KR102448428B1 - 내배엽계 세포 집단, 및 다능성 세포로부터 3배엽 중 어느 하나의 세포 집단을 제조하는 방법 - Google Patents

내배엽계 세포 집단, 및 다능성 세포로부터 3배엽 중 어느 하나의 세포 집단을 제조하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 과제는, 세포 치료 제제로서 최적인 체세포를 얻기 위한 내배엽계 세포 집단을 제공하는 것이다. 본 발명의 내배엽계 세포 집단은, 세포 집단에 있어서의 미분화 세포의 함유율이 저감되어 있으며, 또한 세포 치료 제제로서 최적인 체세포로 분화 가능한 내배엽계 세포를 포함하는 세포 집단이다. 또한, 본 발명의 내배엽계 세포 집단에서 유래되는 체세포는, 세포 치료 제제로서 우수한 치료 효과를 갖는다.

Description

내배엽계 세포 집단, 및 다능성 세포로부터 3배엽 중 어느 하나의 세포 집단을 제조하는 방법
본 발명은 내배엽계 세포 집단에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 다능성 줄기 세포를 배양하고, 분화 유도함으로써 3배엽 중 어느 하나의 세포 집단을 제조하는 방법에 관한 것이다.
재생 의료는, 도너 부족을 과제로 하는 장기 이식의 대체법이나 불치병의 새로운 치료법 개발 등에 있어서 큰 기대가 모아지고 있다. 배성 줄기 세포(ES 세포)나 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포)는, 다능성 및 무한 증식성을 갖고 있기 때문에, 재생 의료에 필요로 하는 세포를 조제하기 위한 세포 소스로서 기대되고 있다. 이들 다능성 줄기 세포를 사용한 재생 의료의 실용화 시에는, 다능성 줄기 세포를 효율적으로 목적 세포로 분화 유도시키는 기술의 확립이 필요하며, 다양한 분화 유도 방법에 대하여 보고되어 있다.
예를 들어, 다능성 줄기 세포를 3배엽 중 어느 것으로 분화 유도시키는 배양 방법으로서, 비특허문헌 1에는, 마트리겔로 코팅한 디쉬 상에서 인간 ES 세포 및 인간 iPS 세포를 접착 배양하면서, 3배엽(내배엽계 세포, 외배엽계 세포 또는 중배엽계 세포)으로 분화 유도하는 것이 기재되어 있다. 또한, 분화 유도 전에 메티오닌 불함유 배지에서 10시간 배양함으로써 세포 주기를 정지시키고, 그 후에 3배엽(내배엽계 세포, 외배엽계 세포 또는 중배엽계 세포)으로의 분화를 유도함으로써 분화 유도 효율을 향상시킬 수 있는 것도 나타나 있다.
다능성 줄기 세포를 내배엽계 세포로 분화 유도시키기 위한 배지에 대해서도 몇 가지 지견이 보고되어 있다.
예를 들어, 특허문헌 1에는, TGFβ 수퍼패밀리의 성장 인자를 다능성 세포 배양물에 공급함으로써 배체(胚體) 내배엽으로의 분화를 행하고, 이어서 SOX17 양성 배체 내배엽 세포의 세포 배양물 또는 세포 집단에서 TGFβ 수퍼패밀리 성장 인자 시그널 전달을 저감, 제거(eliminating) 또는 없앰(removing)으로써, 배체 내배엽 세포를 PDX1 음성 전장 내배엽 세포로 분화되도록 하는 것이 기재되어 있다(단락 0144 내지 0150).
또한, 특허문헌 2에는, 다능성 세포를 조혈 전구 세포 또는 내피 세포로 분화되도록 하는 방법으로서, 이하의 순차적 공정: (a) 적어도 하나의 성장 인자를 포함하는 제1 특정 배지 중에서 복수의 실질적으로 미분화 다능성 세포를 배양 또는 유지하는 공정, (b) BMP4, VEGF, IL-3, Flt3 리간드 및 GMCSF를 본질적으로 포함하지 않는 제2 특정 배지 중에서 세포를 인큐베이팅하는 공정, (c) 복수의 세포를 증식하거나 분화를 촉진하기에 충분한 양의 BMP4 및 VEGF를 포함하는 제3 특정 배지 중에서 세포를 배양하는 공정, 및 (d) 복수의 세포를 증식하거나 분화를 촉진하기에 충분한 양의 (1) IL-3 및 Flt3 리간드, 또는 (2) VEGF, FGF-2 또는 FGF-2 모방물 및 IGF 중 어느 것을 포함하는 제4 특정 배지 중에서 세포를 배양하는 공정을 포함하고, 복수의 다능성 세포가 조혈 전구 세포 또는 내피 세포로 분화되는 방법이 기재되어 있다(단락 0009).
일본 특허 공표 제2016-506736호 공보 일본 특허 공개 제2015-192681호 공보
Shiraki N et al., Methionine metabolism regulates maintenance and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Metab. 2014 May 6; 19(5): 780-94.
전술한 바와 같이, 다능성 줄기 세포로부터 3배엽(내배엽계 세포, 외배엽계 세포 또는 중배엽계 세포)을 거쳐, 체세포 중 어느 하나로 분화 유도하기 위한 배양 방법은 보고되어 있지만, 세포 치료 제제로서의 치료 효과의 향상과 미분화 세포를 저감시키는 관점에서, 보다 분화 유도의 효율을 향상시키고, 세포의 품질을 높일 필요가 있다.
따라서, 본 발명은, 세포 치료 제제로서 최적인 체세포를 얻기 위한 내배엽계 세포 집단을 제공하는 것을 해결해야 할 과제로 하였다. 또한, 본 발명은, 다능성 줄기 세포를 배양하는 것을 포함하는 3배엽 중 어느 하나의 세포 집단을 제조하는 방법으로서, 세포 집단에 있어서의 미분화 세포의 함유율을 저감시키고, 또한 세포 치료 제제로서 최적인 체세포로 분화 가능한 세포 집단이 얻어지는 제조 방법을 제공하는 것을 해결해야 할 과제로 하였다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토한 결과, 다능성 줄기 세포를 분화 유도하기 전에, 특정한 화합물을 첨가 또는 미첨가로 부유 배양하고, 또한 분화 유도에 있어서는, 분화 유도에 작용하는 인자를 첨가, 저감, 제거 또는 없앰으로써 내배엽계 세포로의 분화 유도의 효율을 대폭 향상시킬 수 있는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은, 얻어진 내배엽계 세포 집단으로부터 분화 유도한 체세포가, 높은 치료 효과를 발휘할 수 있다는 점에 있어서, 종래의 내배엽계 세포 집단과 비교하여 우수한 내배엽계 세포 집단인 것을 발견하였다. 본 발명은 이들 지견에 기초하여 완성된 것이다.
즉, 본 명세서에 의하면, 이하의 발명이 제공된다.
(1) OAZ1 유전자의 발현량에 대한 Nanog 유전자의 상대 발현량이 0.8 이하이고, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 HNF1B 유전자의 상대 발현량이 1.0 이상이고, SOX17의 양성을 나타내는 세포의 비율이 80％ 이상인 내배엽계 세포 집단.
(2) 추가로, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 HNF4A 유전자의 상대 발현량이 0.5 이상인, (1)에 기재된 내배엽계 세포 집단.
(3) 추가로, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 EpCAM 유전자의 상대 발현량이 0.6 이상인, (1) 또는 (2)에 기재된 내배엽계 세포 집단.
(4) 추가로, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 VIM 유전자의 상대 발현량이 12 이하인, (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 내배엽계 세포 집단.
(5) 추가로, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 SOX2 유전자의 상대 발현량이 0.11 이하인, (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 내배엽계 세포 집단.
(6) 추가로, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 c-Myc 유전자의 상대 발현량이 0.1 이하인, (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 내배엽계 세포 집단.
(7) 추가로, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 피브로넥틴(Fibronectin)-1 유전자의 상대 발현량이 1.0 이상인, (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 내배엽 세포 집단.
(8) 추가로, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 시클린(Cyclin) D1 유전자의 상대 발현량이 0.015 이하인, (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 내배엽 세포 집단.
(9) 추가로, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 매트릭스 메탈로펩티다제(Matrix metallopeptidase) 2 유전자의 상대 발현량이 0.020 이하인, (1) 내지 (8) 중 어느 하나에 기재된 내배엽 세포 집단.
(10) 다능성 줄기 세포로부터 내배엽계 세포를 제조하는 방법으로서, 이하에 나타내는 (a) 내지 (b):
(a) 다능성 줄기 세포를 2-머캅토에탄올을 포함하는 배지를 사용하여 부유 배양하고, 세포 집단을 조제하는 공정,
(b) 상기 세포 집단을, TGFβ 수퍼패밀리 시그널 활성화제를 포함하는 배지에서 배양한 후, FGF2 및 BMP4를 첨가하지 않은 배지에서 배양하는 공정
을 포함하는 제조 방법.
(11) 2-머캅토에탄올을 포함하는 배지가, 액티빈 A를 첨가하지 않은 배지인, (10)에 기재된 제조 방법.
(12) 2-머캅토에탄올을 포함하는 배지가, WNT 시그널 활성화제를 첨가하지 않은 배지인, (10) 또는 (11)에 기재된 제조 방법.
(13) 2-머캅토에탄올을 포함하는 배지가, FGF2를 첨가하지 않은 배지인, (10) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
(14) 2-머캅토에탄올을 포함하는 배지가, TGFβ1을 첨가하지 않은 배지인, (10) 내지 (13) 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
(15) 2-머캅토에탄올을 포함하는 배지가, 추가로 인슐린을 포함하는 배지인, (10) 내지 (14) 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
(16) FGF2 및 BMP4를 첨가하지 않은 배지가, 인슐린, 트란스페린, 아셀렌산나트륨 및 에탄올아민으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류 이상을 포함하는 배지인, (10) 내지 (15) 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
(17) TGFβ 수퍼패밀리 시그널 활성화제를 포함하는 배지, 및/또는 FGF2 및 BMP4를 첨가하지 않은 배지가, 추가로 2-머캅토에탄올을 포함하는 배지인, (10) 내지 (16) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(18) TGFβ 수퍼패밀리 시그널 활성화제를 포함하는 배지, 및/또는 FGF2 및 BMP4를 첨가하지 않은 배지가, 글루코오스를 1.0g/L 이하의 농도로 함유하는 배지인, (10) 내지 (17) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(19) 다능성 줄기 세포로부터 3배엽 중 어느 하나의 세포 집단을 제조하는 방법으로서, 이하에 나타내는 (a) 내지 (b):
(a) 다능성 줄기 세포를 2-머캅토에탄올을 포함하는 배지를 사용하여 부유 배양하고, 세포 집단을 조제하는 공정,
(b) 상기 세포 집단을, 내배엽계 세포, 중배엽계 세포 또는 외배엽계 세포 중 어느 하나로 분화 유도할 수 있는 조건 하에서 배양하는 공정
을 포함하는 제조 방법.
(20) 2-머캅토에탄올을 포함하는 배지가, FGF2를 첨가하지 않은 배지인, (19)에 기재된 제조 방법.
(21) 2-머캅토에탄올을 포함하는 배지가, TGFβ1을 첨가하지 않은 배지인, (19) 또는 (20)에 기재된 제조 방법.
본 발명의 내배엽계 세포 집단은, 세포 집단에 있어서의 미분화 세포의 함유율이 저감되어 있으며, 또한 세포 치료 제제로서 최적인 체세포로 분화 가능한 내배엽계 세포를 포함하는 세포 집단이다. 또한, 본 발명의 내배엽계 세포 집단에서 유래되는 체세포는, 세포 치료 제제로서 우수한 치료 효과를 갖는다. 또한, 본 발명의 제조 방법은, 세포 집단에 있어서의 미분화 세포의 함유율을 저감시키고, 또한 세포 치료 제제로서 최적인 체세포로 분화 가능한 세포 집단이 얻어지는 점에서, 고품질의 세포 치료 제제를 제공할 수 있다.
도 1은, 다능성 줄기 세포의 접착 배양과 부유 배양에 있어서의 미분화 마커 및 원시 장관 세포(PGT) 마커의 발현을 해석한 결과를 나타낸다.
도 2는, 다능성 줄기 세포의 접착 배양과 부유 배양에 있어서의 SOX17의 발현을 해석한 결과를 나타낸다.
도 3은, 다능성 줄기 세포의 접착 배양과 부유 배양에 있어서의 EpCAM 및 VIM의 발현을 해석한 결과를 나타낸다.
도 4는, 당뇨병 모델 마우스로의 세포 이식 실험에 있어서의 혈 중 c-펩티드(c-peptide) 농도의 측정 결과를 나타낸다.
도 5는, 당뇨병 모델 마우스로의 세포 이식 실험에 있어서의 수시 혈당값의 측정 결과를 나타낸다.
도 6은, 인간 iPS 세포로부터 내배엽계 세포로의 분화 유도에 있어서의 OCT4, SOX17 및 FOXA2의 발현 레벨의 측정 결과를 나타낸다.
도 7은, 인간 iPS 세포로부터 내배엽계 세포로의 분화 유도에 있어서의 SOX2 및 SXO17의 양성 세포의 비율을 측정한 결과를 나타낸다.
도 8은, 인간 iPS 세포로부터 내배엽계 세포로의 분화 유도에 있어서의 Day5에 있어서의 세포 밀도를 나타낸다.
도 9는, 인간 iPS 세포로부터 내배엽계 세포로의 분화 유도에 있어서의 SOX17 및 FOXA2의 양성 세포의 비율을 측정한 결과를 나타낸다.
도 10은, 다능성 줄기 세포의 접착 배양과 부유 배양에 있어서의 피브로넥틴-1(FN1)의 발현을 해석한 결과를 나타낸다.
도 11은, 다능성 줄기 세포의 접착 배양과 부유 배양에 있어서의 시클린 D1의 발현을 해석한 결과를 나타낸다.
도 12는, 다능성 줄기 세포의 접착 배양과 부유 배양에 있어서의 CD44의 발현을 해석한 결과를 나타낸다.
도 13은, 다능성 줄기 세포의 접착 배양과 부유 배양에 있어서의 매트릭스 메탈로펩티다제 2(MMP2)의 발현을 해석한 결과를 나타낸다.
도 14는, 다능성 줄기 세포의 접착 배양과 부유 배양에 있어서의 인슐린 수용체 기질(insulin receptor substrate) 1(IRS1)의 발현을 해석한 결과를 나타낸다.
도 15는, 다능성 줄기 세포를 상이한 글루코오스 농도에서 분화 유도한 경우에 있어서의 세포 밀도를 나타낸다.
도 16은, 다능성 줄기 세포를 상이한 글루코오스 농도에서 분화 유도한 경우에 있어서의 SOX2 및 Nanog의 발현을 해석한 결과를 나타낸다.
도 17은 다능성 줄기 세포를 상이한 글루코오스 농도에서 분화 유도한 경우에 있어서의 SOX2의 발현을 해석한 결과를 나타낸다.
도 18은, 다능성 줄기 세포를 상이한 글루코오스 농도에서 분화 유도한 경우에 있어서의 SOX17의 발현을 해석한 결과를 나타낸다.
도 19는, 다능성 줄기 세포를 상이한 글루코오스 농도에서 분화 유도한 경우에 있어서의 SOX2 및 SOX17의 양성률을 측정한 결과를 나타낸다.
도 20은, 다능성 줄기 세포를 상이한 글루코오스 농도에서 분화 유도한 경우에 있어서의 SOX2 및 SOX17의 양성률을 측정한 결과를 나타낸다.
도 21은, 다능성 줄기 세포를 상이한 글루코오스 농도에서 분화 유도한 경우에 있어서의 SOX2 및 SOX17의 발현을 해석한 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명의 실시 형태에 대하여 구체적으로 설명하지만, 하기 설명은 본 발명의 이해를 용이하게 하기 위한 것이고, 본 발명의 범위는 하기 실시 형태에 한정되는 것은 아니며, 당업자가 하기 실시 형태의 구성을 적절히 치환한 다른 실시 형태도 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 배지에 대하여, 「첨가하지 않은」이라는 용어는, 배양물 또는 순화 배지에 있어서 첨가하지 않는다고 특정된 단백질, 펩티드 및 화합물 등의 인자를 외인적으로 첨가하지 않는 것을 가리킨다. 또한, 배양물 또는 순화 배지에 있어서 첨가하지 않는다고 특정된 단백질, 펩티드 및 화합물 등의 인자가 배양의 연속적인 조작에 의해 들어오게 되는 경우에는, 1％ 미만(체적/체적), 0.5％(체적/체적) 미만, 0.1％(체적/체적) 미만, 0.05％(체적/체적) 미만, 0.01％(체적/체적) 미만, 0.001％(체적/체적) 미만이 되도록 조정한다.
본 발명의 세포 집단에 대하여, 「저감되어 있다」는 용어는, 세포 집단에 있어서 포함되지 않는다고 특정된 세포형(세포 표면 마커의 양성이나 음성의 비율이어도 됨)이, 세포 집단의 총 수에 있어서, 30％ 미만, 20％ 미만, 10％ 미만, 9％ 미만, 8％ 미만, 7％ 미만, 6％ 미만, 5％ 미만, 4％ 미만, 3％ 미만, 2％ 미만, 1％ 미만, 0.9％ 미만, 0.8％ 미만, 0.7％ 미만, 0.6％ 미만, 0.5％ 미만, 0.4％ 미만, 0.3％ 미만, 0.2％ 미만, 0.1％ 미만의 양으로 존재하는 것을 의미한다.
본 발명의 유전자 발현량에 관하여, 「향상되고 있다」는 용어는, 비교 대상이 되는 세포 집단에 있어서의 특정한 유전자 발현량보다도 유전자의 발현이 증가하고 있는 것을 가리키고, 비교 대상이 되는 세포 집단에 대하여, 1.1배 이상, 1.2배 이상, 1.3배 이상, 1.4배 이상, 1.5배 이상, 1.6배 이상, 1.7배 이상, 1.8배 이상, 1.9배 이상, 2.0배 이상, 2.1배 이상, 2.2배 이상, 2.3배 이상, 2.4배 이상, 2.5배 이상, 2.6배 이상, 2.7배 이상, 2.8배 이상, 2.9배 이상, 3.0배 이상, 3.1배 이상, 3.2배 이상, 3.3배 이상, 3.4배 이상, 3.5배 이상, 3.6배 이상, 3.7배 이상, 3.8배 이상, 3.9배 이상, 4.0배 이상, 4.1배 이상, 4.2배 이상, 4.3배 이상, 4.4배 이상, 4.5배 이상, 4.6배 이상, 4.7배 이상, 4.8배 이상, 4.9배 이상, 5.0배 이상, 5.1배 이상, 5.2배 이상, 5.3배 이상, 5.4배 이상, 5.5배 이상, 5.6배 이상, 5.7배 이상, 5.8배 이상, 5.9배 이상, 6.0배 이상, 6.1배 이상, 6.2배 이상, 6.3배 이상, 6.4배 이상, 6.5배 이상, 6.6배 이상, 6.7배 이상, 6.8배 이상, 6.9배 이상, 7.0배 이상, 7.1배 이상, 7.2배 이상, 7.3배 이상, 7.4배 이상, 7.5배 이상, 7.6배 이상, 7.7배 이상, 7.8배 이상, 7.9배 이상, 8.0배 이상, 8.1배 이상, 8.2배 이상, 8.3배 이상, 8.4배 이상, 8.5배 이상, 8.6배 이상, 8.7배 이상, 8.8배 이상, 8.9배 이상, 9.0배 이상, 9.1배 이상, 9.2배 이상, 9.3배 이상, 9.4배 이상, 9.5배 이상, 9.6배 이상, 9.7배 이상, 9.8배 이상, 9.9배 이상, 10.0배 이상이다.
본 발명의 유전자 발현량에 관하여, 「감소되고 있다」는 용어는, 비교 대상이 되는 세포 집단에 있어서의 특정한 유전자 발현량보다도 유전자의 발현이 감소되고 있는 것을 가리키고, 비교 대상이 되는 세포 집단에 대하여, 1.1배 이하, 1.2배 이하, 1.3배 이하, 1.4배 이하, 1.5배 이하, 1.6배 이하, 1.7배 이하, 1.8배 이하, 1.9배 이하, 2.0배 이하, 2.1배 이하, 2.2배 이하, 2.3배 이하, 2.4배 이하, 2.5배 이하, 2.6배 이하, 2.7배 이하, 2.8배 이하, 2.9배 이하, 3.0배 이하, 3.1배 이하, 3.2배 이하, 3.3배 이하, 3.4배 이하, 3.5배 이하, 3.6배 이하, 3.7배 이하, 3.8배 이하, 3.9배 이하, 4.0배 이하, 4.1배 이하, 4.2배 이하, 4.3배 이하, 4.4배 이하, 4.5배 이하, 4.6배 이하, 4.7배 이하, 4.8배 이하, 4.9배 이하, 5.0배 이하, 5.1배 이하, 5.2배 이하, 5.3배 이하, 5.4배 이하, 5.5배 이하, 5.6배 이하, 5.7배 이하, 5.8배 이하, 5.9배 이하, 6.0배 이하, 6.1배 이하, 6.2배 이하, 6.3배 이하, 6.4배 이하, 6.5배 이하, 6.6배 이하, 6.7배 이하, 6.8배 이하, 6.9배 이하, 7.0배 이하, 7.1배 이하, 7.2배 이하, 7.3배 이하, 7.4배 이하, 7.5배 이하, 7.6배 이하, 7.7배 이하, 7.8배 이하, 7.9배 이하, 8.0배 이하, 8.1배 이하, 8.2배 이하, 8.3배 이하, 8.4배 이하, 8.5배 이하, 8.6배 이하, 8.7배 이하, 8.8배 이하, 8.9배 이하, 9.0배 이하, 9.1배 이하, 9.2배 이하, 9.3배 이하, 9.4배 이하, 9.5배 이하, 9.6배 이하, 9.7배 이하, 9.8배 이하, 9.9배 이하, 10.0배 이하, 20배 이하, 30배 이하, 40배 이하, 50배 이하, 60배 이하, 70배 이하, 80배 이하, 90배 이하, 100배 이하, 250배 이하, 500배 이하, 750배 이하, 1000배 이하, 5000배 이하, 10000배 이하이다.
본 발명의 응집체에 대하여, 「응집 덩어리」 또는 「클러스터」라는 용어로 바꾸어 사용할 수 있고, 단세포로 해리되지 않은 한 무리의 세포를 일반적으로 가리킨다.
[1] 다능성 줄기 세포
본 발명의 제조 방법에 있어서는, 다능성 줄기 세포를 배양함으로써 3배엽(내배엽계 세포, 중배엽계 세포 또는 외배엽계 세포)의 세포 집단을 제조한다.
다능성 줄기 세포란, 생체를 구성하는 모든 종류의 세포로 분화될 수 있는 다분화능(다능성)을 갖는 세포이며, 적절한 조건 하의 인비트로(in vitro)에서의 배양에 있어서 다능성을 유지한 채 무한히 증식을 계속할 수 있는 세포를 말한다. 구체적으로는 배성 줄기 세포(ES 세포), 태아의 시원 생식 세포 유래의 다능성 줄기 세포(EG 세포: Proc Natl Acad Sci U S A. 1998, 95: 13726-31), 정소 유래의 다능성 줄기 세포(GS 세포: Nature. 2008, 456: 344-9), 인공 다능성 줄기 세포(induced pluripotent stem cells; iPS 세포), 체성 줄기 세포(조직 줄기 세포) 등을 들 수 있다. 다능성 줄기 세포는, 바람직하게는 iPS 세포 또는 ES 세포이며, 보다 바람직하게는 iPS 세포이다. 또한, 「배(embryonic)」란, 배우자 융합에 의해 도출된 배에 더하여, 체세포 핵 이식에 의해 도출된 배도 가리킨다.
ES 세포로서는, 임의의 온혈 동물, 바람직하게는 포유 동물에서 유래되는 세포를 사용할 수 있다. 포유 동물로서는, 예를 들어 마우스, 래트, 모르모트, 햄스터, 토끼, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 말, 염소, 원숭이 또는 인간을 들 수 있다. 바람직하게는 인간에서 유래하는 세포를 사용할 수 있다.
ES 세포의 구체예로서는, 착상 이전의 초기배를 배양함으로써 수립한 포유 동물 등의 ES 세포, 체세포의 핵을 핵 이식함으로써 제작된 초기배를 배양함으로써 수립한 ES 세포, 및 이들 ES 세포의 염색체 상의 유전자를 유전자 공학의 방법을 사용하여 개변한 ES 세포를 들 수 있다. 각 ES 세포는 당 분야에서 통상 실시되고 있는 방법이나, 공지 문헌을 따라서 조제할 수 있다. 마우스의 ES 세포는, 1981년에 에반스 등(Evans et al., 1981, Nature 292: 154-6)이나, 마틴 등(Martin GR. et al., 1981, Proc Natl Acad Sci 78: 7634-8)에 의해 수립되어 있다. 인간의 ES 세포는 1998년에 톰슨 등(Thomson et al., Science, 1998, 282: 1145-7)에 의해 수립되어 있으며, WiCell 연구 시설(WiCell Research Institute, 웹사이트: http://www.wicell.org/, 메디슨, 위스콘신주, 미국), 미국 국립 위생 연구소(National Institute of Health), 교토 대학 등으로부터 입수 가능하고, 예를 들어 Cellartis사(웹사이트: http://www.cellartis.com/, 스웨덴)로부터 구입 가능하다.
인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포)는, 체세포를 초기화함으로써 얻어지는 다능성을 갖는 세포이다. iPS 세포의 제작은, 교토 대학의 야마나카 신야 교수 등의 그룹, 메사추세츠 공과 대학의 루돌프·야닛슈(Rudolf Jaenisch) 등의 그룹, 위스콘신 대학의 제임스·톰슨(James Thomson) 등의 그룹, 하버드 대학의 콘라드·홋케들링거(Konrad Hochedlinger) 등의 그룹 등을 포함하는 복수의 그룹이 성공하였다. 예를 들어, 국제 공개 WO2007/069666호 공보에는, Oct 패밀리 유전자, Klf 패밀리 유전자 및 Myc 패밀리 유전자의 유전자 산물을 포함하는 체세포의 핵 초기화 인자, 그리고 Oct 패밀리 유전자, Klf 패밀리 유전자, Sox 패밀리 유전자 및 Myc 패밀리 유전자의 유전자 산물을 포함하는 체세포의 핵 초기화 인자가 기재되어 있으며, 또한 체세포에 상기 핵 초기화 인자를 접촉시키는 공정을 포함하는, 체세포의 핵 초기화에 의해 유도 다능성 줄기 세포를 제조하는 방법이 기재되어 있다.
iPS 세포의 제조에 사용하는 체세포의 종류는 특별히 한정되지 않고, 임의의 체세포를 사용할 수 있다. 즉, 체세포란, 생체를 구성하는 세포의 내생식 세포 이외의 모든 세포를 포함하고, 분화된 체세포여도 되고, 미분화 줄기 세포여도 된다. 체세포의 유래는 포유 동물, 조류, 어류, 파충류, 양서류 중 어느 것이어도 되고, 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 포유 동물(예를 들어, 마우스 등의 설치류, 또는 인간 등의 영장류)이며, 특히 바람직하게는 마우스 또는 인간이다. 또한, 인간의 체세포를 사용하는 경우, 태아, 신생아 또는 성인 중 어느 체세포를 사용해도 된다. 체세포의 구체예로서는, 예를 들어 섬유아세포(예를 들어, 피부 섬유아세포), 상피 세포(예를 들어, 위 상피 세포, 간 상피 세포, 폐포 상피 세포), 내피 세포(예를 들어 혈관, 임파관), 신경 세포(예를 들어, 뉴런, 신경교세포), 췌장 세포, 백혈구 세포(B 세포, T 세포 등), 골수 세포, 근육 세포(예를 들어, 골격근 세포, 평활근 세포, 심근 세포), 간실질 세포, 비간실질 세포, 지방 세포, 골아 세포, 치주 조직을 구성하는 세포(예를 들어, 치근막 세포, 시멘트아세포, 잇몸 섬유아세포, 골아 세포), 신장·눈·귀를 구성하는 세포 등을 들 수 있다.
iPS 세포는, 소정의 배양 조건 하(예를 들어, ES 세포를 배양하는 조건 하)에 있어서 장기에 걸쳐 자기 복제능을 가지고, 또한 소정의 분화 유도 조건 하에서외배엽계 세포, 중배엽계 세포 또는 내배엽계 세포 중 어느 것으로도 다분화능을 갖는 줄기 세포이다. 또한, iPS 세포는 마우스 등의 시험 동물에 이식한 경우에 테라토마를 형성하는 능력을 갖는 줄기 세포여도 된다.
체세포로부터 iPS 세포를 제조하기 위해서는, 먼저, 적어도 1종류 이상의 초기화 유전자를 체세포에 도입한다. 초기화 유전자란, 체세포를 초기화하여 iPS 세포로 하는 작용을 갖는 초기화 인자를 코딩하는 유전자이다. 초기화 유전자의 조합의 구체예로서는, 이하의 조합을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
(i) Oct 유전자, Klf 유전자, Sox 유전자, Myc 유전자
(ii) Oct 유전자, Sox 유전자, NANOG 유전자, LIN28 유전자
(iii) Oct 유전자, Klf 유전자, Sox 유전자, Myc 유전자, hTERT 유전자, SV40 largeT 유전자
(iv) Oct 유전자, Klf 유전자, Sox 유전자
상기 이 외에도, 도입 유전자를 더 저감시킨 방법(Nature. 2008 Jul 31; 454(7204): 646-50), 저분자 화합물을 이용한 방법(Cell Stem Cell. 2009 Jan 9; 4(1): 16-9, Cell Stem Cell. 2009 Nov 6; 5(5): 491-503), 유전자 대신에 전사 인자 단백질을 이용한 방법(Cell Stem Cell. 2009 May 8; 4(5): 381-4) 등이 보고되어 있으며, 어느 방법으로 제조된 iPS 세포여도 된다.
[2] 3배엽
본 발명의 방법에 의하면, 다능성 줄기 세포로부터 내배엽계 세포, 외배엽계 세포, 중배엽계 세포 등의 3배엽 중 어느 하나의 세포 집단이 제조된다.
3배엽으로서는, 내배엽계 세포, 중배엽계 세포 및 외배엽계 세포를 들 수 있다.
내배엽계 세포는 소화관, 폐, 갑상선, 췌장, 간장 등의 기관의 조직, 소화관으로 개구되는 분비선의 세포, 복막, 흉막, 후두, 이관, 기관, 기관지, 요로(방광, 요도의 대부분, 요관의 일부) 등으로 분화되는 능력을 가지고, 일반적으로 배체 내배엽(DE)이라고 칭해지는 것이 있다. 다능성 줄기 세포로부터 내배엽계 세포로의 분화는, 내배엽계 세포에 특이적인 유전자의 발현량을 측정함으로써 확인할 수 있다. 내배엽계 세포에 특이적인 유전자로서는, 예를 들어 SOX17, FOXA2, CXCR4, AFP, GATA4, EOMES 등을 들 수 있다. 또한, 본 명세서 중에 있어서, 내배엽계 세포를 배체 내배엽으로 바꾸어 말하여 사용하는 경우가 있다.
중배엽계 세포는 체강 및 그것을 보강하는 중피, 근육, 골격, 피부 진피, 결합 조직, 심장, 혈관(혈관 내피도 포함함), 혈액(혈액 세포도 포함함), 임파관, 비장, 신장, 요관, 생식선(정소, 자궁, 생식선 상피) 등으로 분화된다. 중배엽계 세포에 특이적인 유전자로서는, 예를 들어 MESP1, MESP2, FOXF1, BRACHYURY, HAND1, EVX1, IRX3, CDX2, TBX6, MIXL1, ISL1, SNAI2, FOXC1 및 PDGFRα 등을 들 수 있다.
외배엽계 세포는, 피부의 표피나 남성의 요도 말단부의 상피, 모발, 손톱, 피부선(유선, 한선을 포함함), 감각 기관(구강, 인두, 코, 직장의 말단부의 상피를 포함하는, 타액선) 수정체 등을 형성한다. 외배엽계 세포의 일부는 발생 과정에서 홈상으로 함입되어 신경관을 형성하고, 뇌나 척수 등의 중추 신경계의 뉴런이나 멜라노사이트 등의 바탕이 되기도 한다. 또한 말초 신경계도 형성한다. 외배엽계 세포에 특이적인 유전자로서는, 예를 들어 FGF5, OTX2, SOX1, PAX6 등을 들 수 있다.
본 발명의 방법으로 제조되는 3배엽 세포 집단은, 내배엽계 세포 집단, 중배엽계 세포 집단 또는 외배엽계 세포 집단 중 어느 것이어도 되지만, 특히 바람직하게는 내배엽계 세포 집단이다.
본 발명의 방법에 의하면, 다능성 줄기 세포로부터 분화 유도된 내배엽계 세포 집단을 사용하여, 예를 들어 췌장, 간장, 위, 장 등의 소화기계의 치료에 사용할 수 있는 체세포를 얻을 수 있다. 이하에, 각 소화기계 치료에 있어서의 실시 형태의 하나를 예시하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
장계에서는, 크리프트 세포 등의 장의 전구 세포를 얻은 경우에는, 이것을 카테터 등으로 이식함으로써, 궤양성 대장염, 크론병, 단장증 등의 치료에 이용할 수 있다.
췌장계에서는, 췌장 β 세포(인슐린 산생 세포로 바꾸어 말하는 경우가 있음)를 얻은 경우에는, 이것을 카테터 등으로 또는 면역 격리 디바이스 등에 봉입하여 이식함으로써, 당뇨병 치료에 이용할 수 있다.
간장계에서는, 예를 들어 알부민 산생 세포를 얻은 경우에는, 이것을 카테터 등으로 또는 면역 차단 디바이스에 봉입하여 이식함으로써, 대량 출혈을 수반하는 외상 치료 등에 이용할 수 있다.
또한, 췌장, 간장, 위, 장 등의 소화기계에 있어서의 치료용 조직을, 고분자 지지 담체 등을 이용하여 배양함으로써 얻을 수도 있다. 예를 들어, 간장 조직을 유도하여 얻은 경우에는, 간암, 간경변, 급성 간부전이나, 헤모크로마토시스 등의 간 대사 장애의 치료에 이용할 수 있다. 폐 세포 조직을 얻은 경우, 이것을 환부에 이식함으로써 낭포성 섬유증이나 천식 등의 폐호흡기 질환 치료에 이용할 수 있다. 신장계에서는, 메산기움 세포나 요세관 상피 세포, 사구체 세포 등 포함하는 조직을 얻은 경우, 이것을 직접 이식함으로써, 신부전이나 신장염의 치료나 투석 치료 등에 이용할 수 있다. 간장계의, 신진 대사가 가능한 세포를 얻음으로써, 알부민 산생 세포, 혈액 응고 인자 산생 세포, α1 안티트립신 등의 대사 효소 산생 세포를 제작하고, 산생한 대사 효소를 직접 주사를 놓거나 점적 투여함으로써, 이들 단백질의 결핍증의 치료에 사용할 수 있다. 예를 들어, 췌장 β 세포 등의 신진 대사가 가능한 췌장계 세포를 얻음으로써, 그 췌장 β 세포가 산생한 인슐린을 직접 주사를 놓음으로써, I형 당뇨병 치료에 사용할 수도 있다.
또한, 본 발명의 방법으로 얻어지는 3배엽 중 어느 하나의 세포 집단 및 거기에서 얻어지는 체세포는, 피검 물질의 약효/독성 평가나 작용 메커니즘의 해명, 또는 생물 현상 메커니즘의 해석에 사용하는 것도 가능하다.
[3] 다능성 줄기 세포의 유지 배양
본 발명의 방법에 따라서 다능성 줄기 세포의 분화 유도를 행하기 전의 다능성 줄기 세포는, 미분화 유지 배지를 사용하여 미분화성을 유지한 것으로 하는 것이 바람직하다. 미분화 유지 배지를 사용하여 다능성 줄기 세포의 미분화성을 유지하는 배양을, 다능성 줄기 세포의 유지 배양이라고도 한다.
미분화 유지 배지는, 다능성 줄기 세포의 미분화성을 유지할 수 있는 배지라면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 마우스 배성 줄기 세포 및 마우스 인공 다능성 줄기 세포의 미분화성을 유지하는 성질을 갖고 있는 것이 알려져 있는 백혈병 억제 인자(leukemia inhibitory factor)를 포함하는 배지나, 인간 iPS의 미분화성을 유지하는 성질을 갖고 있는 것이 알려져 있는 염기성 FGF(섬유아세포 성장 인자(Fibroblast growth factor))를 포함하는 배지 등을 들 수 있다. 예를 들어, 인간 iPS 세포 배지(20％ 녹아웃 혈청 대체물(Knockout serum replacement)(KSR; Gibco사), 1×비필수 아미노산(non-essential amino acids)(NEAA; Wako사), 55μmol/L 2-머캅토에탄올(2-ME; Gibco사), 7.5ng/mL 재조합 인간 섬유아세포 성장 인자(recombinant human fibroblast growth factor) 2(FGF2; Peprotech사), 0.5×페니실린/스트렙토마이신(Penicillin and Streptomycin)(PS; Wako사)을 포함하는 DMEM/Ham's F12(Wako사), 또는 Essential 8 배지(서모 피셔 사이언티픽사), STEMPRO(등록 상표) hESC SFM(라이프 테크놀로지스 재팬 가부시키가이샤), mTeSR1(Veritas사), TeSR2(Veritas사), StemFit(등록 상표) 등을 사용할 수 있지만, 특별히 한정되지 않는다.
다능성 줄기 세포의 유지 배양은, 적합한 피더 세포(예를 들어, SL10 피더 세포, SNL 피더 세포 등) 상에 있어서 상기 미분화 유지 배지를 사용하여 행할 수 있다. 또한, 비트로넥틴, 피브로넥틴, 라미닌, 콜라겐 또는 마트리겔 등의 세포 접착 단백질이나 세포외 매트릭스를 코팅한 세포 배양용 디쉬 상에 있어서도 상기한 미분화 유지 배지를 사용하여 행할 수 있다.
배양 온도는, 사용하는 다능성 줄기 세포의 배양에 적합한 배양 온도라면, 특별히 한정되지 않지만, 일반적으로는 30℃ 내지 40℃이며, 바람직하게는 약 37℃이다.
CO2 인큐베이터 등을 이용하여, 약 1 내지 10％, 바람직하게는 5％의 CO2 농도 분위기 하에서 배양을 행하는 것이 바람직하다.
다능성 줄기 세포의 유지 배양은 계대하면서 원하는 기간 행할 수 있고, 예를 들어 유지 배양 후의 계대수 1 내지 100, 바람직하게는 계대수 10 내지 50, 보다 바람직하게는 계대수 25 내지 40의 다능성 줄기 세포를 사용하여, 응집체의 형성이나 분화 유도를 행하는 것이 바람직하다.
[4] 다능성 줄기 세포의 부유 배양에 의한 응집체의 형성
다능성 줄기 세포의 응집체를 형성하기 위한 실시 형태의 하나로서는, 미분화하여 유지 배양하고 있는 세포를 CTK Solution(Dissociation Solution for human ES/iPS Cells: 리프로셀사) 등에 의해 피더 세포로부터 박리하고, 3 내지 4회 인간 iPS 세포 배지에서 린스를 행하여 피더 세포를 제거할 수 있다. 이어서, 피펫팅에 의해 작은 세포 덩어리 또는 싱글셀로 깨뜨리고, 그들 세포를 배지 중에 현탁한 후에, 현탁액 중의 다능성 줄기 세포가 응집체를 형성할 때까지의 기간에 걸쳐 교반 또는 선회시키면서 부유 배양한다.
부유 배양은, 배지의 점성 등이나 요철을 갖는 마이크로웰 등을 사용한 정치 배양이어도 되고, 스피너 등을 이용하여 액체 배지가 유동하는 조건에서의 배양이어도 되지만, 바람직하게는 액체 배지가 유동하는 조건에서의 배양이다. 액체 배지가 유동하는 조건에서의 배양으로서는, 세포의 응집을 촉진하도록 액체 배지가 유동하는 조건에서의 배양이 바람직하다. 세포의 응집을 촉진하도록 액체 배지가 유동하는 조건에서의 배양으로서는, 예를 들어 선회류, 요동류 등의 흐름에 의한 응력(원심력, 구심력)에 의해 세포가 한 점에 모이도록 액체 배지가 유동하는 조건에서의 배양이나, 직선적인 왕복 운동에 의해 액체 배지가 유동하는 조건에서의 배양을 들 수 있고, 선회류 및/또는 요동류를 이용한 배양이 특히 바람직하다.
부유 배양에 사용하는 배양 용기는, 바람직하게는 용기 내면에 대한 세포의 접착성이 낮은 용기가 바람직하다. 이러한 용기 내면에 대한 세포의 접착성이 낮은 용기로서는, 예를 들어 생체 적합성이 있는 물질로 친수성 표면 처리되어 있는 플레이트를 들 수 있다. 예를 들어, NunclonTMSphera(서모 피셔 사이언티픽 가부시키가이샤)를 사용할 수 있지만 특별히 한정은 되지 않는다. 또한, 배양 용기의 형상은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 디쉬상, 플라스크상, 웰상, 백(bag)상, 스피너 플라스크상 등의 형상의 배양 용기를 들 수 있다.
응집체를 형성시키는 기간으로서는, 6시간을 초과하는 기간이면 특별히 한정되지 않지만, 구체적으로는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 또는 2주일, 3주일, 4주일, 5주일, 6주일, 7주일, 8주일의 기간에 있어서 응집체를 형성시키는 것이 바람직하다.
부유 배양 배지로서는, 다능성 줄기 세포를 증식 가능한 성분이 포함되는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 1 내지 100μM의 Y-27632(Cayman사)를 포함하는 mTeSR1(Veritas사) 배지, 또는 1 내지 100μM의 Y-27632(Cayman사), 1 내지 100mg/mL BSA를 포함하는 Essential 8TM 등을 사용할 수 있다.
부유 배양에 있어서의 교반 또는 선회의 조건으로서는, 현탁액 중에 있어서 다능성 줄기 세포가 응집체를 형성할 수 있는 범위라면 특별히 한정되지 않지만, 상한은, 바람직하게는 200rpm, 보다 바람직하게는 150rpm, 더욱 바람직하게는 120rpm, 보다 바람직하게는 115rpm, 보다 바람직하게는 110rpm, 보다 바람직하게는 105rpm, 더 바람직하게는 100rpm, 보다 바람직하게는 95rpm, 특히 바람직하게는 90rpm으로 할 수 있다. 하한은 바람직하게는 1rpm, 보다 바람직하게는 10rpm, 더욱 바람직하게는 50rpm, 보다 바람직하게는 60rpm, 보다 바람직하게는 70rpm, 더욱 바람직하게는 80rpm, 가장 바람직하게는 90rpm으로 할 수 있다. 선회 배양 시의 선회폭은 특별히 한정되지 않지만, 하한은 예를 들어 1mm, 바람직하게는 10mm, 보다 바람직하게는 20mm, 가장 바람직하게는 25mm로 할 수 있다. 선회폭의 상한은 예를 들어 200mm, 바람직하게는 100mm, 바람직하게는 50mm, 보다 바람직하게는 30mm, 가장 바람직하게는 25mm로 할 수 있다. 선회 배양 시의 회전 반경도 또한 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 선회폭이 상기한 범위로 되도록 설정된다. 회전 반경의 하한은 예를 들어 5mm, 바람직하게는 10mm이며, 상한은 예를 들어 100mm, 바람직하게는 50mm로 할 수 있다. 선회 배양의 조건을 이 범위로 함으로써, 적절한 치수의 세포 응집체를 제조하는 것이 용이해지기 때문에 바람직하다.
또한, 부유 배양은, 요동(로킹) 교반에 의해 액체 배지를 유동시키면서 행하는 요동 배양이어도 된다. 요동 배양은, 액체 배지와 세포를 수용한 배양 용기를 대략 수평면에 수직인 평면 내에서 요동시킴으로써 행한다. 요동 속도는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 1분간에 2 내지 50회, 바람직하게는 4 내지 25회(1 왕복을 1회로 함) 요동시킬 수 있다. 요동 각도는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 0.1° 내지 20°, 보다 바람직하게는 2° 내지 10°로 할 수 있다. 요동 배양의 조건을 이 범위로 함으로써, 적절한 치수의 세포 응집 덩어리를 제조하는 것이 가능해지기 때문에 바람직하다.
또한, 상기와 같은 선회와 요동을 조합한 운동에 의해 교반하면서 배양할 수도 있다.
스피너 플라스크상의 배양 용기를 사용한 부유 배양은, 배양 용기 중에 교반 날개를 사용하여, 액체 배지를 교반하면서 행하는 배양이다. 회전수나 배지량은 특별히 한정되지 않는다. 시판되고 있는 스피너 플라스크상의 배양 용기라면, 메이커 권장의 배양액량을 적합하게 사용할 수 있고, 예를 들어 에이블사의 스피너 플라스크 등도 적합하게 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 부유 배양에 있어서의 세포의 파종 밀도는, 세포가 응집체를 형성하는 파종 밀도라면 특별히 한정되지 않지만, 1×105 내지 1×107cells/mL인 것이 바람직하다. 세포의 파종 밀도는 2×105cells/mL 이상, 3×105cells/mL 이상, 4×105cells/mL 이상 또는 5×105cells/mL 이상이 바람직하고, 9×106cells/mL 이하, 8×106cells/mL 이하, 7×106cells/mL 이하, 6×106cells/mL 이하, 5×106cells/mL 이하, 4×106cells/mL 이하, 3×106cells/mL 이하, 2×106cells/mL 이하, 1.9×106cells/mL 이하, 1.8×106cells/mL 이하, 1.7×106cells/mL 이하, 1.6×106cells/mL 이하, 1.5×106cells/mL 이하가 바람직하다. 특히, 5×105cells/mL로부터 1.5×106cells/mL 범위의 세포 밀도가 적합하다.
세포의 응집체는 응집체당 수백 내지 수천의 세포를 포함한다. 본 발명에 있어서, 세포 응집체의 크기(직경)는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 50㎛ 이상, 55㎛ 이상, 60㎛ 이상, 65㎛ 이상, 70㎛ 이상, 80㎛ 이상, 90㎛ 이상, 100㎛ 이상, 110㎛ 이상, 120㎛ 이상, 130㎛ 이상, 140㎛ 이상, 150㎛ 이상이고, 또한 1000㎛ 이하, 900㎛ 이하, 800㎛ 이하, 700㎛ 이하, 600㎛ 이하, 500㎛ 이하, 400㎛ 이하를 들 수 있다. 150㎛ 내지 400㎛ 범위의 직경을 갖는 세포 응집체는 본 발명에서 적합하다. 상기 범위 이외의 직경을 갖는 세포 응집체가 혼재하고 있어도 된다.
부유 배양 시의 배양액량은 사용하는 배양 용기에 의해 적절히 조정할 수 있지만, 예를 들어 12웰 플레이트(1웰당 평면으로 보아 웰 저면의 면적이 3.5cm2)를 사용하는 경우에는 0.5ml/웰 이상, 1.5ml/웰 이하로 할 수 있고, 보다 바람직하게는 1ml/웰로 할 수 있다. 예를 들어 6웰 플레이트(1웰당 평면으로 보아 웰 저면의 면적이 9.6cm2)를 사용하는 경우에는, 1.5mL/웰 이상, 바람직하게는 2mL/웰 이상, 보다 바람직하게는 3mL/웰 이상으로 할 수 있고, 6.0mL/웰 이하, 바람직하게는 5mL/웰 이하, 보다 바람직하게는 4mL/웰 이하로 할 수 있다. 예를 들어 125mL 삼각 플라스크(용량이 125mL인 삼각 플라스크)를 사용하는 경우에는, 10mL/용기 이상, 바람직하게는 15mL/용기 이상, 보다 바람직하게는 20mL/용기 이상, 보다 바람직하게는 25mL/용기 이상, 보다 바람직하게는 20mL/용기 이상, 보다 바람직하게는 25mL/용기 이상, 보다 바람직하게는 30mL/용기 이상으로 할 수 있고, 50mL/용기 이하, 보다 바람직하게는 45mL/용기 이하, 보다 바람직하게는 40mL/용기 이하로 할 수 있다. 예를 들어 500mL 삼각 플라스크(용량이 500mL인 삼각 플라스크)를 사용하는 경우에는, 100mL/용기 이상, 바람직하게는 105mL/용기 이상, 보다 바람직하게는 110mL/용기 이상, 보다 바람직하게는 115mL/용기 이상, 보다 바람직하게는 120mL/용기 이상으로 할 수 있고, 150mL/용기 이하, 보다 바람직하게는 145mL/용기 이하, 보다 바람직하게는 140mL/용기 이하, 보다 바람직하게는 135mL/용기 이하, 보다 바람직하게는 130mL/용기 이하, 보다 바람직하게는 125mL/용기 이하로 할 수 있다. 예를 들어 1000mL 삼각 플라스크(용량이 1000mL인 삼각 플라스크)를 사용하는 경우에는, 250mL/용기 이상, 바람직하게는 260mL/용기 이상, 보다 바람직하게는 270mL/용기 이상, 보다 바람직하게는 280mL/용기 이상, 보다 바람직하게는 290mL/용기 이상으로 할 수 있고, 350mL/용기 이하, 보다 바람직하게는 340mL/용기 이하, 보다 바람직하게는 330mL/용기 이하, 보다 바람직하게는 320mL/용기 이하, 보다 바람직하게는 310mL/용기 이하로 할 수 있다. 예를 들어 2000mL 삼각 플라스크(용량이 2000mL인 삼각 플라스크)의 경우에는, 500mL/용기 이상, 보다 바람직하게는 550mL/용기 이상, 보다 바람직하게는 600mL/용기 이상으로 할 수 있고, 1000mL/용기 이하, 보다 바람직하게는 900mL/용기 이하, 보다 바람직하게는 800mL/용기 이하, 보다 바람직하게는 700mL/용기 이하로 할 수 있다. 예를 들어 3000mL 삼각 플라스크(용량이 3000mL인 삼각 플라스크)의 경우에는, 1000mL/용기 이상, 바람직하게는 1100mL/용기 이상, 보다 바람직하게는 1200mL/용기 이상, 보다 바람직하게는 1300mL/용기 이상, 보다 바람직하게는 1400mL/용기 이상, 보다 바람직하게는 1500mL/용기 이상으로 할 수 있고, 2000mL/용기 이하, 보다 바람직하게는 1900mL/용기 이하, 보다 바람직하게는 1800mL/용기 이하, 보다 바람직하게는 1700mL/용기 이하, 보다 바람직하게는 1600mL/용기 이하로 할 수 있다. 예를 들어 2L 배양백(용량이 2L인 디스포저블 배양백)의 경우에는, 100mL/백 이상, 보다 바람직하게는 200mL/백 이상, 보다 바람직하게는 300mL/백 이상, 보다 바람직하게는 400mL/백 이상, 보다 바람직하게는 500mL/백 이상, 보다 바람직하게는 600mL/백 이상, 보다 바람직하게는 700mL/백 이상, 보다 바람직하게는 800mL/백 이상, 보다 바람직하게는 900mL/백 이상, 보다 바람직하게는 1000mL/백 이상으로 할 수 있고, 2000mL/백 이하, 보다 바람직하게는 1900mL/백 이하, 보다 바람직하게는 1800mL/백 이하, 보다 바람직하게는 1700mL/백 이하, 보다 바람직하게는 1600mL/백 이하, 보다 바람직하게는 1500mL/백 이하, 보다 바람직하게는 1400mL/백 이하, 보다 바람직하게는 1300mL/백 이하, 보다 바람직하게는 1200mL/백 이하, 보다 바람직하게는 1100mL/백 이하로 할 수 있다. 예를 들어 10L 배양백(용량이 10L인 디스포저블 배양백)의 경우에는, 500mL/백 이상, 보다 바람직하게는 1L/백 이상, 보다 바람직하게는 2L/백 이상, 보다 바람직하게는 3L/백 이상, 보다 바람직하게는 4L/백 이상, 보다 바람직하게는 5L/백 이상으로 할 수 있고, 10L/백 이하, 보다 바람직하게는 9L/백 이하, 보다 바람직하게는 8L/백 이하, 보다 바람직하게는 7L/백 이하, 보다 바람직하게는 6L/백 이하로 할 수 있다. 예를 들어, 20L 배양백(용량이 20L인 디스포저블 배양백)의 경우에는, 1L/백 이상, 보다 바람직하게는 2L/백 이상, 보다 바람직하게는 3L/백 이상, 보다 바람직하게는 4L/백 이상, 보다 바람직하게는 5L/백 이상, 보다 바람직하게는 6L/백 이상, 보다 바람직하게는 7L/백 이상, 보다 바람직하게는 8L/백 이상, 보다 바람직하게는 9L/백 이상, 보다 바람직하게는 10L/백 이상으로 할 수 있고, 20L/백 이하, 보다 바람직하게는 19L/백 이하, 보다 바람직하게는 18L/백 이하, 보다 바람직하게는 17L/백 이하, 보다 바람직하게는 16L/백 이하, 보다 바람직하게는 15L/백 이하, 보다 바람직하게는 14L/백 이하, 보다 바람직하게는 13L/백 이하, 보다 바람직하게는 12L/백 이하, 보다 바람직하게는 11L/백 이하로 할 수 있다. 예를 들어 50L 배양백(용량이 50L인 디스포저블 배양백)의 경우에는, 1L/백 이상, 보다 바람직하게는 2L/백 이상, 보다 바람직하게는 5L/백 이상, 보다 바람직하게는 10L/백 이상, 보다 바람직하게는 15L/백 이상, 보다 바람직하게는 20L/백 이상, 보다 바람직하게는 25L/백 이상으로 할 수 있고, 50L/백 이하, 보다 바람직하게는 45L/백 이하, 보다 바람직하게는 40L/백 이하, 보다 바람직하게는 35L/백 이하, 보다 바람직하게는 30L/백 이하로 할 수 있다. 배양액량이 이 범위일 때, 적절한 크기의 세포 응집체가 형성되기 쉽다.
사용하는 배양 용기의 용량은 적절히 선택할 수 있어 특별히 한정되지 않지만, 액체 배지를 수용하는 부분의 저면을 평면으로 보았을 때의 면적으로서, 하한이, 예를 들어 0.32cm2, 바람직하게는 0.65cm2, 보다 바람직하게는 0.65cm2, 더욱 바람직하게는 1.9cm2, 가장 바람직하게는 3.0cm2, 3.5cm2, 9.0cm2 또는 9.6cm2의 배양 용기를 사용할 수 있고, 상한으로서는 예를 들어 1000cm2, 바람직하게는 500cm2, 보다 바람직하게는 300cm2, 보다 바람직하게는 150cm2, 보다 바람직하게는 75cm2, 더 바람직하게는 55cm2, 더욱 바람직하게는 25cm2, 보다 더 바람직하게는 21cm2, 가장 더 바람직하게는 9.6cm2, 또는 3.5cm2의 배양 용기를 사용할 수 있다.
배양 온도는, 사용하는 다능성 줄기 세포의 배양에 적합한 배양 온도라면, 특별히 한정되지 않지만, 일반적으로는 30℃ 내지 40℃이며, 바람직하게는 약 37℃이다.
CO2 인큐베이터 등을 이용하여, 약 1 내지 10％, 바람직하게는 5％의 CO2 농도 분위기 하에서 배양을 행하는 것이 바람직하다.
[5] 다능성 줄기 세포의 전배양
상기 다능성 줄기 세포의 응집체 또는 다능성 줄기 세포를 3배엽 중 어느 하나의 세포 집단으로 분화 유도하기 전에, 2-머캅토에탄올을 포함하는 배지를 사용하여 부유 배양하고, 세포 집단을 조제한다.
전배양에 사용하는 배지는, 세포의 종류에 따라서 MEM 배지, BME 배지, DMEM 배지, DMEM/F12 배지, αMEM 배지, IMDM 배지, ES 배지, DM-160 배지, Fisher 배지, F12 배지, WE 배지, RPMI1640 배지 또는 Essential 6TM 배지(서모 피셔 사이언티픽사) 등을 사용할 수 있다.
다능성 줄기 세포의 전배양은 부유 배양으로 실시한다. 상술한 부유 배양의 조건에 의해 행할 수 있고, 또한 미리 마이크로캐리어 등에 접착시켜 부유 배양해도 되고, 세포만으로 구성된 세포 응집 덩어리의 상태에서 부유 배양해도 되고, 세포 응집 덩어리 중에 콜라겐 등의 고분자가 혼재하고 있어도 되고, 형태는 특별히 한정되지 않는다.
전배양에 사용하는 배지 중에 있어서의 2-머캅토에탄올의 농도로서는, 분화 유도의 효율이 향상되는 범위라면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 2-머캅토에탄올의 농도로서, 1μM 이상, 2μM 이상, 5μM 이상, 10μM 이상, 20μM 이상, 30μM 이상, 40μM 이상 또는 50μM 이상이 바람직하고, 200μM 이하, 150μM 이하, 120μM 이하, 100μM 이하, 90μM 이하, 80μM 이하, 70μM 이하 또는 60μM 이하가 바람직하다.
전배양에 사용하는 배지는, FGF2(섬유아세포 성장 인자 2)를 첨가하지 않은 배지인 것도 바람직하다. FGF2를 첨가하지 않은 배지를 사용함으로써, 3배엽 중 어느 하나의 세포 집단으로의 분화 효율을 보다 향상시킬 수 있는 것이 본 발명에 의해 발견되었다.
전배양에 사용하는 배지는, TGFβ1(형질전환 성장 인자(Transforming growth factor)-β1)을 첨가하지 않은 배지인 것도 바람직하다. TGFβ1을 첨가하지 않은 배지를 사용함으로써, 3배엽 중 어느 하나의 세포 집단으로의 분화 효율을 보다 향상시킬 수 있는 것이 본 발명에 의해 발견되었다.
전배양에 사용하는 배지는, WNT 시그널 활성화제를 첨가하지 않은 배지인 것도 바람직하다. WNT 시그널 활성화제를 첨가하지 않은 배지를 사용함으로써, 3배엽 중 어느 하나의 세포 집단으로의 분화 효율을 보다 향상시킬 수 있는 것이 본 발명에 의해 발견되었다.
전배양에 사용하는 배지는, 액티빈 A(본 명세서 중에 있어서 「ACTIVIN A」라고 바꾸어 말하는 경우가 있음)를 첨가하지 않은 배지인 것도 바람직하다. 액티빈 A를 첨가하지 않은 배지를 사용함으로써, 3배엽 중 어느 하나의 세포 집단으로의 분화 효율을 보다 향상시킬 수 있는 것이 본 발명에 의해 발견되었다.
전배양에 사용하는 배지는, 추가로 인슐린을 포함하는 배지인 것도 바람직하다. 인슐린을 포함하는 배지를 사용함으로써, 3배엽 중 어느 하나의 세포 집단으로의 분화 효율을 보다 향상시킬 수 있는 것이 본 발명에 의해 발견되었다.
전배양용 배지에는, 아미노산, 항생 물질, 항산화제, 기타 첨가물을 첨가해도 된다. 예를 들어 0.1 내지 2％(체적/체적)의 비필수 아미노산, 0.1 내지 2％(체적/체적)의 페니실린/스트렙토마이신, 0.1 내지 20mg/mL의 BSA 또는 1 내지 20％(체적/체적)의 녹아웃 혈청 대체물(KSR) 등을 첨가해도 된다.
배양 온도는, 사용하는 다능성 줄기 세포의 배양에 적합한 배양 온도라면, 특별히 한정되지 않지만, 일반적으로는 30℃ 내지 40℃이며, 바람직하게는 약 37℃이다.
CO2 인큐베이터 등을 이용하여, 약 1 내지 10％, 바람직하게는 5％의 CO2 농도 분위기 하에서 배양을 행하는 것이 바람직하다.
다능성 줄기 세포의 전배양의 배양 기간은, 다분화능이 향상될 때까지 배양하는 일수라면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 1주일을 초과하지 않는 기간이면 된다. 보다 구체적으로는, 6일 미만, 5일 미만, 4일 미만, 3일 미만, 또는 6시간 내지 48시간이며, 12시간 내지 36시간 정도이고, 18시간 내지 24시간이다.
[6] 3배엽 중 어느 하나의 세포 집단으로의 분화 유도
본 발명에 있어서는, 상기 전배양에서 얻어진 세포 집단을, 내배엽계 세포, 중배엽계 세포 또는 외배엽계 세포 중 어느 하나로 분화 유도할 수 있는 조건 하에서 배양함으로써, 3배엽 중 어느 하나의 세포 집단을 제조할 수 있다.
다능성 줄기 세포를 3배엽 중 어느 하나의 세포 집단으로 분화 유도할 때에는, 분화 유도화 배지를 사용하여 다능성 줄기 세포의 배양을 행한다.
분화 유도화 배지로서는, 다능성 줄기 세포를 분화 유도시키는 배지라면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 혈청 함유 배지나, 혈청 대체 성분을 함유한 무혈청 배양지 등을 들 수 있다.
사용하는 세포의 종류에 따라서, 영장류 ES/iPS 세포용 배지(리프로셀 배지), BME 배지, BGJb 배지, CMRL 1066 배지, Glasgow MEM 배지, 개선된 MEM 아연 옵션(Improved MEM Zinc Option) 배지, IMDM 배지, Medium 199 배지, Eagle MEM 배지, αMEM 배지, DMEM 배지, 햄 배지, RPMI1640 배지, Fischer's 배지, 및 이들 배지로부터 임의로 선택한 2종 이상의 배지를 혼합한 배지 등을 사용할 수 있다. 또한, 동물 세포의 배양에 사용할 수 있는 배지라면 특별히 한정되지 않는다.
분화 유도 배지는 혈청 성분 또는 혈청 대체 성분을 포함하고 있어도 된다. 혈청 성분 또는 혈청 대체 성분으로서는, 예를 들어 알부민, 인슐린, 트란스페린, 지방산, 콜라겐 전구체, 미량 원소(예를 들어 아연, 셀렌), B-27 서플리먼트(서모 피셔 사이언티픽사), N2 서플리먼트, N21 서플리먼트(R&D Systems사), NeuroBrew-21 서플리먼트(Miltenyibiotec사), KSR2-머캅토에탄올, 3'티올글리세롤, 및 이들의 균등물을 들 수 있다.
분화 유도 배지에는, 추가로 각종 첨가물, 항생 물질, 항산화제 등을 첨가해도 된다. 예를 들어, 0.1mM 내지 5mM의 피루브산나트륨, 0.1 내지 2％(체적/체적)의 비필수 아미노산, 0.1 내지 2％(체적/체적)의 페니실린, 0.1 내지 2％(체적/체적)의 스트렙토마이신, 0.1 내지 2％(체적/체적)의 암포테리신 B, 카탈라아제, 글루타티온, 갈락토오스, 레티노산(비타민 A), 수퍼옥시드 디스무타아제, 아스코르브산(비타민 C), D-α-토코페롤(비타민 E) 등을 첨가해도 된다.
분화 유도 배지에는 추가로, 분화 유도 인자를 첨가한다. 분화 유도 인자의 상세에 대하여는 후기한다.
분화 유도 시에 있어서의 다능성 줄기 세포의 배양은, 부유 배양인 것이 바람직하다. 세포는 마이크로캐리어 등에 접착시켜 부유 배양해도 되고, 세포만으로 구성된 세포 응집 덩어리의 상태에서 부유 배양해도 되고, 세포 응집 덩어리 중에 콜라겐 등의 고분자가 혼재하고 있어도 되고, 형태는 특별히 한정되지 않는다.
분화 유도를 위한 배양에 있어서의 배양 온도는, 사용하는 다능성 줄기 세포의 배양에 적합한 배양 온도라면, 특별히 한정되지 않지만, 일반적으로는 30℃ 내지 40℃이며, 바람직하게는 약 37℃이다.
CO2 인큐베이터 등을 이용하여, 약 1 내지 10％, 바람직하게는 5％의 CO2 농도 분위기 하에서 배양을 행하는 것이 바람직하다.
다능성 줄기 세포로부터 내배엽계 세포로의 분화 배양의 배양 기간은, 내배엽 계열의 세포 특성이 나타내는 세포형으로 되어 있는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 2주일 이내이면 되고, 보다 구체적으로는 2일 이상 8일 이내이며, 보다 바람직하게는 2일 이상 7일 이내이며, 더욱 바람직하게는 3일 이상 6일 이내이며, 일례로서는 5일이다.
[7] 내배엽계 세포로의 분화 유도에 사용하는 분화 유도 인자, 및 기타 첨가물
본 발명의 내배엽계 세포의 제조 방법에 있어서는, 다능성 줄기 세포를, TGFβ(형질전환 성장 인자-β) 수퍼패밀리 시그널 활성화제를 포함하는 배지에서 배양한 후에, FGF2 및 BMP4(골 형태발생 단백질(Bone morphogenetic protein) 4)를 첨가하지 않은 배지에서 배양한다.
TGFβ 수퍼패밀리 시그널이란, 세포 증식의 조절, 분화, 광범위한 생물학적 시스템에서의 발달에 있어서 대단히 중요한 역할을 하고 있다. 일반적으로, 리간드에 의해 야기되는 세린/트레오닌 수용체 키나아제의 다량체 형성과, 골 형태발생 단백(BMP) 경로에 대하여는 Smad1/5/8과 같은 세포 내 시그널 분자의 인산화에 의해, 또한 TGFβ1/액티빈 경로 및 NODAL/액티빈 경로에 대하여는 Smad2/3의 인산화에 의해 시그널은 개시된다. 활성화 수용체에 의한 Smads의 카르복실기 말단의 인산화는, 그것들과 공통의 시그널 트란스듀서인 Smad4와의 파트너를 형성하고, 핵으로의 이행을 재촉한다. 활성화 Smads는, 전사 인자와 파트너를 조합함으로써 다양한 생물학적 효과를 제어하고, 세포의 상태에 특이적인 전사 조절을 행하는 것이 알려져 있다.
TGFβ 수퍼패밀리 시그널 경로에 관여하는 유전자로서는, BMP2 유전자, BMP4 유전자, BMP5 유전자, BMP6 유전자, BMP7 유전자, BMP8 유전자, GDF5(성장 분화 인자(Growth differentiation factor) 5) 유전자, GDF6 유전자, GDF7 유전자, GDF8 유전자, AMH(항뮬러관 호르몬(anti-mullerian hormone)) 유전자, 쌍형성된 유사 호메오도메인(paired like homeodomain) 2(PITX2) 유전자, 및 NODAL 유전자 등을 들 수 있다.
TGFβ 수퍼패밀리 시그널 활성화제로서는, 골 형태발생 단백질(BMP) 경로, TGFβ1/액티빈 경로, 및/또는 NODAL/액티빈 경로의 시그널을 활성화하는 물질이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 액티빈 A, FGF2, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8, GDF5, GDF6, GDF7, GDF8, AMH, PITX2 및/또는 NODAL 등을 사용할 수 있다. 특히, TGFβ1/액티빈 경로의 시그널을 활성화하는 물질을 적합하게 사용할 수 있고, 구체적으로는 액티빈 A, FGF2 및 BMP4로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종을 사용하는 것이 바람직하고, 액티빈 A, FGF2 및 BMP4를 모두 사용하는 것이 특히 바람직하다.
TGFβ 수퍼패밀리 시그널 활성화제를 포함하는 배지에 있어서 액티빈 A를 사용하는 경우, 액티빈 A의 첨가 초기 농도는, 바람직하게는 1ng/mL 이상, 2ng/mL 이상, 3ng/mL 이상, 5ng/mL 이상, 10ng/mL 이상, 20ng/mL 이상, 30ng/mL 이상, 40ng/mL 이상 또는 50ng/mL 이상이고, 바람직하게는 1,000ng/mL 이하, 900ng/mL 이하, 800ng/mL 이하, 700ng/mL 이하, 600ng/mL 이하, 500ng/mL 이하, 400ng/mL 이하, 300ng/mL 이하, 200ng/mL 이하, 150ng/mL 이하 또는 100ng/mL 이하이다.
TGFβ 수퍼패밀리 시그널 활성화제를 포함하는 배지에 있어서 FGF2를 사용하는 경우, FGF2의 첨가 초기 농도는, 바람직하게는 1ng/mL 이상, 2ng/mL 이상, 3ng/mL 이상, 5ng/mL 이상, 10ng/mL 이상, 20ng/mL 이상, 30ng/mL 이상 또는 40ng/mL 이상이고, 바람직하게는 1,000ng/mL 이하, 900ng/mL 이하, 800ng/mL 이하, 700ng/mL 이하, 600ng/mL 이하, 500ng/mL 이하, 400ng/mL 이하, 300ng/mL 이하, 200ng/mL 이하, 150ng/mL, 100ng/mL 이하, 90ng/mL 이하, 80ng/mL 이하 또는 70ng/mL 이하이다.
TGFβ 수퍼패밀리 시그널 활성화제를 포함하는 배지에 있어서 BMP4를 사용하는 경우, BMP4의 첨가 초기 농도는, 바람직하게는 1ng/mL 이상, 2ng/mL 이상, 3ng/mL 이상, 5ng/mL 이상, 6ng/mL 이상, 7ng/mL 이상, 8ng/mL 이상, 9ng/mL 이상, 10ng/mL 이상, 11ng/mL 이상, 12ng/mL 이상, 13ng/mL 이상, 14ng/mL 이상 또는 15ng/mL 이상이고, 바람직하게는 1,000ng/mL 이하, 900ng/mL 이하, 800ng/mL 이하, 700ng/mL 이하, 600ng/mL 이하, 500ng/mL 이하, 400ng/mL 이하, 300ng/mL 이하, 200ng/mL 이하, 150ng/mL, 100ng/mL 이하, 90ng/mL 이하, 80ng/mL 이하, 70ng/mL 이하, 60ng/mL 이하, 50ng/mL 이하, 40ng/mL 이하 또는 30ng/mL 이하이다.
FGF2 및 BMP4를 첨가하지 않은 배지는, 액티빈 A를 포함하는 것이 바람직하다.
FGF2 및 BMP4를 첨가하지 않은 배지가 액티빈 A를 포함하는 경우에 있어서의 액티빈 A의 첨가 초기 농도는, 바람직하게는 1ng/mL 이상, 2ng/mL 이상, 3ng/mL 이상, 5ng/mL 이상, 10ng/mL 이상, 20ng/mL 이상, 30ng/mL 이상, 40ng/mL 이상 또는 50ng/mL 이상이고, 바람직하게는 1,000ng/mL 이하, 900ng/mL 이하, 800ng/mL 이하, 700ng/mL 이하, 600ng/mL 이하, 500ng/mL 이하, 400ng/mL 이하, 300ng/mL 이하, 200ng/mL 이하, 150ng/mL 이하 또는 100ng/mL 이하이다.
FGF2 및 BMP4를 첨가하지 않은 배지는, 인슐린, 트란스페린, 아셀렌산나트륨 및 에탄올아민으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류 이상을 포함하는 것이 바람직하다.
인슐린의 첨가 농도는, 바람직하게는 0.001μg/mL 이상, 0.01μg/mL 이상, 0.05μg/mL 이상, 0.1μg/mL 이상, 0.2μg/mL 이상이고, 바람직하게는 10,000μg/mL 이하, 1,000μg/mL 이하, 100μg/mL 이하, 10μg/mL 이하, 9μg/mL 이하, 8μg/mL 이하, 7μg/mL 이하, 6μg/mL 이하, 5μg/mL 이하, 4μg/mL 이하, 3μg/mL 이하, 2μg/mL 이하이다. 트란스페린의 첨가 농도는, 바람직하게는 0.001μg/mL 이상, 0.01μg/mL 이상, 0.05μg/mL 이상, 0.06μg/mL 이상, 0.07μg/mL 이상, 0.08μg/mL 이상, 0.09μg/mL 이상, 0.1μg/mL 이상, 0.11μg/mL 이상이고, 바람직하게는 10,000μg/mL 이하, 1,000μg/mL 이하, 100μg/mL 이하, 10μg/mL 이하, 9μg/mL 이하, 8μg/mL 이하, 7μg/mL 이하, 6μg/mL 이하, 5μg/mL 이하, 4μg/mL 이하, 3μg/mL 이하, 2μg/mL 이하, 1.9μg/mL 이하, 1.8μg/mL 이하, 1.7μg/mL 이하, 1.6μg/mL 이하, 1.5μg/mL 이하, 1.4μg/mL 이하, 1.3μg/mL 이하, 1.2μg/mL 이하, 1.1μg/mL 이하이다. 아셀렌산나트륨의 첨가 농도는, 바람직하게는 0.001ng/mL 이상, 0.01ng/mL 이상, 0.1ng/mL 이상이고, 바람직하게는 10,000ng/mL 이하, 1,000ng/mL 이하, 100ng/mL 이하, 10ng/mL 이하, 1ng/mL 이하이다. 에탄올아민의 첨가 농도는, 바람직하게는 0.001μg/mL 이상, 0.01μg/mL 이상, 0.02μg/mL 이상, 0.03μg/mL 이상, 0.04μg/mL 이상이고, 바람직하게는 10,000μg/mL 이하, 1,000μg/mL 이하, 100μg/mL 이하, 10μg/mL 이하, 1μg/mL 이하, 0.9μg/mL 이하, 0.8μg/mL 이하, 0.7μg/mL 이하, 0.6μg/mL 이하, 0.5μg/mL 이하, 0.4μg/mL 이하이다.
TGFβ 수퍼패밀리 시그널 활성화제를 포함하는 배지, 및/또는 FGF2 및 BMP4를 첨가하지 않은 배지는, 추가로 2-머캅토에탄올을 포함하는 것이 바람직하다. 2-머캅토에탄올을 작용함으로써, 내배엽계 세포로의 분화 유도 효율을 높일 수 있다.
TGFβ 수퍼패밀리 시그널 활성화제를 포함하는 배지는, 추가로 WNT 시그널 활성화제를 포함하는 것이 바람직하다.
WNT 시그널이란, β-카테닌의 핵 이행을 재촉하고, 전사 인자로서의 기능을 발휘하는 일련의 작용을 말한다. WNT 시그널은 세포간 상호 작용에서 기인하여, 예를 들어 어느 세포로부터 분비된 WNT3A라는 단백이 또 다른 세포에 작용하고, 세포 내의 β-카테닌이 핵 이행하여, 전사 인자로서 작용하는 일련의 흐름이 포함된다. 일련의 흐름은 상피 간엽 상호 작용을 예로 하는 기관 구축의 최초의 현상을 야기한다. WNT 시그널은 β-카테닌 경로, PCP 경로, Ca2+ 경로의 3개 경로를 활성화함으로써, 세포의 증식이나 분화, 기관 형성이나 초기 발생 시의 세포 운동 등 각종 세포 기능을 제어하는 것으로 알려져 있다.
WNT 시그널 경로에 관여하는 유전자로서는, WNT3A 유전자 등이 있다.
WNT 시그널 활성화제로서는, 특별히 한정되지 않지만, 글리코겐 신타제 키나아제-3(GSK-3)의 저해 활성을 나타내는 것이면 어떠한 것이어도 되고, 예를 들어 비스-인돌로(인딜빈) 화합물(BIO)((2'Z,3'E)-6-브로모인딜빈-3'-옥심), 그의 아세톡심 유사체 BIO-아세톡심(2'Z,3'E)-6-브로모인딜빈-3'-아세톡심), 티아디아졸리딘(TDZD) 유사체(4-벤질-2-메틸-1,2,4-티아디아졸리딘-3,5-디온), 옥소티아디아졸리딘-3-티온 유사체(2,4-디벤질-5-옥소티아디아졸리딘-3-티온), 티에닐α-클로로메틸케톤 화합물(2-클로로-1-(4,4-디브로모-티오펜-2-일)-에타논), 페닐α브로모메틸케톤 화합물(α-4-디브로모아세토페논), 티아졸 함유 요소 화합물(N-(4-메톡시벤질)-N'-(5-니트로-1,3-티아졸-2-일)우레아)나 GSK-3β-펩티드 저해제, 예를 들어 H-KEAPPAPPQSpP-NH2 등을 사용할 수 있고, 특히 바람직하게는 CHIR99021(CAS: 252917-06-9)을 사용할 수 있다. WNT3A도 적합하게 사용할 수 있다.
TGFβ 수퍼패밀리 시그널 활성화제를 포함하는 배지에 있어서 CHIR99021을 사용하는 경우, 첨가 초기 농도는, 바람직하게는 0.01μM 이상, 0.02μM 이상, 0.03μM 이상, 0.04μM 이상, 0.05μM 이상, 0.1μM 이상, 0.2μM 이상, 0.3μM 이상, 0.4μM 이상, 0.5μM 이상, 0.6μM 이상, 0.7μM 이상, 0.8μM 이상, 0.9μM 이상, 1μM 이상 또는 2μM 이상이고, 바람직하게는 100μM 이하, 90μM 이하, 80μM 이하, 70μM 이하, 60μM 이하, 50μM 이하, 45μM 이하, 40μM 이하, 35μM 이하, 30μM 이하, 25μM 이하, 20μM 이하, 15μM 이하, 10μM 이하 또는 5μM 이하이다. 보다 바람직하게는 3μM 또는 4μM이다.
TGFβ 수퍼패밀리 시그널 활성화제를 포함하는 배지, 및/또는 FGF2 및 BMP4를 첨가하지 않은 배지는, 적어도 글루코오스를 포함한다. 상기 배지 중에 포함되는 글루코오스 농도의 하한은, 세포가 증식할 수 있는 농도라면 특별히 한정되지 않지만, 0.01g/L 이상이 바람직하다. 또한, 상기 배지 중에 포함되는 글루코오스 농도의 상한은, 세포가 사멸하지 않는 농도라면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 10g/L 이하가 바람직하다. 다른 실시 형태로서, 내배엽 계열의 체세포로 효율적으로 분화시키는 관점에 있어서는, 글루코오스를 2.0g/L 미만으로 함유하는 배지가 바람직하다. TGFβ 수퍼패밀리 시그널 활성화제를 포함하는 배지, 및/또는 FGF2 및 BMP4를 첨가하지 않은 배지에 있어서의 글루코오스의 농도는, 1.0g/L 이하여도 되고, 0.9g/L 이하여도 되고, 0.8g/L 이하, 0.7g/L 이하, 0.6g/L 이하여도 된다. TGFβ 수퍼패밀리 시그널 활성화제를 포함하는 배지, 및/또는 FGF2 및 BMP4를 첨가하지 않은 배지가 글루코오스를 포함하는 경우에 있어서의, 글루코오스의 농도의 하한은 특별히 한정되지 않지만, 0.01g/L 이상이어도 되고, 0.02g/L 이상, 0.05g/L 이상, 0.1g/L 이상, 0.2g/L 이상, 0.3g/L 이상, 0.4g/L 이상, 0.5g/L 이상이어도 된다.
TGFβ 수퍼패밀리 시그널 활성화제를 포함하는 배지, 및/또는 FGF2 및 BMP4를 첨가하지 않은 배지로서, 글루코오스를 1.0g/L 이하의 농도로 함유하는 배지를 사용함으로써, SOX2 양성 세포는 감소하고, SOX17 양성 세포가 증가하는 점에서, 체세포로 분화 유도하기에 보다 적합한 세포 집단을 취득할 수 있다.
[8] 내배엽계 세포 집단
본 발명에 따르면, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 Nanog 유전자의 상대 발현량이 0.8 이하이고, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 HNF1B 유전자의 상대 발현량이 1.0 이상이고, SOX17의 양성을 나타내는 세포의 비율이 80％ 이상인 내배엽계 세포 집단이 제공된다.
OAZ1(오르니틴 데카르복실라제 안티자임(ornithine decarboxylase antizyme) 1, 유전자 서열은 National Center for Biotechnology Infomation의 유전자 데이터베이스에 등록되어 있는 ID: 4946을 참조) 유전자의 발현량에 대한 Nanog(나노그 호메오박스(Nanog homeobox), 유전자 서열은 National Center for Biotechnology Infomation의 유전자 데이터베이스에 등록되어 있는 ID: 79923을 참조) 유전자의 상대 발현량은 0.8 이하이지만, 바람직하게는 0.7 이하이고, 0.65 이하, 0.6 이하이고, 0.55 이하이고, 0.5 이하이고, 0.45 이하이고, 0.4 이하이고, 0.35 이하여도 된다. Nanog는 미분화 마커인 점에서, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 Nanog 유전자의 상대 발현량이 0.8 이하인 것은, 미분화 정도가 낮은 것, 즉 세포 집단에 있어서 미분화 세포가 저감되어 있음을 나타내고 있는 점에서, 효율적인 분화 유도가 행해지고 있음을 의미한다.
OAZ1 유전자의 발현량에 대한 HNF1B(간세포 핵 인자(hepatocyte nuclear factor) 1 베타, 유전자 서열은 National Center for Biotechnology Infomation의 유전자 데이터베이스에 등록되어 있는 ID: 6928을 참조) 유전자의 상대 발현량은 1.0 이상이지만, 바람직하게는 1.1 이상이고, 1.2 이상이고, 1.5 이상이고, 1.7 이상이고, 2.0 이상이고, 2.3 이상이고, 2.5 이상이어도 된다. HNF1B는 원시 장관 세포(PGT) 마커인 점에서, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 HNF1B 유전자의 상대 발현량이 1.0 이상인 것은, 내배엽 계열의 체세포로 분화 유도하기에 보다 적합한 세포 집단인 것을 의미한다.
본 발명의 내배엽계 세포 집단에 있어서는, SOX17(성 결정 영역(sex determining region) Y-box 17)의 양성을 나타내는 세포의 비율은 80％ 이상이지만, 바람직하게는 85％ 이상이고, 90％ 이상이고, 91％ 이상이고, 92％ 이상이고, 93％ 이상이고, 94％ 이상이고, 95％ 이상이고, 96％ 이상이고, 97％ 이상이고, 98％ 이상이고, 99％ 이상이고, 99.5 이상이며 99.9 이상이어도 된다. SOX17은 내배엽계 마커인 점에서, SOX17의 양성을 나타내는 세포의 비율이 80％ 이상인 것은, 배체 내배엽(DE)으로의 분화 유도가 효율적으로 행해지고 있음을 의미한다. 또한, SOX17의 양성을 나타내는 세포의 비율을 측정하는 경우에 있어서는, Becton, Dickinson and Company사의 항SOX17 항체(카탈로그 번호: 562594)를 사용하는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 본 발명의 내배엽계 세포 집단에 있어서는, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 HNF4A(팔량체-결합 전사 인자(octamer-binding transcription factor) 4, 유전자 서열은 National Center for Biotechnology Infomation의 유전자 데이터베이스에 등록되어 있는 ID: 3172를 참조) 유전자의 상대 발현량이 0.5 이상이지만, 바람직하게는 0.6 이상이고, 0.65 이상이고, 0.7 이상이고, 0.75 이상이고, 1.0 이상이고, 1.5 이상이고, 2.0 이상이고, 2.3 이상이고, 3 이상이어도 된다. HNF4A는 원시 장관 세포(PGT) 마커인 점에서, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 HNF4A 유전자의 상대 발현량이 0.5 이상인 것은, 내배엽 계열의 체세포로 분화 유도하기에 보다 적합한 세포 집단인 것을 의미한다.
바람직하게는, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 EpCAM(상피 세포 부착 분자(epithelial cell adhesion molecule), 유전자 서열은 National Center for Biotechnology Infomation의 유전자 데이터베이스에 등록되어 있는 ID: 4072를 참조) 유전자의 상대 발현량은 0.6 이상이고, 보다 바람직하게는 0.7 이상이고, 0.8 이상이고, 0.9 이상이고, 1.0 이상이고, 1.1 이상이고, 1.2 이상이고, 1.3 이상이고, 1.5 이상이고, 2.0 이상이어도 된다. EpCAM은 내배엽계 마커인 점에서, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 EpCAM 유전자의 상대 발현량은 0.6 이상인 것은, 내배엽 계열의 체세포로 분화 유도하기에 보다 적합한 세포 집단인 것을 의미한다.
바람직하게는, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 VIM(비멘틴(vimentin), 유전자 서열은 National Center for Biotechnology Infomation의 유전자 데이터베이스에 등록되어 있는 ID: 7431을 참조) 유전자의 상대 발현량은 12 이하이고, 보다 바람직하게는 11 이하이고, 10 이하이고, 9 이하이고, 8 이하이고, 7 이하이고, 6 이하이고, 5 이하이고, 4 이하이고, 3.5 이하이고, 3.0 이하여도 된다. VIM은 간충직 마커인 점에서, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 VIM 유전자의 상대 발현량은 12 이하인 것은, 내배엽 계열의 체세포로 분화 유도하기에 보다 적합한 세포 집단인 것을 의미한다.
바람직하게는, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 SOX2(성 결정 영역 Y-box 2, 유전자 서열은 National Center for Biotechnology Infomation의 유전자 데이터베이스에 등록되어 있는 ID: 6657을 참조) 유전자의 상대 발현량은 0.11 이하이고, 보다 바람직하게는 0.10 이하이고, 0.07 이하이고, 0.05 이하이고, 0.01 이하이고, 0.006 이하이고, 0.0045 이하여도 된다. SOX2는 미분화 마커인 점에서, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 SOX2 유전자의 상대 발현량이 0.11 이하인 것은, 미분화 정도가 낮은 것, 즉 세포 집단에 있어서 미분화 세포가 저감되어 있음을 나타내고 있는 점에서, 효율적인 분화 유도가 행해지고 있음을 의미한다.
바람직하게는, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 c-Myc(v-myc 조류 골수세포증 바이러스 종양유전자 상동체(avian myelocytomatosis viral oncogene homolog), 유전자 서열은 National Center for Biotechnology Infomation의 유전자 데이터베이스에 등록되어 있는 ID: 4609를 참조) 유전자의 상대 발현량은 0.1 이하이고, 보다 바람직하게는 0.095 이하이고, 0.05 이하이고, 0.045 이하이고, 0.035 이하이고, 0.02 이하이고, 0.015 이하이고, 0.01 이하여도 된다. c-Myc는 미분화 마커인 점에서, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 c-Myc 유전자의 상대 발현량이 0.1 이하인 것은, 미분화 정도가 낮은 것, 즉 세포 집단에 있어서 미분화 세포가 저감되어 있음을 나타내고 있는 점에서, 효율적인 분화 유도가 행해지고 있음을 의미한다.
바람직하게는, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 OCT4(팔량체-결합 전사 인자 4, 유전자 서열은 National Center for Biotechnology Infomation의 유전자 데이터베이스에 등록되어 있는 ID: 5460을 참조) 유전자의 상대 발현량은 0.4 이하이고, 보다 바람직하게는 0.35 이하이고, 0.3 이하이고, 0.25 이하이고, 0.2 이하이고, 0.15 이하이고, 0.1 이하이고, 0.05 이하이고, 0.01 이하여도 된다. OCT4는 미분화 마커인 점에서, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 OCT4 유전자의 상대 발현량이 0.4 이하인 것은, 미분화 정도가 낮은 것, 즉 세포 집단에 있어서 미분화 세포가 저감되어 있음을 나타내고 있는 점에서, 효율적인 분화 유도가 행해지고 있음을 의미한다.
바람직하게는, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 피브로넥틴-1(피브로넥틴-1 유전자 서열은 National Center for Biotechnology Infomation의 유전자 데이터베이스에 등록되어 있는 ID: 2335를 참조) 유전자의 상대 발현량은 1.0 이상이고, 보다 바람직하게는 1.1 이상이고, 1.2 이상이고, 1.3 이상이고, 1.4 이상이고, 1.5 이상이고, 1.6 이상이어도 된다. 피브로넥틴-1은 ECM(세포외 매트릭스: Extracellular matrix) 수용체 상호 작용에 관여하는 분자이다. ECM은 세포에 있어서 발판이 될 뿐만 아니라, 조직의 형태 형성·분화·항상성에 필요로 하는 시그널을 내는 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 피브로넥틴-1의 상대 발현량이 1.0 이상인 것은, 내배엽 계열의 체세포로 분화 유도하기에 보다 적합한 세포 집단인 것을 의미한다.
바람직하게는, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 시클린 D1(시클린 D1 유전자 서열은 National Center for Biotechnology Infomation의 유전자 데이터베이스에 등록되어 있는 ID: 595를 참조) 유전자의 상대 발현량은 0.015 이하이고, 보다 바람직하게는 0.014 이하이고, 0.013 이하이고, 0.012 이하이고, 0.011 이하여도 된다. 시클린 D1은 세포 주기에 관여하고 있다. 따라서, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 시클린 D1 유전자의 상대 발현량이 0.015 이하인 것은, 세포 주기가 정지하기 쉬운 상태(세포의 증식이 억제되는 상태)임을 나타내고 있는 점에서, 보다 효율적인 분화 유도가 행해지고 있음을 의미한다.
바람직하게는, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 매트릭스 메탈로펩티다제 2(매트릭스 메탈로펩티다제 2 유전자 서열은 National Center for Biotechnology Infomation의 유전자 데이터베이스에 등록되어 있는 ID: 4313을 참조) 유전자의 상대 발현량은 0.020 이하이고, 보다 바람직하게는 0.019 이하이고, 0.018 이하이고, 0.017 이하여도 된다. 매트릭스 메탈로펩티다제 2는 암에 있어서의 혈관 신생 등에 관여하는 것이 알려져 있고, 기저막을 구성하고 있는 콜라겐 등의 세포외 매트릭스를 분해하는 것이 알려져 있다. 따라서, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 매트릭스 메탈로펩티다제 2 유전자의 상대 발현량이 0.020 이하인 것은, 세포외 매트릭스의 분해가 억제되고, 상기 피브로넥틴-1 등의 ECM과의 접촉이 안정화되며, 조직의 형태 형성·분화·항상성에 필요로 하는 시그널이 들어가기 쉬움을 나타내고 있는 점에서, 보다 효율적인 분화 유도가 행해지고 있음을 의미한다.
바람직하게는, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 CD44(CD44 유전자 서열은 National Center for Biotechnology Infomation의 유전자 데이터베이스에 등록되어 있는 ID: 960을 참조) 유전자의 상대 발현량은 0.020 이하이고, 보다 바람직하게는 0.019 이하이고, 0.018 이하이고, 0.017 이하, 0.016 이하, 0.015 이하, 0.014 이하, 0.013 이하, 0.012 이하, 0.011 이하, 0.010 이하, 0.009 이하여도 된다. CD44는 히알루론산을 주된 리간드로 하는 접착 분자로서 알려져 있고, 암 세포의 증식능 등에 관여하는 것이 알려져 있다. OAZ1 유전자의 발현량에 대한 CD44 유전자의 상대 발현량이 0.020 이하인 것은, 세포의 증식이 억제되는 것을 나타내고 있는 점에서, 보다 효율적인 분화 유도가 행해지고 있음을 의미한다.
바람직하게는, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 인슐린 수용체 기질 1(인슐린 수용체 기질 1 유전자 서열은 National Center for Biotechnology Infomation의 유전자 데이터베이스에 등록되어 있는 ID: 3667을 참조) 유전자의 상대 발현량은 0.0010 이하이고, 보다 바람직하게는 0.0009 이하이고, 0.0008 이하이고, 0.0007 이하여도 된다. 인슐린 수용체 기질 1은 PI3K(포스파티딜이노시톨 3-키나아제(phosphatidylinositol 3-kinase))-Akt 시그널 전달 경로에 관여하는 분자이며, PI3K-Akt 시그널이 활성화되면 분화가 억제되는 것이 알려져 있다. OAZ1 유전자의 발현량에 대한 인슐린 수용체 기질 1 유전자의 상대 발현량이 0.0010 이하인 것은, PI3K-Akt 시그널이 들어가기 어려운 것을 나타내고 있는 점에서, 보다 효율적인 분화 유도가 행해지고 있음을 의미한다.
OAZ1 유전자의 발현량에 대한 Nanog 유전자의 상대 발현량, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 HNF1B 유전자의 상대 발현량, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 HNF4A 유전자의 상대 발현량, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 EpCAM 유전자의 상대 발현량, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 VIM 유전자의 상대 발현량, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 SOX2 유전자의 상대 발현량, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 OCT4 유전자의 상대 발현량, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 c-Myc 유전자의 상대 발현량, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 피브로넥틴-1 유전자의 상대 발현량, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 시클린 D1 유전자의 상대 발현량, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 매트릭스 메탈로펩티다제 2 유전자의 상대 발현량, OAZ1 유전자의 발현량에 대한 CD44 유전자의 상대 발현량, 그리고 OAZ1 유전자의 발현량에 대한 인슐린 수용체 기질 1 유전자의 상대 발현량이란, OAZ1 유전자의 발현량을 1로 한 경우에 있어서의, Nanog 유전자, HNF1B 유전자, HNF4A 유전자, EpCAM 유전자, VIM 유전자, SOX2 유전자, OCT4 유전자, c-Myc 유전자, 피브로넥틴-1 유전자, 시클린 D1 유전자, 매트릭스 메탈로펩티다제 2 유전자, CD44 유전자, 인슐린 수용체 기질 1 유전자의 발현량의 비율을 의미한다. 각 유전자의 발현량의 측정은, 당업자에게 공지된 방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들어, 분화 유도한 내배엽계 세포의 total RNA를 회수하여, cDNA의 합성을 행하고, 이 cDNA를 주형으로 하여, 정량적 RT-PCR(qPCR)을 실시함으로써, 각 유전자의 발현량을 측정할 수 있다. Nanog 유전자, HNF1B 유전자, HNF4A 유전자, EpCAM 유전자, VIM 유전자, SOX2 유전자, OCT4 유전자, c-Myc 유전자, 피브로넥틴-1 유전자, 시클린 D1 유전자, 매트릭스 메탈로펩티다제 2 유전자, CD44 유전자, 인슐린 수용체 기질 1 유전자의 발현량은, OAZ1 유전자의 발현량에 의해 표준화된다.
SOX17의 양성을 나타내는 세포의 비율은, 플로우 사이토메트리에 의해 측정할 수 있지만, 특별히 한정되지 않는다. 형광 표지 항체를 사용하는 플로우 사이토메트리에 있어서, 네거티브 컨트롤(아이소타입 컨트롤)과 비교하여 보다 강한 형광을 발하는 세포가 검출된 경우, 당해 세포는 당해 마커에 대하여 「양성」이라고 판정된다. 형광 표지 항체는, 당해 기술 분야에 있어서 공지된 임의의 항체를 사용할 수 있고, 예를 들어 이소티오시안산플루오레세인(FITC), 피코에리스린(PE), 알로피코시아닌(APC) 등에 의해 표지된 항체를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
[9] 췌장 β 세포로의 분화 유도
내배엽계 세포로부터 췌장 β 세포로의 분화 유도는, 일반적으로 내배엽계 세포(배체 내배엽: Definitive endoderm: DE)→원시 장관 세포(Primitive Gut Tube: PGT)→후전장 세포(Posterior Foregut: PFG)→췌장 전구 세포(Pancreatic Progenitor: PP)→내분비 전구 세포(Endocrine Precursor: EP)→췌장 β 세포(pancreatic β cell: β)라는 순서로 행할 수 있다.
췌장 β 세포로의 분화 유도에 있어서의 배양 온도는, 사용하는 다능성 줄기 세포의 배양에 적합한 배양 온도라면, 특별히 한정되지 않지만, 일반적으로는 30℃ 내지 40℃이며, 바람직하게는 약 37℃이다.
CO2 인큐베이터 등을 이용하여, 약 1 내지 10％, 바람직하게는 5％의 CO2 농도 분위기 하에서 배양을 행하는 것이 바람직하다.
내배엽계 세포(배체 내배엽)로부터 원시 장관 세포로의 분화 유도에 사용하는 배지로서는, 기초 배지(예를 들어, DMEM 배지 등)에, B27 서플리먼트, FGF-2 및 FGF-7, EC23, SB431542, 도르소모르핀 및 SANT1을 첨가한 배지를 사용할 수 있다.
내배엽계 세포(배체 내배엽)로부터 원시 장관 세포로의 분화 유도의 배양 기간은, 일반적으로는, 일반적으로 24시간 내지 72시간이며, 바람직하게는 36시간 내지 60시간 정도이다.
원시 장관 세포로부터 후전장 세포로의 분화 유도에 사용하는 배지로서는, 기초 배지(예를 들어, DMEM 배지 등)에, B27 서플리먼트, FGF-2, EC23, SB431542, 도르소모르핀 및 SANT1을 첨가한 배지를 사용할 수 있다.
원시 장관 세포로부터 후전장 세포로의 분화 유도의 배양 기간은, 일반적으로는, 일반적으로 48시간 내지 144시간이며, 바람직하게는 72시간 내지 120시간 정도이다.
후전장 세포로부터 췌장 전구 세포로의 분화 유도에 사용하는 배지로서는, 기초 배지(예를 들어, DMEM 배지 등)에, B27 서플리먼트, FGF-10, EC23, 도르소모르핀, ALK 저해제 II, 인도락탐 V 및 엑센딘(Exendin)-4를 첨가한 배지를 사용할 수 있다.
후전장 세포로부터 췌장 전구 세포로의 분화 유도의 배양 기간은, 일반적으로는, 일반적으로 24시간 내지 120시간이며, 바람직하게는 48시간 내지 96시간 정도이다.
췌장 전구 세포로부터 내분비 전구 세포로의 분화 유도에 사용하는 배지로서는, 기초 배지(예를 들어, Advanced-DMEM 배지 등)에, B27 서플리먼트, EC23, 도르소모르핀, ALK 저해제 II, SANT1 및 엑센딘-4를 첨가한 배지를 사용할 수 있다.
췌장 전구 세포로부터 내분비 전구 세포로의 분화 유도의 배양 기간은, 일반적으로는, 일반적으로 24시간 내지 120시간이며, 바람직하게는 48시간 내지 96시간 정도이다.
내분비 전구 세포로부터 췌장 β 세포로의 분화 유도에 사용하는 배지로서는, 기초 배지(예를 들어, Advanced-DMEM 배지 등)에, B27 서플리먼트, FGF-2, BMP-4, HGF, IGF-1, ALK 저해제 II, 엑센딘-4, 니코틴아미드, 포르스콜린(Forskolin)을 첨가한 배지를 사용할 수 있다.
내분비 전구 세포로부터 췌장 β 세포로의 분화 유도의 배양 기간은, 일반적으로는, 일반적으로 96시간 내지 240시간 정도이다.
상기 방법에 의해 얻어지는 췌장 β 세포는, 인슐린 분비능이 높고, 당뇨병에 대하여 높은 치료 효과를 발휘할 수 있다.
[10] 중배엽계 세포 또는 외배엽계 세포로의 분화 유도
본 발명에 있어서, 다능성 줄기 세포를 중배엽계 세포로 분화 유도시키는 경우에는, 예를 들어 일본 특허 공표 제2013-530680호 공보에 기재되어 있는 방법을 사용할 수 있다. 일본 특허 공표 제2013-530680호 공보에는, (i) 액티빈 A 및 Wnt를 포함하는 배지 중에서 인간 다능성 줄기 세포를 배양하는 공정, 및 (ii) BMP 및 Wnt 또는 Wnt의 기능 등가물을 포함하는 배지 중에서, 공정 (i)에서 얻어진 세포를 배양하는 공정을 포함하는, 인간 다능성 줄기 세포로부터 중간 중배엽계 세포의 제조 방법이 기재되어 있다. 또한, Albert Q Lam et al, J Am Soc Nephrol 25: 1211-12225, 2015에는, 인간 다능성 줄기 세포를, GSK3β 저해제인 CHIR99021로 처리한 후에, FGF2 및 레티노산으로 처리함으로써 효율적으로 중배엽계 세포로 분화 유도할 수 있는 것이 기재되어 있다. 본 발명에 있어서도, 상기 문헌에 기재되어 있는 분화 유도 인자를 사용하여, 다능성 줄기 세포를 중배엽계 세포로 분화 유도시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 다능성 줄기 세포를 외배엽계 세포로 분화 유도시키는 경우에는, 예를 들어 BMP 저해제(Noggin 등) 및 TGFβ/ACTIVIN 저해제를 포함하는 배지 중에서 다능성 줄기 세포를 배양하는 방법(Chambers SM. et al., Nat Biotechnol. 27, 275-280(2009)), BMP 저해제(Noggin 등) 및 Nodal/ACTIVIN 저해제를 포함하는 배지 중에서 다능성 줄기 세포를 배양하는 방법(Beata Surnacz et al., Stem Cells, 2012; 30: 1875-1884)을 채용할 수 있다.
이하의 실시예에서 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
[실시예 1]
<다능성 줄기 세포의 유지 배양>
(TKDN4-M주)
인간 iPS 세포주 TKDN4-M(동경 대학 의과학 연구소)은 미토마이신(MITOMYCIN)-C(WAKO사)로 처리를 한 SNL 피더 세포 상에서 인간 iPS 세포 배지(20％ 녹아웃 혈청 대체물(KSR; GIBCO사), 1×비필수 아미노산(NEAA; WAKO사), 55μmol/L 2-머캅토에탄올(2-ME; GIBCO사), 7.5NG/ML 재조합 인간 섬유아세포 성장 인자(FGF2; PEPROTECH사), 0.5×페니실린/스트렙토마이신(PS; WAKO사)을 포함하는 DMEM/HAM'S F12(WAKO사))에서 미분화 유지 배양을 행하였다. 또는, 비트로넥틴(VITRONECTIN)(GIBCO)으로 코팅한 플레이트 상에서, 1×페니실린/스트렙토마이신 및 암포테리신 B(WAKO사)를 포함하는 ESSENTIAL 8 배지(E8; GIBCO사)에서 미분화 유지 배양하였다. 또한, 파종 시에만 최종 농도 10μM이 되도록 Y27632를 첨가하여 배양하였다.
(454E2주)
인간 iPS 세포주 454E2(CIRA)는 미토마이신-C(WAKO사)로 처리를 한 SNL 피더 세포 상에서 인간 iPS 세포 배지(20％ 녹아웃 혈청 대체물(KSR; GIBCO사), 1×비필수 아미노산(NEAA; WAKO사), 55μmol/L 2-머캅토에탄올(2-ME; GIBCO사), 7.5NG/ML 재조합 인간 섬유아세포 성장 인자(FGF2; PEPROTECH사), 0.5×페니실린/스트렙토마이신(PS; WAKO사)을 포함하는 DMEM/HAM'S F12(WAKO사))에서 미분화 유지 배양을 행하였다. 또는, 비트로넥틴(GIBCO)으로 코팅한 플레이트 상에서, 1×페니실린/스트렙토마이신 및 암포테리신 B(WAKO사)를 포함하는 ESSENTIAL 8 배지(E8; GIBCO사)에서 미분화 유지 배양하였다. 또한, 파종 시에만 최종 농도 10μM이 되도록 Y27632를 첨가하여 배양하였다.
<응집 덩어리의 제작>
(TkDN4-M주)
인간 iPS 세포주 TkDN4-M(동경 대학 의과학 연구소)은, 미토마이신-C(Wako사)로 처리를 한 SNL 피더 세포로부터 박리하기 위해 배지로 3회 린스한 후, 추가로 1회 PBS로 린스를 행하고, 아큐맥스(accumax)(Innova Cell Technologies사)로 37℃에서 15분 인큐베이팅하고 나서 피펫팅에 의해 싱글셀로 하였다. 3×107세포의 싱글셀로 한 TkDN4-M을 30mL의 10μM의 Y27632를 포함하는 mTeSR1의 배지 중에 현탁시키고, 30mL 싱글 유스 바이오리액터(에이블사)로 옮겨 6채널 자기 교반 막대(에이블사)에 장착하여 부유 배양을 1일간 행하였다.
(454E2주)
인간 iPS 세포주 454E2(Cira)는, PBS로 2회 린스하고 나서, 아큐타제(Accutase)(Innova Cell Technologies사)로 37℃, 5분 정도 인큐베이팅을 행하고, 피펫팅에 의해 회수한 싱글셀로 한 후에, DMEM/Ham's F12로 린스하였다. 3×107세포의 싱글셀로 한 454E2를 30mL의 10μM의 Y27632를 포함하는 mTeSR1에 현탁시키고, 30mL 싱글 유스 바이오리액터(에이블사)로 옮겨 6채널 자기 교반 막대(에이블사)에 장착하여 부유 배양을 1일간 행하였다.
<다능성 줄기 세포의 전배양>
유지 배양에서 얻어진 응집체를 형성한 세포 집단을, 20％(체적/체적) 녹아웃 혈청 대체물(KSR; Gibco사), 1×비필수 아미노산(NEAA; Wako사), 55μmol/L 2-머캅토에탄올(Gibco사), 7.5ng/mL 재조합 인간 섬유아세포 성장 인자(FGF2; Peprotech사), 0.5×페니실린/스트렙토마이신(PS; Wako사)을 포함하는 DMEM/Ham's F12(Wako사)에 현탁시키고, 30mL 싱글 유스 바이오리액터(에이블사)로 옮기고, 6채널 자기 교반 막대(에이블사)에 장착하여 부유 배양을 1일간 행하였다.
<내배엽계 세포(배체 내배엽)으로의 분화 유도>
전배양에서 얻어진 응집체를 형성한 세포 집단을, 최초의 2일간은 0.5％ 소 혈청 알부민(Bovine Serum Albumin)(BSA; sigma), 0.4×PS, 1mmol/L 피루브산나트륨(sodium pyruvate)(Wako사), 1×NEAA, 80ng/mL 재조합 인간 액티빈 A(Peprotech사), 50ng/mL FGF2, 20ng/mL 재조합 골 형태발생 단백질 4(BMP4; Peprotech사), 3μmol/L CHIR99021(Wako사)를 포함하는 RPMI1640(Wako사)에서 부유 배양하였다. 3일째는 이 배지로부터 BMP4, FGF2, CHIR99021을 제거하여 부유 배양을 행하고, 4일째는 추가로 1％ KSR을 첨가한 배지에서 부유 배양을 1일간 행하였다. 또한, 부유 배양은, 6채널 자기 교반 막대(에이블사)에 장착하여 행하고, 샘플을 조정하였다.
[참고예 1]
<다능성 줄기 세포의 유지 배양>
실시예 1에 기재된 방법으로 동일하게 배양하였다.
<다능성 줄기 세포의 전배양>
유지 배양에서 얻어진 세포 집단을, TkDN4-M주는, 미토마이신-C로 처리를 한 SNL 피더 세포 상에서, 454E2주는 비트로넥틴으로 코팅한 디쉬 상에서, 20％ 녹아웃 혈청 대체물, 1×비필수 아미노산, 55μmol/L 2-머캅토에탄올, 7.5ng/mL 재조합 인간 섬유아세포 성장 인자, 0.5×페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DMEM/Ham's F12에서, 피더 세포 또는 디쉬 상에 접착시킨 상태로 배양을 1일간 행하였다.
<내배엽계 세포(배체 내배엽)으로의 분화 유도>
전배양에서 얻어진 세포 집단을, 최초의 2일간은, 0.5％ 소 혈청 알부민, 0.4×PS, 1mmol/L 피루브산나트륨, 1×NEAA, 80ng/mL 재조합 인간 액티빈 A, 50ng/mL FGF2, 20ng/mL 재조합 골 형태발생 단백질 4, 3μmol/L CHIR99021을 포함하는 RPMI1640에서 디쉬 상에 접착시킨 상태로 배양하였다. 3일째는 이 배지로부터 CHIR99021을 제거하여 디쉬 상에 접착시킨 상태로 배양을 행하고, 4일째는 추가로 1％(체적/체적) KSR을 첨가한 배지에서 디쉬 상에 접착시킨 상태로 배양을 1일간 행하였다.
[분화 효율의 해석]
실시예 1 및 참고예 1에서 제작한 내배엽계 세포 집단에 있어서의 배체 내배엽(DE)으로의 분화 효율을 조사하기 위해서, 이하에 나타내는 수순으로, 정량적 RT-PCR 및 플로우 사이토메트리 해석으로 분석하였다.
<정량적 RT-PCR>
분화 유도한 내배엽계 간질 세포의 total RNA를 ISOGEN(Wako사)에 의해 단리·정제하고, PrimeScriptII(Takara Bio사)를 사용하여 cDNA의 합성을 행하였다. 여기서 합성한 cDNA를 주형으로 하고, GoTaq qPCR master mix(Promega사)를 사용하여 MyiQ qPCR machine(Bio-Rad사)에 의해 qPCR를 실행하였다. 검출은 SYBR Green에 의한 인터칼레이션법으로, 유전자 발현량 비교는 검량선 제작에 의한 상대 정량법으로 행하였다. 각 유전자의 발현 레벨은 하우스 키핑 유전자인 OAZ1에 의해 표준화하였다. 또한, OCT4, SOX2, c-Myc, Nanog, HNH1B 및 HNF4A의 유전자에 대하여는, 샘플 1 및 2를 분석하였다. 피브로넥틴-1(FN1), 시클린 D1, CD44, 매트릭스 메탈로펩티다제 2(MMP2), 인슐린 수용체 기질 1(IRS1)에 대하여는 n=3으로 분석을 하고, 얻어진 분석값으로부터 평균값과 표준 편차값을 산출하였다. 그 상세에 대하여는, [표 1]에 기재한다.
qPCR에 사용한 프라이머의 염기 서열은 다음과 같다.
C-MYC F: GTC TCC ACA CAT CAG CAC AAC TAC(서열 번호 1)
C-MYC R: TTC GGT TGT TGC TGA TCT GTC(서열 번호 2)
HNF1B F: GAG ATC CTC CGA CAA TTC AAC C(서열 번호 3)
HNF1B R: AAA CAG CAG CTG ATC CTG ACT G(서열 번호 4)
HNF4A F: AAG AGA TCC ATG GTG TTC AAG GAC(서열 번호 5)
HNF4A R: AGG TAG GCA TAC TCATTG TCA TCG(서열 번호 6)
NANOG F: CGA AGA ATA GCA ATG GTG TGA C(서열 번호 7)
NANOG R: GTT GCT CCA GGT TGA ATT GTT C(서열 번호 8)
OAZ1 F: GTC AGA GGG ATC ACA ATC TTT CAG(서열 번호 9)
OAZ1 R: GTC TTG TCG TTG GAC GTT AGT TC(서열 번호 10)
OCT4 F: CGC TTC AAG AAC ATG TGT AAG CTG C(서열 번호 11)
OCT4 R: CTC TCA CTC GGT TCT CGA TAC TG(서열 번호 12)
SOX2 F: ATA AGT ACT GGC GAA CCA TCT CTG(서열 번호 13)
SOX2 R: AAT TAC CAA CGG TGT CAA CCT G(서열 번호 14)
EPCAM F: ATG ATC CTG ACT GCG ATG AGA G(서열 번호 15)
EPCAM R: CAG TGT CCT TGT CTG TTC TTC TGA C(서열 번호 16)
VIM F: GTC ACC TTC GTG AAT ACC AAG AC(서열 번호 17)
VIM R: AGG CAG AGA AAT CCT GCT CTC(서열 번호 18)
피브로넥틴-1(FN1) F: CTC TGT CAA CGA AGG CTT GAA C(서열 번호 27)
피브로넥틴-1(FN1) R: CAC TTC CAA AGC CTA AGC ACT G(서열 번호 28)
CD44 F: ATA GAA GGG CAC GTG GTG ATT C(서열 번호 29)
CD44 R: ATG TGT CAT ACT GGG AGG TGT TG(서열 번호 30)
시클린 D1 F: CCG CAC GAT TTC ATT GAA C(서열 번호 31)
시클린 D1 R: ACT TCA CAT CTG TGG CAC AGA G(서열 번호 32)
매트릭스 메탈로펩티다제 2(MMP2) F: CAC CCA TTT ACA CCT ACA CCA AG(서열 번호 33)
매트릭스 메탈로펩티다제 2(MMP2) R: TTG CAG ATC TCA GGA GTG ACA G(서열 번호 34)
인슐린 수용체 기질 1(IRS1) F: GTT TCA TCT CCT CGG ATG AGT ATG(서열 번호 35)
인슐린 수용체 기질 1(IRS1) R: TAG TTG CTT AGC TCC TCC TCA CC(서열 번호 36)
<측정의 결과>
유전자 발현량을 측정한 결과를 도 1 내지 도 3 및 도 10 내지 도 14에 도시한다.
도 10 내지 도 14의 결과는, 하기 표에 정리하여 나타낸다.
Figure 112019086226143-pct00001
참고예 1에 기재된 방법으로 분화 유도한 내배엽계 세포에 대하여, 실시예 1에 기재된 방법으로 분화 유도한 내배엽계 세포는, 미분화 마커(OCT4, SOX2, c-Myc 및 Nanog)의 유전자 발현량이, 감소되어 있었다(도 1).
참고예 1에 기재된 방법으로 분화 유도한 내배엽계 세포에 대하여, 실시예 1에 기재된 방법으로 분화 유도한 내배엽계 세포는, 원시 장관 세포(PGT) 마커(HNF1B 및 HNF4A)의 유전자 발현량이 향상되어 있었다(도 1).
참고예 1에 기재된 방법으로 분화 유도한 내배엽계 세포에 대하여, 실시예 1에 기재된 방법으로 분화 유도한 내배엽계 세포는, 피브로넥틴-1(FN1)의 유전자 발현량이 향상되어 있었다(도 10).
참고예 1에 기재된 방법으로 분화 유도한 내배엽계 세포에 대하여, 실시예 1에 기재된 방법으로 분화 유도한 내배엽계 세포는, 시클린 D1, CD44, 매트릭스 메탈로펩티다제 2(MMP2) 및 인슐린 수용체 기질 1(IRS1)의 유전자 발현량이 감소되어 있었다(도 11 내지 도 14).
<플로우 사이토메트리 해석>
회수하여 싱글셀까지 분산된 세포를 4％ PFA(파라포름알데히드)에 의해 실온에서 20분간 고정 후, PBS로 3회 세정하고, 냉메탄올에 의해 -20℃에서 밤새 투과 처리를 행하였다. 3％ FBS(소태아 혈청)/PBS로 3회 세정 후, 3％ FBS(소태아 혈청)/PBS에 의해 블로킹하고, 하기 표의 형광 표지 완료 항체에 의해 4℃에서 30분 내지 1시간 염색하였다. 3％ FBS(소태아 혈청)/PBS로 1회 세정 후, 셀 스트레이너에 통과시킨 세포를 FACSVerse(Becton, Dickinson and Company; BD사)로 해석하였다.
Figure 112019086226143-pct00002
참고예 1에 기재된 방법으로 분화 유도한 내배엽계 세포에 대하여, 실시예 1에 기재된 방법으로 분화 유도한 내배엽계 세포는, 내배엽계 마커인 EpCAM의 유전자 발현량이 향상되어 있으며, SOX17의 양성을 나타내는 세포가 90％ 이상을 차지하였다(도 2 및 도 3).
참고예 1에 기재된 방법으로 분화 유도한 내배엽계 세포에 대하여, 실시예 1에 기재된 방법으로 분화 유도한 내배엽계 세포는, 간충직 마커인 VIM의 유전자 발현량이 감소되어 있었다(도 3).
[실시예 2]
<췌장 β 세포로의 분화 유도>
실시예 1 및 참고예 1에 기재된 방법으로 얻어진 내배엽계 세포로부터 췌장 β 세포로의 분화 유도는, Yabe SG, Fukuda S, Takeda F, Nashiro K, Shimoda M, Okochi H. Efficient generation of functional pancreatic β-cells from human induced pluripotent stem cells. J Diabetes. 2017 Feb; 9(2): 168-179에 기재된 방법에 기초하여 실시하였다. 구체적으로는 원시 장관 세포(PGT) 분화는 0.5％ BSA, 1mmol/L 피루브산나트륨, 1×NEAA, 0.4×PS, 50ng/mL FGF2, 50ng/mL 재조합 인간 FGF7(Peprotech사), 2％ B27 서플리먼트(Gibco사), 0.67μmol/L EC23(Santa Cruz사), 1μmol/L 도르소모르핀(Wako사), 10μmol/L SB431542(wako사), 0.25mol/L SANT1(Wako사)를 포함하는 RPMI1640에서 2일간 배양하였다.
후전장 세포(PFG) 분화는 0.4×PS, 1×NEAA, 50ng/mL FGF2, 2％ B27, 0.67μmol/L EC23, 1μmol/L 도르소모르핀, 10μmol/L SB431542, 0.25μmol/L SANT1을 포함하는 DMEM-고 글루코오스(Wako사)에서 4일간 배양하였다.
췌장 전구 세포(PP) 분화는 0.4×PS, 1×NEAA, 50ng/mL 재조합 인간 FGF10(Peprotech사), 2％ B27, 0.5μmol/L EC23, 1μmol/L 도르소모르핀, 0.25μmol/L SANT1, 5μmol/L Alk5 저해제 II(Biovision사), 0.3μmol/L 인돌락탐(indolactam) V(ILV; Cayman사)를 포함하는 DMEM-고 글루코오스에서 3일간 배양하였다.
내분비 전구 세포(Endocrine Progenitor) 분화는 0.4×PS, 2mmol/L L-글루타민(glutamine), 2％ B27, 0.2μmol/L EC23, 1μmol/L 도르소모르핀, 0.25μmol/L SANT1, 5μmol/L Alk5 저해제 II, 50ng/mL 엑센딘 4(Sigma사)를 포함하는 Advanced-DMEM(Gibco사)에서 3일간 배양하였다.
췌장 β 세포 분화는, 0.4×PS, 2mmol/L L-글루타민, 2％ B27, 10ng/mL BMP4, 10ng/mL FGF2, 50ng/mL 재조합 인간 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor)(HGF; Peprotech사), 50ng/mL 인슐린-유사 성장 인자(insulin-like growth factor) 1(IGF1; Peprotech사), 5μmol/L Alk5 저해제 II, 50ng/mL 엑센딘 4, 5mmol/L 니코틴아미드(nicotinamide)(Sigma사), 5μmol/L 포르스콜린(Wako사)을 포함하는 Advanced-DMEM에서 6일간 배양하였다. 이것에 의해 얻어진 세포를 iPS-β 세포라고 칭한다.
<당뇨병 모델 마우스로의 이식 실험(당뇨병 모델 비-비만 당뇨병성(NOD)-중증 조합 면역결핍(SCID)(non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency) 마우스 실험)>
상기 췌장 β 세포로의 분화 유도에 있어서 얻어진 iPS-β 세포를, HBSS로 1회 린스한 후에, 3.33μg/mL의 iMatrix-511(Wako사)을 포함하는 HBSS에 현탁시키고, 현탁한 세포를 헤밀톤 시린지(헤밀톤사)에 의해 당뇨병 모델 NOD/SCID 마우스(니혼 클레아사)의 좌신장 피막 아래에 이식하였다(마우스 개체 9A-1, 9A-2, 9B-2는 4×106개의 세포를 투여, 27B-1은 6×106개의 세포를 투여). 당뇨병 모델 NOD/SCID 마우스는 130mg/kg의 스트렙토조토신(streptozotocin)(STZ; Sigma사)을 꼬리 정맥으로부터 투여하여 혈당값이 250mg/dL 이상이 된 개체를 사용하였다. 이식(0일)은 STZ 투여(-14일)로부터 14일 후에 행하였다. 수시 혈당값은 꼬리 정맥으로부터 혈액을 채취하여 글루테스트 Neo 알파(산와 가가꾸사)를 사용하여 측정하였다. 마우스 혈중 인간 c-펩티드 측정은 이식 후에 혈액 샘플을 꼬리 정맥으로부터 Fisherbrand 헤파린 처리 헤마토크리트관(Fisher Scientific사)에 채취하고, 원심 분리(10분, 4℃, 800×g)에 의해 혈청을 분리한 후에 인간 초고감도 c-펩티드 ELISA 키트(Mercodia사)를 사용하여 행하였다. 참고예 1에 기재된 방법에 의해 얻어진 내배엽계 세포로부터 제작된 iPS-β 세포를 이식한 마우스 개체 9A-1, 9A-2, 9B-2에 대하여는 이식 후 12주, 실시예 1에 기재된 방법에 의해 얻어진 내배엽계 세포로부터 제작된 iPS-β 세포를 이식한 마우스 개체 27B-1은 이식 후 2, 6, 11, 16주에 혈액 샘플 채취를 행하였다.
생체 내에서의 기능을 조사하기 위해 마우스 혈중 인간 c-펩티드의 농도를 조사한 결과를 도 4에 도시한다. 참고예 1에 기재된 방법에 의해 얻어진 내배엽계 세포로부터 제작된 iPS-β 세포의 이식 후 12주에 있어서, 마우스 혈중 인간 c-펩티드의 농도는 수십pM 정도였지만, 실시예 1에 기재된 방법에 의해 얻어진 내배엽계 세포로부터 제작된 iPS-β 세포의 이식 후 2주에 있어서는, 마우스 혈중 인간 c-펩티드의 농도가 50pM을 초과하고, 또한 그 이후도 c-펩티드양이 증가해가고, 16주에 있어서 300pM 근방까지 증가하였다. 상기한 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해, 마우스에 이식한 인간 iPS 세포 유래 췌장 β 세포가 분비되는 마우스 혈중 인간 c-펩티드양을 대폭 증가시킬 수 있었다.
또한 당뇨병 모델 마우스의 수시 혈당을 측정한 결과를 도 5에 도시한다.
세포 이식이 없는 마우스 개체에서는 혈당값이 400 내지 600mg/dL로 매우 높은 값을 이식 후 140일간 나타내었던 것에 비해, 실시예 1에 기재된 방법에 의해 얻어진 내배엽계 세포로부터 제작된 iPS-β 세포를 이식한 개체에서는, 이식 후에 혈당값이 저하되어가고, 이식 후 60일에 250mg/dL까지 저하되고, 이식 후 140일에서는 125mg/dl로 거의 정상값을 나타내었다. 이것으로부터 본 발명의 방법에 의해 분화 유도하여 얻어진 체세포(췌장 β 세포)는, 당뇨병 치료에 매우 효과적인 것이 명확해졌다.
[실시예 3]
<다능성 줄기 세포로부터 내배엽계 세포로의 분화 유도에 있어서의 BSA와 ITS의 효과>
다능성 줄기 세포의 유지 배양 및 전배양에 대하여는, 실시예 1에 기재된 방법에 의해 행하여, 다능성 줄기 세포로부터 내배엽계 세포로의 분화 유도에 있어서의 BSA와 ITS의 첨가의 유용성에 대하여는 이하의 방법으로 검증하였다. iPS 세포주로서는, 253G1(Cira) 및 454E2(Cira)를 사용하였다.
첫번째 조건에서는 최초의 2일간은 10mg/mL(1.0％) 소 혈청 알부민, 0.4×PS, 1mmol/L 피루브산나트륨, 1×NEAA, 80ng/mL 액티빈 A, 50ng/mL FGF2, 20ng/mL BMP4, 3μmol/L CHIR99021, 1:50000 ITS-X(Gibco사)를 포함하는 RPMI1640에서 배양하였다. 3일째는 이 배지로부터 BMP4, FGF2, CHIR99021을 제거하여 배양을 행하고, 추가로 1％ KSR을 첨가한 배지에서 1일간 배양하였다.
두번째 조건에서는 최초의 2일간은 2.5mg/mL(0.25％) 소 혈청 알부민, 0.4×PS, 1mmol/L 피루브산나트륨, 1×NEAA, 80ng/mL 액티빈 A, 50ng/mL FGF2, 20ng/mL BMP4, 3μmol/L CHIR99021, 1:5000 ITS-X를 포함하는 RPMI1640에서 배양하였다. 3일째는 이 배지로부터 BMP4, FGF2, CHIR99021을 제거하여 배양을 행하고, 추가로 1％ KSR을 첨가한 배지에서 1일간 배양하였다.
내배엽계 세포로의 분화 효율을 조사하기 위해서, 이들 방법에 의해 분화 유도한 내배엽계 세포 집단의 total RNA를 ISOGEN(Wako사)에 의해 단리·정제하고, PrimeScript II(Takara Bio사)를 사용하여 cDNA의 합성을 행하였다. 여기서 합성한 cDNA를 주형으로 하고, GoTaq qPCR master mix(Promega사)를 사용하여 MyiQ qPCR machine(Bio-Rad사)에 의해 qPCR를 실행하였다. 검출은 SYBR Green에 의한 인터칼레이션법으로, 유전자 발현량 비교는 검량선 제작에 의한 상대 정량법으로 행하였다. 미분화 마커인 OCT3/4, 분화 마커인 SOX17의 발현 레벨은 하우스 키핑 유전자인 OAZ1에 의해 표준화하였다.
qPCR에 사용한 프라이머의 염기 서열은 다음과 같다.
OAZ1-F: GTC AGA GGG ATC ACA ATC TTT CAG(서열 번호 19)
OAZ1-R: GTC TTG TCG TTG GAC GTT AGT TC(서열 번호 20)
OCT4-F: CGC TTC AAG AAC ATG TGT AAG CTG C(서열 번호 21)
OCT4-R: CTC TCA CTC GGT TCT CGA TAC TG(서열 번호 22)
SOX17-F: TAC ACA CTT CCT GGA GGA GCT AAG(서열 번호 23)
SOX17-R: CCA AAC TGT TCA AGT GGC AGA C(서열 번호 24)
FOXA2-F: GAG ATC TAC CAG TGG ATC ATG GAC(서열 번호 25)
FOXA2-R: CAC CTT CAG GAA ACA GTC GTT G(서열 번호 26)
상기 측정 결과를 도 6에 나타낸다.
1％ BSA-1:50000 ITS-X의 조건 및 0.25％ BSA-1:5000 ITS-X의 조건 중 어느 것에 있어서도, DE 마커의 SOX17 및 FOXA2의 발현 레벨이 높은 점에서, 효율적인 분화 유도가 행해지고 있는 것이 확인되었다. 또한, 1％ BSA-1:50000 ITS-X의 조건보다 0.25％ BSA-1:5000 ITS-X의 조건에서 배양한 샘플 쪽이, 미분화 마커인 OCT4의 발현 레벨이 보다 현저하게 저하되고, 반대로 내배엽계 마커의 SOX17 및 FOXA2의 발현 레벨이 보다 현저하게 높아진 점에서 1％ BSA-1:50000 ITS-X의 조건보다 0.25％ BSA-1:5000 ITS-X 쪽이 보다 효과적인 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 4]
<다능성 줄기 세포로부터 내배엽계 세포로의 분화 유도에 있어서의 2-머캅토에탄올의 효과>
다능성 줄기 세포의 유지 배양 및 전배양에 대하여는, 실시예 1에 기재된 방법에 의해 행하여, 다능성 줄기 세포로부터 내배엽계 세포로의 분화 유도에 있어서의 2-머캅토메탄올의 첨가의 유용성에 대하여는 이하의 방법으로 검증하였다.
서브콘플루언트(80％ 정도)까지 배양한 세포를 아큐타제((Innova Cell Technologies사)로 박리하여 회수하고, 펠릿화한 후, 1mL당 5×105개의 세포를 포함하도록, 10mg/mL BSA, 10μM Y27632를 포함하는 Essential 8을 첨가하여 세포를 재현탁하고, 부유 배양용 6웰 플레이트(스미토모 베이크라이트 가부시키가이샤)에 4ml/웰의 비율로 파종하였다. 오비탈 셰이커(옵티마사) 상에서 90rpm의 회전 속도로 밤새 배양하여 세포 응집 덩어리를 제작하였다. 그 후, 20％ 녹아웃 혈청 대체물, 1×비필수 아미노산, 55μmol/L 2-머캅토메탄올, 7.5ng/mL 재조합 인간 섬유아세포 성장 인자, 1×페니실린/스트렙토마이신 및 암포테리신 B에 배지 교환하여 1일 배양한 후, 배체 내배엽(DE) 분화는 4일간 행하고, 최초 1일간은 0.5％ 소 혈청 알부민, 1×PSB, 1mmol/L 피루브산나트륨, 1×NEAA, 80ng/mL 액티빈 A, 50ng/mL FGF2, 20ng/mL BMP4, 3μmol/L CHIR99021을 포함하는 RPMI1640에 55μmol/L 2-머캅토에탄올 또는 1％ N21 서플리먼트(R&D 시스템즈사)를 첨가하여 배양하였다. 2일째와 3일째는 이 배지로부터 BMP4, FGF2, CHIR99021을 제거하여 액티빈 A의 농도를 100ng/mL로 하여, 55μmol/L 2-머캅토에탄올 또는 1％ N21 서플리먼트를 첨가하여 배양을 행하고, 4일째는 추가로 1％ KSR을 첨가한 배지에서 1일간 배양하였다.
<세포 밀도 계수>
내배엽계 세포로의 분화 유도 후, 아큐타제에 의해 37℃에서 5 내지 10분 처리하고, 피펫팅에 의해 세포를 단분산시켜, 트리판 블루 염색한 후, 혈구 계산판을 사용하여, 내배엽계 세포로 분화 유도한 세포 집단의 세포수를 계수하고, 세포 밀도를 측정하였다.
<플로우 사이토메트리 해석>
내배엽계 세포로의 분화 유도 후, 회수하여 싱글셀까지 분산된 세포를 4％ PFA(파라포름알데히드)에 의해 실온에서 20분간 고정 후, PBS로 3회 세정하고, 냉메탄올에 의해 -20℃에서 밤새 투과 처리를 행하였다. 3％ FBS(소태아 혈청)/PBS로 3회 세정 후, 3％ FBS(소태아 혈청)/PBS에 의해 블로킹하고, 하기 표의 형광 표지 완료 항체에 의해 4℃에서 30분 내지 1시간 염색하였다. 3％ FBS(소태아 혈청)/PBS로 1회 세정 후, 셀 스트레이너에 통과시킨 세포를 FACSVerse(Becton, Dickinson and Company; BD사)로 해석하였다.
Figure 112019086226143-pct00003
상기에 있어서 55μmol/L 2-머캅토에탄올을 사용하지 않은 것 이외에는 동일한 방법으로 하여 배양을 행하는 실험도 행하였다.
상기에 있어서, 55μmol/L 2-머캅토에탄올 대신에 N21-MAX Media 서플리먼트(R&D Systems사)(단, 인슐린을 포함하지 않은 것)를 사용한 것 이외에는, 동일한 방법으로 하여 배양을 행하는 실험도 행하였다.
N21-MAX Media 서플리먼트로부터 인슐린을 제외한 조성은 이하와 같다.
알부민(소), L-카르니틴, 카탈라아제, 코르티코스테론, 에탄올아민, 글루타티온, 갈락토오스, 트란스페린, 리놀레산, 리놀렌산, 리포산, 프로게스테론, 푸트레신, 레티닐아세테이트, 레티놀, 아셀렌산염, 수퍼옥시드·디무스타제, 트리요오도-L-티로닌, D,L-알파-토코페놀, D,L-알파-토코페놀아세테이트
상기 배양 후(5일째)의 세포에 대하여, FACS에서 SOX2, SOX17이 양성인 세포의 비율을 측정한 결과를 도 7에 나타낸다. 또한, 상기 배양 후(5일째)의 세포의 세포 밀도를 측정한 결과를 도 8에 나타낸다.
2-머캅토에탄올을 첨가한 경우 및 2-머캅토에탄올을 첨가하지 않은 경우의 어느 것에 있어서도, 내배엽계 세포로의 분화는 확인되었다. 또한, 2-머캅토에탄올을 첨가한 경우에는, 세포 밀도의 측정 결과로부터, 생존 세포수의 증가도 확인되었다. 또한, N21-MAX Media 서플리먼트로부터 인슐린을 제외한 조성물을 사용한 경우에 있어서도, 생존 세포수의 증가가 확인되었다. 또한, 2-머캅토에탄올을 첨가한 경우, 미분화 잔존율(SOX2 양성 세포율)이 저하되는 것을 알았다. 2-머캅토에탄올을 첨가해도, 내배엽계 분화 효율(SOX17 양성 세포율, FOXA2 양성 세포율)은 실질적으로 변화하지 않았다.
[실시예 5]
<다능성 줄기 세포의 전배양에 있어서의 FGF2와 TGFβ1의 검토>
TkDN4-M주를 실시예 1에 기재된 미분화 유지를 행한 후, 서브콘플루언트(80％ 정도)까지 배양한 세포를 아큐타제로 박리하여 회수하고, 펠릿화한 후, 4mL/웰에 10mg/mL BSA, 10μM Y27632를 포함하는 Essential 8을 첨가한 후, 펠릿화한 세포를 웰에 현탁시키고, 오비탈 셰이커에서 90rpm의 회전 속도로 12시간 배양하여 세포 응집체를 제작하였다.
제작한 세포 응집체를 전배양할 때, 5mg/mL BSA, 1×NEAA, 55μmol/L 2-머캅토에탄올, 1×PS를 포함하는 Essential 6 배지(FGF2 불함유이면서 또한 TGFβ1 불함유)에서 하루 배양하고 나서, 실시예 1에 기재된 분화 유도를 개시한 샘플 1을 조정하였다. 또한, 별도로, 제작한 세포 응집체를 전배양할 때, 5mg/mL BSA, 1×NEAA, 55μmol/L 2-머캅토에탄올, 1×PS를 포함하는 Essential 8 배지에서 하루 배양하고 나서, 실시예 1에 기재된 분화 유도를 개시한 샘플 2를 조정하였다. 그리고, 조정한 샘플 1 및 2를, 이하에 나타내는 플로우 사이토메트리 해석에 의해 분화 유도 효율을 검증하였다.
<플로우 사이토메트리 해석>
내배엽계 세포로의 분화 유도 후, 세포를 회수하여 싱글셀까지 분산된 세포를 4％ PFA(파라포름알데히드)에 의해 실온에서 20분간 고정 후, PBS로 3회 세정하고, 냉메탄올에 의해 -20℃에서 밤새 투과 처리를 행하였다. 3％ FBS(소태아 혈청)/PBS로 3회 세정 후, 3％ FBS(소태아 혈청)/PBS에 의해 블로킹하고, 하기 표의 형광 표지 완료 항체에 의해 4℃에서 30분 내지 1시간 염색하였다. 3％ FBS(소태아 혈청)/PBS로 1회 세정 후, 셀 스트레이너에 통과시킨 세포를 FACSVerse(Becton, Dickinson and Company; BD사)로 해석하였다.
Figure 112019086226143-pct00004
상기 배양 후(4일째)의 세포에 대하여, FACS에서 SOX17, FOXA2가 양성인 세포의 비율을 측정한 결과를 도 9에 나타낸다.
샘플 1 및 2 각각에 있어서, 내배엽계 세포로의 분화 유도가 확인되었다. 또한, 샘플 1의 쪽이, 내배엽계 세포로의 분화 유도의 효율이 샘플 2보다 높은 것이 밝혀졌다. 즉, 다능성 줄기 세포의 전배양에 있어서, FGF2와 TGFβ1을 첨가하지 않은 배지를 사용하면 내배엽계 세포로의 분화 유도의 효율이 향상되는 것이 명확해졌다.
[실시예 6]
<다능성 줄기 세포로부터 내배엽계 세포로의 분화 유도에 있어서의 글루코오스의 효과>
(응집 덩어리의 제작)
실시예 1의 방법으로 유지 배양한 TkDN-4주를 1회 PBS로 린스를 행하고, 아큐타제로 3 내지 5분간 처리하여 박리하고, 단세포까지 분산하였다. 이 세포를 최종 농도 5mg/mL의 BSA(와코 쥰야꾸 고교 가부시키가이샤) 및 10μM의 Y-27632(와코 쥰야꾸 고교 가부시키가이샤)를 포함하는 Essential 8TM 배지로 현탁하고, 그의 일부를 트리판 블루 염색하여 세포수를 조사하였다. 1mL당 5×105개의 세포를 포함하도록 조제하였다. 부유 배양용 6웰 플레이트(스미토모 베이크라이트 가부시키가이샤)에 4ml/웰의 비율로 파종하였다. 세포를 파종한 플레이트는, 로터리 셰이커(가부시키가이샤 옵티마) 상에서 90rpm의 스피드로 수평면을 따라서 선회폭(직경)이 25mm인 원을 그리도록 선회 배양하고, 5％ CO2, 37℃의 환경 하에서 부유 배양을 1일간 행하였다.
(전배양)
상기 유지 배양에서 얻어진 응집체를 형성한 세포 집단을, 20％(체적/체적) 녹아웃 혈청 대체물(KSR; Gibco사), 1×비필수 아미노산(NEAA; Wako사), 55μmol/L 2-머캅토에탄올(Gibco사), 7.5ng/mL 재조합 인간 섬유아세포 성장 인자(FGF2; Peprotech사), 0.5×페니실린/스트렙토마이신(PS; Wako사)을 포함하는 DMEM/Ham's F12(Wako사)에 재현탁하고, 부유 배양용 6웰 플레이트(스미토모 베이크라이트 가부시키가이샤)에 4ml/웰의 비율로 파종하였다. 세포를 파종한 플레이트는, 로터리 셰이커(가부시키가이샤 옵티마) 상에서 90rpm의 스피드로 수평면을 따라서 선회폭(직경)이 25mm인 원을 그리도록 선회 배양하고, 5％ CO2, 37℃의 환경 하에서 부유 배양을 1일간 행하였다.
(내배엽계 세포(배체 내배엽)로의 분화 유도)
전배양에서 얻어진 응집체를 형성한 세포 집단을, 최초의 1일째는 0.5％ 소 혈청 알부민(BSA; sigma), 0.4×PS, 1mmol/L 피루브산나트륨(Wako사), 1×NEAA, 80ng/mL 재조합 인간 액티빈 A(Peprotech사), 50ng/mL FGF2, 20ng/mL 재조합 골 형태발생 단백질 4(BMP4; Peprotech사), 3μmol/L CHIR99021(Wako사)을 포함하는 글루코오스 불함유 RPMI1640(Wako사)에 각 최종 농도(0g/L, 0.5g/L, 1g/L, 2g/L, 또는 4g/L)가 되도록 글루코오스를 첨가하여 부유 배양하였다.
2일째 및 3일째는, 이 배지로부터 BMP4, FGF2, CHIR99021을 제거하여 부유 배양을 행하였다. 또한, 2일째 및 3일째의 배지 중의 글루코오스 농도는, 1일째와 동일하게 0g/L, 0.5g/L, 1g/L, 2g/L 또는 4g/L이다. 부유 배양은, 부유 배양용 6웰 플레이트(스미토모 베이크라이트 가부시키가이샤)에 4ml/웰의 비율로 파종하고, 로터리 셰이커(가부시키가이샤 옵티마) 상에서 90rpm의 스피드로 수평면을 따라서 선회폭(직경)이 25mm인 원을 그리도록 선회 배양하고, 5％ CO2, 37℃의 환경 하에서 행하였다.
4일째(Day4)에, 이하의 수순으로 내배엽계 세포로 분화 유도한 세포 집단에 있어서의 세포 밀도의 측정을 행하였다.
<세포 밀도 계수>
내배엽계 세포로의 분화 유도 후, 아큐타제에 의해 37℃에서 5 내지 10분 처리하고, 피펫팅에 의해 세포를 단분산시켜, 트리판 블루 염색한 후, 혈구 계산판을 사용하여 세포수를 계수하고, 내배엽계 세포로 분화 유도한 세포 집단의 세포 밀도를 측정하였다.
세포 밀도의 측정 결과를 도 15에 도시한다. 글루코오스 농도가 낮을수록 세포 밀도가 높아지는 것이 판명되었다. 단, 글루코오스 농도가 0g/L인 경우에는 세포가 사멸하였다.
1일째 내지 4일째(Day1 내지 Day4)에, 정량적 RT-PCR(수순은 실시예 1 및 참고예 1에 기재한 대로임)에 의한 내배엽계 세포로 분화 유도한 세포 집단의 유전자 발현의 해석을 행하였다. 결과를 도 16 내지 도 18에 나타낸다.
도 16 및 도 17의 결과로부터, 글루코오스 농도가 1.0g/L 이하인 경우에는, 미분화 세포(SOX2 양성 세포, Nanog 양성 세포)가 적어지는 경향이 있음을 알았다.
도 18의 결과로부터, 글루코오스 농도가 낮은 쪽이, 내배엽 분화가 빠른 단계로부터 진행하는 것이 시사되었다.
4일째에, 이하의 수순대로 플로우 사이토메트리 해석에 의해 SOX2 및 SOX17의 양성률을 측정하였다.
<플로우 사이토메트리 해석>
내배엽계 세포로의 분화 유도 후, 회수하여 싱글셀까지 분산된 세포를 4％ PFA(파라포름알데히드)에 의해 실온에서 20분간 고정 후, PBS로 3회 세정하고, 냉메탄올에 의해 -20℃에서 밤새 투과 처리를 행하였다. 3％ FBS(소태아 혈청)/PBS로 3회 세정 후, 3％ FBS(소태아 혈청)/PBS에 의해 블로킹하고, 하기 표의 형광 표지 완료 항체에 의해 4℃에서 30분 내지 1시간 염색하였다. 3％ FBS(소태아 혈청)/PBS로 1회 세정 후, 셀 스트레이너에 통과시킨 세포를 FACSVerse(Becton, Dickinson and Company; BD사)로 해석하였다.
Figure 112019086226143-pct00005
플로우 사이토메트리 해석의 결과를 도 19에 나타낸다.
도 19의 결과로부터, 글루코오스 농도가 1.0g/L 이하인 경우에는, 미분화 세포(SOX2 양성 세포)가 적어지는 경향을 알았다. 미분화 iPS 세포(SOX2 양성 세포)는 글루코오스 요구성이 높은 점에서, 글루코오스 농도가 1.0g/L 이하인 조건에서는, 미분화 세포(SOX2 양성 세포)는 생존할 수 없어 사멸한 것으로 추측된다.
[실시예 7]
<다능성 줄기 세포로부터 내배엽계 세포로의 분화 유도에 있어서의 글루코오스의 효과>
1일째, 2일째 및 3일째의 배지 중의 글루코오스 농도(g/L)를 이하의 표에 나타내는 대로 변경한 것 이외에는, 실시예 6과 동일하게, 다능성 줄기 세포로부터 내배엽계 세포로의 분화 유도를 행하였다.
Figure 112019086226143-pct00006
4일째에, 실시예 6과 동일한 수순으로 플로우 사이토메트리 해석에 의해, 내배엽계 세포로 분화 유도한 세포 집단의 SOX2 및 SOX17의 양성률을 측정한 결과를 도 20에 나타낸다.
도 20의 결과로부터, 글루코오스 농도가 0.5g/L에서 배양하는 기간이 길수록, SOX2 양성 세포는 감소하고, SOX17 양성 세포는 증가하는 것을 알 수 있다.
또한, 상기 플로우 사이토메트리 해석의 결과를 도 21에 나타낸다. 도 21의 좌측 도면은 실험 1의 경우를 나타내고, 도 21의 우측 도면은 실험 4의 경우를 나타낸다.
도 21의 결과로부터, 글루코오스 첨가 농도가 0.5g/L에서 배양하면, SOX2 양성 세포는 감소하고, SOX17 양성 세포는 증가하는 것을 알 수 있다.
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  10. 다능성 줄기 세포로부터 내배엽계 세포를 제조하는 방법으로서, 이하에 나타내는 (a) 내지 (b):
    (a) 다능성 줄기 세포를 2-머캅토에탄올을 포함하는 배지를 사용하여 부유 배양하고, 세포 집단을 조제하는 공정,
    (b) 상기 세포 집단을, TGFβ 수퍼패밀리 시그널 활성화제를 포함하는 배지에서 배양한 후, FGF2 및 BMP4를 첨가하지 않은 배지에서 배양하는 공정
    을 포함하고,
    상기 2-머캅토에탄올을 포함하는 배지가 추가로 인슐린을 포함하는 배지인
    제조 방법.
  11. 제10항에 있어서, 2-머캅토에탄올을 포함하는 배지가, 액티빈 A를 첨가하지 않은 배지인 제조 방법.
  12. 제10항에 있어서, 2-머캅토에탄올을 포함하는 배지가, WNT 시그널 활성화제를 첨가하지 않은 배지인 제조 방법.
  13. 제10항에 있어서, 2-머캅토에탄올을 포함하는 배지가, FGF2를 첨가하지 않은 배지인 제조 방법.
  14. 제10항에 있어서, 2-머캅토에탄올을 포함하는 배지가, TGFβ1을 첨가하지 않은 배지인 제조 방법.
  15. 삭제
  16. 제10항에 있어서, FGF2 및 BMP4를 첨가하지 않은 배지가, 인슐린, 트란스페린, 아셀렌산나트륨 및 에탄올아민으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류 이상을 포함하는 배지인 제조 방법.
  17. 제10항에 있어서, TGFβ 수퍼패밀리 시그널 활성화제를 포함하는 배지, 및 FGF2 및 BMP4를 첨가하지 않은 배지 중 하나 이상이, 추가로 2-머캅토에탄올을 포함하는 배지인 방법.
  18. 제10항 내지 제14항, 제16항, 및 제17항 중 어느 한 항에 있어서, TGFβ 수퍼패밀리 시그널 활성화제를 포함하는 배지, 및 FGF2 및 BMP4를 첨가하지 않은 배지 중 하나 이상이, 글루코오스를 1.0g/L 이하의 농도로 함유하는 배지인 방법.
  19. 다능성 줄기 세포로부터 3배엽 중 어느 하나의 세포 집단을 제조하는 방법으로서, 이하에 나타내는 (a) 내지 (b):
    (a) 다능성 줄기 세포를 2-머캅토에탄올을 포함하는 배지를 사용하여 부유 배양하고, 세포 집단을 조제하는 공정,
    (b) 상기 세포 집단을, 내배엽계 세포, 중배엽계 세포 또는 외배엽계 세포 중 어느 하나로 분화 유도할 수 있는 조건 하에서 배양하는 공정
    을 포함하고,
    상기 2-머캅토에탄올을 포함하는 배지가 추가로 인슐린을 포함하는 배지인
    제조 방법.
  20. 제19항에 있어서, 2-머캅토에탄올을 포함하는 배지가, FGF2를 첨가하지 않은 배지인 제조 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 2-머캅토에탄올을 포함하는 배지가, TGFβ1을 첨가하지 않은 배지인 제조 방법.
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