%(v/v)未満、約3%(v/v)未満、約4%(v/v)未満、約5%(v/v)未満、約6%(v/v)未満、約7%(v/v)未満、約8%(v/v)未満、約9%(v/v)未満、約10%(v/v)未満、約15%(v/v)未満又は約20%(v/v)未満であり得る。いくつかの実施形態では、PDX1陽性前腸内胚葉細胞は血清を用いずに増殖される。他の実施形態では、PDX1陽性前腸内胚葉細胞は血清代替品で増殖される。
本明細書中に記載される背側PDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む背側PDX1陽性前腸内胚葉細胞培養物及び細胞集団は、上記のような多能性細胞から生じるPDX1陰性胚体内胚葉から産生される。さらに、上記のように、好ましい方法は出発材料としてヒト胚性幹細胞を利用する。一実施形態では、hESCは先ずPDX1陰性胚体内胚葉細胞に転換され、これは次に、背側PDX1陽性前腸内胚葉細胞に転換される。しかしながら、背側PDX1陽性前腸内胚葉細胞の産生のための出発材料は、多能性細胞分化方法を用いて産生される胚体内胚葉細胞に限定されないと理解される。むしろ、任意のPDX1陰性胚体内胚葉細胞は、それらの起源にかかわらず、本明細書中に記載される方法に用いられ得る。
のために用いられる因子を添加する。他の実施形態では、PDX1陰性、SOX17−陽性胚体内胚葉細胞に関して富化される細胞集団は、背側PDX1陽性前腸内胚葉細胞の産生のための供給源として用いられる。
Labs培地(CMRL培地)(Invitrogen, Carlsbad, CA)と一緒に用いられる。
性FGF−10又は他のFGFファミリー増殖因子の非存在下でレチノイン酸を供給することにより産生される。このような実施形態では、RAは約2μMの濃度で供給される。好ましい実施形態では、RAはCMRL培地中に約2μMの濃度で供給される。
溶液10mlを成長培地90mlに加えることで、5倍B27を補充した成長培地が作られる。培地中のB27サプリメントの濃度は、約0.1倍、約0.2倍、約0.3倍、約0.4倍、約0.5倍、約0.6倍、約0.7倍、約0.8倍、約0.9倍、約1倍、約1.1倍、約1.2倍、約1.3倍、約1.4倍、約1.5倍、約1.6倍、約1.7倍、約1.8倍、約1.9倍、約2倍、約2.5倍、約3倍、約3.5倍、約4倍、約4.5倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約11倍、約12倍、約13倍、約14倍、約15倍、約16倍、約17倍、約18倍、約19倍、約20倍及び約20倍超であり得る。
本明細書中に記載される腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞培養物及び細胞集団は、上記のような多能性細胞から生じるPDX1陰性胚体内胚葉から産生される。さらに、上記のように、好ましい方法は出発材料としてヒト胚性幹細胞を利用する。一実施形態では、hESCは先ずPDX1陰性胚体内胚葉細胞に転換され、これは次に、腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞に転換される。しかしながら、腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞の産生のための出発材料は、多能性細胞分化方法を用いて産生される胚体内胚葉細胞に限定されないと理解される。むしろ、任意のPDX1陰性胚体内胚葉細胞は、それらの起源にかかわらず、本明細書中に記載される方法に用いられ得る。
前腸内胚葉細胞へのPDX1陰性胚体内胚葉細胞培養物又は細胞集団の少なくとも一部の分化を促進するのに十分な濃度でこれらの因子が細胞培養物又は細胞集団中に存在するよう、レチノイド並びに上記の分化因子の組合せが細胞に供給される。細胞培養物及び/又は細胞集団に関して用いられる場合、「一部」という用語は、単一細胞から細胞培養物又は細胞集団の全体までの範囲で、任意のゼロ以外の量の細胞培養物又は細胞集団を意味する。好ましい実施形態において、「一部」という用語は、少なくとも5%、少なくとも6%、少なくとも7%、少なくとも8%、少なくとも9%、少なくとも10%、少なくとも11%、少なくとも12%、少なくとも13%、少なくとも14%、少なくとも15%、少なくとも16%、少なくとも17%、少なくとも18%、少なくとも19%、少なくとも20%、少なくとも21%、少なくとも22%、少なくとも23%、少なくとも24%、少なくとも25%、少なくとも26%、少なくとも27%、少なくとも28%、少なくとも29%、少なくとも30%、少なくとも31%、少なくとも32%、少なくとも33%、少なくとも34%、少なくとも35%、少なくとも36%、少なくとも37%、少なくとも38%、少なくとも39%、少なくとも40%、少なくとも41%、少なくとも42%、少なくとも43%、少なくとも44%、少なくとも45%、少なくとも46%、少なくとも47%、少なくとも48%、少なくとも49%、少なくとも50%、少なくとも51%、少なくとも52%、少なくとも53%、少なくとも54%、少なくとも55%、少なくとも56%、少なくとも57%、少なくとも58%、少なくとも59%、少なくとも60%、少なくとも61%、少なくとも62%、少なくとも63%、少なくとも64%、少なくとも65%、少なくとも66%、少なくとも67%、少なくとも68%、少なくとも69%、少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%又は少なくとも75%の細胞培養物又は細胞集団を意味する。
多能性細胞からの胚体内胚葉細胞の分化に関するのと同様に、PDX1陰性、SOX17陽性胚体内胚葉からPDX1陽性前腸内胚葉細胞への分化の進行は、これらの細胞型に特
徴的なマーカーの発現を確定することによりモニタリングされ得る。このようなモニタリングは、種々の条件下での、例えば1つ又は複数の分化因子濃度及び環境条件下での所望量のPDX1陽性前腸内胚葉の産生のために十分である時間の量を確定させ得る。好ましい実施形態では、所望量のPDX1陽性前腸内胚葉の産生のために十分である時間の量は、PDX1の発現を検出することにより確定される。本発明のいくつかの実施形態では、或る特定のマーカーの発現は、マーカーの存在又は非存在を検出することにより確定される。代替的には、或る特定のマーカーの発現は、マーカーが細胞培養物又は細胞集団の細胞中に存在するレベルを測定することにより確定され得る。このような実施形態では、マーカー発現の測定は、定性的又は定量的であり得る。上記のように、マーカー遺伝子により産生される発現マーカーを定量する好ましい方法は、Q−PCRの使用による。特定の実施形態では、Q−PCRは、PDX1陽性前腸内胚葉に特徴的なマーカー遺伝子の発現を、並びに他の細胞型に特徴的なマーカー遺伝子の発現の欠如を定量することにより、PDX1陽性前腸内胚葉細胞へのPDX1陰性、SOX17陽性胚体内胚葉培養の細胞の進行をモニタリングするために用いられる。当該技術分野で既知である他の方法も、マーカー遺伝子発現を定量するために用いられ得る。例えばマーカー遺伝子産物の発現は、対象となる当該マーカー遺伝子産物に特異的な抗体を用いることにより検出され得る。本発明のいくつかの実施形態では、PDX1陽性前腸内胚葉に特徴的なマーカー遺伝子の発現並びにPDX1陰性胚体内胚葉、hESC及び他の細胞型に特徴的なマーカー遺伝子の有意の発現の欠如が確定される。
以下の実施例中の表3及び/又は表4に記載される1つ又は複数のマーカーの発現は、背側PDX1陽性内胚葉へのPDX1陰性胚体内胚葉の分化をモニタリングするために、上記の方法、例えばQ−PCR及び/又は免疫細胞化学を用いて検出及び/又は定量され得る。背側偏向及び腹側偏向PDX1陽性前腸内胚葉細胞の両方に関連したマーカーは、表3に記載されている。これらのマーカーのうち、CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2及びSLC27A2から成る群から選択されるマーカーは、細胞表面マーカーである。背側PDX1陽性前腸内胚葉の産生をモニタリングするための表3に列挙されるいくつかの好ましいマーカーは、SERPINF2、DUSP9、CDH6及びSOX9から成る群から選択される。背側偏向前腸内胚葉に関連したマーカーは、表4に記載されている。表4マーカーの各々は、他のPDX1陽性細胞と比較して、背側PDX1陽性前腸内胚葉細胞中で選択的に、特異的に又は独自的に発現される。これらのマーカーのうち、ADORA
2A、CD47、EPB41L1、MAG、SFRP5、SLC16A10、SLC16A2、SLC1A3、SLC30A4、SLICK、SLITRK4及びXPR1から成る群から選択されるマーカーは、細胞表面マーカーである。背側PDX1陽性前腸内胚葉の産生をモニタリングするための表4に列挙されるいくつかの好ましいマーカーは、HOXA1、PDE11A、FAM49A及びWNT5Aから成る群から選択される。
前節に記載されたように、背側偏向及び腹側偏向PDX1陽性前腸内胚葉細胞に関連したマーカーは、表3に記載されている。このようなものとして、表3に記載されるマーカーのうちの1つ又は複数の発現は、上記の方法、例えばQ−PCR及び/又は免疫細胞化学を用いて検出及び/又は定量されて、腹側PDX1陽性内胚葉へのPDX1陰性胚体内胚葉の分化をモニタリングし得る。表3に記載されるマーカーのうち、CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2及びSLC27A2から成る群から選択されるマーカーは、細胞表面マーカーである。腹側PDX1陽性前腸内胚葉の産生をモニタリングするための表3に列挙されるいくつかの好ましいマーカーは、SERPINF2、DUSP9、CDH6及びSOX9から成る群から選択される。さらに、表4に記載されるマーカーは、背側偏向前腸内胚葉中で選択的に、特異的に又は独自的に発現されるため、これらのマーカーのうちの1つ又は複数の、背側PDX1陽性前腸内胚葉中での発現と比較した場合の、発現の欠如又は発現低減を検出することは、腹側PDX1陽性前腸内胚葉へのPDX1陰性胚体内胚葉の分化をモニタリングするために有用でもある。表4マーカーのうち、ADORA2A、CD47、EPB41L1、MAG、SFRP5、SLC16A10、SLC16A2、SLC1A3、SLC30A4、SLICK、SLITRK4及びXPR1から成る群から選択されるマーカーは、細胞表面マーカーである。背側PDX1陽性前腸内胚葉の産生をモニタリングするための表4に列挙されるいくつかの好ましいマーカーは、HOXA1、PDE11A、FAM49A及びWNT5Aから成る群から選択される。このようなものとして、表3から選択される1つ又は複数のマーカーを発現するPDX1陽性細胞中のこれらのマーカーの非存在又は微量の発現は、腹側PDX1陽性ということを示す。
/又は神経細胞中で発現されるマーカー、例えばSOX7、AFP、SOX1、ZIC1及び/又はNFM(これらに限定されない)の発現が確定される。
上記のプロセスのいずれかにより産生されるPDX1陽性前腸内胚葉細胞、例えば背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、このような細胞に特異的である親和性タグを用いることにより、富化され、単離され、及び/又は精製され得る。背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞に特異的な親和性タグの例は、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞の細胞表面に存在するが、本明細書中に記載される方法により産生される細胞培養物中に見出される他の細胞型上には実質的に存在しないマーカー分子(例えばポリペプチド)に特異的な抗体、リガンド又は他の結合作因である。いくつかのプロセスでは、CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2、SLC27A2、ADORA2A、CD47、EPB41L1、MAG、SFRP5、SLC16A10、SLC16A2、SLC1A3、SLC30A4、SLICK、SLITRK4及びXPR1から成る群から選択される細胞表面マーカーと結合する抗体が、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞の富化、単離又は精製のための親和性タグとして用いられる。
離回収され、それによりこのような細胞型の単離を生じる。所望により、単離細胞組成物は、代替的親和性ベースの方法を用いることにより、或いは背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞に特異的である同一の又は異なるマーカーを用いる付加的回数の選別により、さらに精製され得る。
本発明の付加的態様に関して、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、富化され、単離され、及び/又は精製され得る。本発明のいくつかの実施形態では、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞に関して富化される細胞集団は、細胞培養物からこのような細胞を単離することにより産生される。
本発明のいくつかの実施形態は、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞組成物、例えば細胞培養物又は細胞集団であって、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞が背側膵芽及び/又は腹側膵芽のような腸管の前部分に由来する細胞、組織又は器官に分化し得る複能性細胞である細胞組成物に関する。或る特定の実施形態によれば、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞は哺乳類の細胞であり、好ましい実施形態では、このような細胞はヒト細胞である。
約3%、少なくとも約2%、又は少なくとも約1%の背側及び/又は腹側のPDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物及び/又は細胞集団を産生する。好ましい実施形態では、この細胞培養物又は細胞集団の細胞は、ヒト細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養物又は細胞集団中の背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞のパーセンテージは、培養物中に残存するフィーダー細胞と関係なく算定される。
生した多細胞構造の生殖腺組織又は胚組織に由来する。
ト細胞の少なくとも約70%で、ヒト細胞の少なくとも約75%で、ヒト細胞の少なくとも約80%で、ヒト細胞の少なくとも約85%で、ヒト細胞の少なくとも約90%で、ヒト細胞の少なくとも約95%で、又はヒト細胞の少なくとも約98%で、AFP、SOX7、SOX1、ZIC1及び/又はNFMマーカーの発現よりも大きい。いくつかの実施形態では、表3から選択される1つ又は複数のマーカーの発現がAFP、SOX7、SOX1、ZIC1及び/又はNFMマーカーの発現よりも大きい細胞培養物又は細胞集団中のヒト細胞のパーセンテージは、フィーダー細胞を考慮せずに算定される。
選択される1つ又は複数のマーカーの発現が内胚葉細胞の少なくとも約2%においてAFP、SOX7、SOX1、ZIC1及び/又はNFMマーカーの発現より大きい組成物に関する。他の実施形態では、PDX1マーカーの発現、及び表3又は表4から選択される1つ又は複数のマーカーの発現は、内胚葉細胞の少なくとも約5%、内胚葉細胞の少なくとも約10%、内胚葉細胞の少なくとも約15%、内胚葉細胞の少なくとも約20%、内胚葉細胞の少なくとも約25%、内胚葉細胞の少なくとも約30%、内胚葉細胞の少なくとも約35%、内胚葉細胞の少なくとも約40%、内胚葉細胞の少なくとも約45%、内胚葉細胞の少なくとも約50%、内胚葉細胞の少なくとも約55%、内胚葉細胞の少なくとも約60%、内胚葉細胞の少なくとも約65%、内胚葉細胞の少なくとも約70%、内胚葉細胞の少なくとも約75%、内胚葉細胞の少なくとも約80%、内胚葉細胞の少なくとも約85%、内胚葉細胞の少なくとも約90%、内胚葉細胞の少なくとも約95%、又は内胚葉細胞の少なくとも約98%でAFP、SOX7、SOX1、ZIC1及び/又はNFMマーカーの発現より大きい。
本発明のいくつかの態様は、SOX17陽性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団中でのPDX1遺伝子産物の発現を増大する方法に関する。このような実施形態では、SOX17陽性胚体内胚葉細胞は、PDX1遺伝子産物の発現を増大するために十分である量で分化因子と接触される。分化因子と接触されるSOX17陽性胚体内胚葉細胞は、PDX1陰性又はPDX1陽性のいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、分化因子はレチノイドである。或る特定の実施形態では、SOX17陽性胚体内胚葉細胞は、約0.01μM〜約50μMの範囲の濃度でレチノイドと接触される。好ましい実施形態では、レチノイドはRAである。
本発明の付加的態様は、PDX1陽性前腸内胚葉細胞へのPDX1陰性胚体内胚葉細胞の分化を促進し得る1つ又は複数の分化因子を同定する方法に関する。このような方法では、PDX1陰性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団が得られ、そして細胞培養物又は細胞集団中でのPDX1の発現が確定される。PDX1の発現を確定した後、細胞培養物又は細胞集団の細胞は、候補分化因子と接触される。いくつかの実施形態では、PDX1の発現は、細胞と候補分化因子との接触時、又は接触直後に、確定される。PDX1発現は次に、細胞と候補分化因子との接触後の1つ又は複数の時点で確定される。候補分化因子との接触前のPDX1発現と比較して、PDX1の発現が候補分化因子との接触後に増大された場合、候補分化因子は、PDX1陽性前腸内胚葉細胞へのPDX1陰性胚体内胚葉細胞の分化を促進し得ると同定される。
の分化を促進し得る因子を同定する上記の方法は、細胞培養物又は細胞集団中でのHOXA13遺伝子及び/又はHOXC6遺伝子の発現を確定することも包含する。このような実施形態では、HOXA13及び/又はHOXC6の発現は、細胞が候補分化因子と接触される前及び後の両方で確定される。候補分化因子との接触前のPDX1及びHOXA13発現と比較して、PDX1及びHOXA13の発現は、候補分化因子との接触後に増大された場合、候補分化因子は、PDX1陽性前腸内胚葉細胞へのPDX1陰性胚体内胚葉細胞の分化を促進し得るとして同定される。同様に、候補分化因子との接触前のPDX1及びHOXC6発現と比較して、PDX1及びHOXC6の発現が候補分化因子との接触後に増大された場合、候補分化因子は、PDX1陽性前腸内胚葉細胞へのPDX1陰性胚体内胚葉細胞の分化を促進し得ると同定される。好ましい実施形態では、候補分化因子は、細胞培養物又は細胞集団の細胞と候補分化因子との接触の前及び後の両方で、PDX1、HOXA13及びHOXC6の発現を確定することにより、候補分化因子は、PDX1陽性前腸内胚葉細胞へのPDX1陰性胚体内胚葉細胞の分化を促進し得ると同定される。好ましい実施形態では、PDX1、HOXA13及び/又はHOXC6の発現は、Q−PCRにより確定される。
し得る因子を同定し得ると理解される。いくつかの実施形態では、表3から選択される1つ又は複数のマーカー及び表4から選択される1つ又は複数のマーカーの発現がモニタリングされる。
本明細書中に記載される或る特定のスクリーニング方法は、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進し得る少なくとも1つの分化因子を同定するための方法に関する。これらの方法のいくつかの実施形態では、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞、例えばヒト背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞集団が得られる。次に細胞集団は、候補分化因子を供給される。候補分化因子を供給される前又はそれとほぼ同時である第1の時点で、マーカーの発現が確定される。代替的には、マーカーの発現は、候補分化因子の供給後に確定され得る。第1の時点の後、そして細胞集団に候補分化因子を供給する工程の後である第2の時点で、同一マーカーの発現が再び確定される。候補分化因子が背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進し得るか否かは、第1の時点でのマーカーの発現を第2の時点でのマーカーの発現と比較することにより確定される。第2の時点でのマーカーの発現が、第1の時点でのマーカーの発現と比較して増大されるか又は低減された場合には、候補分化因子は、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進し得る。好ましい実施形態では、マーカーの発現は、Q−PCRにより確定される。
分化因子と接触されるか、そうでなければそれを供給される。候補分化因子は、ヒト背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進する能力を有し得る任意の分子を含み得る。本明細書中に記載されるいくつかの実施形態では、候補分化因子は、1つ又は複数の型の細胞に関する分化因子であることが既知である分子を含む。代替的実施形態では、候補分化因子は、細胞分化を促進することが既知でない分子を含む。好ましい実施形態では、候補分化因子は、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進することが既知でない分子を含む。
、メラニン細胞刺激ホルモン、コルチコトロピン(corticortropin)、リポトロピン、チロトロピン、成長ホルモン、プロラクチン、黄体形成ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、コルチコトロピン放出因子、ゴナドトロピン放出因子、プロラクチン放出因子、プロラクチン阻害因子、成長ホルモン放出因子、ソマトスタチン、チロトロピン放出因子、カルシトシン遺伝子関連ペプチド、副甲状腺ホルモン、グルカゴン様ペプチド1、グルコース依存性インスリン分泌促進ポリペプチド、ガストリン、セクレチン、コレシストキシン、モチリン、血管活性腸管ペプチド、物質P、膵臓ポリペプチド、ペプチドチロシンチロシン、神経ペプチドチロシン、インスリン、グルカゴン、胎盤性ラクトゲン、リラキシン、アンジオテンシンII、カルシトリオール(calctriol)、心房性ナトリウム利尿ペプチド、及びメラトニン、チロキシン、トリヨードチロニン、カルシトニン、エストラジオール、エストロン、プロゲステロン、テストステロン、コルチゾール、コルチコステロン、アルドステロン、エピネフィン、ノルエピネフリン(norepinepherine)、アンドロスチエン(androstiene)、カルシトリオール、コラーゲン、デキサメタゾン、β−メルカプトエタノール、レチノイン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、5−アザシチジン、アンホテリシンB、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩(Ascrorbate)、イソブチルキサンチン、インドメタシン、β−グリセロールホスフェート、ニコチンアミド、DMSO、チアゾリジンジオン、及びTWS119から成る群から選択される1つ又は複数の増殖因子を含む。
チノイド、FGF10、FGF−4、BMP−4、アクチビンA、アクチビンB又は任意の他の前腸分化因子以外の任意の分子を含む候補分化因子を供給される。いくつかの実施形態では、細胞集団は、レチノイン酸以外の任意の分子を含む候補分化因子を供給される。
0時間である。
ヒトES細胞
内胚葉発達についての研究のために、本発明者等は、多能性であり、そして正常核型を保持しながら培養中に外見上無限に分裂し得るヒト胚性幹細胞を用いた。単離のために免疫学的又は機械的方法を用いて、5日齢胚内部細胞塊からES細胞を得た。特にヒト胚性幹細胞株hESCyt−25を、患者によるインフォームドコンセント後に、体外受精周期からの過剰凍結胚から得た。解凍の直後に、ES培地(DMEM、20%FBS、非必須
アミノ酸、β−メルカプトエタノール、ITSサプリメント)中のマウス胚線維芽細胞(MEF)上に孵化胚盤胞を平板培養した。胚が培養皿に接着し、そして約2週間後、未分化hESCの領域を、MEFとともに新たな皿に移した。機械的に切断し、ディスパーゼで手短に消化し、その後、細胞クラスターを機械的に取り出して、洗浄し、再度平板培養することにより移動を成し遂げた。誘導以来、hESCyt−25を、100回にわたって逐次継代した。胚体内胚葉の産生のための出発物質として、hESCyt−25ヒト胚性幹細胞株を用いた。
hESCyt−25特性化
ヒト胚性幹細胞株hESCyt−25は、培養中に18ヶ月にわたって、正常な形態特性、核型特性、増殖特性及び自己再生特性を保持した。この細胞株は、OCT4、SSEA−4及びTRA−1−60抗原(これらはすべて、未分化hESCに特有である)に対する強免疫反応性を示し、そしてアルカリ性ホスファターゼ活性、並びに他の確立されたhESC株と同一の形態を示す。さらにヒト幹細胞株hESCyt−25は、懸濁液中で培養される場合、胚様体(EB)も容易に形成する。その多能性の実証として、hESCyT−25は、3つの主要胚葉を表わす種々の細胞型に分化する。ZIC1に関するQ−PCR、並びにネスチン及びより成熟したニューロンマーカーに関する免疫細胞化学(ICC)により、外胚葉産生を実証した。β−IIIチューブリンに関する免疫細胞化学染色を、初期ニューロンに特徴的な伸長細胞のクラスター中で観察した。予め、レチノイン酸で懸濁液中のEBを処理して、臓側内胚葉(VE)、胚体外系統への多能性幹細胞の分化を誘導した。処理された細胞は、高レベルのα−フェトプロテイン(AFP)及びSOX7(VEの2つのマーカー)を54時間の処理により発現した。単層中で分化された細胞は、免疫細胞化学染色により実証されるように、散在性パッチ中でAFPを発現した。以下で記載するように、hESCyT−25細胞株は、AFP発現の非存在下でのSOX17に関する実時間定量的ポリメラーゼ連鎖反応(Q−PCR)及び免疫細胞化学により立証されるように、胚体内胚葉も形成し得た。中胚葉への分化を実証するために、分化中のEBを、いくつかの時点でのブラキュリ遺伝子発現に関して分析した。ブラキュリ発現は、実験経過中に漸進的に増大した。上記に鑑みて、三胚葉を表わす細胞を形成する能力により示されるように、hESCyT−25株は多能性である。
SOX17抗体の産生
hESC培養物における胚体内胚葉の同定に対する主要な妨害は、適切なツールの欠如である。したがって、本発明者等は、ヒトSOX17タンパク質に対する抗体の産生に着手した。
FP、SPARC及びトロンボモジュリンに対して反応性がある他の抗体もまた、臓側内胚葉及び壁側内胚葉(胚体外内胚葉)の産生を除外するのに使用された。
DNA免疫化により産生されるE2特異的モノクローナル抗体によるヒト血清におけるG型肝炎ウイルス粒子の同定(Identification of hepatitis G virus particles in human serum by E2-specific monoclonal antibodides generated by DNA immunization), J.
Virol. 72: 4541-4545、Krasemann他(1999) 異例の核酸ベースの免疫化戦略を用いたタンパク質に対するモノクローナル抗体の生成(Generation of monoclonal antibodides against proteins with an unconventional nucleic acid-based immunization strategy),
J. Biotechnol. 73: 119-129、及びUlivieri他(1996) DNA免疫化によるヘリコバクター・ピロリ細胞空胞化毒素の規定部分に対するモノクローナル抗体の生成(Generation of
a monoclonal antibody to a defined portion of the Heliobacter pylori vacuolating cytotoxin by DNA immunization), J. Biotechnol. 51: 191-194(その開示は参照により本明細書に完全に援用される)に見出すことができる。
テアーゼ阻害剤のカクテル(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)を含有する50mM TRIS−HCl(pH8)、150mM NaCl、0.1% SDS、0.5%デオキシコール酸中で回収した。NuPAGE(4〜12%グラジエントポリアクリルアミド、Invitrogen, Carlsbad, CA)上でのSDS−PAGEにより分離され、且つPDVF膜(Hercules, CA)上へのエレクトロブロッティングにより移入された細胞タンパク質100μgのウェスタンブロット分析は、10mMTRIS−HCl(pH8)、150mM NaCl、10%BSA、0.05%Tween−20(Sigma, St. Louis, MO)中のラットSOX17抗血清の1000倍希釈で、続いてアルカリホスファターゼ結合抗ラットIgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)でプロービングして、ベクターブラックアルカリホスファターゼ染色(Vector Laboratories, Burlingame, CA)により明らかにした。使用されるタンパク質サイズ標準物質は、広範囲の色彩マーカー(Sigma, St. Louis, MO)であった。
胚体内胚葉のマーカーとしてのSOX17抗体の確証
部分的に分化させたhESCをSOX17及びAFP抗体で同時標識して、SOX17抗体がヒトSOX17タンパク質に特異的であり、さらに胚体内胚葉をマークすることを実証した。SOX17、SOX7(これは、SOX遺伝子ファミリーサブグループFの密接に関連する成員である(図3))及びAFPはそれぞれ、臓側内胚葉で発現されることが実証されている。しかしながら、AFP及びSOX7は、ICCにより検出可能なレベルでは、胚体内胚葉細胞では発現されず、したがってそれらは、真正(bonifide)の胚体内胚葉細胞に関する陰性マーカーとして用いることができる。SOX17抗体は、細胞の別個の分類として存在するか、或いはAFP陽性細胞と混合される細胞の集団を標識することが示された。特に、図5Aは、少数のSOX17細胞がAFPで同時標識されることを示すが、SOX17+細胞の区域においてAFP+細胞がほとんど存在しないか、或いは全く存在しない領域も見られた(図5B)。同様に、壁側内胚葉は、SOX17を発現することが報告されているため、壁側マーカーSPARC及び/又はトロンボモジュリン(TM)と共にSOX17による抗体の同時標識を使用して、壁側内胚葉であるSOX17+細胞を同定することができる。図6A〜図6Cに示されるように、トロンボモジュリン及びSOX17同時標識された壁側内胚葉細胞は、hES細胞の無作為分化により産生された。
プロファイルの特異性のさらなる徴候として、SOX17及びAFP遺伝子発現が、抗体標識細胞の相対数と定量的に比較された。図7Aに示されるように、レチノイン酸(臓側内胚葉誘導物質)又はアクチビンA(胚体内胚葉誘導物質)で処理したhESCは、SOX17mRNA発現のレベルにおいて10倍の差をもたらした。この結果は、SOX17抗体標識細胞数における10倍の差に反映している(図7B)。さらに、図8Aに示されるように、hESCのアクチビンA処理は、処理無しと比較して6.8倍AFP遺伝子発現を抑制した。これは、図8B及び図8Cに示されるように、これらの培養物におけるAFP標識細胞の数の劇的な減少により可視的に反映された。これをさらに定量化するために、AFP遺伝子発現におけるこのおよそ7倍の減少は、フローサイトメトリーにより測定される場合のAFP抗体標識細胞数における同様の7倍の減少の結果であることが実証された(図9A及び図9B)。この結果は、Q−PCRにより観察されるような遺伝子発現の定量的変化は、抗体染色により観察されるような細胞型特定化における変化を反映することを示すという点で極めて有意である。
Q−PCR遺伝子発現アッセイ
以下の実験では、リアルタイム定量的RT−PCR(Q−PCR)が、hESC分化に対する様々な処理の影響をスクリーニングするのに使用される主要なアッセイであった。特に、遺伝子発現のリアルタイム測定は、Q−PCRにより多数の時点で多数のマーカー遺伝子に関して分析した。細胞集団の全体的な動態のより良好な理解を得るために、所望の細胞型並びに望ましくない細胞型のマーカー遺伝子の特徴を評価した。Q−PCR分析の長所として、ゲノム配列が容易に入手可能である場合、その極度の感度及び必要なマーカーを開発することが比較的容易であることが挙げられる。さらに、Q−PCRの極めて高い感度により、相当大きな集団内での比較的少数の細胞からの遺伝子発現の検出が可能となる。さらに、非常に低レベルの遺伝子発現を検出する能力は、集団内の「分化の偏り」に関する指標を提供する。これらの細胞の表現型の顕在的な分化に先立つ特定の分化経路に対する偏りは、免疫細胞化学的技法を使用して認知することはできない。このため、Q−PCRは、分化処理の成功をスクリーニングするための少なくとも補完的であり且つ免疫組織化学的技法よりも潜在的に相当優れている分析の方法を提供する。さらに、Q−PCRは、半ハイスループットスケール(semi-high throughput scale)の分析にて定量的方式で分化プロトコルの成功を評価するメカニズムを提供する。
用のcDNAサンプルの積上げが可能となり、したがって、サンプル間の逆転写効率における可変性を回避した。
胚体内胚葉へのヒトES細胞の定方向分化
ヒトES細胞培養物は、それらの未分化状態を能動的に維持しない条件下で培養される場合に、無作為に分化する。この不均一分化は、壁側内胚葉及び臓側内胚葉の両方から構成される胚体外内胚葉細胞(AFP、SPARC及びSOX7発現)並びにZIC1及びネ
スチン(外胚葉)及びブラキュリ(中胚葉)発現によりマークされるような初期外胚葉誘導体及び中胚葉誘導体の産生をもたらす。胚体内胚葉細胞出現は、ES細胞培養物における特異的抗体マーカーの欠如に関して検査又は特定されていない。それ自体で、また初期状態で、ES細胞培養物における初期胚体内胚葉産生は、十分研究されていない。胚体内胚葉細胞に関する満足のいく抗体試薬が入手不可能であったため、特性化の大部分が、外胚葉及び胚体外内胚葉に焦点を当ててきた。概して、無作為に分化されたES細胞培養物においてSOX17hi胚体内胚葉細胞と比較して、有意により多数の胚体外細胞型及び神経外胚葉細胞型が存在する。
へ添加して、分化プロセスを開始させた。
れるように培養物中で分裂することを実証した。矢印は、PCNA/DAPI標識有糸分裂プレートパターン及び位相差有糸分裂プロファイルにより明らかなように有糸分裂中であるSOX17/PCNA/DAPIで標識された細胞を示す。
ケモカイン受容体4(CXCR4)発現は、胚体内胚葉に関するマーカーと相関し、中胚葉、外胚葉又は臓側内胚葉に関するマーカーとは相関しない
上述したように、hESCは、TGFβファミリー、より具体的にはアクチビン/ノーダルサブファミリーのサイトカインの適用により、胚体内胚葉の胚葉へ分化するように誘導することができる。さらに、本発明者等は、分化培養培地におけるウシ胎児血清(FBS)の比率が、hESCからの胚体内胚葉分化の効率に影響を及ぼすことを示している。この影響は、培地においてアクチビンAの所定濃度で、より高いレベルのFBSが胚体内胚葉への最大限の分化を阻害するようなものである。外因性アクチビンAの非存在下では、胚体内胚葉系統へのhESCの分化は、非常に非効率であり、FBS濃度は、hESCの分化プロセスに対して相当穏やかに影響する。
固なSOX17遺伝子発現を示す培養条件は、胚体内胚葉を含有し、臓側内胚葉を含有しない可能性が高い。SOX7が、アクチビンAを施さない培養物において高度に発現され、SOX7はまた、FBSが10%で包含される場合に、アクチビンAの存在下でさえ増大された発現を示したことが図28Eに示されている。このパターンは、CXCR4発現パターンの逆であり、CXCR4が、臓側内胚葉ではあまり高度に発現されないことを示唆する。
胚体内胚葉に関して富化する分化条件は、CXCR4陽性細胞の比率を増大させる
アクチビンAの用量はまた、胚体内胚葉をhESCから得ることができる効率に影響を及ぼす。本実施例は、アクチビンAの用量を増大させることにより培養物におけるCXCR4+細胞の比率が増大することを実証する。
発現における強固な増大と相関する(図31A〜図31D)。
CXCR4陽性細胞の単離は、胚体内胚葉遺伝子発現に関して富化し、また中胚葉、外胚葉及び臓側内胚葉のマーカーを発現する細胞を激減させる
上記実施例8で同定されるCXCR4+細胞及びCXCR4-細胞を回収して、相対遺伝子発現に関して分析し、母集団の遺伝子発現を同時に確定した。
CXCR4を使用した細胞集団中の胚体内胚葉細胞の定量
本明細書中ですでに確定されるような、及び2003年12月23日に出願された「胚体内胚葉(DEFINITIVE ENDODERM)」と題する米国仮特許出願第60/532,004号で確定されるような細胞培養物又は細胞集団中に存在する胚体内胚葉細胞の比率の定量を確認するために、CXCR4及び胚体内胚葉の他のマーカーを発現する細胞をFACSにより分析した。
胚体内胚葉細胞のさらなるマーカー
以下の実験では、精製胚体内胚葉及びヒト胚性幹細胞集団からRNAを単離した。続いて、遺伝子発現は、各精製集団由来のRNAの遺伝子チップ分析により分析した。Q−PCRも実施して、胚体内胚葉に関するマーカーとして、胚体内胚葉では発現されるが、胚性幹細胞では発現されない遺伝子の潜在性をさらに研究した。
レチノイン酸及びFGF−10は、胚体内胚葉培養物において特異的にPDX1を誘導する
以下の実験は、RA及びFGF−10が胚体内胚葉細胞においてPDX1の発現を誘導することを実証する。
発現をQ−PCRにより定量した。
FGF−10は、RA単独を上回るPDX1発現のさらなる増大を提供する
本実施例は、RA及びFGF−10の組合せが、RA単独よりも大いにPDX1発現を誘導することを示す。
レチノイン酸用量は、in vitroで前方−後方(A−P)位置に影響を及ぼす
RAの用量がin vitro細胞培養物のA−P位置に影響を及ぼすかどうかを判定するために、以下の実験を実施した。
0.2μM)は、中腸内胚葉マーカー(CDX1、HOXC6)を誘導した(図38C及び図41Eを参照)のに対して、RAの最小用量(0.04μM)は、後腸内胚葉マーカー(HOXA13)を優先的に誘導した(図38Dを参照)。RA用量は、神経(SOX1)又はニューロン(NFM)マーカーのいずれかの相対発現に対して実質的に影響しなかった(図38F及び図38Gを参照)。本実施例は、invitroでモルフォゲンとしての、特に分化hESCの内胚葉誘導体のモルフォゲンとしてのRAの使用を示す。
B27サプリメントの使用は、PDX1の発現を増強する
胚体内胚葉におけるPDX1発現は、多数の因子の使用及び細胞増殖/分化状態により影響を与え得る。以下の実験では、本発明者等はB27サプリメントの使用が胚体内胚葉細胞においてPDX1の発現を増強することを示す。
PDX1の誘導を増強するためのアクチビンBの使用
本実施例は、アクチビンBの使用が、in vitro細胞培養物においてPDX1陽性細胞へのPDX1陰性細胞の分化を増強することを示す。
ビンBの添加が、50ng/mlでアクチビンAのみを施した培養物を少なくとも2倍PDX1発現を増大させたことを示す。アクチビンBの添加の結果としてのPDX1の増大は、発達におけるこの時点で肝臓並びに膵臓に関するマーカーであるHNF6発現の増大を伴わなかった(図40Bを参照)。この結果は、膵臓へ分化している細胞の比率が肝臓に比べて増大していることを示唆する。
PDX1の誘導を増強するための血清用量の使用
胚体内胚葉細胞におけるPDX1の発現は、分化プロセス全体にわたって細胞培養物中に存在する血清の量により影響を受ける。以下の実験は、PDX1陰性胚体内胚葉へのhESCの分化中の培養物における血清のレベルが、PDX1陽性内胚葉へのこれらの細胞のさらなる分化中のPDX1の発現に影響することを示す。
PDX1の誘導を増強するための条件培地の使用
また、胚体内胚葉細胞におけるPDX1の発現に影響を与える他の因子及び成長条件を研究した。以下の実験は、PDX1陽性内胚葉細胞へのPDX1陰性胚体内胚葉細胞の分化に対する条件培地の影響を示す。
00ng/mlで供給された。これらの3つの異なる分化パラダイムは、PDX1誘導培地が条件付けられ得るヒト細胞の3つの非常に異なる集団を生じる。増殖因子を添加しない3%FBS(NF)は、大部分が胚体外内胚葉細胞、外胚葉細胞及び中胚葉細胞で構成される不均一集団を生じる。アクチビンA処理培養物(A100)は、大部分の胚体内胚葉をもたらし、BMP4処理培養物(B100)は、主として栄養外胚葉及び幾らかの胚体外内胚葉をもたらす。
PDX1へ結合する抗体の確証
PDX1へ結合する抗体は、細胞集団中のPDX1発現の誘導をモニタリングするための有用なツールである。本実施例は、PDX1に対するウサギポリクローナル抗体及びIgY抗体を使用して、このタンパク質の存在を検出することができることを示す。
もわずかに高い分子量でのさらなるバンドの検出を特徴とした。
ヒト膵臓組織の免疫組織化学
本実施例は、PDX1に対する特異性を有する抗体を使用して、免疫組織化学によりヒトPDX1陽性細胞を同定することができることを示す。
レチノイン酸処理細胞からのPDX1の免疫沈降
RAの存在下で分化させた胚体内胚葉細胞におけるPDX1発現、及びRAを用いて分化させなかった胚体内胚葉細胞におけるPDX1の欠如をさらに確認するために、ウサギ抗PDX1(Rbα−PDX1)抗体を使用して、RA分化させた胚体内胚葉細胞及び未分化の胚体内胚葉細胞の両方からPDX1を免疫沈降させた。免疫沈降させたRAは、IgYα−PDX1抗体を使用してウェスタンブロット分析により検出した。
PDX1プロモーター−EGFPトランスジェニックhESC系の生成
細胞単離に関してPDX1マーカーを使用するために、本発明者等は、PDX1陽性前腸内胚葉細胞を発現可能なレポーター遺伝子で遺伝的にタグ付けした。本実施例は、PDX1調節領域の制御下でレポーター遺伝子を含有するレポーターカセットを含むベクターの構築について記載する。本実施例はまた、このベクターでトランスフェクトした細胞(例えば、ヒト胚性幹細胞)、並びにそのゲノムに組み込まれたこのレポーターカセットを有する細胞の調製について記載する。
PDX1陽性前腸内胚葉の単離
以下の実施例は、PDX1プロモーター/EGFPカセットを含むhESCがPDX1陽性内胚葉細胞へ分化され、これに続いて蛍光活性化細胞選別器(FACS)により単離され得ることを実証する。
た(Hi及びLo)。
PDX1陽性背側前腸内胚葉及びPDX1陽性腹側前腸内胚葉の産生
本実施例は、PDX1陽性背側偏向前腸内胚葉の産生、並びにPDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉の産生を記載する。
した。
PDX1陽性腹側前腸内胚葉細胞の産生は胚体内胚葉形成によっている
本実施例は、種々の量の胚体内胚葉細胞を含む培養物からのPDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉の産生を記載する。胚体内胚葉を有しない培養物は、PDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉の極めて少ない産生を示す。胚体内胚葉細胞の初期量が増大するように、腹側偏向前腸内胚葉の産生も増大する。
を獲得する能力を失っているため、PDX1及びアルブミン発現のレベルはほとんどの前内胚葉において最大であった。これらのデータは、腹側PDX1発現前腸内胚葉及び肝臓の産生が胚体内胚葉の効率的産生によっているということを強く示した。
BMP4はPDX1陽性腹側前腸内胚葉に必要でない
本実施例は、BMP4の非存在下でのPDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉の産生を記載する。
〔実施例27〕
PDX1陽性背側前腸内胚葉及びPDX1陽性腹側前腸内胚葉の同定のためのマーカー
胚葉細胞中で同時発現され得る遺伝子が提供される。表3に列挙した遺伝子は、背側及び腹側のPDX1分化の両方で発現される。表4中の遺伝子は、背側偏向され、そして背側PDX1パターンで選択的に発現される。
PDX1陰性前腸内胚葉の産生
本実施例は、PDX1陰性前腸内胚葉の産生を記載する。
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Claims (15)
- HNF4α、HNF3、HHEX及びHB9からなる群より選択される少なくとも1つのマーカーを発現する、膵臓−十二指腸ホメオボックス因子−1(PDX1)陽性前腸内胚葉細胞であるヒト細胞、レチノイン酸、およびアクチビンAを含む、細胞培養物。
- 前記PDX1陽性前腸内胚葉細胞が、Glut2及びKRT19からなる群より選択される少なくとも1つのマーカーを発現する、請求項1に記載の細胞培養物。
- 前記ヒト細胞の少なくとも7%がPDX1陽性前腸内胚葉細胞である、請求項1または2に記載の細胞培養物。
- 前記ヒト細胞の少なくとも20%がPDX1陽性前腸内胚葉細胞である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の細胞培養物。
- 前記PDX1陽性前腸内胚葉細胞がHHEXを発現する、請求項1に記載の細胞培養物。
- PDX1の発現がHB9の発現よりも大きい、請求項1〜5のいずれか1項に記載の細胞培養物。
- FGF10をさらに含む、請求項1、5または6のいずれか1項に記載の細胞培養物。
- BMP4をさらに含む、請求項7に記載の細胞培養物。
- KAAD−シクロパミンをさらに含む、請求項7または8に記載の細胞培養物。
- (a) アクチビンAの存在下で多能性ヒト細胞を培養するステップ、及び
(b) ステップ(a)により得られた細胞を、外因性レチノイン酸の存在下培養し、HNF
4α、HNF3、HHEX及びHB9からなる群より選択される少なくとも1つのマーカーを発現する、PDX1陽性前腸内胚葉細胞を産生するステップ、
を含む、PDX1陽性前腸内胚葉細胞を産生する方法。 - ステップ(b)がFGF10をさらに含む、請求項9または10に記載の方法。
- (a) アクチビンAの存在下で多能性ヒト細胞を培養するステップ、及び
(b) ステップ(a)により得られた細胞を、外因性レチノイン酸、並びに、外因性FGF
10、FGF4、または、FGF10及びFGF4の組み合わせの存在下培養し、HNF4α、HNF3、HHEX及びHB9からなる群より選択される少なくとも1つのマーカーを発現する、PDX1陽性前腸内胚葉細胞を産生するステップ、
を含む、PDX1陽性前腸内胚葉細胞を産生する方法。 - ステップ(b)がBMP4をさらに含む、請求項12に記載の方法。
- ステップ(b)がKAAD−シクロパミンをさらに含む、請求項12または13に記載の方
法。 - HNF4α、HNF3、HHEX及びHB9からなる群より選択される少なくとも1つのマーカーを発現する、膵臓−十二指腸ホメオボックス因子−1(PDX1)陽性前腸内胚葉細胞であるヒト細胞、およびレチノイン酸を含む、細胞培養物。
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