JP6077046B2 - Pdx1発現背側及び腹側前腸内胚葉 - Google Patents
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Description
本出願は、米国特許仮出願第60/730,917号(表題「PDX1発現背側及び腹側前腸内胚葉(PDX1-EXPRESSING DORSAL AND VENTRAL FOREGUT ENDODERM)」、2005年
10月27日提出)(この記載内容は参照により本明細書中で完全に援用される)の本出願であり、そしてそれに対する優先権を主張する。
的に膵島/β−細胞株に向けることが有益である。
されるマーカーを実質的に発現しない。
抗体、リガンド又は他の分子を用いることにより、細胞集団中の他の細胞から分離される。本発明の他の実施の形態は、PDX1陽性背側偏向前腸内胚葉細胞を富化、単離、及び/又は精製する方法に関する。このような実施の形態では、PDX1陽性背側偏向前腸内胚葉細胞は、表3から選択される細胞表面分子、或いは表4から選択される細胞表面分子のようなPDX1陽性背側偏向前腸内胚葉細胞の細胞表面上で発現される分子と結合する抗体、リガンド又は他の分子を用いることにより、細胞集団中の他の細胞から分離される。本発明のさらに他の実施の形態は、PDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞を富化、単離、及び/又は精製する方法に関する。このような実施の形態では、PDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞は、表3から選択される細胞表面分子のようなPDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞の細胞表面で発現される分子と結合する抗体、リガンド又は他の分子を用いることにより、細胞集団中の他の細胞から分離される。
細胞を含む細胞集団中のヒトPDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞の分化を促進し得る分化因子を同定する方法に関する。この方法は、ヒトPDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞を含む細胞集団を得る工程、細胞集団に候補分化因子を供給する工程、第1の時点での細胞集団中の表3から選択されるマーカーのようなマーカーの発現を確定する工程、そして第2の時点での細胞集団中の同一マーカーの発現を確定する工程を包含する。このような実施の形態では、第2の時点は第1の時点の後であり、そして第2の時点は候補分化因子を細胞集団に供給した後である。第2の時点での細胞集団中のマーカーの発現が第1の時点での細胞集団中のマーカーの発現と比較して増大又は低減される場合には、候補分化因子はヒトPDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞の分化を促進し得る。
ら選択される少なくとも1つのマーカーを発現する膵臓−十二指腸ホメオボックス因子−1(PDX1)陽性背側偏向前腸内胚葉細胞であり、当該PDX1陽性背側偏向前腸内胚葉細胞が背側膵芽の細胞に分化することができる複能性細胞である細胞培養物。
6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2及びSLC27A2から成る群から選択される段落2の細胞培養物。
マーカーを発現する、段落1の細胞培養物。
の細胞培養物。
、MAG、SFRP5、SLC16A10、SLC16A2、SLC1A3、SLC30A4、SLICK、SLITRK4及びXPR1から成る群から選択される、段落5の細胞培養物。
段落1の細胞培養物。
段落1の細胞培養物。
、段落1の細胞培養物。
外のヒト細胞の少なくとも約2%がPDX1陽性背側偏向前腸内胚葉細胞である、段落1の細胞培養物。
テイン(AFP)、SOX7、SOX1、ZIC1及びNFMから成る群から選択されるマーカーの発現より大きい、段落1の細胞培養物。
選択される細胞を実質的に含有しない、段落1の細胞培養物。
から選択される少なくとも1つのマーカーを発現する膵臓−十二指腸ホメオボックス因子−1(PDX1)陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞であり、当該PDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞が腹側膵芽の細胞に分化することができる複能性細胞である細胞培養物。
18の細胞培養物。
L6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2及びSLC27A2から成る群から選択される、段落19の細胞培養物。
マーカーを実質的には発現しない、段落18の細胞培養物。
、段落18の細胞培養物。
る、段落18の細胞培養物。
る、段落18の細胞培養物。
外のヒト細胞の少なくとも約2%がPDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞である、段落18の細胞培養物。
テイン(AFP)、SOX7、SOX1、ZIC1及びNFMから成る群から選択されるマーカーの発現より大きい、段落18の細胞培養物。
選択される細胞を実質的に含有しない、段落18の細胞培養物。
選択される少なくとも1つのマーカーを発現するヒトPDX1陽性背側偏向前腸内胚葉細胞であり、当該PDX1陽性背側偏向前腸内胚葉細胞が背側膵芽の細胞に分化することができる複能性細胞である細胞集団。
33の細胞集団。
L6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2及びSLC27A2から成る群から選択される、段落34の細胞集団。
のマーカーを発現する、段落33の細胞集団。
36の細胞集団。
1、MAG、SFRP5、SLC16A10、SLC16A2、SLC1A3、SLC30A4、SLICK、SLITRK4及びXPR1から成る群から選択される、段落37の細胞集団。
段落33の細胞集団。
7、SOX1、ZIC1及びNFMから成る群から選択されるマーカーの発現より大きい、段落33の細胞集団。
選択される少なくとも1つのマーカーを発現するヒトPDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞であり、当該PDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞が腹側膵芽の細胞に分化し得る複能性細胞である細胞集団。
42の細胞集団。
L6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2及びSLC27A2から成る群から選択される、段落43の細胞集団。
マーカーを実質的に発現しない、段落42の細胞集団。
段落42の細胞集団。
段落42の細胞集団。
7、SOX1、ZIC1及びNFMから成る群から選択されるマーカーの発現より大きい、段落42の細胞集団。
体内胚葉細胞を含む細胞集団を得る工程、及び表3から選択される少なくとも1つのマーカーを発現するPDX1陽性背側偏向前腸内胚葉細胞への当該PDX1陰性胚体内胚葉細胞集団の少なくとも約26%の分化を促進するのに十分な量でレチノイドを当該細胞集団に供給する工程であって、当該PDX1陽性背側偏向前腸内胚葉細胞が背側膵芽の細胞に分化し得る複能性細胞である工程を包含する方法。
のマーカーも発現する、段落49の方法。
をさらに包含し、当該PDX1陽性背側偏向前腸内胚葉細胞が形成されるのに十分な時間が上記細胞集団中の背側偏向前腸内胚葉細胞中の表4から選択されるマーカーの存在を検出することにより確定される、段落50の方法。
(Q−PCR)により確定される、段落50の方法。
落50の方法。
テイン(AFP)、SOX7、SOX1、ZIC1及びNFMから成る群から選択されるマーカーの発現より大きい、段落49の方法。
0の方法。
法。
る、段落65の方法。
る、段落66の方法。
地の約0.5%のB27を含む、段落69の方法。
含む細胞集団を得ること、胚体内胚葉細胞への当該多能性細胞の分化を促進するのに十分な量でTGFβスーパーファミリーの少なくとも1つの増殖因子を当該細胞集団に供給すること、そして胚体内胚葉が形成されるのに十分な時間を与えることを包含し、当該胚体内胚葉細胞が形成されるのに十分な時間が当該細胞集団中の胚体内胚葉細胞の存在を検出することにより確定される、段落49の方法。
細胞集団に供給する工程であって、当該PDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞が腹側膵芽の細胞に分化し得る複能性細胞である工程を包含する方法。
マーカーを発現しない、段落73の方法。
をさらに包含し、当該PDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞が形成されるのに上記十分な時間が上記細胞集団中の腹側偏向前腸内胚葉細胞中の表3から選択されるマーカーの存在を検出することにより確定される、段落75の方法。
CR)により確定される、段落76の方法。
76の方法。
テイン(AFP)、SOX7、SOX1、ZIC1及びNFMから成る群から選択されるマーカーの発現より大きい、段落73の方法。
ng/ml〜約500ng/mlの範囲の濃度で供給される、段落73の方法。
る、段落80の方法。
、段落73の方法。
4の方法。
法。
法。
方法。
ロパミンが約0.1μM〜約50μMの濃度で供給される、段落89の方法。
、段落90の方法。
73の方法。
−シクロパミン及び総培地の約0.5%のB27を含む、段落93の方法。
含む細胞集団を得ること、胚体内胚葉細胞への当該多能性細胞の分化を促進するのに十分な量でTGFβスーパーファミリーの少なくとも1つの増殖因子を当該細胞集団に供給すること、そして胚体内胚葉細胞が形成されるのに十分な時間を与えることを包含し、当該胚体内胚葉細胞が形成されるのに十分な時間が当該細胞集団中の胚体内胚葉細胞の存在を検出することにより確定される、段落73の方法。
、PDX1陽性背側偏向前腸内胚葉細胞を産生するようにPDX1陰性胚体内胚葉細胞の集団中の細胞を分化させる工程であって、当該PDX1陽性背側偏向前腸内胚葉細胞が背側膵芽の細胞に分化し得る複能性細胞である工程、当該PDX1陽性背側偏向前腸内胚葉細胞中で発現されるマーカーと結合するが、当該細胞集団中に存在する他の細胞型中では実質的に発現されない試薬を当該細胞集団に供給する工程、及び当該細胞集団中に存在する当該他の細胞型から、当該試薬と結合された当該PDX1陽性背側偏向前腸内胚葉細胞を分離し、それによりPDX1陽性背側偏向前腸内胚葉細胞に富んだ細胞集団を産生する、分離する工程を包含する方法。
5、SLC16A10、SLC16A2、SLC1A3、SLC30A4、SLICK、SLITRK4及びXPR1から成る群から選択される、段落98の方法。
、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2及びSLC27A2から成る群から選択される、段落98の方法。
DX1陽性背側偏向前腸内胚葉細胞へのPDX1陰性胚体内胚葉細胞の分化を促進するのに十分な量でレチノイドを当該細胞集団に供給すること(当該PDX1陽性背側偏向前腸内胚葉細胞は背側膵芽の細胞に分化し得る複能性細胞である)、そしてPDX1陽性背側偏向前腸内胚葉細胞が形成されるのに十分な時間を与えることをさらに包含し、当該PDX1陽性背側偏向前腸内胚葉細胞が形成されるのに十分な時間が当該細胞集団中のPDX1陽性背側偏向前腸内胚葉細胞の存在を検出することにより確定される、段落98の方法
。
ることを包含する、段落101の方法。
、段落98の方法。
、段落98の方法。
、SLC16A10、SLC16A2、SLC1A3、SLC30A4、SLICK、SLITRK4、XPR1、CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2及びSLC27A2から成る群から選択される細胞表面ポリペプチドに対する親和性を有する、段落106の方法。
集団。
て、PDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞を産生するようにPDX1陰性胚体内胚葉細胞の集団中の細胞を分化させる工程であって、当該PDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞が腹側膵芽の細胞に分化し得る複能性細胞である工程、当該PDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞中で発現されるマーカーと結合するが、当該細胞集団中に存在する他の細胞型中では実質的に発現されない試薬を当該細胞集団に供給する工程、及び当該細胞集団中に存在する当該他の細胞型から当該試薬と結合された当該PDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞を分離し、それによりPDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞に富んだ細胞集団を産生する、分離する工程を包含する方法。
、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2及びSLC27A2から成る群から選択される、段落109の方法。
DX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞への当該PDX1陰性胚体内胚葉細胞の分化を促進するのに十分な量でFGFファミリー増殖因子を当該細胞集団に供給すること(当該PDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞は腹側膵芽の細胞に分化し得る複能性細胞である)、そしてPDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞が形成されるのに十分な時間を与えることをさらに包含し、当該PDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞が形成されるのに十分な時間が当該細胞集団中のPDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞の存在を検出することにより確定される、段落109の方法。
ることを包含する、段落111の方法。
、段落109の細胞集団。
、段落109の細胞集団。
GALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2及びSLC27A2から成る群から選択される細胞表面ポリペプチドに対する親和性を有する、段落116の方法。
化集団。
て、多能性細胞の集団を得る工程であって、当該多能性細胞集団の少なくとも1つの細胞が表4から選択されるマーカー遺伝子のいずれか1つのプロモーターの制御下で核酸の少なくとも1つのコピーを含み、当該核酸は蛍光タンパク質をコードする配列又はその生物学的活性断片を含む工程、PDX1陽性背側偏向前腸内胚葉細胞を産生するように当該多能性細胞を分化させる工程であって、当該PDX1陽性背側偏向前腸内胚葉細胞は背側膵芽の細胞に分化し得る複能性細胞である工程、そして細胞集団中に存在する他の細胞型から当該PDX1陽性背側偏向前腸内胚葉細胞を分離する工程を包含する方法。
胞を含む、段落119の方法。
胞を含む、段落119の方法。
進するのに十分な量でTGFβスーパーファミリーの少なくとも1つの増殖因子を当該多能性細胞集団に供給すること、そしてPDX1陽性背側偏向前腸内胚葉細胞への当該PDX1陰性胚体内胚葉細胞の分化を促進するのに十分な量でレチノイドを当該PDX1陰性胚体内胚葉細胞に供給することをさらに包含する、段落119の方法。
法。
)により細胞集団中に存在する他の細胞型から分離される、段落119の方法。
化集団。
て、多能性細胞の集団を得る工程であって、当該多能性細胞集団の少なくとも1つの細胞は表3から選択されるマーカー遺伝子のいずれか1つのプロモーターの制御下で核酸の少なくとも1つのコピーを含み、当該核酸は蛍光タンパク質をコードする配列又はその生物学的活性断片を含む工程、PDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞を産生するように当該多能性細胞を分化させる工程であって、当該PDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞は腹側膵芽の細胞に分化し得る複能性細胞である工程、そして非腹側偏向内胚葉細胞から当該PDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞を分離する工程を包含する方法。
胞を含む、段落128の方法。
胞を含む、段落128の方法。
進するのに十分な量でTGFβスーパーファミリーの少なくとも1つの増殖因子を当該多能性細胞集団に供給すること、そしてPDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞へのPDX1陰性胚体内胚葉細胞の分化を促進するのに十分な量でFGFファミリー増殖因子を当該PDX1陰性胚体内胚葉細胞に供給することをさらに包含する、段落128の方法。
法。
)により細胞集団中に存在する他の細胞型から分離される、段落128の方法。
化集団。
を促進し得る分化因子を同定する方法であって、ヒトPDX1陽性背側偏向前腸内胚葉細胞を含む細胞集団を得る工程、当該細胞集団に候補分化因子を供給する工程、第1の時点での当該細胞集団中のマーカーの発現を確定する工程、第2の時点での当該細胞集団中の同一マーカーの発現を確定する工程であって、当該第2の時点は当該第1の時点の次に起こり、そして当該第2の時点は当該候補分化因子を当該細胞集団に供給することに続いて起こる工程、そして当該第2の時点での当該細胞集団中のマーカーの発現が当該第1の時点での当該細胞集団中のマーカーの発現と比較した場合に増大又は低減されるかを判定する工程であって、当該細胞集団中の当該マーカーの発現の増大又は低減は当該候補分化因子がヒトPDX1陽性背側偏向前腸内胚葉細胞の分化を促進し得ることを示す工程を包含する方法。
少なくとも約10%を含む、段落136の方法。
外のヒト細胞の少なくとも約10%がPDX1陽性背側偏向前腸内胚葉細胞である、段落136の方法。
少なくとも約90%を含む、段落136の方法。
胞以外のヒト細胞の少なくとも約90%がPDX1陽性背側偏向前腸内胚葉細胞である、段落136の方法。
する、段落136の方法。
ある、段落136の方法。
である、段落136の方法。
る、段落136の方法。
定される、段落136の方法。
を促進することができる分化因子を同定する方法であって、ヒトPDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞を含む細胞集団を得る工程、候補分化因子を当該細胞集団に供給する工程、第1の時点で当該細胞集団中のマーカーの発現を確定する工程、第2の時点で当該細胞集団中の同一マーカーの発現を確定する工程であって、当該第2の時点が当該第1の時点の後であり、当該第2の時点が当該細胞集団に当該候補分化因子を供給することの後である工程、そして当該第2の時点での当該細胞集団中のマーカーの発現が、当該第1の時点での当該細胞集団中のマーカーの発現と比較して増大又は低減されているかを判定する工程
であって、当該細胞集団中のマーカーの発現の増大又は低減は、当該候補分化因子が、当該ヒトPDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞の分化を促進することができることを示す工程を含む方法。
少なくとも約10%を含む、段落154の方法。
外のヒト細胞の少なくとも約10%がPDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞である、段落154の方法。
少なくとも約90%を含む、段落154の方法。
胞以外のヒト細胞の少なくとも約90%がPDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞である、段落154の方法。
、段落154の方法。
分化する、段落154の方法。
ある、段落154の方法。
である、段落154の方法。
る、段落154の方法。
定される、段落154の方法。
う。しかしながら上記のin vitro分化細胞組成物は、in vivo用途のために用いられ得る。
60/566,293号(表題「PDX1発現内胚葉(PDX1 EXPRESSING ENDODERM)」、2004年4月27日出願)、米国特許仮出願第60/586,566号(表題「胚体内胚葉の単離のためのケモカイン細胞表面受容体(CHEMOKINE CELL SURFACE RECEPTOR FOR THE ISOLATION OF DEFINITIVE ENDODERM)」、2004年7月9日出願)、米国特許仮出願第60/587,942号(表題「胚体内胚葉の単離のためのケモカイン細胞表面受容体(CHEMOKINE CELL SURFACE RECEPTOR FOR THE ISOLATION OF DEFINITIVE ENDODERM)」、2004年7月14日出願)、米国特許出願第11/021,618号(表題「胚体内胚葉(DEFINITIVE ENDODERM)」、2004年12月23日出願)、及び米国特許出願第
11/115,868号(表題「PDX1発現内胚葉(PDX1 EXPRESSING ENDODERM)」、2005年4月26日出願)、米国特許出願第11/165,305号(表題「胚体内胚葉を分化させるための因子の同定方法(METHODS FOR IDENTIFYING FACTORS FOR DIFFERENTIATING DEFINITIVE ENDODERM)」、2005年6月23日出願)(これらの開示は参照
により本明細書に完全に援用される)にも見出され得る。
原腸形成と呼ばれる初期ヒト発達におけるきわめて重大な段階は、受精後2〜3週間で起こる。原腸形成は、3つの一次胚葉が最初に特定化され、そして器官形成されるのがこの時期であるため、非常に有意である(Lu他、2001;Schoenwolf and Smith, 2000)。外胚葉は、身体の外被及び全神経系の終局的形成に関与するが、一方、心臓、血液、骨、骨格筋及び他の結合組織は中胚葉に由来する。胚体内胚葉は、食道、胃並びに小腸及び大腸を含む全腸管、並びに腸管に由来する器官、例えば肺、肝臓、胸腺、上皮小体及び甲状腺、胆嚢及び膵臓の形成に関与する胚葉として定義される(Grapin-Botton and Melton, 2000;Kimelman and Griffin, 2000;Tremblay他、2000;Wells and Melton, 1999;Wells and Melton, 2000)。非常に重要な区別は、胚体内胚葉と原始内胚葉と呼ばれる細胞の完全に別個の系統との間でなされるべきである。原始内胚葉は主として、胚体外組織、主に胎盤卵黄嚢の壁側内胚葉部分及び臓側内胚葉部分、並びにライヘルト膜の細胞外マトリックス物質の形成に関与する。
PDX1(STF−1、IDX−1、IPF−1、IUF−1及びGSFとも呼ばれる)は、膵臓及び吻側十二指腸の発生のために必要とされる転写因子である。PDX1は、後前腸内胚葉から生じる膵臓性内胚葉中で最初に発現され、そしてマウスではE8.5から出発して、外分泌細胞及び内分泌細胞の両方を生じる。その後、PDX1はベータ細胞及びいくつかのデルタ細胞に制限されるようになる。この発現パターンは、成人で保持される。PDX1は、発生の早期に十二指腸性内胚葉で(形成中の膵臓に隣接する)、次に十二指腸性腸細胞並びに腸内分泌細胞、洞性胃で、並びに総胆管、胆嚢管及び胆管でも発現される。発現のこの領域も、膵臓発現が主に吻側十二指腸に制限されるようになる時点で、限定されるようになる。
臓内分泌細胞の最終的分化中にも必要とされ、そしてヒトにおける単一対立遺伝子の機能的崩壊はMODY4型(青年の成人発症型糖尿病)及び後期開始II型糖尿病の重症膵臓機能不全に関連する(Stoffers D.A.他, Nature Genetics 138-139, 1997)。
本発明の実施形態は、PDX1陰性内胚葉細胞の産生のための新規の確立したプロセスであって、PDX1陰性内胚葉細胞が腸管の前腸/中腸領域(PDX1陰性前腸/中腸内胚
葉)由来の細胞、組織又は器官に分化し得る複能性細胞であるプロセスに関する。本明細書中で用いる場合、「複能性」又は「複能性細胞」とは、限定数の他の特定細胞型を生じ得るが、3つの一次胚細胞株(内胚葉、外胚葉及び中胚葉)すべてを生じ得るわけではない細胞型を指す。本明細書中で用いる場合、「前腸/中腸」は、腸管の前部分の細胞並びに腸管の中央部分の細胞(前腸/中腸接合部の細胞を含む)を指す。
本発明の実施形態は、PDX1陰性内胚葉細胞の産生のための新規の確立したプロセスであって、PDX1陽性内胚葉細胞が腸管の前腸/中腸領域(PDX1陽性前腸/中腸内胚葉)由来の細胞、組織又は器官に分化し得る複能性細胞であるプロセスに関する。本発明の他の実施形態は、PDX1陽性内胚葉細胞の産生のための新規の確立したプロセスであって、PDX1陽性内胚葉細胞が腸管の前腸/中腸領域(PDX1陽性前腸/中腸内胚葉)由来の細胞、組織又は器官に分化し得る複能性細胞であるプロセスに関する。本明細書中で用いる場合、「複能性」又は「複能性細胞」とは、限定数の他の特定細胞型を生じ得るが、3つの一次胚細胞株(内胚葉、外胚葉及び中胚葉)すべてを生じ得るわけではない細胞型を指す。本明細書中で用いる場合、「前腸/中腸」は、腸管の前部分の細胞並びに腸管の中央部分の細胞(前腸/中腸接合部の細胞を含む)を指す。いくつかの実施形態は、PDX1陽性内胚葉細胞は背側前腸内胚葉細胞である。他の実施形態では、PDX1陽性内胚葉細胞は腹側前腸内胚葉細胞である。
参照により本明細書中で完全に援用される)に記載されている。
いくつかの態様は、背側PDX1陽性前腸内胚葉細胞へのPDX1陰性胚体内胚葉細胞の約26%から少なくとも約75%の転換を生じるin vitro方法に関する。本発明
の他の態様は、腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞へのPDX1陰性胚体内胚葉細胞の約26%から少なくとも約75%の転換を生じるin vitro方法に関する。典型的には
、上記の方法は、限定化及び一時的特定化方式での培養及び増殖因子の適用を包含する。PDX1陽性前腸内胚葉細胞、例えば背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞に関する細胞集団のさらなる富化は、PDX1陽性前腸内胚葉細胞と特異的に結合する試薬を用いることによる集団中の他の細胞からのPDX1陽性前腸内胚葉細胞の単離及び/又は精製により達成され得る。代替的方法として、PDX1発現の検出を可能にするために、PDX1陽性前腸内胚葉細胞、例えば背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、レポーター遺伝子、例えば緑色蛍光タンパク質(GFP)で標識され得る。このような蛍光標識細胞は次に、蛍光励起細胞選別器(FACS)により精製され得る。本発明のさらなる態様は、PDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物及び富化細胞集団に、並びにPDX1陽性前腸内胚葉へのそしてそれからの分化に有用な因子を同定するための方法に関する。本発明の付加的態様は、背側PDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物及び富化細胞集団に、並びに背側PDX1陽性前腸内胚葉へのそしてそれからの分化に有用な因子を同定するための方法に関する。本発明のさらなる他の態様は、腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物及び富化細胞集団に、並びに腹側PDX1陽性前腸内胚葉へのそしてそれからの分化に有用な因子を同定するための方法に関する。
書中で用いる場合、「発現」とは、材料又は物質の産生、及び材料又は物質の産生のレベル又は量を指す。したがって特定マーカーの発現の確定は、発現されるマーカーの相対量若しくは絶対量の検出、又は単にマーカーの存在若しくは非存在の検出のいずれかを指す。本明細書中で用いる場合、「マーカー」とは、観察され得るか又は検出され得る任意の分子を指す。例えばマーカーとしては、核酸、例えば特定遺伝子の転写体、遺伝子のポリペプチド産物、非遺伝子産物ポリペプチド、糖タンパク質、炭水化物、糖脂質、脂質、リポタンパク質又は小分子(例えば10,000amu未満の分子量を有する分子)が挙げられるが、これらに限定されない。
量的PCR(Q−PCR)により確定される。例えば或る特定の遺伝子マーカー、例えばPDX1、SOX17、SOX7、SOX1、ZIC1、NFM、α−フェトプロテイン(AFP)、ホメオボックスA13(HOXA13)、ホメオボックスC6(HOXC6)、及び/又は本明細書中に記載される他のマーカーにより産生される転写体の量が、定量的Q−PCRにより確定される。他の実施形態では、免疫組織化学を用いて、上記遺伝子により発現されるタンパク質を検出する。さらに他の実施形態では、Q−PCR及び免疫組織化学的技法が、このようなマーカーの量又は相対的割合を同定すると共に確定するために用いられる。いくつかの実施形態では、背側及び腹側の両方のPDX1陽性前腸内胚葉細胞に共通であるマーカー、例えばPDX1、及び/又は表3から選択される1つ又
は複数のマーカーは、Q−PCR及び/又は免疫組織化学により検出される。他の実施形態では、背側PDX1陽性前腸内胚葉細胞中で選択的に、特異的に又は独自的に発現されるマーカー、例えば表4から選択される1つ又は複数のマーカーは、Q−PCR及び/又
は免疫組織化学により検出される。
PDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物及び/又は細胞集団は、PDX1陰性胚体内胚葉(「胚体内胚葉」とも呼ばれる)を先ず産生することにより、多能性細胞から産生される。胚体内胚葉を含む細胞培養物及び富化細胞集団を産生するように多能性細胞を分化させるプロセスは、以下に簡潔に、また米国特許第11/021,618号(表題「胚体内胚葉(DEFINITIVE ENDODERM)」、2004年12月23日出願)(その開示は参照
により本明細書に完全に援用される)に詳細に記載されている。これらのプロセスのいくつかでは、出発材料として使用される多能性細胞は、幹細胞である。或る特定のプロセスでは、胚体内胚葉細胞を含む胚体内胚葉細胞培養物及び富化細胞集団は、胚性幹細胞から産生される。本明細書中で用いる場合、「胚性」とは、単一接合体で始まり、発生した配
偶子細胞以外には多能性又は全能性細胞を含まない多細胞構造で終わる生物体の一連の発生段階を指す。配偶子融合により得られる胚のほかに、「胚性」という用語は、体細胞核移入により得られる胚を指す。胚体内胚葉細胞を派生させる好ましい方法は、胚体内胚葉産生のための出発材料として、ヒト胚性幹細胞を利用することである。このような多能性細胞は、桑実胚に由来する細胞、胚の内部細胞塊又は胚の生殖腺隆起に由来する細胞であり得る。ヒト胚性幹細胞は、当該技術分野で既知の方法を使用して、実質的な分化無しで多能性状態で培養物中で維持されることができる。このような方法は、例えば米国特許第5,453,357号、同第5,670,372号、同第5,690,926号、同第5,843,780号、同第6,200,806号及び同第6,251,671号に(その開示は参照により本明細書に完全に援用される)記載されている。
子は、それらの添加後、細胞培養物から除去される。例えば増殖因子は、それらの添加後、約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、約7日、約8日、約9日、又は約10日以内に除去され得る。好ましいプロセスでは、増殖因子は、それらの添加後約4日で除去される。
胚体内胚葉へのhESC培養の進行は、胚体内胚葉に特徴的なマーカーの発現を確定することによりモニタリングされ得る。いくつかのプロセスでは、或る特定のマーカーの発現は、マーカーの存在又は非存在を検出することにより確定される。代替的には或る特定のマーカーの発現は、マーカーが細胞培養物又は細胞集団の細胞中に存在するレベルを測定することにより確定され得る。このようなプロセスでは、マーカー発現の測定は、定性的又は定量的であり得る。マーカー遺伝子により産生されるマーカーの発現を定量する一方法は、定量的PCR(Q−PCR)の使用による。Q−PCRを実施する方法は、当該技術分野で既知である。マーカー遺伝子発現を定量するために、当該技術分野で既知である他の方法も用いられ得る。例えばマーカー遺伝子産物の発現は、対象のマーカー遺伝子産物に特異的な抗体を用いることにより検出され得る。或る特定のプロセスでは、胚体内胚葉に特徴的なマーカー遺伝子の発現並びにhESC及び他の細胞型に特徴的なマーカー遺伝子の有意な発現の欠如が確定される。
C., and Broxmeyer, H.J. Leukocyte Biol. 65, 6-15 (1999)]。CXCR4受容体はまた、T細胞へのHIV−1の進入のための共受容体として機能する[Feng, Y.他, Science, 272, 872-877 (1996)]。[McGrath, K.E.他, Dev. Biology 213, 442-456 (1999)]
により実施される広範囲の一連の研究では、ケモカイン受容体CXCR4及びその特有のリガンドであるSDF−1[Kim, C., and Broxmyer, H., J. Leukocyte Biol. 65, 6-15
(1999)]の発現は、マウスにおいて初期発達及び成体期中に示された。発達におけるC
XCR4/SDF1相互作用は、いずれかの遺伝子がトランスジェニックマウスで崩壊される[Nagasawa他, Nature, 382, 635-638 (1996), Ma, Q.他, Immunmity, 10, 463-471 (1999)]場合、それが後期胚致死性をもたらしたことが実証された際に明らかとなってきた。McGrath他は、CXCR4は、RNアーゼ保護及びin situハイブリッド形成方法論の組合せを使用して初期原腸形成胚(E7.5)中に検出される最も豊富なケモカイン受容体メッセンジャーRNAであることを実証した。原腸形成胚では、CXCR4/SDF−1シグナル伝達は、原始線条胚葉細胞を遊走することに主に関与されるようであり、この時期に存在する胚体内胚葉、中胚葉及び胚体外中胚葉上で発現される。E7.2−7.8マウス胚では、CXCR4及びα−フェトプロテインは、相互排他的であり、臓側内胚葉における発現の欠如を示している[McGrath, K.E.他, Dev. Biology 213, 442-456
(1999)]。
上述のプロセスのいずれかにより産生される胚体内胚葉細胞は、このような細胞に特異的である親和性タグを使用することにより、富化、単離及び/又は精製することができる。胚体内胚葉細胞に特異的な親和性タグの例は、胚体内胚葉細胞の細胞表面上に存在するが、本明細書中に記載する方法により産生される細胞培養物中に見出されるであろう他の細胞型上に実質的に存在するマーカー分子(例えば、ポリペプチド)に特異的である抗体、リガンド又は他の結合剤である。いくつかのプロセスでは、CXCR4に結合する抗体は、胚体内胚葉細胞の富化、単離又は精製用の親和性タグとして使用される。他のプロセスでは、ケモカインSDF−1又はSDF−1に基づく他の分子もまた、親和性タグとして使用され得る。このような分子としては、SDF−1フラグメント、SDF−1融合体又はSDF−1擬似体が挙げられるが、これらに限定されない。
することができる。一プロセスでは、CXCR4に結合する抗体を磁気ビーズへ結合させた後、細胞間接着及び基材接着を低減させるように酵素的に処理した細胞培養物において胚体内胚葉細胞へ結合させる。続いて、ビーズと結合された胚体内胚葉細胞と未結合細胞を分離するのに使用される可動性磁界へ細胞/抗体/ビーズ複合体を暴露させる。いったん胚体内胚葉細胞が培養物において他の細胞と物理的に分離されると、抗体結合は崩壊されて、細胞は、適切な組織培養培地中で再度平板培養される。
る。いくつかの方法では、細胞は、無作為な分化を受ける。しかしながら、好ましい方法では、細胞は、主として胚体内胚葉へ分化するように誘導される。いくつかの好ましい富化、単離及び/又は精製方法は、ヒト胚性幹細胞からの胚体内胚葉のin vitro産
生に関する。本明細書中に記載する方法を使用して、細胞集団又は細胞培養物は、未処理の細胞集団又は細胞培養物と比較した場合、少なくとも約2〜約1000倍、胚体内胚葉含有量が富化され得る。
上記の方法により産生される細胞組成物としては、胚体内胚葉を含む細胞培養物、並びに胚体内胚葉に富んだ細胞集団が挙げられる。例えば、培養物中の細胞の少なくとも約50〜80%が胚体内胚葉細胞である胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物が産生され得る。分化プロセスの効率は、或る特定のパラメーター、例えば細胞増殖条件、増殖因子濃度及び培養工程の時機(これらに限定されない)を修正することにより調整され得るため、本明細書中に記載される分化手法は、胚体内胚葉への多能性細胞の約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%
、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、又は約95%より多い転換を生じ得る。胚体内胚葉細胞の単離が用いられるプロセスでは、例えばCXCR4受容体と結合する親和性試薬を用いることにより、実質的に純粋な胚体内胚葉細胞集団が回収され得る。
胚体内胚葉細胞は、これらの細胞のさらなる分化により膵臓分化に向けて特殊化されて、PDX1陰性前腸内胚葉細胞を産生し得る。本明細書中に記載される分化プロセスのいくつかでは、胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物並びに富化又は精製された細胞集団は、PDX1陰性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物及び/又は富化細胞集団へのさらなる分化のために用いられ得る。
も約0.1μM、少なくとも約0.2μM、少なくとも約0.3μM、少なくとも約0.4μM、少なくとも約0.5μM、少なくとも約0.6μM、少なくとも約0.7μM、少なくとも約0.8μM、少なくとも約0.9μM、少なくとも約1μM、少なくとも約1.1μM、少なくとも約1.2 μM、少なくとも約1.3μM、少なくとも約1.4
μM、少なくとも約1.5μM、少なくとも約1.6μM、少なくとも約1.7μM、少なくとも約1.8μM、少なくとも約1.9μM、少なくとも約2μM、少なくとも約2.1μM、少なくとも約2.2μM、少なくとも約2.3μM、少なくとも約2.4μM、少なくとも約2.5μM、少なくとも約2.6μM、少なくとも約2.7μM、少なくとも約2.8μM、少なくとも約2.9μM、少なくとも約3μM、少なくとも約3.5μM、少なくとも約4μM、少なくとも約4.5μM、少なくとも約5μM、少なくとも約10μM、少なくとも約20μM、少なくとも約30μM、少なくとも約40μM又は少なくとも約50μMの濃度で供給され得る。
/v)、約10%(v/v)、約15%(v/v)又は約20%(v/v)である。或いは、添加するB27サプリメントの濃度は、市販のB27ストック溶液の濃度の倍数単位で調整され得る。例えば、B27は、50倍ストック溶液としてInvitrogen(Carlsbad, CA)から入手可能である。十分な容量の成長培地へこのストック溶液を十分量添加することにより、所望の量のB27を補充した培地が生じる。例えば、成長培地90mlへ50倍B27ストック溶液10mlを添加することにより、5倍B27を補充した成長培地が生じる。培地中のB27サプリメントの濃度は、約0.1倍、約0.2倍、約0.3倍、約0.4倍、約0.5倍、約0.6倍、約0.7倍、約0.8倍、約0.9倍、約1倍、約1.1倍、約1.2倍、約1.3倍、約1.4倍、約1.5倍、約1.6倍、約1.7倍、約1.8倍、約1.9倍、約2倍、約2.5倍、約3倍、約3.5倍、約4倍、約4.5倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約11倍、約12倍、約13倍、約14倍、約15倍、約16倍、約17倍、約18倍、約19倍、約20倍及び約20倍以上であり得る。
くとも約0.02μM、少なくとも約0.04μM、少なくとも約0.08μM、少なくとも約0.1μM、少なくとも約0.2μM、少なくとも約0.3μM、少なくとも約0.4μM、少なくとも約0.5μM、少なくとも約0.6μM、少なくとも約0.7μM、少なくとも約0.8μM、少なくとも約0.9μM、少なくとも約1μM、少なくとも約1.1μM、少なくとも約1.2μM、少なくとも約1.3μM、少なくとも約1.4μM、少なくとも約1.5μM、少なくとも約1.6μM、少なくとも約1.7μM、少なくとも約1.8μM、少なくとも約1.9μM、少なくとも約2μM、少なくとも約2.1μM、少なくとも約2.2μM、少なくとも約2.3μM、少なくとも約2.4μM、少なくとも約2.5μM、少なくとも約2.6μM、少なくとも約2.7μM、少なくとも約2.8μM、少なくとも約2.9μM、少なくとも約3μM、少なくとも約3.5μM、少なくとも約4μM、少なくとも約4.5μM、少なくとも約5μM、少なくとも約10μM、少なくとも約20μM、少なくとも約30μM、少なくとも約40μM又は少なくとも約50μMの濃度で存在するように、細胞培養物の細胞へ供給される。このような実施形態では、レチノイドは、約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、約7日、約8日、約9日、約10日又は約10日超で細胞に供給され、その後胚体内胚葉細胞培養物でのTGFβスーパーファミリー増殖因子シグナル伝達が低滅又は除かれる。好ましい実施形態では、約0.05μM RA〜約2μM RAが、約2〜3日、PDX−1陰性前腸内胚葉細胞培養物に供給され、その後TGFβスーパーファミリー増殖因子シグナル伝達が低滅又は除去される。
HNF1b及び/又はFOXA1の発現、並びにPDX1の発現の欠如は、Q−PCR及び/又は免疫細胞化学のような上記の方法を用いて検出され及び/又は定量されて、PDX1陰性前腸内胚葉へのPDX1陰性胚体内胚葉の分化をモニタリングする。上記のマーカーのほかに、本発明のいくつかの実施形態では、SOX17の発現も確定される。
内胚葉細胞培養物は、SOX7、AFP、SOX1、ZIC1又はNFMマーカー遺伝子を発現する細胞を実質的に含まない。或る特定の実施形態では、本明細書中に記載するプロセスにより産生されるPDX1陰性前腸内胚葉細胞培養物は、臓側内胚葉、壁側内胚葉及び/又は神経細胞を実質的に含まない。
本発明のいくつかの実施形態は、PDX1陰性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような細胞組成物に関し、ここでPDX1陰性前腸内胚葉細胞は、腸管の前部分に由来する細胞、組織又は器官へ分化することができる多分化能細胞である。或る特定の実施形態によれば、PDX1陰性前腸内胚葉は哺乳類細胞であり、好ましい実施形態では、そのような細胞はヒト細胞である。
なくとも約13%、少なくとも約12%、少なくとも約11%、少なくとも約10%、少なくとも約9%、少なくとも約8%、少なくとも約7%、少なくとも6%、少なくとも5%、少なくとも4%、少なくとも約3%、少なくとも約2%又は少なくとも約1%のPDX1陰性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物及び/又は細胞集団を産生する。好ましい実施形態では、この細胞培養物又は細胞集団の細胞は、ヒト細胞から成る。いくつかの実施形態では、細胞培養物又は細胞集団中のPDX1陰性前腸内胚葉細胞のパーセントは、培養物中に存在するフィーダー細胞を考慮せずに算出される。
又はFOXA1マーカーの発現は、少なくとも約2%のヒト細胞において、AFP、SOX7、SOX1、ZIC1及び/又はNFMマーカーの発現よりも多い。他の実施形態では、SOX17、HNF1b及び/又はFOXA1マーカーの発現は、少なくとも約5%のヒト細胞において、少なくとも約10%のヒト細胞において、少なくとも約15%のヒト細胞において、少なくとも約20%のヒト細胞において、少なくとも約25%のヒト細胞において、少なくとも約30%のヒト細胞において、少なくとも約35%のヒト細胞において、少なくとも約40%のヒト細胞において、少なくとも約45%のヒト細胞において、少なくとも約50%のヒト細胞において、少なくとも約55%のヒト細胞において、少なくとも約60%のヒト細胞において、少なくとも約65%のヒト細胞において、少なくとも約70%のヒト細胞において、少なくとも約75%のヒト細胞のヒト細胞において、少なくとも約80%のヒト細胞において、少なくとも約85%のヒト細胞において、少なくとも約90%のヒト細胞において、少なくとも約95%のヒト細胞において、或いは少なくとも約98%のヒト細胞において、AFP、SOX7、SOX1、ZIC1及び/又はNFMマーカーの発現よりも多い。いくつかの実施形態では、細胞培養物又は細胞集団中のヒト細胞のパーセント(ここで、SOX17、HNF1b及び/又はFOXA1マーカーの発現は、AFP、SOX7、SOX1、ZIC1及び/又はNFMマーカーの発現よりも多い)は、フィーダー細胞を考慮せずに算出される。
本明細書中に記載されるPDX1陽性前腸内胚葉細胞を含むPDX1陽性前腸内胚葉細胞培養物及び細胞集団は、上記のような多能性細胞から生じるPDX1陰性胚体内胚葉細胞から産生される。好ましい方法は、出発物質としてヒト胚性幹細胞を利用する。一実施形態では、hESCは先ずPDX1陰性胚体内胚葉細胞に転換され、これは次に、PDX1陽性前腸内胚葉細胞に転換される。しかしながら、PDX1陽性前腸内胚葉の産生のための出発物質は、多能性細胞分化方法を用いて産生される胚体内胚葉細胞に限定されないと理解されたい。むしろ、任意のPDX1陰性胚体内胚葉細胞が、それらの起源と関係なく、本明細書中に記載される方法に用いられ得る。
子を含むRPMIのような培地中で約5日間に亘って、hESCのような多能性細胞から分化される細胞である。分化因子、例えばアクチビンA及びBMP4は、約1ng/ml〜約1000ng/mlの濃度で供給される。本発明の或る特定の実施形態では、培地を状態調節するために用いられる細胞は、低血清RPMI中で約5日間に亘って、hESCから分化される。いくつかの実施形態によれば、低血清RPMIとは、低血清含有培地を指し、この場合、血清濃度は限定期間に亘って漸次増大される。例えば一実施形態では、低血清RPMIは、細胞増殖の第1日目に約0.2%のウシ胎児血清(FBS)、細胞増殖の第2日目に約0.5%FBS、そして細胞増殖の第5日目に約2%FBSを含む。別の実施形態では、低血清RPMIは、1日目に約0%、2日目に約0.2%、3〜6日目に約2%の濃度を含む。或る特定の好ましい実施形態では、低血清RPMIは、1つ又は複数の分化因子、例えばアクチビンA及びBMP4を供給される。培地を状態調節するために用いられる細胞を調製するに際しての使用のほかに、低血清RPMIは、PDX1陰性胚体内胚葉細胞からのPDX1陽性前腸内胚葉細胞の分化のための培地として用いられ得る。
も約1.1μM、少なくとも約1.2μM、少なくとも約1.3μM、少なくとも約1.4μM、少なくとも約1.5μM、少なくとも約1.6μM、少なくとも約1.7μM、少なくとも約1.8μM、少なくとも約1.9μM、少なくとも約2μM、少なくとも約2.1μM、少なくとも約2.2μM、少なくとも約2.3μM、少なくとも約2.4μM、少なくとも約2.5μM、少なくとも約2.6μM、少なくとも約2.7μM、少なくとも約2.8μM、少なくとも約2.9μM、少なくとも約3μM、少なくとも約3.5μM、少なくとも約4μM、少なくとも約4.5μM、少なくとも約5μM、少なくと
も約10μM、少なくとも約20μM、少なくとも約30μM、少なくとも約40μM又は少なくとも約50μMの濃度で存在するように細胞培養物の細胞に供給される。本明細書で用いられるように、「レチノイド」は、レチノール、レチナール又はレチノイン酸、及び任意のこれらの化合物の誘導体を表す。好ましい実施形態では、レチノイドはレチノイン酸である。
(v/v)未満、約0.2%(v/v)未満、約0.3%(v/v)未満、約0.4%(v/v)未満、約0.5%(v/v)未満、約0.6%(v/v)未満、約0.7%(v/v)未満、約0.8%(v/v)未満、約0.9%(v/v)未満、約1%(v/v)未満、約2%(v/v)未満、約3%(v/v)未満、約4%(v/v)未満、約5%(v/v)未満、約6%(v/v)未満、約7%(v/v)未満、約8%(v/v)未満、約9%(v/v)未満、約10%(v/v)未満、約15%(v/v)未満又は約20%(v/v)未満であり得る。いくつかの実施形態では、PDX1陽性前腸内胚葉細胞は血清を用いずに増殖される。他の実施形態では、PDX1陽性前腸内胚葉細胞は血清代替品で増殖される。
)、約0.3%(v/v)、約0.4%(v/v)、約0.5%(v/v)、約0.6%(v/v)、約0.7%(v/v)、約0.8%(v/v)、約0.9%(v/v)、約1%(v/v)、約2%(v/v)、約3%(v/v)、約4%(v/v)、約5%(v/v)、約6%(v/v)、約7%(v/v)、約8%(v/v)、約9%(v/v)、約10%(v/v)、約15%(v/v)又は約20%(v/v)である。代替的には、添加するB27サプリメントの濃度を、市販のB27ストック溶液の濃度の位数単位で調整することができる。例えば、B27は50倍ストック溶液としてInvitrogen(Carlsbad, CA)で市販されている。このストック溶液を十分量、十分量の成長培地に添加することで、所望量のB27を添加した培地が作られる。例えば、50倍B27ストック溶液10mlを成長培地90mlに加えることで、5倍B27を添加した成長培地が作られる。培地中のB27サプリメントの濃度は、約0.1倍、約0.2倍、約0.3倍、約0.4倍、約0.5倍、約0.6倍、約0.7倍、約0.8倍、約0.9倍、約1倍、約1.1倍、約1.2倍、約1.3倍、約1.4倍、約1.5倍、約1.6倍、約1.7倍、約1.8倍、約1.9倍、約2倍、約2.5倍、約3倍、約3.5倍、約4倍、約4.5倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約11倍、約12倍、約13倍、約14倍、約15倍、約16倍、約17倍、約18倍、約19倍、約20倍及び約20倍超であり得る。
本明細書中に記載される背側PDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む背側PDX1陽性前腸内胚葉細胞培養物及び細胞集団は、上記のような多能性細胞から生じるPDX1陰性胚体内胚葉から産生される。さらに、上記のように、好ましい方法は出発材料としてヒト胚性幹細胞を利用する。一実施形態では、hESCは先ずPDX1陰性胚体内胚葉細胞に転換され、これは次に、背側PDX1陽性前腸内胚葉細胞に転換される。しかしながら、背側PDX1陽性前腸内胚葉細胞の産生のための出発材料は、多能性細胞分化方法を用いて産生される胚体内胚葉細胞に限定されないと理解される。むしろ、任意のPDX1陰性胚体内胚葉細胞は、それらの起源にかかわらず、本明細書中に記載される方法に用いられ得る。
PDX1陽性前腸内胚葉細胞へのPDX1陰性、SOX17−陽性胚体内胚葉細胞の分化のために用いられる因子を添加する。他の実施形態では、PDX1陰性、SOX17−陽性胚体内胚葉細胞に関して富化される細胞集団は、背側PDX1陽性前腸内胚葉細胞の産生のための供給源として用いられる。
Labs培地(CMRL培地)(Invitrogen, Carlsbad, CA)と一緒に用いられる。
することで、所望量のB27を添加した培地が作られる。例えば、50×B27ストック溶液10mlを成長培地90mlに加えることで、5倍B27を補充した成長培地が作られる。培地中のB27サプリメントの濃度は、約0.1倍、約0.2倍、約0.3倍、約0.4倍、約0.5倍、約0.6倍、約0.7倍、約0.8倍、約0.9倍、約1倍、約1.1倍、約1.2倍、約1.3倍、約1.4倍、約1.5倍、約1.6倍、約1.7倍、約1.8倍、約1.9倍、約2倍、約2.5倍、約3倍、約3.5倍、約4倍、約4.5倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約11倍、約12倍、約13倍、約14倍、約15倍、約16倍、約17倍、約18倍、約19倍、約20倍及び約20倍超であり得る。
本明細書中に記載される腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞培養物及び細胞集団は、上記のような多能性細胞から生じるPDX1陰性胚体内胚葉から産生される。さらに、上記のように、好ましい方法は出発材料としてヒト胚性幹細胞を利用する。一実施形態では、hESCは先ずPDX1陰性胚体内胚葉細胞に転換され、これは次に、腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞に転換される。しかしながら、腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞の産生のための出発材料は、多能性細胞分化方法を用いて産生される胚体内胚葉細胞に限定されないと理解される。むしろ、任意のPDX1陰性胚体内胚葉細胞は、それらの起源にかかわらず、本明細書中に記載される方法に用いられ得る。
RML培地)(Invitrogen, Carlsbad, CA)と一緒に用いられる。特に好ましい実施形態では、FGF−10及び/又はKAAD−シクロパミンは、RA又は他のレチノイドの非存在下でPDX1陰性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物に供給される。或る特定の実施形態では、BMP4は、RA又は他のレチノイドの非存在下でFGF−10及び/又はKAAD−シクロパミン中に含まれ得る。FGFファミリー増殖因子類似体又は模倣物及び/又はヘッジホッグ阻害剤の添加後約1日〜約10日後、レチノイド、例えばRA、又はレチノイド含有サプリメント、例えばB27が供給されて、PDX1の発現を誘導する。好ましい実施形態では、RAは、FGFファミリー増殖因子類似体又は模倣物及び/又はヘッジホッグ阻害剤の添加後約2日、約3日、約4日又は約5日目に供給される。他の実施形態では、B27は、FGFファミリー増殖因子類似体又は模倣物及び/又はヘッジホッグ阻害剤を供給するのとほぼ同時に供給される。
08μM、少なくとも約0.1μM、少なくとも約0.2μM、少なくとも約0.3μM、少なくとも約0.4μM、少なくとも約0.5μM、少なくとも約0.6μM、少なくとも約0.7μM、少なくとも約0.8μM、少なくとも約0.9μM、少なくとも約1μM、少なくとも約1.1μM、少なくとも約1.2 μM、少なくとも約1.3μM、
少なくとも約1.4μM、少なくとも約1.5μM、少なくとも約1.6μM、少なくとも約1.7μM、少なくとも約1.8μM、少なくとも約1.9μM、少なくとも約2μM、少なくとも約2.1μM、少なくとも約2.2μM、少なくとも約2.3μM、少なくとも約2.4μM、少なくとも約2.5μM、少なくとも約2.6μM、少なくとも約2.7μM、少なくとも約2.8μM、少なくとも約2.9μM、少なくとも約3μM、少なくとも約3.5μM、少なくとも約4μM、少なくとも約4.5μM、少なくとも約5μM、少なくとも約10μM、少なくとも約20μM、少なくとも約30μM、少なくとも約40μM又は少なくとも約50μMの濃度で供給され得る。
多能性細胞からの胚体内胚葉細胞の分化に関するのと同様に、PDX1陰性、SOX17
陽性胚体内胚葉からPDX1陽性前腸内胚葉細胞への分化の進行は、これらの細胞型に特徴的なマーカーの発現を確定することによりモニタリングされ得る。このようなモニタリングは、種々の条件下での、例えば1つ又は複数の分化因子濃度及び環境条件下での所望量のPDX1陽性前腸内胚葉の産生のために十分である時間の量を確定させ得る。好ましい実施形態では、所望量のPDX1陽性前腸内胚葉の産生のために十分である時間の量は、PDX1の発現を検出することにより確定される。本発明のいくつかの実施形態では、或る特定のマーカーの発現は、マーカーの存在又は非存在を検出することにより確定される。代替的には、或る特定のマーカーの発現は、マーカーが細胞培養物又は細胞集団の細胞中に存在するレベルを測定することにより確定され得る。このような実施形態では、マーカー発現の測定は、定性的又は定量的であり得る。上記のように、マーカー遺伝子により産生される発現マーカーを定量する好ましい方法は、Q−PCRの使用による。特定の実施形態では、Q−PCRは、PDX1陽性前腸内胚葉に特徴的なマーカー遺伝子の発現を、並びに他の細胞型に特徴的なマーカー遺伝子の発現の欠如を定量することにより、PDX1陽性前腸内胚葉細胞へのPDX1陰性、SOX17陽性胚体内胚葉培養の細胞の進行をモニタリングするために用いられる。当該技術分野で既知である他の方法も、マーカー遺伝子発現を定量するために用いられ得る。例えばマーカー遺伝子産物の発現は、対象となる当該マーカー遺伝子産物に特異的な抗体を用いることにより検出され得る。本発明のいくつかの実施形態では、PDX1陽性前腸内胚葉に特徴的なマーカー遺伝子の発現並びにPDX1陰性胚体内胚葉、hESC及び他の細胞型に特徴的なマーカー遺伝子の有意の発現の欠如が確定される。
以下の実施例中の表3及び/又は表4に記載される1つ又は複数のマーカーの発現は、背側PDX1陽性内胚葉へのPDX1陰性胚体内胚葉の分化をモニタリングするために、上記の方法、例えばQ−PCR及び/又は免疫細胞化学を用いて検出及び/又は定量され得る。背側偏向及び腹側偏向PDX1陽性前腸内胚葉細胞の両方に関連したマーカーは、表3に記載されている。これらのマーカーのうち、CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2及びSLC27A2から成る群から選択されるマーカーは、細胞表面マーカーである。背側PDX1陽性前腸内胚葉の産生をモニタリングするための表3に列挙されるいくつかの好ましいマーカーは、SERPINF2、DUSP9、CDH6及びSOX9から成る群から選択される。背側偏向前腸内胚葉に関連したマーカーは、表4に記載されている。表4マーカーの各々は、他のPDX1陽性細胞と比較して、背側PDX1陽性前腸内胚葉細胞
中で選択的に、特異的に又は独自的に発現される。これらのマーカーのうち、ADORA2A、CD47、EPB41L1、MAG、SFRP5、SLC16A10、SLC16A2、SLC1A3、SLC30A4、SLICK、SLITRK4及びXPR1から成る群から選択されるマーカーは、細胞表面マーカーである。背側PDX1陽性前腸内胚葉の産生をモニタリングするための表4に列挙されるいくつかの好ましいマーカーは、HOXA1、PDE11A、FAM49A及びWNT5Aから成る群から選択される。
前節に記載されたように、背側偏向及び腹側偏向PDX1陽性前腸内胚葉細胞に関連したマーカーは、表3に記載されている。このようなものとして、表3に記載されるマーカーのうちの1つ又は複数の発現は、上記の方法、例えばQ−PCR及び/又は免疫細胞化学を用いて検出及び/又は定量されて、腹側PDX1陽性内胚葉へのPDX1陰性胚体内胚葉の分化をモニタリングし得る。表3に記載されるマーカーのうち、CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2及びSLC27A2から成る群から選択されるマーカーは、細胞表面マーカーである。腹側PDX1陽性前腸内胚葉の産生をモニタリングするための表3に列挙されるいくつかの好ましいマーカーは、SERPINF2、DUSP9、CDH6及びSOX9から成る群から選択される。さらに、表4に記載されるマーカーは、背側偏向前腸内胚葉中で選択的に、特異的に又は独自的に発現されるため、これらのマーカーのうちの1つ又は複数の、背側PDX1陽性前腸内胚葉中での発現と比較した場合の、発現の欠如又は発現低減を検出することは、腹側PDX1陽性前腸内胚葉へのPDX1陰性胚体内胚葉の分化をモニタリングするために有用でもある。表4マーカーのうち、ADORA2A、CD47、EPB41L1、MAG、SFRP5、SLC16A10、SLC16A2、SLC1A3、SLC30A4、SLICK、SLITRK4及びXPR1から成る群から選択されるマーカーは、細胞表面マーカーである。背側PDX1陽性前腸内胚葉の産生をモニタリングするための表4に列挙されるいくつかの好ましいマーカーは、HOXA1、PDE11A、FAM49A及びWNT5Aから成る群から選択される。このようなものとして、表3から選択される1つ又は複数のマーカーを発現するPDX1陽性細胞中のこれらのマーカーの非存在又は微量の発現は、腹側PDX1陽性ということを示す。
実質的非存在を実証することに関する。例えばいくつかの実施形態では、内蔵内胚葉及び/又は神経細胞中で発現されるマーカー、例えばSOX7、AFP、SOX1、ZIC1及び/又はNFM(これらに限定されない)の発現が確定される。
上記のプロセスのいずれかにより産生されるPDX1陽性前腸内胚葉細胞、例えば背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、このような細胞に特異的である親和性タグを用いることにより、富化され、単離され、及び/又は精製され得る。背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞に特異的な親和性タグの例は、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞の細胞表面に存在するが、本明細書中に記載される方法により産生される細胞培養物中に見出される他の細胞型上には実質的に存在しないマーカー分子(例えばポリペプチド)に特異的な抗体、リガンド又は他の結合作因である。いくつかのプロセスでは、CDH6、GABRA2、GRIA3、IL6R、KCNJ2、LGALS3、LGALS3/GALIG、SERPINF2、SLC27A2、ADORA2A、CD47、EPB41L1、MAG、SFRP5、SLC16A10、SLC16A2、SLC1A3、SLC30A4、SLICK、SLITRK4及びXPR1から成る群から選択される細胞表面マーカーと結合する抗体が、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞の富化、単離又は精製のための親和性タグとして用いられる。
胞選別器(FACS)を用いて選別される。マーカー陽性細胞はマーカー陰性細胞から分離回収され、それによりこのような細胞型の単離を生じる。所望により、単離細胞組成物は、代替的親和性ベースの方法を用いることにより、或いは背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞に特異的である同一の又は異なるマーカーを用いる付加的回数の選別により、さらに精製され得る。
つかの方法では、細胞は無作為分化を受ける。しかしながら好ましい方法では、細胞は主に、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞に分化するよう指図される。いくつかの好ましい富化、単離及び/又は精製方法は、ヒトPDX1陰性胚体内胚葉細胞からの背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞のin vitro産生に関する。本明
細書中に記載される方法を用いて、細胞集団又は細胞培養物は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して少なくとも約2〜約1000倍、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉含量を富化され得る。いくつかの実施形態では、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して少なくとも約5〜約500倍富化され得る。他の実施形態では、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して少なくとも約10〜約200倍富化され得る。さらに他の実施形態では、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して少なくとも約20〜約100倍富化され得る。さらに他の実施形態では、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して少なくとも約40〜約80倍富化され得る。或る特定の実施形態では、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して少なくとも約2〜約20倍富化され得る。
本発明の付加的態様に関して、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、富化され、単離され、及び/又は精製され得る。本発明のいくつかの実施形態では、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞に関して富化される細胞集団は、細胞培養物から
このような細胞を単離することにより産生される。
生され得る。いくつかの実施形態では、細胞は無作為分化を受ける。しかしながら好ましい実施形態では、細胞は主に、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞に分化するよう指図される。いくつかの好ましい富化、単離及び/又は精製方法は、ヒト胚性幹細胞からの背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞のin vitro産生に関す
る。
の実施形態では、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して少なくとも約2〜約20倍富化され得る。
本発明のいくつかの実施形態は、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞組成物、例えば細胞培養物又は細胞集団であって、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞が背側膵芽及び/又は腹側膵芽のような腸管の前部分に由来する細胞、組織又は器官に分化し得る複能性細胞である細胞組成物に関する。或る特定の実施形態によれば、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞は哺乳類の細胞であり、好ましい実施形態では、このような細胞はヒト細胞である。
、少なくとも約11%、少なくとも約10%、少なくとも約9%、少なくとも約8%、少なくとも約7%、少なくとも約6%、少なくとも約5%、少なくとも約4%、少なくとも約3%、少なくとも約2%、又は少なくとも約1%の背側及び/又は腹側のPDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物及び/又は細胞集団を産生する。好ましい実施形態では、この細胞培養物又は細胞集団の細胞は、ヒト細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養物又は細胞集団中の背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞のパーセンテージは、培養物中に残存するフィーダー細胞と関係なく算定される。
来する。或る特定の実施形態では、ヒト多能性細胞は、桑実胚、胚の内部細胞塊又は胚の生殖腺隆起に由来する。或る特定の他の実施形態では、ヒト多能性細胞は、胚段階後に発生した多細胞構造の生殖腺組織又は胚組織に由来する。
ト細胞の少なくとも約45%で、ヒト細胞の少なくとも約50%で、ヒト細胞の少なくとも約55%で、ヒト細胞の少なくとも約60%で、ヒト細胞の少なくとも約65%で、ヒト細胞の少なくとも約70%で、ヒト細胞の少なくとも約75%で、ヒト細胞の少なくとも約80%で、ヒト細胞の少なくとも約85%で、ヒト細胞の少なくとも約90%で、ヒト細胞の少なくとも約95%で、又はヒト細胞の少なくとも約98%で、AFP、SOX7、SOX1、ZIC1及び/又はNFMマーカーの発現よりも大きい。いくつかの実施形態では、表3から選択される1つ又は複数のマーカーの発現がAFP、SOX7、SOX1、ZIC1及び/又はNFMマーカーの発現よりも大きい細胞培養物又は細胞集団中のヒト細胞のパーセンテージは、フィーダー細胞を考慮せずに算定される。
、SOX7 低、SOX1 低、ZIC1 低及びNFM 低である。
本発明のいくつかの態様は、SOX17陽性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団中でのPDX1遺伝子産物の発現を増大する方法に関する。このような実施形態では、SOX17陽性胚体内胚葉細胞は、PDX1遺伝子産物の発現を増大するために十分である量で分化因子と接触される。分化因子と接触されるSOX17陽性胚体内胚葉細胞は、PDX1陰性又はPDX1陽性のいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、分化因子はレチノイドである。或る特定の実施形態では、SOX17陽性胚体内胚葉細胞は、約0.01μM〜約50μMの範囲の濃度でレチノイドと接触される。好ましい実施形態では、レチノイドはRAである。
本発明の付加的態様は、PDX1陽性前腸内胚葉細胞へのPDX1陰性胚体内胚葉細胞の分化を促進し得る1つ又は複数の分化因子を同定する方法に関する。このような方法では、PDX1陰性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団が得られ、そして細胞培養物又は細胞集団中でのPDX1の発現が確定される。PDX1の発現を確定した後、細胞培養物又は細胞集団の細胞は、候補分化因子と接触される。いくつかの実施形態では、PDX1の発現は、細胞と候補分化因子との接触時、又は接触直後に、確定される。PDX1発現は次に、細胞と候補分化因子との接触後の1つ又は複数の時点で確定される。候補分化因子との接触前のPDX1発現と比較して、PDX1の発現が候補分化因子との接触後に増大された場合、候補分化因子は、PDX1陽性前腸内胚葉細胞へのPDX1陰性胚体内胚葉細胞の分化を促進し得ると同定される。
本明細書中に記載される或る特定のスクリーニング方法は、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進し得る少なくとも1つの分化因子を同定するための方法に関する。これらの方法のいくつかの実施形態では、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞、例えばヒト背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞集団が得られる。次に細胞集団は、候補分化因子を供給される。候補分化因子を供給される前又はそれとほぼ同時である第1の時点で、マーカーの発現が確定される。代替的には、マーカーの発現は、候補分化因子の供給後に確定され得る。第1の時点の後、そして細胞集団に候補分化因子を供給する工程の後である第2の時点で、同一マーカーの発現が再び確定される。候補分化因子が背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進し得るか否かは、第1の時点でのマーカーの発現を第2の時点でのマーカーの発現と比較することにより確定される。第2の時点でのマーカーの発現が、第1の時点でのマーカーの発現と比較して増大されるか又は低減された場合には、候補分化因子は、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進し得る。好ましい実施形態では、マーカーの発現は、Q−PCRにより確定される。
は複数の型の細胞に関する分化因子であることが既知である分子を含む。代替的実施形態では、候補分化因子は、細胞分化を促進することが既知でない分子を含む。好ましい実施形態では、候補分化因子は、背側及び/又は腹側PDX1陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進することが既知でない分子を含む。
骨形成タンパク質8(造骨タンパク質(osteogeneic protein)2)、骨形成タンパク質
6、骨形成タンパク質7、結合組織増殖因子(CTGF)、CGI−149タンパク質(神経内分泌分化因子)、サイトカインA3(マクロファージ炎症性タンパク質1−α)、膠芽腫(Gliablastoma)細胞分化関連タンパク質(GBDR1)、肝細胞癌由来増殖因子、ニューロメジンU−25前駆体、血管内皮増殖因子(VEGF)、血管内皮増殖因子B(VEGF−B)、T細胞特異的RANTES前駆体、胸腺樹状細胞誘導因子1、トランスフェリン、インターロイキン1(IL1)、インターロイキン2(IL2)、インターロイキン3(IL3)、インターロイキン4(IL4)、インターロイキン5(IL5)、インターロイキン6(IL6)、インターロイキン7(IL7)、 インターロイキン
8(IL8)、インターロイキン9(IL9)、インターロイキン10(IL10)、インターロイキン11(IL11)、インターロイキン12(IL12)、インターロイキン13(IL13)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)、エリスロポイエチン、トロンボポイエチン、ビタミンD3、上皮細胞増殖因子(EGF)、脳由来神経栄養因子、白血病抑制因子、甲状腺ホルモン、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、aFGF、FGF−4、FGF−6、ケラチノサイト増殖因子(KGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、血小板由来増殖因子−BB、β神経増殖因子、アクチビンA、形質転換増殖因子β1(TGF−β1)、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、バースト促進活性(Burst promoting activity)(BPA)、赤血球促進活性(EPA)、PGE2、インスリン増殖因子1(IGF−1)、IGF−II、ニュートロフィン増殖因子(NGF)、ニュートロフィン3、ニュートロフィン4/5、毛様体神経栄養因子、神経膠由来ネキシン、デキサメタゾン、β−メルカプトエタノール、レチノイン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、5−アザシチジン、アンホテリシンB、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩(Ascror
bate)、イソブチルキサンチン、インドメタシン、β−グリセロールホスフェート、ニコチンアミド、DMSO、チアゾリジンジオン、TWS119、オキシトシン、バソプレシン、メラニン細胞刺激ホルモン、コルチコトロピン(corticortropin)、リポトロピン、チロトロピン、成長ホルモン、プロラクチン、黄体形成ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、コルチコトロピン放出因子、ゴナドトロピン放出因子、プロラクチン放出因子、プロラクチン阻害因子、成長ホルモン放出因子、ソマトスタチン、チロトロピン放出因子、カルシトシン遺伝子関連ペプチド、副甲状腺ホルモン、グルカゴン様ペプチド1、グルコース依存性インスリン分泌促進ポリペプチド、ガストリン、セクレチン、コレシストキシン、モチリン、血管活性腸管ペプチド、物質P、膵臓ポリペプチド、ペプチドチロシンチロシン、神経ペプチドチロシン、インスリン、グルカゴン、胎盤性ラクトゲン、リラキシン、アンジオテンシンII、カルシトリオール(calctriol)、心房
性ナトリウム利尿ペプチド、及びメラトニン、チロキシン、トリヨードチロニン、カルシトニン、エストラジオール、エストロン、プロゲステロン、テストステロン、コルチゾール、コルチコステロン、アルドステロン、エピネフィン、ノルエピネフリン(norepinepherine)、アンドロスチエン(androstiene)、カルシトリオール、コラーゲン、デキサメタゾン、β−メルカプトエタノール、レチノイン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、5−アザシチジン、アンホテリシンB、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩(Ascrorbate)、イソブチルキサンチン、インドメタシン、β−グリセロールホスフェート、ニコチンアミド、DMSO、チアゾリジンジオン、及びTWS119から成る群から選択される1つ又は複数の増殖因子を含む。
子は、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度が約0.1ng/ml〜約10mg/mlの範囲であるよう、細胞集団に供給される。いくつかの実施形態では、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度は、約1ng/ml〜約1mg/mlの範囲である。他の実施形態では、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度は、約10ng/ml〜約100μg/mlの範囲である。さらに他の実施形態では、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度は、約100ng/ml〜約10μg/mlの範囲である。好ましい実施形態では、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度は、約5ng/ml、約25ng/ml、約50ng/ml、約75ng/ml、約100ng/ml、約125ng/ml、約150ng/ml、約175ng/ml、約200ng/ml、約225ng/ml、約250ng/ml、約275ng/ml、約300ng/ml、約325ng/ml、約350ng/ml、約375ng/ml、約400ng/ml、約425ng/ml、約450ng/ml、約475ng/ml、約500ng/ml、約525ng/ml、約550ng/ml、約575ng/ml、約600ng/ml、約625ng/ml、約650ng/ml、約675ng/ml、約700ng/ml、約725ng/ml、約750ng/ml、約775ng/ml、約800ng/ml、約825ng/ml、約850ng/ml、約875ng/ml、約900ng/ml、約925ng/ml、約950ng/ml、約975ng/ml、約1μg/ml、約2μg/ml、約3μg/ml、約4μg/ml、約5μg/ml、約6μg/ml、約7μg/ml、約8μg/ml、約9μg/ml、約10μg/ml、約11μg/ml、約12μg/ml、約13μg/ml、約14μg/ml、約15μg/ml、約16μg/ml、約17μg/ml、約18μg/ml、約19μg/ml、約20μg/ml、約25μg/ml、約50μg/ml、約75μg/ml、約100μg/ml、約125μg/ml、約150μg/ml、約175μg/ml、約200μg/ml、約250μg/ml、約300μg/ml、約350μg/ml、約400μg/ml、約450μg/ml、約500μg/ml、約550μg/ml、約600μg/ml、約650μg/ml、約700μg/ml、約750μg/ml、約800μg/ml、約850μg/ml、約900μg/ml、約950μg/ml、約1000μg/ml又は約1000μ/ml超である。
くとも約204時間、少なくとも約210時間、少なくとも約216時間、少なくとも約222時間、少なくとも約228時間、少なくとも約234時間、又は少なくとも約240時間である。
ヒトES細胞
内胚葉発達についての研究のために、本発明者等は、多能性であり、そして正常核型を保持しながら培養中に外見上無限に分裂し得るヒト胚性幹細胞を用いた。単離のために免疫学的又は機械的方法を用いて、5日齢胚内部細胞塊からES細胞を得た。特にヒト胚性幹
細胞株hESCyt−25を、患者によるインフォームドコンセント後に、体外受精周期からの過剰凍結胚から得た。解凍の直後に、ES培地(DMEM、20%FBS、非必須アミノ酸、β−メルカプトエタノール、ITSサプリメント)中のマウス胚線維芽細胞(MEF)上に孵化胚盤胞を平板培養した。胚が培養皿に接着し、そして約2週間後、未分化hESCの領域を、MEFとともに新たな皿に移した。機械的に切断し、ディスパーゼで手短に消化し、その後、細胞クラスターを機械的に取り出して、洗浄し、再度平板培養することにより移動を成し遂げた。誘導以来、hESCyt−25を、100回にわたって逐次継代した。胚体内胚葉の産生のための出発物質として、hESCyt−25ヒト胚性幹細胞株を用いた。
hESCyt−25特性化
ヒト胚性幹細胞株hESCyt−25は、培養中に18ヶ月にわたって、正常な形態特性、核型特性、増殖特性及び自己再生特性を保持した。この細胞株は、OCT4、SSEA−4及びTRA−1−60抗原(これらはすべて、未分化hESCに特有である)に対する強免疫反応性を示し、そしてアルカリ性ホスファターゼ活性、並びに他の確立されたhESC株と同一の形態を示す。さらにヒト幹細胞株hESCyt−25は、懸濁液中で培養される場合、胚様体(EB)も容易に形成する。その多能性の実証として、hESCyT−25は、3つの主要胚葉を表わす種々の細胞型に分化する。ZIC1に関するQ−PCR、並びにネスチン及びより成熟したニューロンマーカーに関する免疫細胞化学(ICC)により、外胚葉産生を実証した。β−IIIチューブリンに関する免疫細胞化学染色を、初期ニューロンに特徴的な伸長細胞のクラスター中で観察した。予め、レチノイン酸で懸濁液中のEBを処理して、臓側内胚葉(VE)、胚体外系統への多能性幹細胞の分化を誘導した。処理された細胞は、高レベルのα−フェトプロテイン(AFP)及びSOX7(VEの2つのマーカー)を54時間の処理により発現した。単層中で分化された細胞は、免疫細胞化学染色により実証されるように、散在性パッチ中でAFPを発現した。以下で記載するように、hESCyT−25細胞株は、AFP発現の非存在下でのSOX17に関する実時間定量的ポリメラーゼ連鎖反応(Q−PCR)及び免疫細胞化学により立証されるように、胚体内胚葉も形成し得た。中胚葉への分化を実証するために、分化中のEBを、いくつかの時点でのブラキュリ遺伝子発現に関して分析した。ブラキュリ発現は、実験経過中に漸進的に増大した。上記に鑑みて、三胚葉を表わす細胞を形成する能力により示されるように、hESCyT−25株は多能性である。
SOX17抗体の産生
hESC培養物における胚体内胚葉の同定に対する主要な妨害は、適切なツールの欠如である。したがって、本発明者等は、ヒトSOX17タンパク質に対する抗体の産生に着手した。
番号1)の一部(図2)は、抗体産生会社GENOVAC(Freiberg, Germany)にて、そこで開発された手順に従って、ラットにおける遺伝子免疫化に使用した。遺伝子免疫化に関する手段は、米国特許第5,830,876号、同第5,817,637号、同第6,165,993号及び同第6,261,281号、並びに国際特許出願公開第WO00/29442号及び同第WO99/13915号(その開示は参照により本明細書に完全に援用される)に見出すことができる。
DNA免疫化により産生されるE2特異的モノクローナル抗体によるヒト血清における
G型肝炎ウイルス粒子の同定(Identification of hepatitis G virus particles in human serum by E2-specific monoclonal antibodides generated by DNA immunization), J.
Virol. 72: 4541-4545、Krasemann他(1999) 異例の核酸ベースの免疫化戦略を用いたタ
ンパク質に対するモノクローナル抗体の生成(Generation of monoclonal antibodides against proteins with an unconventional nucleic acid-based immunization strategy),
J. Biotechnol. 73: 119-129、及びUlivieri他(1996) DNA免疫化によるヘリコバクター・ピロリ細胞空胞化毒素の規定部分に対するモノクローナル抗体の生成(Generation of
a monoclonal antibody to a defined portion of the Heliobacter pylori vacuolating cytotoxin by DNA immunization), J. Biotechnol. 51: 191-194(その開示は参照により本明細書に完全に援用される)に見出すことができる。
。タンパク質産生に関して、テロメラーゼ不死化MDXヒト線維芽細胞を、リポフェクタ
ミン2000(Invitrogen, Carlsbad, CA)の存在下で、スーパーコイルDNAで一過的にトランスフェクトした。総細胞溶解産物は、トランスフェクションの36時間後に、プロテアーゼ阻害剤のカクテル(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)を含有
する50mM TRIS−HCl(pH8)、150mM NaCl、0.1% SDS、
0.5%デオキシコール酸中で回収した。NuPAGE(4〜12%グラジエントポリアクリルアミド、Invitrogen, Carlsbad, CA)上でのSDS−PAGEにより分離され、且
つPDVF膜(Hercules, CA)上へのエレクトロブロッティングにより移入された細胞タンパク質100μgのウェスタンブロット分析は、10mM TRIS−HCl(pH8)
、150mM NaCl、10%BSA、0.05%Tween−20(Sigma, St. Louis, MO)中のラットSOX17抗血清の1000倍希釈で、続いてアルカリホスファターゼ
結合抗ラットIgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)でプロー
ビングして、ベクターブラックアルカリホスファターゼ染色(Vector Laboratories, Burlingame, CA)により明らかにした。使用されるタンパク質サイズ標準物質は、広範囲の色
彩マーカー(Sigma, St. Louis, MO)であった。
れたヒト線維芽細胞から作製されるタンパク質抽出物を、SOX17抗体によりウェスタンブロットでプロービングした。hSOX17トランスフェクト細胞からのタンパク質抽出物のみが、ヒトSOX17タンパク質の予測46Kda分子量に近い〜51Kdaのバンドを生じた。ヒトSOX7又はEGFPトランスフェクト細胞のいずれかから作製される抽出物に対してもSOX17抗体の反応性は見られなかった。さらに、SOX17抗体は、hSOX17発現構築物でトランスフェクトしたヒト線維芽細胞の核を明らかに標識したが、EGFPのみでトランスフェクトした細胞は標識しなかった。したがって、SOX17抗体は、ICCによる特異性を示す。
胚体内胚葉のマーカーとしてのSOX17抗体の確証
部分的に分化させたhESCをSOX17及びAFP抗体で同時標識して、SOX17抗体がヒトSOX17タンパク質に特異的であり、さらに胚体内胚葉をマークすることを実証した。SOX17、SOX7(これは、SOX遺伝子ファミリーサブグループFの密接に関連する成員である(図3))及びAFPはそれぞれ、臓側内胚葉で発現されることが実証されている。しかしながら、AFP及びSOX7は、ICCにより検出可能なレベルでは、胚体内胚葉細胞では発現されず、したがってそれらは、真正(bonifide)の胚体内胚葉細胞に関する陰性マーカーとして用いることができる。SOX17抗体は、細胞の別個の分類として存在するか、或いはAFP陽性細胞と混合される細胞の集団を標識することが示された。特に、図5Aは、少数のSOX17細胞がAFPで同時標識されることを示すが、SOX17+細胞の区域においてAFP+細胞がほとんど存在しないか、或いは全く存在しない領域も見られた(図5B)。同様に、壁側内胚葉は、SOX17を発現することが報告されているため、壁側マーカーSPARC及び/又はトロンボモジュリン(TM)と共にSOX17による抗体の同時標識を使用して、壁側内胚葉であるSOX17+
細胞を同定することができる。図6A〜図6Cに示されるように、トロンボモジュリン及びSOX17同時標識された壁側内胚葉細胞は、hES細胞の無作為分化により産生された。
7抗体標識細胞数における10倍の差に反映している(図7B)。さらに、図8Aに示されるように、hESCのアクチビンA処理は、処理無しと比較して6.8倍AFP遺伝子発現を抑制した。これは、図8B及び図8Cに示されるように、これらの培養物におけるAFP標識細胞の数の劇的な減少により可視的に反映された。これをさらに定量化するために、AFP遺伝子発現におけるこのおよそ7倍の減少は、フローサイトメトリーにより測定される場合のAFP抗体標識細胞数における同様の7倍の減少の結果であることが実証された(図9A及び図9B)。この結果は、Q−PCRにより観察されるような遺伝子発現の定量的変化は、抗体染色により観察されるような細胞型特定化における変化を反映することを示すという点で極めて有意である。
ト(95%を超える標識細胞)並びにSOX17及びAFP(臓側内胚葉)に関して同時標識する少量パーセント(5%未満)の細胞を認識した。アクチビンによるhESC培養物の処理は、SOX17遺伝子発現並びにSOX17標識細胞の顕著な増大をもたらし、AFP mRNAの発現及びAFP抗体で標識した細胞の数を劇的に抑制した。
Q−PCR遺伝子発現アッセイ
以下の実験では、リアルタイム定量的RT−PCR(Q−PCR)が、hESC分化に対する様々な処理の影響をスクリーニングするのに使用される主要なアッセイであった。特に、遺伝子発現のリアルタイム測定は、Q−PCRにより多数の時点で多数のマーカー遺伝子に関して分析した。細胞集団の全体的な動態のより良好な理解を得るために、所望の細胞型並びに望ましくない細胞型のマーカー遺伝子の特徴を評価した。Q−PCR分析の長所として、ゲノム配列が容易に入手可能である場合、その極度の感度及び必要なマーカーを開発することが比較的容易であることが挙げられる。さらに、Q−PCRの極めて高い感度により、相当大きな集団内での比較的少数の細胞からの遺伝子発現の検出が可能となる。さらに、非常に低レベルの遺伝子発現を検出する能力は、集団内の「分化の偏り」に関する指標を提供する。これらの細胞の表現型の顕在的な分化に先立つ特定の分化経路に対する偏りは、免疫細胞化学的技法を使用して認知することはできない。このため、Q−PCRは、分化処理の成功をスクリーニングするための少なくとも補完的であり且つ免疫組織化学的技法よりも潜在的に相当優れている分析の方法を提供する。さらに、Q−PCRは、半ハイスループットスケール(semi-high throughput scale)の分析にて定量的方式で分化プロトコルの成功を評価するメカニズムを提供する。
h)でのSYBR Green化学及び2段階RT−PCR方式を使用して相対定量を実施
することであった。このようなアプローチにより、今後のさらなるマーカー遺伝子の分析用のcDNAサンプルの積上げが可能となり、したがって、サンプル間の逆転写効率における可変性を回避した。
00ngからの逆転写は、オリゴdTプライマー及び無作為なプライマーのミックスを含有するiScript逆転写酵素キット(BioRad)を使用して実施した。続いて、反応物それぞれ20μLを総容量100μLにまで希釈して、3μLをそれぞれ400nM順方向プライマー及び逆方向プライマーを含有するQ−PCR反応物10μL並びに2×SYBR Greenマスターミックス(Qiagen)5μLにおいて使用した。2段階サイクリング
パラメータは、85〜94℃(具体的には各プライマー組に関するアンプリコンの融点に従って選択される)で5秒の変性、続く60℃での45秒のアニール/伸長を用いて使用された。各伸長段階の最後の15秒の間に、蛍光データを回収した。3点の10倍希釈シリーズを使用して、各実施に関する標準曲線を作成して、サイクル閾値(Ct)をこの標準曲線に基づいて定量値へ変換した。各サンプルに関する定量値は、ハウスキーピング遺伝子性能に対して正規化され、続いて平均値及び標準偏差は、三重反復サンプルに関して算出された。PCRサイクリングの終わりには、融解曲線分析を実施して、反応物の特異性を確かめた。単一の特異的産物は、そのPCRアンプリコンに適したTmでの単一ピー
クにより示された。さらに、逆転写酵素無しで実施される反応は、陰性対照として役立ち、増幅しない。
出した。多数のHGの使用は、同時に正規化プロセスに固有の可変性を低減し、相対遺伝子発現値の信頼性を増大させる。
7(臓側内胚葉)、SPARC(壁側内胚葉)及びブラキュリ(中胚葉)を発現すると予測された。さらに、ZIC1は、初期外胚葉の誘導をさらに除外するのに本明細書で使用された。最後に、GATA4及びHNF3bは、胚体内胚葉及び胚体外内胚葉の両方で発現され、したがって、胚体内胚葉におけるSOX17発現と相関する(表1)。表1に記載するマーカー遺伝子が、様々なサンプル間でどのように互いに相関するかを実証し、したがって、胚体内胚葉及び胚体外内胚葉への、並びに中胚葉及び神経細胞型への分化の特異的パターンを示す代表的な実験を図11〜図14に示している。
胚体内胚葉へのヒトES細胞の定方向分化
ヒトES細胞培養物は、それらの未分化状態を能動的に維持しない条件下で培養される場合に、無作為に分化する。この不均一分化は、壁側内胚葉及び臓側内胚葉の両方から構成される胚体外内胚葉細胞(AFP、SPARC及びSOX7発現)並びにZIC1及びネ
スチン(外胚葉)及びブラキュリ(中胚葉)発現によりマークされるような初期外胚葉誘導体及び中胚葉誘導体の産生をもたらす。胚体内胚葉細胞出現は、ES細胞培養物における特異的抗体マーカーの欠如に関して検査又は特定されていない。それ自体で、また初期状態で、ES細胞培養物における初期胚体内胚葉産生は、十分研究されていない。胚体内胚葉細胞に関する満足のいく抗体試薬が入手不可能であったため、特性化の大部分が、外胚葉及び胚体外内胚葉に焦点を当ててきた。概して、無作為に分化されたES細胞培養物においてSOX17hi胚体内胚葉細胞と比較して、有意により多数の胚体外細胞型及び神経外胚葉細胞型が存在する。
を創出するのに使用するためのノーダル/アクチビン/BMPのようなTGFβファミリー増殖因子の影響を分析及び記載した。通常の実験では、アクチビンA、アクチビンB、BMP又はこれらの増殖因子の組合せを未分化ヒト幹細胞系hES Cyt−25の培養
物へ添加して、分化プロセスを開始させた。
より長い処理時間がSOX17の増大された発現をもたらすことを示している。
in vitroでSOX17の発現及び胚体内胚葉形成を促進する。さらに、BMPの
添加は、おそらくノーダル補助受容体であるCriptoのさらなる誘導により、改善されたSOX17の誘導をもたらす。
れるように培養物中で分裂することを実証した。矢印は、PCNA/DAPI標識有糸分裂プレートパターン及び位相差有糸分裂プロファイルにより明らかなように有糸分裂中であるSOX17/PCNA/DAPIで標識された細胞を示す。
ケモカイン受容体4(CXCR4)発現は、胚体内胚葉に関するマーカーと相関し、中胚葉、外胚葉又は臓側内胚葉に関するマーカーとは相関しない
上述したように、hESCは、TGFβファミリー、より具体的にはアクチビン/ノーダルサブファミリーのサイトカインの適用により、胚体内胚葉の胚葉へ分化するように誘導することができる。さらに、本発明者等は、分化培養培地におけるウシ胎児血清(FBS)の比率が、hESCからの胚体内胚葉分化の効率に影響を及ぼすことを示している。この影響は、培地においてアクチビンAの所定濃度で、より高いレベルのFBSが胚体内胚葉への最大限の分化を阻害するようなものである。外因性アクチビンAの非存在下では、胚体内胚葉系統へのhESCの分化は、非常に非効率であり、FBS濃度は、hESCの分化プロセスに対して相当穏やかに影響する。
固なSOX17遺伝子発現を示す培養条件は、胚体内胚葉を含有し、臓側内胚葉を含有しない可能性が高い。SOX7が、アクチビンAを施さない培養物において高度に発現され、SOX7はまた、FBSが10%で包含される場合に、アクチビンAの存在下でさえ増大された発現を示したことが図28Eに示されている。このパターンは、CXCR4発現パターンの逆であり、CXCR4が、臓側内胚葉ではあまり高度に発現されないことを示唆する。
もまた確定した。hESCは、高用量アクチビンA及び低FBS濃度(0.5%〜2.0%)の存在下で分化させた場合、SOX17+細胞は、培養物全体にわたって遍在的に分
布した。高用量アクチビンAを使用したが、FBSは10%(v/v)で包含された場合、SOX17+細胞は、相当低い頻度で出現し、培養物全体にわたって均一に分布される
のではなく、常に単離クラスターに出現した(図29A及び図29C、並びに図29B及び図29E)。外因性アクチビンAが使用されなかった場合に、SOX17+細胞のさら
なる減少が観察された。これらの条件下では、SOX17+細胞はまたクラスターに出現
し、これらのクラスターは、高アクチビンA低FBS処理で見出されるものよりも小さく、且つ相当稀であった(図29C及び図29F)。これらの結果は、CXCR4発現パターンが、各条件下で胚体内胚葉遺伝子発現に対応するだけでなく、胚体内胚葉細胞の数にも対応することを実証している。
胚体内胚葉に関して富化する分化条件は、CXCR4陽性細胞の比率を増大させる
アクチビンAの用量はまた、胚体内胚葉をhESCから得ることができる効率に影響を及ぼす。本実施例は、アクチビンAの用量を増大させることにより培養物におけるCXCR4+細胞の比率が増大することを実証する。
液50μl中に再懸濁させた。二次抗体(FITC結合ロバ抗マウス、Jackson ImmunoResearch、カタログ番号715−096−151)を最終濃度5μg/mlで添加して、30分間標識させた後、上述のように緩衝液中で2回洗浄を行った。細胞は、緩衝液中に5×106個の細胞/mlで再懸濁させて、フローサイトメトリーの中心的な施設(The Scripps Research Institute)にてスタッフによりFACS Vantage(Beckton Dickenson)を使用して分析及び選別した。細胞は、これに続くリアルタイム定量的PCRによる
遺伝子発現分析用の総RNAの単離のために、RLT溶解緩衝液(Qiagen)に直接回収した。
用量が分化培養培地中で増大されると、劇的に増加することが観察された(図30A〜図30C)。CXCR4+細胞は、R4ゲート内に納まるものであり、このゲートは、事象
の0.2%がR4ゲートに位置される二次抗体のみの対照を使用して設定された。CXC
R4+細胞数の劇的な増大は、アクチビンA用量が増大される場合に、胚体内胚葉遺伝子
発現における強固な増大と相関する(図31A〜図31D)。
CXCR4陽性細胞の単離は、胚体内胚葉遺伝子発現に関して富化し、また中胚葉、外胚葉及び臓側内胚葉のマーカーを発現する細胞を激減させる
上記実施例8で同定されるCXCR4+細胞及びCXCR4-細胞を回収して、相対遺伝子発現に関して分析し、母集団の遺伝子発現を同時に確定した。
関した(図30A〜図30C)。また、各集団からのCXCR4+細胞の単離は、この集
団中のほぼすべてのCXCR4遺伝子発現を占めたことも明らかである。これは、これらの細胞を回収するためのFACS方法の効率を実証している。
だけでなく、CXCR4+細胞はまた、胚体内胚葉の他のマーカーに関する遺伝子発現も
含有することが明らかとなった。図31A〜図31Dに示されるように、CXCR4+細
胞はさらに、SOX17、GSC、HNF3B及びMIXL1に関してA100母集団を上回って富化した。さらに、CXCR4-分画は、これらの胚体内胚葉マーカーに関して
非常に少ない遺伝子発現を含有した。さらに、CXCR4+及びCXCR4-集団は、中胚葉、外胚葉及び胚体外内胚葉のマーカーに関して逆パターンの遺伝子発現を示した。図33A〜図33Dは、CXCR4+細胞が、A100母集団に対してブラキュリ、MOX1
、ZIC1及びSOX7の遺伝子発現に関して激減したことを示す。このA100母集団は、低用量条件又はアクチビンA無しの条件に対して、これらのマーカーの発現がすでに低かった。これらの結果は、高アクチビンAの存在下で分化されるhESCからのCXCR4+細胞の単離は、胚体内胚葉に関して高度に富化され、且つ実質的に純粋な胚体内胚
葉である集団を生じることを示す。
CXCR4を使用した細胞集団中の胚体内胚葉細胞の定量
本明細書中ですでに確定されるような、及び2003年12月23日に出願された「胚体内胚葉(DEFINITIVE ENDODERM)」と題する米国仮特許出願第60/532,004号で確
定されるような細胞培養物又は細胞集団中に存在する胚体内胚葉細胞の比率の定量を確認するために、CXCR4及び胚体内胚葉の他のマーカーを発現する細胞をFACSにより分析した。
胚体内胚葉細胞のさらなるマーカー
以下の実験では、精製胚体内胚葉及びヒト胚性幹細胞集団からRNAを単離した。続いて、遺伝子発現は、各精製集団由来のRNAの遺伝子チップ分析により分析した。Q−PCRも実施して、胚体内胚葉に関するマーカーとして、胚体内胚葉では発現されるが、胚性幹細胞では発現されない遺伝子の潜在性をさらに研究した。
L−グルタミン、非必須アミノ酸及びペニシリン/ストレプトマイシンを補充したDMEM/F12培地中で維持された。hESCは、100ng/mlの組換えヒトアクチビンA、ウシ胎児血清(FBS)及びペニシリン/ストレプトマイシンを補充したRPMI培地中で5日間培養することにより胚体内胚葉へ分化させた。FBSの濃度は、各日以下の通りに変化させた:0.1%(1日目)、0.2%(2日目)、2%(3〜5日目)。
細胞選別器(FACS)により単離した。免疫精製は、hESCに関してはSSEA4抗原(R&D Systems、カタログ番号FAB1435P)を使用して、また胚体内胚葉に関し
てはCXCR4(R&D Systems、カタログ番号FAB170P)を使用して達成された。
細胞は、トリプシン/EDTA(Invitrogen、カタログ番号25300−054)を使用して解離させて、2%ヒト血清を含有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で洗浄して、氷上で10分間100%ヒト血清中に再懸濁させて、非特異的結合をブロックした。染色は、ヒト血清800μl中で5×106個の細胞にフィコエリトリン結合抗体200μ
lを添加することにより氷上で30分間実施した。細胞をPBS緩衝液8mlで2度洗浄して、同1ml中に再懸濁させた。FACS単離は、FACS Vantage(BD Biosciences)を使用して、The Scripps Research Instituteの中心的な施設により実施された
。細胞は、RLT溶解緩衝液に直接回収して、RNAは、製造業者の指示書に従ってRNeasy(Qiagen)により単離した。
わちhESCと胚体内胚葉との間で差次的に発現する遺伝子を同定する群の比較である。hESCに見出される発現レベルを上回る強固な上方変化を示す遺伝子は、胚体内胚葉の高度に特性化される新たな候補マーカーとして選択された。選択遺伝子は、上述のようにQ−PCRによりアッセイして、遺伝子チップ上に見られる遺伝子発現変化を確証し、また経時的なhESC分化のこれらの遺伝子の発現パターンを研究した。
レチノイン酸及びFGF−10は、胚体内胚葉培養物において特異的にPDX1を誘導する
以下の実験は、RA及びFGF−10が胚体内胚葉細胞においてPDX1の発現を誘導することを実証する。
び50ng/ml FGF−10を細胞培養物へ添加した。RA/FGF−10添加の4
8時間後に、PDX1マーカー遺伝子及び前腸内胚葉に特異的でない他のマーカー遺伝子の発現をQ−PCRにより定量した。
FGF−10は、RA単独を上回るPDX1発現のさらなる増大を提供する
本実施例は、RA及びFGF−10の組合せが、RA単独よりも大いにPDX1発現を誘導することを示す。
−10のいずれかと併用した1μM RA、或いはFGF−4及びFGF−10の両方と
併用した1μM RA。PDX1、SOX7及びNFMの発現は、RA又はRA/FGF
の96時間後に、Q−PCRにより定量された。
レチノイン酸用量は、in vitroで前方−後方(A−P)位置に影響を及ぼす
RAの用量がin vitro細胞培養物のA−P位置に影響を及ぼすかどうかを判定す
るために、以下の実験を実施した。
ー(HOXA13)を優先的に誘導した(図38Dを参照)。RA用量は、神経(SOX1)又はニューロン(NFM)マーカーのいずれかの相対発現に対して実質的に影響しなかった(図38F及び図38Gを参照)。本実施例は、in vitroでモルフォゲン
としての、特に分化hESCの内胚葉誘導体のモルフォゲンとしてのRAの使用を示す。
B27サプリメントの使用は、PDX1の発現を増強する
胚体内胚葉におけるPDX1発現は、多数の因子の使用及び細胞増殖/分化状態により影響を与え得る。以下の実験では、本発明者等はB27サプリメントの使用が胚体内胚葉細胞においてPDX1の発現を増強することを示す。
び50ng/ml FGF−10と共に50ng/mlのアクチビンA(無し、+FBS
、+B27)、並びに同様に2%血清代替物(SR)の2μM RA及び50ng/ml FGF−10と共に50ng/mlのアクチビンAのいずれかを施した。B27サプリメント(Gibco/BRL)は、2%FBS/DMEM/F12へ直接50倍希釈として添加した(
+B27)。二重反復細胞サンプルを各点に関して採取して、総RNAを単離して、上述のようにQ−PCRへ付した。
PDX1の誘導を増強するためのアクチビンBの使用
本実施例は、アクチビンBの使用が、in vitro細胞培養物においてPDX1陽性
細胞へのPDX1陰性細胞の分化を増強することを示す。
は、発達におけるこの時点で肝臓並びに膵臓に関するマーカーであるHNF6発現の増大を伴わなかった(図40Bを参照)。この結果は、膵臓へ分化している細胞の比率が肝臓に比べて増大していることを示唆する。
PDX1の誘導を増強するための血清用量の使用
胚体内胚葉細胞におけるPDX1の発現は、分化プロセス全体にわたって細胞培養物中に存在する血清の量により影響を受ける。以下の実験は、PDX1陰性胚体内胚葉へのhESCの分化中の培養物における血清のレベルが、PDX1陽性内胚葉へのこれらの細胞のさらなる分化中のPDX1の発現に影響することを示す。
PDX1の誘導を増強するための条件培地の使用
また、胚体内胚葉細胞におけるPDX1の発現に影響を与える他の因子及び成長条件を研究した。以下の実験は、PDX1陽性内胚葉細胞へのPDX1陰性胚体内胚葉細胞の分化に対する条件培地の影響を示す。
い3%FBS(NF)は、大部分が胚体外内胚葉細胞、外胚葉細胞及び中胚葉細胞で構成される不均一集団を生じる。アクチビンA処理培養物(A100)は、大部分の胚体内胚葉をもたらし、BMP4処理培養物(B100)は、主として栄養外胚葉及び幾らかの胚体外内胚葉をもたらす。
PDX1へ結合する抗体の確証
PDX1へ結合する抗体は、細胞集団中のPDX1発現の誘導をモニタリングするための有用なツールである。本実施例は、PDX1に対するウサギポリクローナル抗体及びIgY抗体を使用して、このタンパク質の存在を検出することができることを示す。
胞溶解産物は、SDS−PAGEにより分離して、エレクトロブロッティングにより膜へ転写して、その後IgY α−PDX1一次抗血清で、それに続いてアルカリホスファタ
ーゼ結合ウサギ抗IgY(Rb α−IgY)二次抗体でプロービングした。一次抗体及
び二次抗体の種々の希釈は、細長い膜(strips of the membrane)を分離するために以下の組合せで適用した:A(500倍一次希釈、10,000倍二次希釈)、B(2,000倍、10,000倍)、C(500倍、40,000倍)、D(2,000倍、40,000倍)、E(8,000倍、40,000倍)。
抗体の結合を免疫組織化学により試験した。このような実験用のPDX1発現細胞を産生するために、MS1−V細胞(ATCC#CRL−2460)をPDX1EGFPの発現ベクター(pEGFP−N1(Clontech)を用いて構築した)で一過的にトランスフェクトした。続いて、トランスフェクト細胞をRb α−PDX1及びα−EGFP抗血清で標
識した。トランスフェクト細胞は、Cy5結合二次抗体の使用によるEGFP蛍光並びにα−EGFP免疫組織化学の両方により可視化した。PDX1免疫蛍光は、α−Rb C
y3結合二次抗体の使用により可視化した。
ヒト膵臓組織の免疫組織化学
本実施例は、PDX1に対する特異性を有する抗体を使用して、免疫組織化学によりヒトPDX1陽性細胞を同定することができることを示す。
れたイヌ抗モルモット(D α−GP)二次抗体でインスリンに関して染色した。第2の
実験では、ヒト膵臓の同じパラフィン包埋切片を、4000倍希釈でのIgY α−PD
X1一次抗体で、これに続いて300倍希釈でのAF555へ結合されたRb α−Ig
Y二次抗体でPDX1に関して染色した。第1の実験及び第2の実験から回収した画像を併せた。第3の実験では、IgY α−PDX1抗体で染色した細胞をDAPIでも染色
した。
レチノイン酸処理細胞からのPDX1の免疫沈降
RAの存在下で分化させた胚体内胚葉細胞におけるPDX1発現、及びRAを用いて分化させなかった胚体内胚葉細胞におけるPDX1の欠如をさらに確認するために、ウサギ抗PDX1(Rb α−PDX1)抗体を使用して、RA分化させた胚体内胚葉細胞及び未
分化の胚体内胚葉細胞の両方からPDX1を免疫沈降させた。免疫沈降させたRAは、IgY α−PDX1抗体を使用してウェスタンブロット分析により検出した。
−PDX1及びウサギ特異的二次抗体を各溶解産物へ添加することにより免疫沈降させた。沈降物を遠心分離により回収した。免疫沈降物をSDS含有緩衝液中に溶解させた後、ポリアクリルアミドゲル上へ充填した。分離後、タンパク質をエレクトロブロッティングにより膜へ転写し、その後IgY α−PDX1一次抗体、これに続いて標識Rb α−IgY二次抗体でプロービングした。
PDX1プロモーター−EGFPトランスジェニックhESC系の生成
細胞単離に関してPDX1マーカーを使用するために、本発明者等は、PDX1陽性前腸内胚葉細胞を発現可能なレポーター遺伝子で遺伝的にタグ付けした。本実施例は、PDX1調節領域の制御下でレポーター遺伝子を含有するレポーターカセットを含むベクターの構築について記載する。本実施例はまた、このベクターでトランスフェクトした細胞(例えば、ヒト胚性幹細胞)、並びにそのゲノムに組み込まれたこのレポーターカセットを有する細胞の調製について記載する。
PDX1陽性前腸内胚葉の単離
以下の実施例は、PDX1プロモーター/EGFPカセットを含むhESCがPDX1陽性内胚葉細胞へ分化され、これに続いて蛍光活性化細胞選別器(FACS)により単離され得ることを実証する。
プルが、EGFPに関してゲーティングすることなく採取され(Live)、単一の生細胞は、EGFP陽性(GFP)及びGFP陰性(Neg)集団へゲーティングされた。一実験では、EGFP陽性分画は、蛍光強度に従って2つの同様のサイズの集団に分離された(Hi及びLo)。
DNAへ変換された。Q−PCRは、上述したように実施した。免疫組織化学分析に関して、細胞をPBS中に選別して、4%パラホルムアルデヒド中で10分間固定して、Cytospin遠心分離機を使用してスライドガラス上へ接着させた。サイトケラチン19(KRT19)に対する一次抗体はChemicon製であり、肝細胞核因子3β(HNF3β)に対する一次抗体はSanta Cruz製であり、グルコーストランスポーター2(GLUT2)に対する一次抗体はR&D systems製であった。FITC(緑色)又はローダミン(赤色)に結合させた適切な二次抗体を使用して、一次抗体の結合を検出した。
PDX1陽性背側前腸内胚葉及びPDX1陽性腹側前腸内胚葉の産生
本実施例は、PDX1陽性背側偏向前腸内胚葉の産生、並びにPDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉の産生を記載する。
)培地(Invitrogen, Carlsbad, CA)(Parker R.C.他, 1957. N.Y. Academy of Sciences 5: 303参照(この記載内容は参照により本明細書中で完全に援用される))中で、BMP4/FGF10添加を実行した。背側分化手法に関して、100ng/mlのアクチビンA中で5日間、胚体内胚葉を産生し、次に、B27サプリメントを含有するCMRL培地(1:200)中の2μMのレチノイン酸(RA)及び25ng/mlのアクチビンAに曝露した。
PDX1陽性腹側前腸内胚葉細胞の産生は胚体内胚葉形成によっている
本実施例は、種々の量の胚体内胚葉細胞を含む培養物からのPDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉の産生を記載する。胚体内胚葉を有しない培養物は、PDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉の極めて少ない産生を示す。胚体内胚葉細胞の初期量が増大するように、腹側偏向前腸内胚葉の産生も増大する。
内胚葉において最大であった。これらのデータは、腹側PDX1発現前腸内胚葉及び肝臓の産生が胚体内胚葉の効率的産生によっているということを強く示した。
BMP4はPDX1陽性腹側前腸内胚葉に必要でない
本実施例は、BMP4の非存在下でのPDX1陽性腹側偏向前腸内胚葉の産生を記載する。
〔実施例27〕
PDX1陽性背側前腸内胚葉及びPDX1陽性腹側前腸内胚葉の同定のためのマーカー
チドアレイを用いて、遺伝子発現プロファイルを確定した。手動検査による、並びに階層的クラスター分析によるこれら7つの条件/時点全体の遺伝子発現のパターンを評価した。腹側分化パラダイム及び背側分化パラダイムの両方で発現される新規の遺伝子を見出すためにPDX1発現(背側及び腹側)の一過性パターンを整合させる遺伝子発現のパターンを調べた。
腹側のPDX1分化の両方で発現される。表4中の遺伝子は、背側偏向され、そして背側PDX1パターンで選択的に発現される。
PDX1陰性前腸内胚葉の産生
本実施例は、PDX1陰性前腸内胚葉の産生を記載する。
50ng/ml)及びKAAD-シクロパミン(0.5μM)を含有する2%FBSを伴
う新鮮なRPMI中での2日分化から成る。
onstam, D. B. (2002). Extra-embryonic proteases regulate Nodal signalling during gastrulation. Nat Cell Biol 4, 981-985.
and maintenance of the primitive streak in the mouse. Development 120, 1919-1928.
Dev 6, 432-438.
s. Differentiation 37, 20-25.
necessary and sufficient for early endoderm formation in zebrafish. Genes Dev 15, 1493- 1505.
and Zic2 mutant mice: implications as models for human neurological disorders. Behav Genet 31, 317-324.
Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol 18, 399-404.
in brain and somites is affected by BMP and hedgehog signalling. Mech Dev 55, 147-159.
ion of pluripotent stem cells from cultured human primordial germ cells. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 13726-13731.
L., Kneteman, N. M., and Rajotte, R. V. (2000). Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes niellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med 343, 230-238.
diabetes? Insulin independence should be dominant force in islet transplantation. Bmj 322, 861.
M. (1997). Upstream and downstream from Brachyury, a gene required for vertebrate mesoderm formation. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 62, 337-346.
Berta, P. (2001). SOX7 transcription factor: sequence, chromosomal localisation, expression, transactivation and interference with Wnt signalling. Nucleic Acids Res 29, 4274- 4283.
Isolation and characterization of a mouse SRY-related cDNA, mSox7. Biochim Biophys Acta 1445, 225-231.
Bioessays 23, 788-794.
3, RESEARCH0034.
Of America SP, 2155-2159.
novel TGF-beta-like gene expressed in the mouse node during gastrulation. Nature 361, 543-547.
Claims (19)
- SOX17を発現し、CERを発現しないヒト膵臓−十二指腸ホメオボックス因子−1(PDX1)陰性内胚葉細胞を含むヒト細胞を含む、インビトロ細胞培養物。
- 前記PDX1陰性内胚葉細胞が、HB9を発現する、請求項1に記載の細胞培養物。
- 前記ヒト細胞の少なくとも10%が、SOX17を発現し、CERを発現しないPDX1陰性内胚葉細胞である、請求項2に記載の細胞培養物。
- 前記ヒト細胞の少なくとも25%が、SOX17を発現し、CERを発現しないPDX1陰性内胚葉細胞である、請求項3に記載の細胞培養物。
- 前記PDX1陰性内胚葉細胞が、SOX17を発現し、CERを発現しない、請求項2〜4のいずれか1項に記載の細胞培養物。
- FGFファミリー増殖因子をさらに含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の細胞培養物。
- FGFファミリー増殖因子がFGF7である、請求項6に記載の細胞培養物。
- 前記ヒト細胞が非組換え細胞である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の細胞培養物。
- 臓側内胚葉細胞、壁側内胚葉細胞および神経細胞からなる群より選択される細胞が含まれていない、請求項1〜8のいずれか1項に記載の細胞培養物。
- 前記PDX1陰性内胚葉細胞が、前腸に由来する細胞にさらに分化し得る多能性細胞である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の細胞培養物。
- 前記PDX1陰性内胚葉細胞が胚体内胚葉に由来する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の細胞培養物。
- 前記PDX1陰性内胚葉細胞がヒト多能性細胞に由来する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の細胞培養物。
- 前記ヒト多能性細胞は分化の前に胚様体を形成しない、請求項12に記載の細胞培養物。
- レチノイド、TGFβサブファミリーメンバー、またはヘッジホッグ阻害剤を含む培地をさらに含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載の細胞培養物。
- 前記TGFβスーパーファミリーメンバーが、ノーダル、アクチビンA、アクチビンBおよびBMP4からなる群より選択される、請求項14に記載の細胞培養物。
- 前記ヘッジホッグ阻害剤がKAAD−シクロパミンである、請求項14または15に記載の細胞培養物。
- 前記レチノイドがレチノイン酸である、請求項14〜16のいずれか1項に記載の細胞培養物。
- EGFおよびbFGFからなる群より選択される化合物を欠いている培地をさらに含む、請求項1〜17のいずれか1項に記載の細胞培養物。
- SOX17を発現し、CERを発現しないPDX1陰性内胚葉細胞を含むヒト細胞を含む細胞集団。
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JP5102030B2 (ja) * | 2004-08-13 | 2012-12-19 | ユニバーシティ・オブ・ジョージア・リサーチ・ファウンデイション・インコーポレイテッド | ヒト胚性幹細胞における自己再生および分化のための組成物および方法 |
US8017395B2 (en) | 2004-12-17 | 2011-09-13 | Lifescan, Inc. | Seeding cells on porous supports |
CA2613889A1 (en) | 2005-06-08 | 2006-12-14 | Centocor, Inc. | A cellular therapy for ocular degeneration |
DK1957636T3 (en) * | 2005-10-27 | 2018-10-01 | Viacyte Inc | PDX1-EXPRESSING DORSAL AND VENTRAL FORTARM ENDODERM |
SG10201405107YA (en) | 2006-02-23 | 2014-10-30 | Viacyte Inc | Compositions and methods useful for culturing differentiable cells |
EP1999253B1 (en) | 2006-03-02 | 2019-05-22 | Viacyte, Inc. | Endocrine precursor cells, pancreatic hormone-expressing cells and methods of production |
US7695965B2 (en) | 2006-03-02 | 2010-04-13 | Cythera, Inc. | Methods of producing pancreatic hormones |
US11254916B2 (en) | 2006-03-02 | 2022-02-22 | Viacyte, Inc. | Methods of making and using PDX1-positive pancreatic endoderm cells |
US8741643B2 (en) | 2006-04-28 | 2014-06-03 | Lifescan, Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage |
WO2008013664A2 (en) | 2006-07-26 | 2008-01-31 | Cythera, Inc. | Methods of producing pancreatic hormones |
US9080145B2 (en) | 2007-07-01 | 2015-07-14 | Lifescan Corporation | Single pluripotent stem cell culture |
MX2010000746A (es) * | 2007-07-18 | 2010-07-05 | Lifescan Inc | Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas. |
KR101617243B1 (ko) | 2007-07-31 | 2016-05-02 | 라이프스캔, 인코포레이티드 | 인간 배아 줄기 세포의 분화 |
WO2009027654A1 (en) * | 2007-08-24 | 2009-03-05 | University Court Of The University Of Edinburgh | Regionalised endoderm cells and uses thereof |
KR101592182B1 (ko) | 2007-11-27 | 2016-02-05 | 라이프스캔, 인코포레이티드 | 인간 배아 줄기 세포의 분화 |
KR101731474B1 (ko) | 2008-02-21 | 2017-05-11 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | 세포 부착, 배양 및 탈리를 위한 방법, 표면 개질 플레이트 및 조성물 |
US8338170B2 (en) | 2008-04-21 | 2012-12-25 | Viacyte, Inc. | Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells |
US8623648B2 (en) | 2008-04-24 | 2014-01-07 | Janssen Biotech, Inc. | Treatment of pluripotent cells |
US20090298178A1 (en) * | 2008-06-03 | 2009-12-03 | D Amour Kevin Allen | Growth factors for production of definitive endoderm |
PL2942392T3 (pl) | 2008-06-30 | 2019-02-28 | Janssen Biotech, Inc | Różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych |
US9234178B2 (en) | 2008-10-31 | 2016-01-12 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human pluripotent stem cells |
CN102333862B (zh) | 2008-10-31 | 2018-04-27 | 詹森生物科技公司 | 人胚胎干细胞向胰腺内分泌谱系的分化 |
JP5390624B2 (ja) | 2008-11-04 | 2014-01-15 | バイアサイト インク | 幹細胞集合体懸濁液組成物、その分化方法 |
US8008075B2 (en) | 2008-11-04 | 2011-08-30 | Viacyte, Inc. | Stem cell aggregate suspension compositions and methods of differentiation thereof |
US8895300B2 (en) | 2008-11-04 | 2014-11-25 | Viacyte, Inc. | Scalable primate pluripotent stem cell aggregate suspension culture and differentiation thereof |
EP2356227B1 (en) | 2008-11-14 | 2018-03-28 | Viacyte, Inc. | Encapsulation of pancreatic cells derived from human pluripotent stem cells |
JP5719305B2 (ja) | 2008-11-20 | 2015-05-13 | ヤンセン バイオテツク,インコーポレーテツド | 平面支持体上での細胞付着及び培養のための方法及び組成物 |
AU2009316580B2 (en) | 2008-11-20 | 2016-04-14 | Janssen Biotech, Inc. | Pluripotent stem cell culture on micro-carriers |
US9109245B2 (en) | 2009-04-22 | 2015-08-18 | Viacyte, Inc. | Cell compositions derived from dedifferentiated reprogrammed cells |
ES2849181T3 (es) * | 2009-04-22 | 2021-08-16 | Viacyte Inc | Composiciones celulares derivadas de células reprogramadas desdiferenciadas |
JP2012527880A (ja) * | 2009-05-29 | 2012-11-12 | ノヴォ ノルディスク アー/エス | hPS細胞由来の胚体内胚葉からの特定の内胚葉の派生 |
RU2540016C2 (ru) * | 2009-07-20 | 2015-01-27 | Янссен Байотек, Инк. | Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека |
MX340952B (es) * | 2009-07-20 | 2016-07-29 | Janssen Biotech Inc | Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas. |
WO2011011300A2 (en) * | 2009-07-20 | 2011-01-27 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
US9150833B2 (en) | 2009-12-23 | 2015-10-06 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
SG181685A1 (en) | 2009-12-23 | 2012-07-30 | Centocor Ortho Biotech Inc | Differentiation of human embryonic stem cells |
RU2607380C2 (ru) | 2010-03-01 | 2017-01-10 | Янссен Байотек, Инк. | Способы очистки клеток, производных от плюрипотентных стволовых клеток |
US9719068B2 (en) | 2010-05-06 | 2017-08-01 | Children's Hospital Medical Center | Methods and systems for converting precursor cells into intestinal tissues through directed differentiation |
WO2011143299A2 (en) | 2010-05-12 | 2011-11-17 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
MX348537B (es) | 2010-08-31 | 2017-06-07 | Janssen Biotech Inc | Diferencia de celulas madre pluripotentes. |
EP3211070A1 (en) | 2010-08-31 | 2017-08-30 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
US9506036B2 (en) | 2010-08-31 | 2016-11-29 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
US9433557B2 (en) | 2011-02-21 | 2016-09-06 | Viacyte, Inc. | Loading system for an encapsulation device |
RU2705001C2 (ru) | 2011-12-22 | 2019-11-01 | Янссен Байотек, Инк. | Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека в одногормональные инсулинположительные клетки |
CN104160018A (zh) | 2012-03-07 | 2014-11-19 | 詹森生物科技公司 | 用于扩增和维持多能干细胞的成分确定的培养基 |
CN104428410B (zh) | 2012-05-25 | 2016-08-31 | 学校法人埼玉医科大学 | 胰激素产生细胞的制造方法及胰激素产生细胞、以及分化诱导促进剂 |
ES2690118T3 (es) | 2012-06-08 | 2018-11-19 | Janssen Biotech, Inc. | Diferenciación de células madre embrionarias humanas en células endocrinas pancreáticas |
AU2013248265B2 (en) | 2012-11-08 | 2018-11-01 | Viacyte, Inc. | Scalable primate pluripotent stem cell aggregate suspension culture and differentiation thereof |
BR112015015770A2 (pt) | 2012-12-31 | 2017-07-11 | Janssen Biotech Inc | cultivo de células-tronco embrionárias humanas na interface ar-líquido para diferenciação em células pancreáticas endócrinas |
KR101942769B1 (ko) | 2012-12-31 | 2019-01-28 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | Hb9 조절제를 사용하는 인간 배아 줄기세포의 췌장 내분비 세포로의 분화 |
US10370644B2 (en) | 2012-12-31 | 2019-08-06 | Janssen Biotech, Inc. | Method for making human pluripotent suspension cultures and cells derived therefrom |
CA2896750A1 (en) | 2012-12-31 | 2014-07-03 | Janssen Biotech, Inc. | Suspension and clustering of human pluripotent cells for differentiation into pancreatic endocrine cells |
US8859286B2 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-14 | Viacyte, Inc. | In vitro differentiation of pluripotent stem cells to pancreatic endoderm cells (PEC) and endocrine cells |
CN105358680B (zh) * | 2013-04-03 | 2019-06-25 | 富士费勒姆细胞动力学有限公司 | 用于悬浮培养内胚层祖细胞的方法和组合物 |
JP6352908B2 (ja) | 2013-05-24 | 2018-07-04 | 学校法人 埼玉医科大学 | 新規ペプチド及びその用途 |
CN106414718A (zh) | 2013-06-11 | 2017-02-15 | 哈佛学院校长同事会 | SC-β细胞以及用于产生其的组合物和方法 |
EP2896688A1 (en) * | 2014-01-20 | 2015-07-22 | Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) | A method of producing beta pancreatic cells from progenitor cells through the use of hydrogen peroxide |
US11051900B2 (en) | 2014-04-16 | 2021-07-06 | Viacyte, Inc. | Tools and instruments for use with implantable encapsulation devices |
WO2015175307A1 (en) | 2014-05-16 | 2015-11-19 | Janssen Biotech, Inc. | Use of small molecules to enhance mafa expression in pancreatic endocrine cells |
CN113249297A (zh) | 2014-05-28 | 2021-08-13 | 儿童医院医疗中心 | 用于经由定向分化将前体细胞转化为胃组织的方法和系统 |
CN107075471A (zh) * | 2014-10-08 | 2017-08-18 | 新加坡科技研究局 | 将干细胞分化为肝细胞谱系的方法 |
EP3207123A1 (en) | 2014-10-17 | 2017-08-23 | Children's Hospital Center D/b/a Cincinnati Children's Hospital Medical Center | In vivo model of human small intestine using pluripotent stem cells and methods of making and using same |
CN107614678B (zh) | 2014-12-18 | 2021-04-30 | 哈佛学院校长同事会 | 干细胞来源的β细胞的产生方法及其使用方法 |
US10443042B2 (en) | 2014-12-18 | 2019-10-15 | President And Fellows Of Harvard College | Serum-free in vitro directed differentiation protocol for generating stem cell-derived beta cells and uses thereof |
WO2016100909A1 (en) | 2014-12-18 | 2016-06-23 | President And Fellows Of Harvard College | METHODS FOR GENERATING STEM CELL-DERIVED β CELLS AND USES THEREOF |
EP3234109A4 (en) * | 2014-12-19 | 2018-06-27 | Janssen Biotech, Inc. | Suspension culturing of pluripotent stem cells |
MA45479A (fr) | 2016-04-14 | 2019-02-20 | Janssen Biotech Inc | Différenciation de cellules souches pluripotentes en cellules de l'endoderme de l'intestin moyen |
US11066650B2 (en) | 2016-05-05 | 2021-07-20 | Children's Hospital Medical Center | Methods for the in vitro manufacture of gastric fundus tissue and compositions related to same |
US11767515B2 (en) | 2016-12-05 | 2023-09-26 | Children's Hospital Medical Center | Colonic organoids and methods of making and using same |
KR102448428B1 (ko) | 2017-01-27 | 2022-09-30 | 가부시키가이샤 가네카 | 내배엽계 세포 집단, 및 다능성 세포로부터 3배엽 중 어느 하나의 세포 집단을 제조하는 방법 |
IL308120B1 (en) | 2017-06-14 | 2024-08-01 | Vertex Pharma | Devices and methods for drug administration |
US10391156B2 (en) | 2017-07-12 | 2019-08-27 | Viacyte, Inc. | University donor cells and related methods |
CA3081762A1 (en) | 2017-11-15 | 2019-05-23 | Semma Therapeutics, Inc. | Islet cell manufacturing compositions and methods of use |
AU2019320072A1 (en) | 2018-08-10 | 2021-02-25 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Stem cell derived islet differentiation |
US10724052B2 (en) | 2018-09-07 | 2020-07-28 | Crispr Therapeutics Ag | Universal donor cells |
CA3139294A1 (en) * | 2019-05-22 | 2020-11-26 | The Cleveland Clinic Foundation | Generating dorsal foregut, and anterior domain, endoderm cells |
CN114173837A (zh) | 2019-05-31 | 2022-03-11 | W.L.戈尔及同仁股份有限公司 | 生物相容性膜复合材料 |
EP3976236A1 (en) | 2019-05-31 | 2022-04-06 | W.L. Gore & Associates Inc. | A biocompatible membrane composite |
JP7328362B2 (ja) | 2019-05-31 | 2023-08-16 | ダブリュ.エル.ゴア アンド アソシエイツ,インコーポレイティド | 制御された酸素拡散距離を伴う細胞カプセル化デバイス |
CN114206407A (zh) | 2019-05-31 | 2022-03-18 | W.L.戈尔及同仁股份有限公司 | 生物相容性膜复合材料 |
US11118196B2 (en) | 2019-09-05 | 2021-09-14 | Crispr Therapeutics Ag | Universal donor cells |
KR20220058579A (ko) | 2019-09-05 | 2022-05-09 | 크리스퍼 테라퓨틱스 아게 | 보편적 공여자 세포 |
US11850303B2 (en) | 2020-10-27 | 2023-12-26 | Uqora, Inc. | Gel and a suppository and methods to provide the gel and suppository |
US11566230B2 (en) | 2020-12-31 | 2023-01-31 | Crispr Therapeutics Ag | Universal donor cells |
WO2024151541A1 (en) | 2023-01-09 | 2024-07-18 | Sana Biotechnology, Inc. | Type-1 diabetes autoimmune mouse |
Family Cites Families (80)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US2161804A (en) | 1935-11-09 | 1939-06-13 | Baldwin Southwark Corp | Hydraulic press |
US4873702A (en) | 1988-10-20 | 1989-10-10 | Chiu Ran Fun | Method and apparatus for DC restoration in digital receivers |
US6165993A (en) | 1992-03-23 | 2000-12-26 | University Of Massachusetts Medical Center | DNA vaccines against rotavirus infections |
US5690926A (en) | 1992-10-08 | 1997-11-25 | Vanderbilt University | Pluripotential embryonic cells and methods of making same |
US5453357A (en) * | 1992-10-08 | 1995-09-26 | Vanderbilt University | Pluripotential embryonic stem cells and methods of making same |
US7153684B1 (en) * | 1992-10-08 | 2006-12-26 | Vanderbilt University | Pluripotential embryonic stem cells and methods of making same |
US5593972A (en) | 1993-01-26 | 1997-01-14 | The Wistar Institute | Genetic immunization |
US6015671A (en) * | 1995-06-07 | 2000-01-18 | Indiana University Foundation | Myocardial grafts and cellular compositions |
US5874301A (en) * | 1994-11-21 | 1999-02-23 | National Jewish Center For Immunology And Respiratory Medicine | Embryonic cell populations and methods to isolate such populations |
US5843780A (en) | 1995-01-20 | 1998-12-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Primate embryonic stem cells |
US5748681A (en) | 1995-10-27 | 1998-05-05 | Lucent Technologies Inc | Offset correction for a homodyne radio |
CA2247502A1 (en) | 1996-02-28 | 1997-09-04 | Vanderbilt University | Compositions and methods of making embryonic stem cells |
US5877207A (en) * | 1996-03-11 | 1999-03-02 | Allergan Sales, Inc. | Synthesis and use of retinoid compounds having negative hormone and/or antagonist activities |
US5964261A (en) * | 1996-05-29 | 1999-10-12 | Baxter International Inc. | Implantation assembly |
AU5734998A (en) | 1997-01-10 | 1998-08-03 | Life Technologies, Inc. | Embryonic stem cell serum replacement |
US5798644A (en) | 1997-02-20 | 1998-08-25 | At&T Corp | Method and apparatus for locating buried conveyances using locating & confirmation signals with an array of sensors |
US5793230A (en) | 1997-02-26 | 1998-08-11 | Sandia Corporation | Sensor readout detector circuit |
US6331406B1 (en) * | 1997-03-31 | 2001-12-18 | The John Hopkins University School Of Medicine | Human enbryonic germ cell and methods of use |
US6090622A (en) | 1997-03-31 | 2000-07-18 | The Johns Hopkins School Of Medicine | Human embryonic pluripotent germ cells |
US6261281B1 (en) * | 1997-04-03 | 2001-07-17 | Electrofect As | Method for genetic immunization and introduction of molecules into skeletal muscle and immune cells |
CA2302316A1 (en) | 1997-09-15 | 1999-03-25 | Genetic Immunity, Llc. | Method of delivering genes to antigen presenting cells of the skin |
US6800480B1 (en) | 1997-10-23 | 2004-10-05 | Geron Corporation | Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells in feeder-free culture |
US20030008919A1 (en) * | 1999-06-03 | 2003-01-09 | Jean-Baptiste Roullet | Use of retinoids to treat high blood pressure and other cardiovascular disease |
US6921811B2 (en) * | 1998-09-22 | 2005-07-26 | Biosurface Engineering Technologies, Inc. | Bioactive coating composition and methods |
US6667176B1 (en) * | 2000-01-11 | 2003-12-23 | Geron Corporation | cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells |
DE19852800C1 (de) | 1998-11-16 | 2000-04-13 | Univ Albert Ludwigs Freiburg | Verfahren zur Herstellung von Antikörpern gegen ein Polypeptid, von dem die kodierende Nukleinsäure bekannt ist |
IL144654A0 (en) | 1999-02-10 | 2002-05-23 | Curis Inc | Pancreatic progenitor cells, methods and uses related thereto |
US6872389B1 (en) * | 1999-07-08 | 2005-03-29 | Rhode Island Hospital | Liver stem cell |
US7005252B1 (en) | 2000-03-09 | 2006-02-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Serum free cultivation of primate embryonic stem cells |
US6458589B1 (en) * | 2000-04-27 | 2002-10-01 | Geron Corporation | Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells |
US7256042B2 (en) * | 2000-04-27 | 2007-08-14 | Geron Corporation | Process for making hepatocytes from pluripotent stem cells |
US7045353B2 (en) | 2000-08-01 | 2006-05-16 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Directed differentiation of human embryonic cells |
AU2002226075A1 (en) | 2000-10-23 | 2002-05-06 | University Of Kansas | Cadherin peptides for drug delivery and inhibition of tumor metastasis/invasion |
JP2005503759A (ja) | 2001-01-24 | 2005-02-10 | アメリカ合衆国 | 幹細胞の膵臓内分泌細胞への分化方法 |
US20050079159A1 (en) * | 2001-06-13 | 2005-04-14 | Massachusetts Instiute Of Technology | In vivo bioreactors |
EP1298201A1 (en) | 2001-09-27 | 2003-04-02 | Cardion AG | Process for the production of cells exhibiting an islet-beta-cell-like state |
WO2003033697A1 (en) * | 2001-10-18 | 2003-04-24 | Ixion Biotechnology, Inc. | Conversion of liver stem and progenitor cells to pancreatic functional cells |
WO2003046141A2 (en) | 2001-11-26 | 2003-06-05 | Advanced Cell Technology, Inc. | Methods for making and using reprogrammed human somatic cell nuclei and autologous and isogenic human stem cells |
US7157278B2 (en) * | 2001-12-04 | 2007-01-02 | Organogenesis, Inc. | Cultured cells from pancreatic islets |
GB2415432B (en) * | 2001-12-07 | 2006-09-06 | Geron Corp | Islet cells from human embryonic stem cells |
US20030138949A1 (en) * | 2001-12-12 | 2003-07-24 | Anil Bhushan | Methods for the regeneration of pancreatic islets and expansion of pancreatic endocrine cells |
EP2361966A1 (en) * | 2002-05-17 | 2011-08-31 | Mount Sinai School of Medicine of New York University | Mesoderm and definitive endoderm cell populations |
US20060003446A1 (en) * | 2002-05-17 | 2006-01-05 | Gordon Keller | Mesoderm and definitive endoderm cell populations |
CN1668324A (zh) | 2002-05-28 | 2005-09-14 | 诺沃塞尔公司 | 用于胰岛素产生细胞的方法、组合物及生长与分化因子 |
CA2487094A1 (en) * | 2002-05-28 | 2003-12-11 | Becton, Dickinson And Company | Methods for in vitro expansion and transdifferentiation of human pancreatic acinar cells into insulin-producing cells |
EP1567639A4 (en) * | 2002-12-05 | 2005-12-21 | Technion Res & Dev Foundation | CULTURE OF HUMAN PANCREATIC ISLANDS AND USES THEREOF |
FR2849043B1 (fr) * | 2002-12-24 | 2005-07-08 | Gemac | Procede de fabrication d'un vecteur de molecules actives applicable dans le domaine de la diffusion de principes actifs et vecteur obtenu |
EP1594954A4 (en) * | 2003-02-07 | 2010-01-27 | Wisconsin Alumni Res Found | GENETIC MODIFICATIONS DIRECTED FROM HUMAN STEM CELLS |
WO2005045001A2 (en) | 2003-02-14 | 2005-05-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Insulin-producing cells derived from stem cells |
US20030224411A1 (en) * | 2003-03-13 | 2003-12-04 | Stanton Lawrence W. | Genes that are up- or down-regulated during differentiation of human embryonic stem cells |
US20040229350A1 (en) * | 2003-05-12 | 2004-11-18 | Nikolai Strelchenko | Morula derived embryonic stem cells |
US20060281136A1 (en) | 2003-05-20 | 2006-12-14 | Shinichi Nishikawa | Preparation of endodermal stem cells |
WO2005017131A2 (en) | 2003-08-14 | 2005-02-24 | THE GOUVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by THE SECRETARY OF THE DEPARTMENT F HEALTH AND HUMAN SERVICES | Methods for the differentiation of human stem cells |
US20050170502A1 (en) | 2003-09-30 | 2005-08-04 | Regents Of The University Of California | Methods for maintaining hepatocytes in culture and for differentiating embryonic stem cells along a hepatocyte lineage |
US7985585B2 (en) * | 2004-07-09 | 2011-07-26 | Viacyte, Inc. | Preprimitive streak and mesendoderm cells |
WO2007059007A2 (en) * | 2005-11-14 | 2007-05-24 | Cythera, Inc. | Markers of definitive endoderm |
US20050266554A1 (en) * | 2004-04-27 | 2005-12-01 | D Amour Kevin A | PDX1 expressing endoderm |
US7541185B2 (en) * | 2003-12-23 | 2009-06-02 | Cythera, Inc. | Methods for identifying factors for differentiating definitive endoderm |
US7510876B2 (en) * | 2003-12-23 | 2009-03-31 | Cythera, Inc. | Definitive endoderm |
US7625753B2 (en) * | 2003-12-23 | 2009-12-01 | Cythera, Inc. | Expansion of definitive endoderm cells |
CA2581424A1 (en) * | 2004-03-09 | 2005-09-22 | Gang Xu | Methods for generating insulin-producing cells |
WO2005097980A2 (en) | 2004-03-26 | 2005-10-20 | Geron Corporation | New protocols for making hepatocytes from embryonic stem cells |
JP4491014B2 (ja) * | 2004-04-01 | 2010-06-30 | ウイスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション | 幹細胞の内胚葉および膵臓系統への分化 |
CN103103158B (zh) * | 2004-04-27 | 2016-08-03 | 韦尔赛特公司 | 细胞培养基 |
CA2966883A1 (en) * | 2004-07-09 | 2006-02-16 | Cythera, Inc. | Methods for identifying factors for differentiating definitive endoderm |
JP5433879B2 (ja) | 2004-07-09 | 2014-03-05 | ヴィアサイト,インコーポレイテッド | 前原始線条及び中内胚葉細胞 |
JP5102030B2 (ja) * | 2004-08-13 | 2012-12-19 | ユニバーシティ・オブ・ジョージア・リサーチ・ファウンデイション・インコーポレイテッド | ヒト胚性幹細胞における自己再生および分化のための組成物および方法 |
CA2580798A1 (en) | 2004-09-29 | 2006-04-06 | Cellartis Ab | Methods for the generation of hepatocyte-like cells from human blastocyst-derived stem (hbs) |
AU2006210955A1 (en) | 2005-01-31 | 2006-08-10 | Es Cell International Pte Ltd. | Directed differentiation of embryonic stem cells and uses thereof |
CN100425694C (zh) | 2005-04-15 | 2008-10-15 | 北京大学 | 诱导胚胎干细胞向胰腺细胞分化的方法 |
WO2007002210A2 (en) | 2005-06-20 | 2007-01-04 | Bresagen, Inc. | Embryonic stem cell culture compositions and methods of use thereof |
US7732202B2 (en) * | 2005-10-21 | 2010-06-08 | International Stem Cell Corporation | Oxygen tension for the parthenogenic activation of human oocytes for the production of human embryonic stem cells |
DK1957636T3 (en) * | 2005-10-27 | 2018-10-01 | Viacyte Inc | PDX1-EXPRESSING DORSAL AND VENTRAL FORTARM ENDODERM |
GB0602063D0 (en) | 2006-02-02 | 2006-03-15 | Univ Manchester | Cell Culture |
US7695965B2 (en) * | 2006-03-02 | 2010-04-13 | Cythera, Inc. | Methods of producing pancreatic hormones |
EP1999253B1 (en) | 2006-03-02 | 2019-05-22 | Viacyte, Inc. | Endocrine precursor cells, pancreatic hormone-expressing cells and methods of production |
WO2008013664A2 (en) * | 2006-07-26 | 2008-01-31 | Cythera, Inc. | Methods of producing pancreatic hormones |
WO2008058233A2 (en) * | 2006-11-08 | 2008-05-15 | Maastricht University | In vivo bioreactors and methods of making and using same |
US7695963B2 (en) * | 2007-09-24 | 2010-04-13 | Cythera, Inc. | Methods for increasing definitive endoderm production |
US11586805B2 (en) | 2021-07-26 | 2023-02-21 | Atlassian Pty Ltd. | Machine-learning-based natural language processing techniques for low-latency document summarization |
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