JP7311116B2 - 膵臓β細胞の製造方法 - Google Patents

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Description

本発明は、膵臓β細胞の製造方法に関する。本発明はさらに、上記の膵臓β細胞の製造方法において製造される膵臓前駆細胞（ＰＰ）、膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）および膵臓β細胞に関する。
再生医療は、ドナー不足を課題とする臓器移植の代替法や難病の新たな治療法開発などにおいて大きな期待が寄せられている。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は多能性及び無限増殖性を有しているため、再生医療に必要とされる細胞を調製するための細胞ソースとして期待されている。これらの多能性幹細胞を用いた再生医療の実用化に際しては、多能性幹細胞を効率よく目的の体細胞に分化誘導させる技術の確立が必要であり、多様な分化誘導方法について報告されている。
例えば、膵臓β細胞は、糖尿病の細胞治療において有用であることから、多能性幹細胞から効率よく膵臓β細胞を作製する方法が検討されている。非特許文献１には、ヒトｉＰＳ細胞から機能的な膵臓β細胞を生成するためのプロセスについての総説が記載されている。非特許文献２には、ヒトｉＰＳ細胞から機能的な膵臓β細胞を効率よく生成する方法が記載されている。非特許文献２においては、ステージ１においてｉＰＳ細胞を内胚葉系細胞に分化させた後、ステージ２において原始腸管細胞（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｇｕｔ：ＰＧＴ）へ分化誘導し、ステージ３において後前腸細胞（ＰＦＧ）へ分化誘導し、ステージ４において膵臓前駆細胞（ＰＰ）へ分化誘導し、ステージ５において膵臓前駆細胞（ＰＰ）へ分化誘導し、ステージ６において膵臓β細胞へと分化誘導している。
Ｌａｒｒｙ Ｓａｉ Ｗｅｎｇ Ｌｏｏ ＭＳｃ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｏｂｅｓ Ｍｅｔａｂ．２０１８：２０－３－１３ Ｓｈｉｇｅｈａｒｕ Ｇ．Ｙａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２０１７ Ｆｅｂ；９（２）：１６８－１７９
上記した通り、多能性幹細胞から膵臓β細胞を分化誘導するための培養方法は報告されているが、細胞治療製剤としての治療効果の観点から、分化誘導効率を、より向上させ、膵臓β細胞としての細胞の品質を高める必要がある。
従って、本発明は、多能性幹細胞から分化誘導された原始腸管細胞から膵臓β細胞を製造する方法であって、前記原始腸管細胞から効率的に膵臓β細胞を製造でき、得られた膵臓β細胞が高い品質を有することを可能とするような上記方法を提供することを解決すべき課題とした。本発明はさらに、上記の膵臓β細胞の製造方法において製造される膵臓前駆細胞（ＰＰ）、膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）および膵臓β細胞を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、多能性幹細胞から分化誘導された原始腸管細胞（ＰＧＴ）を、それぞれ所定の条件下で培養することにより、後前腸細胞（ＰＦＧ）、膵臓前駆細胞（ＰＰ）及び膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）を経て膵臓β細胞へと分化誘導することができ、この膵臓β細胞が糖尿病モデルマウスにおいて優れた血糖値正常化作用を示すことを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。
すなわち、本明細書によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞ （ａ）多能性幹細胞から分化誘導された原始腸管細胞（ＰＧＴ）を、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化剤の存在下において培養することにより後前腸細胞（ＰＦＧ）を製造する工程：
（ｂ）前記の後前腸細胞（ＰＦＧ）を、レチノイン酸又はそのアナログの存在下において培養することにより膵臓前駆細胞（ＰＰ）を製造する工程：
（ｃ）前記の膵臓前駆細胞（ＰＰ）を、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤及びＲＯＣＫシグナル阻害剤の存在下において培養することにより膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）を製造する工程：及び
（ｄ）前記の膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）をインスリン受容体シグナル活性化剤、トランスフェリン及び亜セレン酸の存在下において培養することにより膵臓β細胞を製造する工程：
を含む、膵臓β細胞の製造方法。
＜１－１＞ （ａ）多能性幹細胞から分化誘導された原始腸管細胞（ＰＧＴ）を、後前腸細胞（ＰＦＧ）への分化誘導に適した培養条件下、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化剤の存在下において培養することにより後前腸細胞（ＰＦＧ）を製造する工程：
（ｂ）前記の後前腸細胞（ＰＦＧ）を、膵臓前駆細胞（ＰＰ）への分化誘導に適した培養条件下、レチノイン酸又はそのアナログの存在下において培養することにより膵臓前駆細胞（ＰＰ）を製造する工程：
（ｃ）前記の膵臓前駆細胞（ＰＰ）を、膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）への分化誘導に適した培養条件下、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤及びＲＯＣＫシグナル阻害剤の存在下において培養することにより膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）を製造する工程：及び
（ｄ）前記の膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）を、膵臓β細胞への分化誘導に適した培養条件下、インスリン受容体シグナル活性化剤、トランスフェリン及び亜セレン酸の存在下において培養することにより膵臓β細胞を製造する工程：
を含む、膵臓β細胞の製造方法。
＜２＞ 多能性幹細胞から分化誘導された原始腸管細胞（ＰＧＴ）を、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化剤の存在下において培養する工程が、ＦＧＦ２の非存在下である、＜１＞に記載の膵臓β細胞の製造方法。
＜３＞ 膵臓前駆細胞（ＰＰ）を、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤及びＲＯＣＫシグナル阻害剤の存在下において培養する工程が、ニコチンアミドを含む培地において培養する工程である、＜１＞又は＜２＞に記載の膵臓β細胞の製造方法。
＜４＞ 膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）をインスリン受容体シグナル活性化剤、トランスフェリン及び亜セレン酸の存在下において培養する工程が、ＦＧＦ２の非存在下である、＜１＞から＜３＞のいずれか一に記載の膵臓β細胞の製造方法。
＜５＞多能性幹細胞から分化誘導された原始腸管細胞（ＰＧＴ）が、多能性幹細胞を内胚葉系細胞に分化誘導できる条件下で培養する工程、および前記内胚葉系細胞から原始腸管細胞（ＰＧＴ）に分化誘導できる条件下で培養する工程により得られる細胞である、＜１＞から＜４＞の何れか一に記載の方法。
＜６＞ 多能性幹細胞を内胚葉系細胞に分化誘導できる条件下で培養する工程が、多能性幹細胞を、ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地で培養した後、ＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地で培養する工程である、＜５＞に記載の方法。
＜７＞ 内胚葉系細胞を原始腸管細胞（ＰＧＴ）に分化誘導できる条件下で培養する工程が、内胚葉系細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤の非存在下において培養する工程である、＜５＞又は＜６＞に記載の方法。
＜８＞ 多能性幹細胞から分化誘導された原始腸管細胞（ＰＧＴ）を、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化剤の存在下において培養する工程が、ＴＧＦ－βシグナル阻害剤の非存在下である、＜１＞から＜７＞のいずれか一に記載の膵臓β細胞の製造方法。
＜９＞ 多能性幹細胞から分化誘導された原始腸管細胞（ＰＧＴ）を、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化剤の存在下において培養する工程が、ＦＧＦ受容体シグナル活性化剤及びインスリン受容体シグナル活性化剤の少なくとも一つの存在下である、＜１＞から＜８＞のいずれか一に記載の膵臓β細胞の製造方法。
＜１０＞ 多能性幹細胞から分化誘導された原始腸管細胞（ＰＧＴ）を、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化剤の存在下において培養する工程が、ＦＧＦ７及びインスリンの少なくとも一つの存在下である、＜１＞から＜９＞のいずれか一に記載の膵臓β細胞の製造方法。
＜１１＞ 後前腸細胞（ＰＦＧ）を、レチノイン酸又はそのアナログの存在下において培養する工程が、ＦＧＦ受容体シグナル活性化剤、インスリン受容体シグナル活性化剤、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤、ＰＫＣ活性化剤、ＨＨシグナル阻害剤及びＴＧＦ－β受容体シグナル阻害剤の少なくとも一つの存在下である、＜１＞から＜１０＞のいずれか一に記載の膵臓β細胞の製造方法。
＜１２＞ 後前腸細胞（ＰＦＧ）を、レチノイン酸又はそのアナログの存在下において培養する工程が、ＦＧＦ１０、インスリン、ＩＬＶ、ＳＡＮＴ１及びＲｅｐＳｏｘの少なくとも一つの存在下である、＜１＞から＜１１＞のいずれか一に記載の膵臓β細胞の製造方法。
＜１３＞ 後前腸細胞（ＰＦＧ）を、レチノイン酸又はそのアナログの存在下において培養する工程が、さらに、亜鉛及びＬＤＮから選択される少なくとも一の存在下である、＜１＞から＜１２＞のいずれか一に記載の膵臓β細胞の製造方法。
＜１４＞ 膵臓前駆細胞（ＰＰ）を、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤及びＲＯＣＫシグナル阻害剤の存在下において培養する工程が、ＥＧＦ受容体シグナル活性化剤、インスリン受容体シグナル活性化剤、ＧＬＰ－1 （Ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ－１）受容体シグナル活性化剤、ＨＨシグナル阻害剤、ＴＧＦ－β受容体シグナル阻害剤、増殖因子安定化剤、及びニコチンアミドから選択される少なくとも一の存在下である、＜１＞から＜１３＞のいずれか一に記載の膵臓β細胞の製造方法。
＜１５＞ 膵臓前駆細胞（ＰＰ）を、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤及びＲＯＣＫシグナル阻害剤の存在下において培養する工程が、ＥＧＦ、インスリン、Ｅｘｅｎｄｉｎ４、ＳＡＮＴ１、ＲｅｐＳｏｘ、ヘパリン、及びニコチンアミドから選択される少なくとも一の存在下である、＜１＞から＜１４＞のいずれか一に記載の膵臓β細胞の製造方法。
方法。
＜１６＞ 膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）をインスリン受容体シグナル活性化剤、トランスフェリン及び亜セレン酸の存在下において培養する工程が、ＴＧＦ－βスーパーファミリーシグナル活性化剤、ＧＬＰ－１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ－１）受容体シグナル活性化剤、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、Ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ活性化剤（細胞内のｃＡＭＰ濃度を向上させる物質）、ＴＧＦ－β受容体シグナル阻害剤、増殖因子安定化剤、及びニコチンアミドから選択される少なくとも一の存在下である、＜１＞から＜１５＞のいずれか一に記載の膵臓β細胞の製造方法。
＜１７＞ 膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）をインスリン受容体シグナル活性化剤、トランスフェリン及び亜セレン酸の存在下において培養する工程が、ＢＭＰ４、Ｅｘｅｎｄｉｎ４、ＨＧＦ、ＩＧＦ－１、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ、ＲｅｐＳｏｘ、ヘパリン、及びニコチンアミドから選択される少なくとも一の存在下である、＜１＞から＜１６＞のいずれか一に記載の膵臓β細胞の製造方法。
＜１８＞ 骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤が、ドルソモルフィン（Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）またはＬＤＮ１９３１８９である、＜１＞から＜１７＞のいずれか一に記載の膵臓β細胞の製造方法。
＜１９＞ レチノイン酸又はそのアナログが、ＥＣ２３である、＜１＞から＜１８＞のいずれか一に記載の膵臓β細胞の製造方法。
＜２０＞ Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤が、ジベンズアゼピン（ＤＢＺ）であり、ＲＯＣＫシグナル阻害剤が、Ｙ２７６３２である、＜１＞～＜１９＞のいずれか一に記載の膵臓β細胞の製造方法。
＜２１＞ （ａ）多能性幹細胞から分化誘導された原始腸管細胞（ＰＧＴ）を、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化剤の非存在下において培養することにより後前腸細胞（ＰＦＧ）を製造する工程；及び
（ｂ）前記の後前腸細胞（ＰＦＧ）を、レチノイン酸又はそのアナログの存在下において培養する工程；
を含む方法によって製造された膵臓前駆細胞（ＰＰ）と比較して、ＧＮＡＳ遺伝子及び／又はＧＣＫ遺伝子のいずれかの遺伝子発現が向上、及び／又はＣＤ４４遺伝子の発現が減少している、膵臓前駆細胞（ＰＰ）。
＜２２＞ （ａ）多能性幹細胞から分化誘導された原始腸管細胞（ＰＧＴ）を、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化剤の非存在下において培養することにより後前腸細胞（ＰＦＧ）を製造する工程；
（ｂ）前記の後前腸細胞（ＰＦＧ）を、レチノイン酸又はそのアナログの存在下において培養することにより膵臓前駆細胞（ＰＰ）を製造する工程；及び
（ｃ）前記の膵臓前駆細胞（ＰＰ）を、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤及びＲＯＣＫシグナル阻害剤の非存在下において培養する工程；
を含む方法によって製造された膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）と比較して、ＬＩＧ１遺伝子の発現が減少している膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）。
＜２３＞ （ａ）多能性幹細胞から分化誘導された原始腸管細胞（ＰＧＴ）を、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化剤の非存在下において培養することにより後前腸細胞（ＰＦＧ）を製造する工程；
（ｂ）前記の後前腸細胞（ＰＦＧ）を、レチノイン酸又はそのアナログの存在下において培養することにより膵臓前駆細胞（ＰＰ）を製造する工程；
（ｃ）前記の膵臓前駆細胞（ＰＰ）を、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤及びＲＯＣＫシグナル阻害剤の非存在下において培養することにより膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）を製造する工程；及び
（ｄ）前記の膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）をインスリン受容体シグナル活性化剤及びトランスフェリンの存在下において培養する工程；
を含む方法によって製造された膵臓β細胞と比較して、ＡＤＣＹ１遺伝子、ＡＤＣＹ２遺伝子、ＰＬＣＢ４遺伝子からなる群より選択される少なくとも１以上の遺伝子の発現が向上しているか、及び／又はＳＭＡＤ９遺伝子の発現が減少している、膵臓β細胞。
＜２４＞
膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）をインスリン受容体シグナル活性化剤及びトランスフェリンの存在下において培養する工程が、亜セレン酸を含む培地において培養する工程である、＜２３＞に記載の膵臓β細胞。
本発明による膵臓β細胞の製造方法を利用することにより、優れた血糖値正常化作用を示す膵臓β細胞を多能性幹細胞由来の原始腸管細胞（ＰＧＴ）から製造することが可能になる。また、本発明により製造された膵臓β細胞は、優れた血糖値正常化作用を示し、高品質な細胞治療製剤として有用である。
図１は、ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導した膵臓β細胞における膵臓β細胞マーカー遺伝子（ＮＫＸ６．１）の発現を解析した結果を示す。 図２は、糖尿病モデルマウスへの細胞移植実験における血中ヒトｃ－Ｐｅｐｔｉｄｅ濃度の測定結果を示す。 図３は、糖尿病モデルマウスへの細胞移植実験における随時血糖値の測定結果を示す。 図４は、ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導した膵臓前駆細胞（ＰＰ）におけるＧＮＡＳ遺伝子、ＧＣＫ遺伝子およびＣＤ４４遺伝子の発現を解析した結果を示す。 図５は、ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導した膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）におけるＬＩＧ１遺伝子の発現を解析した結果を示す。 図６は、ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導した膵臓β細胞におけるＡＤＣＹ１遺伝子、ＡＤＣＹ２遺伝子、ＰＬＣＢ４遺伝子およびＳＭＡＤ９遺伝子の発現を解析した結果を示す。
以下、本発明の実施形態について具体的に説明するが、下記の説明は本発明の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が下記の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も本発明の範囲に含まれる。
［用語の説明］
本発明において、「阻害剤の非存在下において」とは、「当該阻害剤を添加していない培地において」を意味する。
本発明の培地に関して、「を添加していない」という用語は、培養物又は馴化培地において添加していないと特定されたタンパク質、ペプチド及び化合物等の因子を外因的に加えないことを指す。なお、培養物又は馴化培地において添加していないと特定されたタンパク質、ペプチド及び化合物等の因子が培養の連続的な操作により持ち込んでいる場合は、１％未満（体積／体積）、０．５％（体積／体積）未満、０．１％（体積／体積）未満、０．０５％（体積／体積）未満、０．０１％（体積／体積）未満、０．００１％（体積／体積）未満になるように調整する。
遺伝子発現量に関して、「が向上している」という用語は、比較対象となる細胞集団における特定の遺伝子発現量よりも遺伝子の発現が増加していることを指し、比較対象となる細胞集団に対して、１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．４倍以上、１．５倍以上、１．６倍以上、１．７倍以上、１．８倍以上、１．９倍以上、２．０倍以上、２．１倍以上、２．２倍以上、２．３倍以上、２．４倍以上、２．５倍以上、２．６倍以上、２．７倍以上、２．８倍以上、２．９倍以上、３．０倍以上、３．１倍以上、３．２倍以上、３．３倍以上、３．４倍以上、３．５倍以上、３．６倍以上、３．７倍以上、３．８倍以上、３．９倍以上、４．０倍以上、４．１倍以上、４．２倍以上、４．３倍以上、４．４倍以上、４．５倍以上、４．６倍以上、４．７倍以上、４．８倍以上、４．９倍以上、５．０倍以上、５．１倍以上、５．２倍以上、５．３倍以上、５．４倍以上、５．５倍以上、５．６倍以上、５．７倍以上、５．８倍以上、５．９倍以上、６．０倍以上、６．１倍以上、６．２倍以上、６．３倍以上、６．４倍以上、６．５倍以上、６．６倍以上、６．７倍以上、６．８倍以上、６．９倍以上、７．０倍以上、７．１倍以上、７．２倍以上、７．３倍以上、７．４倍以上、７．５倍以上、７．６倍以上、７．７倍以上、７．８倍以上、７．９倍以上、８．０倍以上、８．１倍以上、８．２倍以上、８．３倍以上、８．４倍以上、８．５倍以上、８．６倍以上、８．７倍以上、８．８倍以上、８．９倍以上、９．０倍以上、９．１倍以上、９．２倍以上、９．３倍以上、９．４倍以上、９．５倍以上、９．６倍以上、９．７倍以上、９．８倍以上、９．９倍以上、１０．０倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、９０倍以上、１００倍以上、２５０倍以上、５００倍以上、７５０倍以上、１０００倍以上、５０００倍以上、１００００倍以上である。
遺伝子発現量に関して、「が減少している」という用語は、比較対象となる細胞集団における特定の遺伝子発現量よりも遺伝子の発現が減少していることを指し、比較対象となる細胞集団に対して、１．１倍以下、１．２倍以下、１．３倍以下、１．４倍以下、１．５倍以下、１．６倍以下、１．７倍以下、１．８倍以下、１．９倍以下、２．０倍以下、２．１倍以下、２．２倍以下、２．３倍以下、２．４倍以下、２．５倍以下、２．６倍以下、２．７倍以下、２．８倍以下、２．９倍以下、３．０倍以下、３．１倍以下、３．２倍以下、３．３倍以下、３．４倍以下、３．５倍以下、３．６倍以下、３．７倍以下、３．８倍以下、３．９倍以下、４．０倍以下、４．１倍以下、４．２倍以下、４．３倍以下、４．４倍以下、４．５倍以下、４．６倍以下、４．７倍以下、４．８倍以下、４．９倍以下、５．０倍以下、５．１倍以下、５．２倍以下、５．３倍以下、５．４倍以下、５．５倍以下、５．６倍以下、５．７倍以下、５．８倍以下、５．９倍以下、６．０倍以下、６．１倍以下、６．２倍以下、６．３倍以下、６．４倍以下、６．５倍以下、６．６倍以下、６．７倍以下、６．８倍以下、６．９倍以下、７．０倍以下、７．１倍以下、７．２倍以下、７．３倍以下、７．４倍以下、７．５倍以下、７．６倍以下、７．７倍以下、７．８倍以下、７．９倍以下、８．０倍以下、８．１倍以下、８．２倍以下、８．３倍以下、８．４倍以下、８．５倍以下、８．６倍以下、８．７倍以下、８．８倍以下、８．９倍以下、９．０倍以下、９．１倍以下、９．２倍以下、９．３倍以下、９．４倍以下、９．５倍以下、９．６倍以下、９．７倍以下、９．８倍以下、９．９倍以下、１０．０倍以下、２０倍以下、３０倍以下、４０倍以下、５０倍以下、６０倍以下、７０倍以下、８０倍以下、９０倍以下、１００倍以下、２５０倍以下、５００倍以下、７５０倍以下、１０００倍以下、５０００倍以下、１００００倍以下である。
＜凝集体＞
本発明の凝集体に関して、「凝集塊」、「クラスター」または「スフェロイド」という用語に言い換えて使用することができ、単細胞に解離していない一群の細胞の集合体を一般的に指す。
＜多能性幹細胞＞
本発明における多能性幹細胞とは、生体を構成する全てまたは複数の種類の細胞に分化することができる多分化能（多能性）を有する細胞であって、適切な条件下のインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での培養において多能性を維持したまま無限に増殖を続けることができる細胞をいう。具体的には胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胎児の始原生殖細胞由来の多能性幹細胞（ＥＧ細胞：Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９８，９５：１３７２６－３１）、精巣由来の多能性幹細胞（ＧＳ細胞：Ｎａｔｕｒｅ．２００８，４５６：３４４－９）、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳ細胞）、体性幹細胞（組織幹細胞）などが挙げられる。多能性幹細胞は、好ましくは、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞であり、より好ましくはｉＰＳ細胞である。なお、「胚（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ）」とは、配偶子融合によって導出された胚に加えて、体細胞核移植によって、導出された胚も指す。
ＥＳ細胞としては、任意の温血動物、好ましくは哺乳動物に由来する細胞を使用できる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、又はヒトが挙げられる。好ましくはヒトに由来する細胞を使用できる。
ＥＳ細胞の具体例としては、着床以前の初期胚を培養することによって樹立した哺乳動物等のＥＳ細胞、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立したＥＳ細胞、及びこれらのＥＳ細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて改変したＥＳ細胞が挙げられる。各ＥＳ細胞は当分野で通常実施されている方法や、公知文献に従って調製することができる。 マウスのＥＳ細胞は、１９８１年にエバンスら（Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１５４－６）や、マーチンら（Ｍａｒｔｉｎ ＧＲ．ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ７８：７６３４－８）によって樹立されている。 ヒトのＥＳ細胞は、１９９８年にトムソンら（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８２：１１４５－７）によって樹立されており、ＷｉＣｅｌｌ研究施設（ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｉｃｅｌｌ．ｏｒｇ／、マジソン、ウイスコンシン州、米国）、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）、京都大学などから入手可能であり、例えばＣｅｌｌａｒｔｉｓ社（ウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌａｒｔｉｓ．ｃｏｍ／、スウェーデン）から購入可能である。
人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、体細胞を初期化することによって得られる多能性を有する細胞である。ｉＰＳ細胞の作製は、京都大学の山中伸弥教授らのグループ、マサチューセッツ工科大学のルドルフ・ヤニッシュ(Ｒｕｄｏｌｆ Ｊａｅｎｉｓｃｈ)らのグループ、ウイスコンシン大学のジェームス・トムソン（Ｊａｍｅｓ Ｔｈｏｍｓｏｎ）らのグループ、ハーバード大学のコンラッド・ホッケドリンガー（Ｋｏｎｒａｄ Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ）らのグループなどを含む複数のグループが成功している。例えば、国際公開ＷＯ２００７／０６９６６６号公報には、Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子及びＭｙｃファミリー遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子、並びにＯｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子及びＭｙｃファミリー遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子が記載されており、さらに体細胞に上記核初期化因子を接触させる工程を含む、体細胞の核初期化により誘導多能性幹細胞を製造する方法が記載されている。
ｉＰＳ細胞の製造に用いる体細胞の種類は特に限定されず、任意の体細胞を用いることができる。即ち、体細胞とは、生体を構成する細胞の内生殖細胞以外の全ての細胞を包含し、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。体細胞の由来は、哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類、両生類の何れでもよく特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（例えば、マウスなどのげっ歯類、又はヒトなどの霊長類）であり、特に好ましくはマウス又はヒトである。また、ヒトの体細胞を用いる場合、胎児、新生児又は成人の何れの体細胞を用いてもよい。体細胞の具体例としては、例えば、線維芽細胞（例えば、皮膚線維芽細胞）、上皮細胞（例えば、胃上皮細胞、肝上皮細胞、肺胞上皮細胞）、内皮細胞（例えば血管、リンパ管）、神経細胞（例えば、ニューロン、グリア細胞）、膵臓細胞、白血球細胞（Ｂ細胞、Ｔ細胞等）、骨髄細胞、筋肉細胞（例えば、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞）、肝実質細胞、非肝実質細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、歯周組織を構成する細胞（例えば、歯根膜細胞、セメント芽細胞、歯肉線維芽細胞、骨芽細胞）、腎臓・眼・耳を構成する細胞などが挙げられる。
ｉＰＳ細胞は、所定の培養条件下（例えば、ＥＳ細胞を培養する条件下）において長期にわたって自己複製能を有し、また所定の分化誘導条件下において外胚葉系細胞、中胚葉系細胞又は内胚葉系細胞への何れにも多分化能を有する幹細胞である。また、ｉＰＳ細胞はマウスなどの試験動物に移植した場合にテラトーマを形成する能力を有する幹細胞でもよい。
体細胞からｉＰＳ細胞を製造するためには、まず、少なくとも１種類以上の初期化遺伝子を体細胞に導入する。初期化遺伝子とは、体細胞を初期化してｉＰＳ細胞とする作用を有する初期化因子をコードする遺伝子である。初期化遺伝子の組み合わせの具体例としては、以下の組み合わせをあげることができるが、これらに限定されるものではない。
（ｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子
（ｉｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子
（ｉｉｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０ ｌａｒｇｅＴ遺伝子
（ｉｖ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子
上記以外にも、導入遺伝子をさらに減らした方法（Ｎａｔｕｒｅ．２００８ Ｊｕｌ ３１；４５４（７２０４）：６４６－５０）、低分子化合物を利用した方法（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２００９ Ｊａｎ ９；４（１）：１６－９、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２００９ Ｎｏｖ ６；５（５）：４９１－５０３）、遺伝子の代わりに転写因子タンパク質を利用した方法（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２００９ Ｍａｙ ８；４（５）：３８１－４）などが報告されており、いずれの方法で製造されたｉＰＳ細胞でもよい。
初期化因子の細胞への導入形態は特に限定されないが、例えば、プラスミドを用いた遺伝子導入、合成ＲＮＡの導入、タンパク質として直接導入などが挙げられる。また、ｍｉｃｒｏＲＮＡやＲＮＡ、低分子化合物等を用いた方法で作製されたｉＰＳ細胞を用いてもよい。ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞を始めとする多能性幹細胞は、市販品又は分譲を受けた細胞を用いてもよいし、新たに作製したものを用いてもよい。
ｉＰＳ細胞として、例えば２５３Ｇ１株、２５３Ｇ４株、２０１Ｂ６株、２０１Ｂ７株、４０９Ｂ２株、４５４Ｅ２株、６０６Ａ１株、６１０Ｂ１株、６４８Ａ１株、１２０１Ｃ１株、１２０５Ｄ１株、１２１０Ｂ２株、１２３１Ａ３株、１３８３Ｄ２株、１３８３Ｄ６株、ｉＰＳ－ＴＩＧ１２０－３ｆ７株、ｉＰＳ－ＴＩＧ１２０－４ｆ１株、ｉＰＳ－ＴＩＧ１１４－４ｆ１株、ＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株、１５Ｍ６３株、１５Ｍ６６株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１Ａ株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－２Ａ株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１２Ａ株、Ｎｉｐｓ－Ｂ２株、ＴｋＤＮ４－Ｍ株、ＴｋＤＡ３－１株、ＴｋＤＡ３－２株、ＴｋＤＡ３－４株、ＴｋＤＡ３－５株、ＴｋＤＡ３－９株、ＴｋＤＡ３－２０株、ｈｉＰＳＣ ３８－２株、ＭＳＣ－ｉＰＳＣ１株、ＢＪ－ｉＰＳＣ１株等を使用することができる。
ＥＳ細胞として、例えばＫｈＥＳ－１株、ＫｈＥＳ－２株、ＫｈＥＳ―３株、ＫｈＥＳ－４株、ＫｈＥＳ－５株、ＳＥＥＳ１株、ＳＥＥＳ２株、ＳＥＥＳ３株、ＨＵＥＳ８株、ＣｙＴ４９株、Ｈ１株、Ｈ９株、ＨＳ－１８１株等を使用することができる。新たに作製された臨床グレードのｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞を用いてもよい。
＜内胚葉系細胞＞
内胚葉系細胞は、消化管、肺、甲状腺、膵臓、肝臓などの器官の組織、消化管に開口する分泌腺の細胞、腹膜、胸膜、喉頭、耳管、気管、気管支、尿路（膀胱、尿道の大部分、尿管の一部）などへと分化する能力を有し、一般的に、胚体内胚葉（ＤＥ）と言われることがある。多能性幹細胞から内胚葉系細胞への分化は、内胚葉系細胞に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。内胚葉系細胞に特異的な遺伝子としては、例えば、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４、ＡＦＰ、ＧＡＴＡ４、ＥＯＭＥＳ等を挙げることができる。なお、本明細書中において、内胚葉系細胞を胚体内胚葉と言い換えて使用することがある。
＜原始腸管細胞＞
原始腸管細胞は、前腸、中腸、後腸を形成する。中腸は卵黄嚢とつながっており、後腸からは胚体外の尿膜が分岐している。また、前腸からは呼吸器系の咽頭も形成される。
胃や腸のように腸管がそのまま分化するものと、肝臓、胆嚢、膵臓、（脾臓（リンパ性器官））などのように腸管から出芽するような形で形成されるものがある。内胚葉系細胞から原始腸管細胞への分化は、原始腸管細胞に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。始腸管細胞に特異的な遺伝子としては、例えば、ＨＮＦ－１β、ＨＮＦ－４αなどを挙げることができる。
＜後前腸細胞（ＰＦＧ）＞
原始腸管細胞から後前腸細胞への分化は、後前腸細胞に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。後前腸細胞に特異的な遺伝子としてはＰＤＸ１、ＨＮＦ６などを挙げることができる。
本発明のＰＦＧ細胞において、パスウェイ名「Maturity onset diabetes of the young」に関する遺伝子発現が向上していることが好ましい。例えば、表１に示した遺伝子の発現量が既存の方法で調製したＰＦＧ細胞と比較して向上していることが好ましい。また、パスウェイ名「Viral myocarditis」および「Proteoglycans in cancer」に関する遺伝子発現が減少していることが好ましい。例えば、表２および３に示した遺伝子の発現量が既存の方法で調製したＰＦＧ細胞と比較して減少していることが好ましい。
＜膵臓前駆細胞（ＰＰ）＞
膵臓前駆細胞は後前腸細胞から分化した細胞であり、膵臓の外分泌系細胞および内分泌系細胞へと分化することができる細胞である。後前腸細胞から膵臓前駆細胞への分化は、膵臓前駆細胞に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。膵臓前駆細胞に特異的な遺伝子としてはＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１などを挙げることができる。
本発明のＰＰ細胞において、パスウェイ名「Maturity onset diabetes of the young」、パスウェイ名「Morphine addiction」、パスウェイ名「GABAergic synapse」、パスウェイ名「Dopaminergic synapse」、パスウェイ名「Retrograde endocannabinoid signaling」、パスウェイ名「Serotonergic synapse」、パスウェイ名「Insulin secretion」、パスウェイ名「Glutamatergic synapse」、パスウェイ名「Circadian entrainment」、パスウェイ名「Amphetamine addiction」、パスウェイ名「Neuroactive ligand-receptor interaction」、パスウェイ名「cAMP signaling pathway」、およびパスウェイ名「Alcoholism」に関する遺伝子発現が向上していることが好ましい。例えば、表４から１６に示した遺伝子の発現量が既存の方法で調製したＰＰ細胞と比較して向上していることが好ましい。また、パスウェイ名「p53 signaling pathway」、パスウェイ名「Focal adhesion」、パスウェイ名「PI3K-Akt signaling pathway」、パスウェイ名「ECM-receptor interaction」、およびパスウェイ名「Graft-versus-host disease」に関する遺伝子発現が減少していることが好ましい。例えば、表１７から２１に示した遺伝子の発現量が既存の方法で調製したＰＰ細胞と比較して減少していることが好ましい。
本発明の膵臓前駆細胞（ＰＰ）としては、後記する参考例１の方法によって製造された膵臓前駆細胞（ＰＰ）と比較して、ＧＮＡＳ遺伝子及び／又はＧＣＫ遺伝子のいずれかの遺伝子の発現が向上しているか、及び／又はＣＤ４４遺伝子の発現が減少している細胞を挙げることができる。
＜膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）＞
膵内分泌前駆細胞は、膵臓前駆細胞から分化した細胞であり、膵臓の内分泌系細胞（α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞、ＰＰ細胞等）へと分化することができる細胞である。膵内分泌前駆細胞への分化は、膵内分泌前駆細胞に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。膵内分泌前駆細胞に特異的な遺伝子としてはＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＮｅｕｒｏＧ３、ＮｅｕｒｏＤ１などを挙げることができる。
本発明のＥＰ細胞において、パスウェイ名「Insulin secretion」、パスウェイ名「Maturity onset diabetes of the young」、パスウェイ名「GABAergic synapse」、パスウェイ名「Dopaminergic synapse」、パスウェイ名「Synaptic vesicle cycle」、パスウェイ名「Glutamatergic synapse」、パスウェイ名「Retrograde endocannabinoid signaling」、パスウェイ名「cAMP signaling pathway」、パスウェイ名「Circadian entrainment」、パスウェイ名「Serotonergic synapse」、パスウェイ名「Alcoholism」、パスウェイ名「Morphine addiction」に関する遺伝子発現が向上していることが好ましい。例えば、表２２から３４に示した遺伝子の発現量が既存の方法で調製したＥＰ細胞と比較して向上していることが好ましい。また、パスウェイ名「DNA replication」、パスウェイ名「Cell cycle」、パスウェイ名「Pathways in cancer」、パスウェイ名「Mismatch repair」、パスウェイ名「PI3K-Akt signaling pathway」、パスウェイ名「p53 signaling pathway」、パスウェイ名「Fanconi anemia pathway」、パスウェイ名「Homologous recombination」、パスウェイ名「ECM-receptor interaction」、パスウェイ名「Small cell lung cancer」に関する遺伝子発現が減少していることが好ましい。例えば、表３４から４３に示した遺伝子の発現量が既存の方法で調製したＥＰ細胞と比較して減少していることが好ましい。
本発明の膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）としては、参考例１の方法によって製造された膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）と比較して、ＬＩＧ１遺伝子の発現が減少している細胞を挙げることができる。
＜膵臓β細胞＞
膵臓β細胞は、膵内分泌前駆細胞から分化した細胞であり、インスリンを分泌する細胞である。膵内分泌前駆細胞から膵臓β細胞への分化は、膵臓β細胞に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。膵臓β細胞に特異的な遺伝子としては、インスリン、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、ＰＤＸ１などを挙げることができる。
本発明の膵臓β細胞において、パスウェイ名「Dopaminergic synapse」、パスウェイ名「Insulin secretion」、パスウェイ名「Synaptic vesicle cycle」、パスウェイ名「GABAergic synapse」、パスウェイ名「Synaptic vesicle cycle」、パスウェイ名「GABAergic synapse」、パスウェイ名「Glutamatergic synapse」、パスウェイ名「Retrograde endocannabinoid signaling」、パスウェイ名「Circadian entrainment」、パスウェイ名「Alcoholism」、パスウェイ名「Serotonergic synapse」、パスウェイ名「Cholinergic synapse」、パスウェイ名「Morphine addiction」、パスウェイ名「Adrenergic signaling in cardiomyocytes」、パスウェイ名「Maturity onset diabetes of the young」に関する遺伝子発現が向上していることが好ましい。例えば、表４５から５６に示した遺伝子の発現量が既存の方法で調製した膵臓β細胞と比較して向上していることが好ましい。また、パスウェイ名「Cell cycle」、パスウェイ名「ECM-receptor interaction」、パスウェイ名「PI3K-Akt signaling pathway」、パスウェイ名「Proteoglycans in cancer」、パスウェイ名「Pathways in cancer」、パスウェイ名「Focal adhesion」、パスウェイ名「DNA replication」、パスウェイ名「TGF-beta signaling pathway」に関する遺伝子発現が減少していることが好ましい。例えば、表５７から６４に示した遺伝子の発現量が既存の方法で調製した膵臓β細胞と比較して減少していることが好ましい。
なお、パスウェイの詳細についてはＫＥＧＧ ｐａｔｈｗａｙ（http://www.genome.jp/kegg/pathway.html）で参照することができる。
本発明の膵臓β細胞としては、参考例１の方法によって製造された膵臓β細胞と比較して、ＡＤＣＹ１遺伝子、ＡＤＣＹ２遺伝子、ＰＬＣＢ４遺伝子からなる群より選択される少なくとも１以上の遺伝子の発現が向上しているか、及び／又はＳＭＡＤ９遺伝子の発現が減少している細胞を挙げることができる。
＜シグナル及び因子＞
（プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化剤）
ＰＫＣは、細胞増殖や細胞死、遺伝子の転写および翻訳、細胞の形態、細胞間接触など、多くの細胞機能の制御に関わるタンパク質である。ＰＫＣは、基質タンパク質のセリン残基およびスレオニン残基のヒドロキシル基をリン酸化するタンパク質キナーゼの一種であり、少なくとも １０種類以上のアイソザイムが存在する。アイソザイムはその構造、活性化の機序、生理活性によって在来型（Ｃｌａｓｓｉｃａｌ）、新型（Ｎｏｖｅｌ）、非典型（Ａｔｙｐｉｃａｌ）の 3 種類のサブファミリーに分類される。在来型 PKC アイソザイム（α、βI、βII、γ）はその活性化のために、ジアシルグリセロール（Ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ； ＤＡＧ）と Ｃａ２＋ を必要とします。ＤＡＧ は、ホスファチジルイノシトール ４，５－二リン酸（ＰＩＰ２）がホスフォリパーゼC（ＰＬＣ）により加水分解されることによって、イノシトール １，４，５－三リン酸（ＩＰ３）と共に生じる。ＩＰ３ が細胞内で拡散し、小胞体上にある IP3 感受性 Ca2+ チャネルに結合すると、Ｃａ２＋ イオンが細胞質に放出されます。これらの Ｃａ２＋ イオンが ＰＫＣ と結合することで ＰＫＣ は細胞膜へと移動する。そこで ＰＫＣ は Ｃ１ ドメインを介し ＤＡＧ と相互作用する。すると ＰＫＣ は、その触媒ドメインから調節領域が外れるような構造変化を起こして活性型となる。新型 ＰＫＣ アイソザイム（δ、ε、θ、η）は ＤＡＧ のみによって活性化される。これは、新型 ＰＫＣ アイソザイムが有する Ｃ１ ドメインの ＤＡＧ に対するアフィニティーが、在来型のものより極めて高いことに起因している。非典型 ＰＫＣ アイソザイム（ζ、Mζ、ι/λ）は、その活性化に ＤＡＧ も Ｃａ２＋ も必要とせず、様々な脂質代謝産物のセカンドメッセンジャーによって活性化される（Khalil, 2010; Wu-Zhang and Newton, 2013; Mochly-Rosen et al., 2012）。
ＰＫＣ活性化剤とは、上記ＰＫＣアイソザイムのうち少なくとも１つ以上のＰＫＣアイソザイムを活性化する物質であればよい。
ＰＫＣ活性化剤としては、特に限定しないが、例えばｉｎｄｏｌａｃｔａｍ Ｖ（ＩＬＶ）、Ｏｋａｄａｉｃ Ａｃｉｄ、Ｐｈｏｒｂｏｌ－１２－Ｍｙｒｉｓｔａｔｅ－１３－Ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ）、Ｂｒｙｏｓｔａｔｉｎ １、１ａｌｐｈａ，２５－Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ Ｄ３、Ｐｒｏｓｔｒａｔｉｎ、１，２－Ｄｉｏｃｔａｎｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１－Ｏｌｅｏｙｌ－２－ａｃｅｔｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏｌ （ＯＡＧ）、Ｏｌｅｉｃ Ａｃｉｄ、Ｉｎｇｅｎｏｌ ３－ａｎｇｅｌａｔｅ、ＤＣＰ－ＬＡ、ＰＩＰ２、Ｐｈｏｒｂｏｌ－１２,１３－ｄｉｂｕｔｙｒａｔｅ、８（Ｓ）－ＨＥＴＥ、およびこれらの誘導体などを用いることができる。
（Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤）
Ｎｏｔｃｈシグナルは多くの細胞の生存、増殖、および分化に深く関わっており、サイトカイン／チロシンキナーゼ、Ｗｎｔ、ＴＧＦ－βファミリー／Ｓｍａｄ、ヘッジホッグ、およびインテグリンと共に、個体発生にも関与している。Ｎｏｔｃｈシグナルの異常は、発がん、がん細胞の増殖、およびがん幹細胞の生存にも関わっている。Ｎｏｔｃｈ受容体は、1回膜貫通型タンパク質で、機能的な細胞外ドメイン (ＮＥＣＤ)、膜貫通ドメイン (ＴＭ）、及び細胞内ドメイン (ＮＩＣＤ) からなる。シグナルを受容する細胞内における小胞体 (ＥＲ) 及びゴルジ体におけるＮｏｔｃｈ受容体のプロセッシングの結果、切断が起こり (Ｓ１切断)、さらに、糖鎖が結合し、カルシウムイオン (Ｃａ２＋) によって安定化されたヘテロ二量体を生じるが、これは膜に挿入されたＴＭ－ＮＩＣＤと非共有結合で接着したＮＥＣＤから構成される。このプロセッシングを受けた受容体は、次に細胞膜へ移行し、リガンドを結合できるようになる。哺乳類では、シグナルを送る側の細胞に存在するＤｅｌｔａ様 (ＤＬＬ１、ＤＬＬ３、ＤＬＬ４) 及びＪａｇｇｅｄ (ＪＡＧ１、ＪＡＧ２) ファミリーのメンバーが、Ｎｏｔｃｈシグナル受容体に対するリガンドとして働く。リガンドが結合すると直ちに、ＮＥＣＤはＴＡＣＥ (ＡＤＡＭ金属プロテアーゼＴＮＦ－α変換酵素) によってＴＭ－ＮＩＣＤドメインから切り離される (Ｓ２切断)。このＮＥＣＤはリガンドに結合した状態を維持し、この複合体はシグナル送信側の細胞内でエンドサイト―シスとリサイクリング／分解を受ける。シグナル受信側の細胞内では、γ-セクレターゼ (アルツハイマー病にも関与する) がＴＭからＮＩＣＤを遊離する (Ｓ３切断) が、これによってＮＩＣＤは核内へ移行し、そこでＣＳＬ (ＣＢＦ１／Ｓｕ(Ｈ)／Ｌａｇ－１) ファミリー転写因子複合体と会合するが、その結果引き続いて、基準的なNotchの標的遺伝子であるＭｙｃ、ｐ２１及びＨＥＳファミリーメンバーの活性化が起こる。
Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤としては、ＩＭＲ－１、ＦＬＩ－０６、Ｃｒｅｎｉｇａｃｅｓｔａｔ （ＬＹ３０３９４７８）などが挙げられる。また、ＤＢＺ（ｄｉｂｅｎｚａｚｅｐｉｎｅ）、ＤＡＰＴ（Ｎ－［Ｎ－（３，５－Ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ａｌａｎｙｌ）］－（Ｓ）－ｐｈｅｎｙｌｇｌｙｃｉｎｅ ｔ－ｂｕｔｙｌ ｅｓｔｅｒ）、ＬＹ４１１５７５、Ｄｉｂｅｎｚａｚｅｐｉｎｅ （ＹＯ－０１０２７）、ＲＯ４９２９０９７、Ｎｉｒｏｇａｃｅｓｔａｔ （ＰＦ－０３０８４０１４, ＰＦ－３０８４０１４）、Ｌ－６８５，４５８ 、Ｓｅｍａｇａｃｅｓｔａｔ （ＬＹ４５０１３９）、Ａｖａｇａｃｅｓｔａｔ （ＢＭＳ－７０８１６３）、ＭＫ－０７５２等のγ―セクレターゼ阻害剤もＮｏｔｃｈシグナル阻害剤として用いることができる。
（ＲＯＣＫシグナル阻害剤）
ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ ｆｏｒｍｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ/Ｒｈｏ結合キナーゼ）はミオシン軽鎖とミオシン軽鎖脱リン酸化酵素のリン酸化を介してミオシン軽鎖を活性型構造に変化させる。さらに、ＲＯＣＫは、ＬＩＭキナーゼのリン酸化を介してアクチン脱重合因子であるコフィリンを不活化し、アクチン脱重合を抑制する。その他、ＲＯＣＫは多数の基質をリン酸化して、細胞運動、細胞極性、細胞接着、細胞分裂、アポトーシス、転写制御など多様な生命機能に関わっている。ＲＯＣＫシグナル阻害剤としては、Ｙ２７６３２、Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ、Ｆａｓｕｄｉｌ （ＨＡ－１０７７） ＨＣｌ、ＧＳＫ４２９２８６Ａ、ＲＫＩ－１４４７、ＧＳＫ１８０７３６Ａ （ＧＳＫ１８０７３６）、Ｈｙｄｒｏｘｙｆａｓｕｄｉｌ （ＨＡ－１１００） ＨＣｌ、Ｙ－３９９８３ ＨＣｌ、Ｎｅｔａｒｓｕｄｉｌ （ＡＲ－１３３２４） ２ＨＣｌ、ＧＳＫ２６９９６２Ａ ＨＣｌ、Ｒｉｐａｓｕｄｉｌ （Ｋ－１１５） ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ ｄｉｈｙｄｒａｔｅ、ＫＤ０２５ （ＳＬｘ－２１１９）、ＡＴ１３１４８などを挙げることができる。
（骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤）
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナルとは、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）リガンドにより媒介されるシグナルであり、脊椎動物において多様な役割を果たす。胚形成の間に、背腹軸は、リガンド、受容体、補助受容体及び可溶性アンタゴニストの協調発現により形成されるＢＭＰシグナル伝達の勾配によって確立される。ＢＭＰは、原腸形成、中胚葉誘導、器官形成及び軟骨性骨形成の重要なレギューレータであり、多能性幹細胞集団の運命を制御する。
ＢＭＰ受容体はＩ型受容体（ａｃｔｉｖｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ；ＡＬＫ－１、ＡＬＫ－２、ＡＬＫ－３またはＡＬＫ－６）とＩＩ型受容体（ＡｃｔＲＩＩ、ＡｃｔＲＩＩＢまたはＢＭＰＲＩＩ）の複合体から成り、活性化したＩ型受容体キナーゼはＲ－Ｓｍａｄ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄＳｍａｄ）タンパク質のＣ末端に存在する２個のセリン残基をリン酸化する。リガンド（ＢＭＰ）が受容体に結合することによりリン酸化を受けるＲ－Ｓｍａｄ（Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ８）をＢＲ－Ｓｍａｄ（ＢＭＰＲ－Ｓｍａｄ）と呼ばれており、リン酸化を受けた２分子のＲ－ＳｍａｄはＳｍａｄ４とヘテロ三量体を形成し，核内に移行することで標的遺伝子の転写を調節する。
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤とは、リガンド（ＢＭＰ－４など）による受容体への結合から始まるＢＭＰシグナルを阻害する物質であれば特に限定しないが、好ましくはＡＬＫ－１、ＡＬＫ－２、ＡＬＫ－３およびＡＬＫ－６の少なくとも１つを阻害する物質である。また、リガンドが受容体へと結合するのを妨げる物質（アンタゴニスト抗体など）をＢＭＰシグナル阻害剤として用いることができる。
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤としては、特に限定しないが、Ｉ型受容体（ＡＬＫ－１、ＡＬＫ－２、ＡＬＫ－３またはＡＬＫ－６）に作用する阻害剤などは効果的にＢＭＰシグナルを阻害することができ、例えばドルソモルフィン（Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）、ＬＤＮ１９３１８９、ＬＤＮ－２１４１１７、ＬＤＮ－２１２８５４、Ｋ０２２８８、ＭＬ３４７などを挙げることができる。
（ヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル阻害剤）
ヘッジホッグ（ＨＨ；Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）シグナルは胎児期の細胞増殖因子，形態形成因子として知られている。加えて，成体でのホメオスタシスや組織再生，組織幹細胞の制御にも機能し得ることが示されている。胎児期のＨＨシグナルの異常は，全前脳症などの先天性疾患の原因となり，成体でのＨＨシグナルの持続的活性は皮膚基底細胞癌や髄芽細胞腫を含む様々な癌に関連すると言われている。ヘッジホッグシグナルのリガンドとしては、哺乳類では3種類のＨＨリガンド（ＳＨＨ；Ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ, ＩＨＨ；Ｉｎｄｉａｎ ｈｅｄｇｅｈｏｇ, ＤＨＨ；Ｄｅｓｅｒｔ ｈｅｄｇｅｈｏｇ）が知られている。ヘッジホッグリガンドが無い状態 (オフ状態) では、ヘッジホッグファミリーリガンドに対する受容体のＰａｔｃｈｅｄは、Ｇタンパク質共役型膜貫通タンパク質であるＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（Ｓｍｏ）に正常に結合し、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄの膜への会合を阻害する。このオフ状態では、ＳｕＦｕ及び (脊椎動物におけるＫｉｆ７である) ＣＯＳ２が、第一繊毛において、微小管に結合している転写因子のＧｌｉの集団を隔離する。ＧｌｉはＰＫＡ、ＣＫＩ及びＧＳＫ－３によってリン酸化され、β－ＴｒＣＰを介したＧｌｉ活性化因子 (哺乳動物におけるＧｌｉ１及びＧｌｉ２) の分解が起こるか、あるいは、保存された経路においてＧｌｉの抑制因子 (ショウジョウバエにおけるＧｌｉ３あるいは短縮されたＣｉ) を産生するが、これがヘッジホッグの標的遺伝子の抑制につながる。活性化状態 (オン状態) では、ヘッジホッグリガンドがＰａｔｃｈｅｄに結合することによってβ－Ａｒｒｅｓｔｉｎを介したＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄの第一繊毛への移動が可能になるが、そこでは、これに会合していたＧタンパク質活性が、Ｇｌｉに作用する抑制性のキナーゼ活性を阻害するため、Ｇｌｉを自由に核に移行させて、サイクリンＤ (Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ)、サイクリンＥ (Ｃｙｃｌｉｎ Ｅ)、Ｍｙｃ及びＰａｔｃｈｅｄなどのヘッジホッグ標的遺伝子を活性化する。
ヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル阻害剤とは、上記ヘッジホッグシグナルを阻害する物質であれば特に限定しないが、例えば、Ｓｍｏに作用してシグナルを阻害する物質などがある。また、ヘッジホッグリガンドがＰａｔｃｈｅｄ等の受容体に結合するのを阻害するアンタゴニスト抗体などもヘッジホッグシグナル阻害剤として使用することができる。
ヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル阻害剤としては、特に限定しないが、例えばＳＡＮＴ１、Ｃｙｃｌｏｐａｍｉｎｅ、Ｓｏｎｉｄｅｇｉｂ、ＰＦ－５２７４８５７、Ｇｌａｓｄｅｇｉｂ、Ｔａｌａｄｅｇｉｂ、ＢＭＳ－８３３９２３、ＭＫ－４１０１、Ｖｉｓｍｏｄｅｇｉｂ、ＧＡＮＴ６１、Ｊｅｒｖｉｎｅ、ＨＰＩ－４などを挙げることができる。例えばＳＡＮＴ－１は細胞透過性の強力なＨＨシグナルのアンタゴニストであり、Ｓｍｏレセプターに直接結合することにより阻害するため、好適に用いることができる。
（ＴＧＦ－β受容体シグナル阻害剤）
ＴＧＦ－β受容体（ＴＧＦβ）シグナルとは、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）のリガンドが関与するシグナル伝達であり、例えば、細胞の成長、増殖、分化及びアポトーシスなどの細胞プロセスにおいて中心的な役割を担う。ＴＧＦβシグナルは、Ｉ型受容体（ＡＬＫ５）を漸増してリン酸化する、ＩＩ型受容体（セリン／トレオニンキナーゼ）へのＴＧＦβリガンドの結合が関与する。次いで、このＩ型受容体が、ＳＭＡＤ４に結合する受容体制御ＳＭＡＤ（Ｒ－ＳＭＡＤ；例えば、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ８、又はＳＭＡＤ９）をリン酸化し、次いで、このＳＭＡＤ複合体が転写調節において役割を果たす核に入る。
ＴＧＦβシグナル阻害剤とは、上記ＴＧＦβシグナルを阻害する物質であれば特に限定しないが、例えば、ＡＬＫ５に作用してそのリン酸化を阻害するような物質である。また、ＴＧＦβが受容体へと結合するのを阻害するアンタゴニスト抗体などもＴＧＦβシグナル阻害剤として用いることができる。
ＴＧＦβシグナル阻害剤としては、特に限定しないが、例えばＡＬＫ５に作用するような阻害剤は好適に用いることができる。例えばＳＢ４３１５４２、Ｇａｌｕｎｉｓｅｒｔｉｂ、ＬＹ２１０９７６１、ＳＢ５２５３３４、ＳＢ５０５１２４、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ３６４９４７、ＲｅｐＳｏｘ、ＳＤ－２０８、Ｖａｃｔｏｓｅｒｔｉｂ、ＬＤＮ－２１２８５４などを挙げることができる。
（レチノイン酸）
レチノイン酸とは、はビタミンAのカルボン酸誘導体で、ａｌｌ－ｔｒａｎｓ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ （ｔｒｅｔｉｎｏｉｎトレチノインとも呼ばれる)、９－ｃｉｓ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ （ａｌｉｔｒｅｔｉｎｏｉｎ とも呼ばれる; ９シスレチノイン酸)、１３－ｃｉｓ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ （ｉｓｏｔｒｅｔｉｎｏｉｎとも呼ばれる; １３シスレチノイン酸)などいくつかの立体異性体が存在する。レチノイン酸は核内受容体の一つであるレチノイン酸受容体（ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ； ＲＡＲ）の天然リガンドとして、生体内におけるレチノイド、カロテノイドの生理活性の主役を担っている。ＲＡＲはレチノイドＸ受容体（ｒｅｔｉｎｏｉｄ Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒ； ＲＸＲ：リガンドは９ｃｉｓレチノイン酸）とヘテロ二量体を形成し、リガンド誘導性転写因子として、特異的な標的遺伝子群のプロモーターに結合することで標的遺伝子群の発現を正負に転写レベルで制御することが知られている。ビタミンAとは全く類似しない化学構造を持つ化合物でも、これら特異的な受容体と非常に高い結合親和性を示す合成化合物を含めて、レチノイドと称されている。
（レチノイン酸のアナログ）
レチノイン酸（ＲＡ）は、細胞分化、細胞分裂周期の停止、またはアポトーシスを促進する作用があることが知られており、多能性幹細胞の分化誘導時にも用いられている。そのレチノイン酸のアナログとしては、核内受容体であるレチノイン酸受容体（Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＰＡＲ）、rｅｔｉｎｏｉｄ Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＲＸＲ））を活性化する物質であれば特に限定しないが、例えば、ＥＣ２３、ＥＣ１９、ＡＣ ２６１０６６、ＡＣ ５５６４９、Ａｄａｐａｌｅｎｅ、ＡＭ ５８０、ＡＭ ８０、ＢＭＳ ７５３、ＢＭＳ ９６１、ＣＤ １５３０、ＣＤ ２３１４、ＣＤ ４３７、Ｃｈ ５５、Ｉｓｏｔｒｅｔｉｎｏｉｎ、Ｔａｚａｒｏｔｅｎｅ、ＴＴＮＰＢなどを挙げることができる。ＥＣ２３はレチノイン酸に比べて光による劣化の影響が少なく、安定な化合物であるため好適に用いることができる。
（インスリン受容体シグナル活性化剤）
インスリン受容体は、肝臓、骨格筋、脂肪組織、神経細胞などに発現しており、インスリン受容体シグナルは、神経回路網の形成、維持、修復に関与することが知られている。インスリンはグルコースや脂質代謝のような重要なエネルギー機能を調節する重要なホルモンであり、インスリン受容体チロシンキナーゼ（ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＩＲ）を活性化し、ＩＲＳ（ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）ファミリーのような異なる基質アダプターのリクルートとリン酸化を行う。チロシンリン酸化されたＩＲＳは多くのシグナルパートナーに結合部位を呈示する。中でも、ＰＩ３Ｋ （ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３－ｋｉｎａｓｅ）は、主に Ａｋｔ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｂ）とＰＫＣ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ）の活性化を介してインスリン機能において重要な役割を果たす。活性化されたＡｋｔは、ＧＳＫ－３（ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ）の阻害を介したｇｌｙｃｏｇｅｎ合成、ｍＴＯＲ（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｒａｐａ）と下流因子を介したタンパク合成、プロアポトーシス因子（Ｂａｄ、転写因子：Ｆｏｒｋｈｅａｄファミリー、ＧＳＫ－３等）の阻害による細胞生存などを引き起こす。インスリン受容体シグナルはまた、細胞の成長と細胞分裂効果を持ち、それらの効果にはＲａｓ／ＭＡＰＫ経路の活性化と同様に、主にＡｋｔカスケードも関与している。
インスリン受容体シグナル活性化剤とは、上記インスリン受容体シグナルを活性化する物質であれば特に限定しないが、例えば、インスリン受容体並びにＩＧＦ受容体に結合するリガンドが挙げられる。また、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＣまたはＡｋｔを直接または間接的に活性化するような物質であってもよい。
インスリン受容体シグナル活性化剤としては、好ましくはインスリン、インスリン様成長因子－１（ＩＧＦ－１）、ＩＧＦ－２などを挙げることができる。また、ＰＩ３Ｋ活性化剤であるＰＩ３－ｋｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社、製品番号：ｓｃ－３０３６）、７４０ Ｙ－Ｐなどもインスリン受容体シグナル活性化剤として用いることができる。
（ＦＧＦ受容体シグナル活性化剤）
ＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）受容体シグナルは、ＦＧＦ受容体を介するシグナル伝達であり、ＲＡＳ－ＭＡＰＫ経路やＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ経路に流れ、細胞増殖、細胞死、血管新生、上皮間葉転換（ＥＭＴ）などの様々な細胞機能に関与しており、また、胚発生 および生後の骨格系の発生の制御において重要な役割を果たす。
ＦＧＦ受容体シグナル活性化剤とは、上記のようなシグナル伝達を活性化するような物質であればよく、ＦＧＦ受容体に結合するリガンド（ＦＧＦファミリー）がその代表例である。またＲＡＳ－ＭＡＰＫ経路やＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ経路の活性化剤もＦＧＦ受容体シグナル活性化剤として用いることができる。
ＦＧＦ受容体シグナル活性化剤としては、ＦＧＦファミリーを挙げることができ、好ましくは、ＦＧＦ７、ＦＧＦ３、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ２２、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５，ＦＧＦ６、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ２０，ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２３など挙げられ、特に好ましくはＦＧＦ７である。
（ＥＧＦ受容体シグナル活性化剤）
上皮成長因子（ＥＧＦ）は５３アミノ酸残基及び３つの分子内ジスルフィド結合から成る６０４５ Ｄａのタンパク質であり、細胞表面に存在する上皮成長因子受容体 （ＥＧＦＲ） にリガンドとして結合し、細胞の成長と増殖の調節に重要な役割をする。ＥＧＦ受容体シグナル活性化剤としては、ＥＧＦなどを挙げることができる。
（ＧＬＰ－１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ－１）受容体シグナル活性化剤）
生体で分泌されるインクレチンホルモンであるグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）は、ＧＬＰ－１受容体を介して作用することによりｃＡＭＰを増加させ、グルコース濃度依存的にインスリン分泌を促進させる。ＧＬＰ－１受容体シグナル活性化剤としては、ＧＬＰ－１、Ｅｘｅｎｄｉｎ４などが挙げられる。
（増殖因子安定化剤）
増殖因子安定化剤とは、増殖因子の安定化作用を有する物質を意味する。増殖因子の安定化とは、増殖因子の分解を抑制する作用、増殖因子の細胞外への分泌を促進する作用など、細胞外の増殖因子の量の減少を抑制する作用である限りにおいて特に限定はされない。増殖因子安定化剤としては、ヘパリン、ヘパラン硫酸などが挙げられる。
（肝細胞増殖因子）
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、生体内で組織再生や修復に関与するサイトカインの一種である。肝細胞増殖因子は、肝細胞以外にもさまざまな細胞に作用し、上皮細胞や内皮細胞の増殖を促進することや、神経細胞に対し神経栄養因子として働くことが知られている。
（インスリン様増殖因子）
インスリン様増殖因子は、プロインスリンに似た構造を持つポリペプチドであり、細胞増殖や生存、遊走やコラーゲンを含む細胞外マトリクスの産生に関与することが知られている。インスリン様増殖因子は、腫瘍細胞を含む種々の細胞型に対して、インスリン様増殖因子受容体－１（ＩＧＦＲ１）と称される共通の受容体に結合することにより細胞分裂促進活性を示す。インスリン様増殖因子としては、インスリン様増殖因子－Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）およびインスリン様増殖因子－ＩＩ（ＩＧＦ－ＩＩ）が挙げられる。
（Ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ活性化剤（細胞内のｃＡＭＰ濃度を向上させる物質））
アデニレートシクラーゼは、ＡＴＰを３’，５’－環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）とピロリン酸への変換を触媒する酵素である。ｃＡＭＰはセカンドメッセンジャーと呼ばれる、真核生物のシグナル伝達に重要な分子である。Ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ活性化剤としては、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ、ＮＫＨ４７７などが挙げられる。
（ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤）
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナルとは、細胞増殖の調節、分化、広汎な生物学的システムでの発達において大変重要な役割を演じている。一般的に、リガンドにより惹起されるセリン／スレオニン受容体キナーゼの多量体形成と、骨形態発生蛋白（ＢＭＰ）経路についてはＳｍａｄ１／５／８ といった細胞内シグナル分子のリン酸化によって、また、ＴＧＦβ／アクチビン経路ならびにＮＯＤＡＬ／アクチビン経路についてはＳｍａｄ２/３のリン酸化によってシグナルは開始される。活性化受容体によるＳｍａｄｓのカルボキシル基末端のリン酸化は、それらと共通のシグナルトランスデューサーであるＳｍａｄ４とのパートナーを形成し、核への移行を促す。活性化Ｓｍａｄｓは、転写因子とパートナーを組むことで様々な生物学的効果を制御し、細胞の状態に特異的な転写調節を行うが知られている。
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル経路に関与する遺伝子としては、Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ遺伝子、ＢＭＰ２遺伝子、ＢＭＰ３遺伝子、ＢＭＰ４遺伝子、ＢＭＰ５遺伝子、ＢＭＰ６遺伝子、ＢＭＰ７遺伝子、ＢＭＰ８遺伝子、ＢＭＰ１３遺伝子、ＧＤＦ２（Ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２）遺伝子、ＧＤＦ３遺伝子、ＧＤＦ５遺伝子、ＧＤＦ６遺伝子、ＧＤＦ７遺伝子、ＧＤＦ８遺伝子、ＧＤＦ１１遺伝子、ＴＧＦ－β１遺伝子、ＴＧＦ－β２遺伝子、ＴＧＦ－β３遺伝子、ＡＭＨ（ａｎｔｉ－ｍｕｌｌｅｒｉａｎ ｈｏｒｍｏｎｅ）遺伝子、ｐａｉｒｅｄ ｌｉｋｅ ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ ２（ＰＩＴＸ２）遺伝子、及びＮＯＤＡＬ遺伝子などが挙げられる。
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤としては、骨形態発生タンパク質（ＢＭＰ）経路、ＴＧＦβ／アクチビン経路、及び／又はＮＯＤＡＬ／アクチビン経路のシグナルを活性化する物質であれば特に限定されないが、例えば、アクチビンＡ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８、ＢＭＰ１３、ＧＤＦ２、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＡＭＨ、ＰＩＴＸ２、及び／又はＮＯＤＡＬなどを用いることができる。特に、ＴＧＦβ／アクチビン経路のシグナルを活性化する物質を好適に用いることができ、具体的には、アクチビンＡ、及びＢＭＰ４からなる群から選択される少なくとも１種類を使用することが好ましく、アクチビンＡ及びＢＭＰ４の全てを使用することが特に好ましい。
（ＷＮＴシグナル活性化剤）
ＷＮＴシグナルとは、β－カテニンの核移行を促し、転写因子としての機能を発揮する一連の作用をいう。ＷＮＴシグナルは細胞間相互作用に起因し、例えば、ある細胞から分泌されたＷＮＴ３Ａというタンパクがさらに別の細胞に作用し、細胞内のβ－カテニンが核移行し、転写因子として作用する一連の流れが含まれる。一連の流れは上皮間葉相互作用を例とする器官構築の最初の現象を引き起こす。ＷＮＴシグナルはβ－カテニン経路、ＰＣＰ経路、Ｃａ２＋経路の三つの経路を活性化することにより、細胞の増殖や分化、器官形成や初期発生時の細胞運動など各種細胞機能を制御することで知られる。
ＷＮＴシグナル経路に関与する遺伝子としては、ＷＮＴ３Ａ遺伝子などがある。
ＷＮＴシグナル活性化剤としては、特に限定されないが、グリコーゲンシンターゼキナーゼ－３（ＧＳＫ－３）の阻害活性を示すものであればいかなるものでもよく、例えばビス－インドロ（インジルビン）化合物（ＢＩＯ）（（２’Ｚ，３’Ｅ）－６－ブロモインジルビン－３’－オキシム）、そのアセトキシム類似体ＢＩＯ－アセトキシム（２’Ｚ，３’Ｅ）－６－ブロモインジルビン－３’－アセトキシム）、チアジアゾリジン（ＴＤＺＤ）類似体（４－ベンジル－２－メチル－１，２，４－チアジアゾリジン－３，５－ジオン）、オキソチアジアゾリジン―３－チオン類似体（２，４－ジベンジル－５－オキソチアジアゾリジン－３－チオン）、チエニルα－クロロメチルケトン化合物（２－クロロ－１－（４，４－ジブロモ－チオフェン－２－イル）－エタノン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物（α－４－ジブロモアセトフェノン）、チアゾール含有尿素化合物（Ｎ－（４－メトキシベンジル）－Ｎ’－（５－ニトロ－１，３－チアゾール－２－イル）ユレア）やＧＳＫ－３βペプチド阻害剤、例えばＨ－ＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ－ＮＨ２、などを使用することができ、特に好ましくは、ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＡＳ：２５２９１７－０６－９）を使用することができる。ＷＮＴ３Ａも好適に用いることができる。
［１］原始腸管細胞（ＰＧＴ）から膵臓β腸細胞を製造する方法
本発明による膵臓β細胞の製造方法は、多能性幹細胞から分化誘導された原始腸管細胞（Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ Ｇｕｔ Ｔｕｂｅ：ＰＧＴ）から後前腸細胞（Ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ Ｆｏｒｅｇｕｔ：ＰＦＧ）を製造する工程、後前腸細胞（ＰＦＧ）から膵臓前駆細胞（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ：ＰＰ）を製造する工程、膵臓前駆細胞（ＰＰ）から膵内分泌前駆細胞（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ：ＥＰ）を製造する工程、膵内分泌前駆細胞から膵臓β細胞（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃβｃｅｌｌ：β）を製造する工程を含む方法である。
多能性幹細胞から分化誘導された原始腸管細胞（ＰＧＴ）から膵臓β細胞を製造する方法について説明する。
本発明における工程（ａ）においては、多能性幹細胞から分化誘導された原始腸管細胞（ＰＧＴ）をプロテインキナーゼ（ＰＫＣ）活性化剤の存在下において培養することにより後前腸細胞（ＰＦＧ）を製造する。
本発明における工程（ｂ）においては、後前腸細胞（ＰＦＧ）を、レチノイン酸又はそのアナログの存在下において培養することにより膵臓前駆細胞（ＰＰ）を製造する。
本発明における工程（ｃ）においては、膵臓前駆細胞（ＰＰ）を、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤及びＲＯＣＫシグナル阻害剤の存在下において培養することにより膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）を製造する。
本発明における工程（ｄ）においては、膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）をインスリン受容体シグナル活性化剤、トランスフェリン及び亜セレン酸の存在下において培養することにより膵臓β細胞を製造する。以下、それぞれの工程について説明する。なお、多能性幹細胞から原始腸管細胞への分化誘導については後記する。
＜培養条件＞
原始腸管細胞（ＰＧＴ）から膵臓β細胞への分化誘導時における細胞の培養は、接着培養、浮遊培養のいずれを用いても良いが、浮遊培養であることが好ましい。細胞はマイクロキャリア等に接着させて浮遊培養しても良いし、細胞のみで構成された細胞凝集塊の状態で浮遊培養しても良いし、細胞凝集塊の中にコラーゲン等の高分子が混在していても良く、形態は特に限定しない。
原始腸管細胞（ＰＧＴ）から膵臓β細胞への分化誘導における培養温度は、使用する細胞の培養に適した培養温度であれば、特に限定されないが、一般的には３０℃～４０℃であり、好ましくは約３７℃である。
ＣＯ２インキュベーターなどを利用して、約１～１０％、好ましくは５％のＣＯ２濃度雰囲気下で培養を行うことが好ましい。
＜培養期間＞
工程（ａ）の後前腸細胞（ＰＦＧ）への分化培養の培養期間は、後前腸細胞（ＰＦＧ）の細胞特性が呈する細胞型になっているのであれば特に限定されないが、例えば、２週間以内であればよく、より具体的には１日以上１０日以内であり、より好ましくは２日以上７日以内であり、さらに好ましくは３日以上５日以内であり、一例としては４日である。
工程（ｂ）の膵臓前駆細胞（ＰＰ）への分化培養の培養期間は、膵臓前駆細胞（ＰＰ）の細胞特性が呈する細胞型になっているのであれば特に限定されないが、例えば、２週間以内であればよく、より具体的には１日以上１０日以内であり、より好ましくは２日以上７日以内であり、さらに好ましくは２日以上４日以内であり、一例としては３日である。
工程（ｃ）の膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）への分化培養の培養期間は、膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）の細胞特性が呈する細胞型になっているのであれば特に限定されないが、例えば、２週間以内であればよく、より具体的には１日以上１０日以内であり、より好ましくは３日以上１０日以内であり、さらに好ましくは５日以上９日以内であり、一例としては７日である。
工程（ｄ）の膵臓β細胞への分化培養の培養期間は、膵臓β細胞の細胞特性が呈する細胞型になっているのであれば特に限定されないが、例えば、３週間以内であればよく、より具体的には３日以上２０日以内であり、より好ましくは５日以上１４日以内であり、さらに好ましくは７日以上１２日以内であり、一例としては１０日である。
＜培地＞
工程（ａ）～工程（ｄ）において使用する培地としては、細胞の種類に応じて、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ－１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、又はＥｓｓｅｎｔｉａｌ ６ＴＭ培地（Tｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等を用いることができる。上記培地はグルコースを含んでいてもよく、グルコース濃度は好ましくは１ｍＭ～１００ｍＭであり、より好ましくは２ｍＭ～５０ｍＭであり、さらに好ましくは５ｍＭ～３０ｍＭである。
培地にはさらに、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）が含まれていてもよい。好ましくはＢＳＡまたはＨＳＡに含まれる脂質が２ｍｇ／ｇ以下、遊離脂肪酸が０．２ｍｇ／ｇ以下である。
培地におけるＢＳＡの添加量の下限は、好ましくは０．０１％、より好ましくは０．０５％、より好ましくは０．１０％、より好ましくは０．１５％である。培地におけるＢＳＡの添加量の上限は、好ましくは１．００％、より好ましくは０．９０％、より好ましくは０．８０％、より好ましくは０．７０％、より好ましくは０．６０％、より好ましくは０．５０％、より好ましくは０．４０％、より好ましくは０．３０％、より好ましくは０．２５％であり、より好ましくは０．２０％であり、より好ましくは０．１５％である。
培地にはさらに、ペニシリンおよびストレプトマイシンなどの抗生物質が含まれていてもよい。例えば、培地には、０．１～２％（体積／体積）のペニシリン、０．１～２％（体積／体積）のストレプトマイシンを含めることができる。
培地にはＢ２７（登録商標）サプリメントが含まれていてもよい。
培地におけるＢ２７（登録商標）サプリメントの添加量の下限は、好ましくは０．０１％、より好ましくは０．１％、より好ましくは０．２％、より好ましくは０．３％、より好ましくは０．４％、より好ましくは０．５％、より好ましくは０．６％、より好ましくは０．７％、より好ましくは０．８％、より好ましくは０．９％である。培地におけるＢ２７（登録商標）サプリメントの添加量の上限は、好ましくは１０％、より好ましくは９％、より好ましくは８％、より好ましくは７％、より好ましくは６％、より好ましくは５％、より好ましくは４％、より好ましくは３％、より好ましくは２％、より好ましくは１％である。
培地には、インスリン、トランスフェリン及び亜セレン酸を含めることができる。インスリン、トランスフェリン及び亜セレン酸は、Ｂ２７サプリメントなど市販の混合物の形態で培地に含まれていてもよい。
培地におけるトランスフェリンの添加量の下限は、好ましくは０．００１ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．０１ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１．１ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１．２ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１．３ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１．４ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１．５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１．６ｍｇ／Ｌである。培地におけるトランスフェリンの添加量の上限は、好ましくは１０００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは５００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは９０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは８０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは７０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは６０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは５０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは４０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは３０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは９ｍｇ／Ｌ、より好ましくは８ｍｇ／Ｌ、より好ましくは７ｍｇ／Ｌ、より好ましくは６ｍｇ／Ｌ、より好ましくは５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは４ｍｇ／Ｌ、より好ましくは３ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２ｍｇ／Ｌである。
培地における亜セレン酸の添加量の下限は、好ましくは０．００１μｇ／Ｌ、より好ましくは０．０１μｇ／Ｌ、より好ましくは０．１μｇ／Ｌ、より好ましくは１μｇ／Ｌ、より好ましくは１．１μｇ／Ｌ、より好ましくは１．２μｇ／Ｌ、より好ましくは１．３μｇ／Ｌ、より好ましくは１．４μｇ／Ｌ、より好ましくは１．５μｇ／Ｌ、より好ましくは１．６μｇ／Ｌ、より好ましくは１．７μｇ／Ｌ、より好ましくは１．８μｇ／Ｌ、より好ましくは１．９μｇ／Ｌ、より好ましくは２μｇ／Ｌである。培地における亜セレン酸の添加量の上限は、好ましくは１０００μｇ／Ｌ、より好ましくは５００μｇ／Ｌ、より好ましくは１００μｇ／Ｌ、より好ましくは９０μｇ／Ｌ、より好ましくは８０μｇ／Ｌ、より好ましくは７０μｇ／Ｌ、より好ましくは６０μｇ／Ｌ、より好ましくは５０μｇ／Ｌ、より好ましくは４０μｇ／Ｌ、より好ましくは３０μｇ／Ｌ、より好ましくは２０μｇ／Ｌ、より好ましくは１０μｇ／Ｌ、より好ましくは９μｇ／Ｌ、より好ましくは８μｇ／Ｌ、より好ましくは７μｇ／Ｌである。
［２］原始腸管細胞から後前腸細胞への分化誘導に用いる分化誘導因子、及びその他の添加物
本発明における工程（ａ）においては、多能性幹細胞から分化誘導された原始腸管細胞（ＰＧＴ）を後前腸細胞（ＰＦＧ）への分化誘導に適した培養条件下、プロテインキナーゼ（ＰＫＣ）活性化剤の存在下において培養することにより後前腸細胞（ＰＦＧ）を製造する。
後前腸細胞（ＰＦＧ）への分化誘導に適した培養条件とは、多能性幹細胞から分化誘導された原始腸管細胞（ＰＧＴ）を後前腸細胞（ＰＦＧ）へ好適に分化誘導できる培養条件であれば、特に限定されない。
分化誘導培地としては、内胚葉系細胞を原始腸管細胞（ＰＧＴ）分化誘導させる培地であれば特に限定されるものではないが、一つの実施態様として、後述する分化誘導培地にて培養することが挙げられる。
前記工程（ａ）において使用する培地におけるＰＫＣ活性剤の含有量の下限は、好ましくは０．０１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．０２μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．０５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．２μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．３μｍｏＬ／Ｌである。培地におけるＰＫＣ活性剤の含有量の上限は、好ましくは１０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．８μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．４ｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．３μｍｏＬ／Ｌである。
前記工程（ａ）において使用する培地は、ヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル阻害剤（ＳＡＮＴ１等）を含んでいてもよい。
培地におけるＨＨシグナル阻害剤（ＳＡＮＴ１等）の添加量の下限は、好ましくは０．０１μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０２μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０３μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０５μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．１０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．１５μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．２０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．２５μｍｏｌ／Ｌである。培地におけるＨＨシグナル阻害剤（ＳＡＮＴ１等）の添加量の上限は、好ましくは５．０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは４．０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは３．０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは２．０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１．０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．８０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．７０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．６０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．５０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．４０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．３０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．３５μｍｏｌ／Ｌである。
工程（ａ）において使用する培地は、レチノイン酸のアナログ（ＥＣ２３等）を含んでいてもよい。
培地におけるレチノイン酸のアナログ（ＥＣ２３等）の添加量の下限は、好ましくは０．０１μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０２μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０３μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０５μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．１μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．２μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．３μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．４μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．５μｍｏｌ／Ｌである。培地におけるレチノイン酸のアナログ（ＥＣ２３等）の添加量の上限は、好ましくは５．０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは４．０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは３．０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは２．０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１．０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．９μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．８μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．７μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．６μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．５μｍｏｌ／Ｌである。
工程（ａ）において使用する培地には、ＮＥＡＡ（例えば、１×ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（ＮＥＡＡ；Ｗａｋｏ社）など）が含まれていてもよい。
培地におけるＮＥＡＡの含有量の下限は、好ましくは０．０５×ＮＥＡＡ、より好ましくは０．１×ＮＥＡＡ、より好ましくは０．５×ＮＥＡＡ、より好ましくは０．６×ＮＥＡＡ、より好ましくは０．７×ＮＥＡＡ、より好ましくは０．８×ＮＥＡＡ、より好ましくは０．９×ＮＥＡＡ、より好ましくは１×ＮＥＡＡである。培地におけるＮＥＡＡの含有量の上限は、好ましくは２０×ＮＥＡＡ、より好ましくは１５×ＮＥＡＡ、より好ましくは１０×ＮＥＡＡ、より好ましくは５×ＮＥＡＡ、より好ましくは４×ＮＥＡＡ、より好ましくは３×ＮＥＡＡ、より好ましくは２×ＮＥＡＡ、より好ましくは１×ＮＥＡＡである。
工程（ａ）における培地は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤を含む。
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤がドルソモルフィン（Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）である場合、培地におけるドルソモルフィンの含有量の下限は、好ましくは０．０１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．０５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．３μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．６μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．７μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．８μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．９μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１μｍｏＬ／Ｌである。培地におけるドルソモルフィンの含有量の上限は、好ましくは２０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは７μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは４μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは３μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは２μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１μｍｏＬ／Ｌである。
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤がＬＤＮ１９３１８９である場合、培地におけるＬＤＮ１９３１８９の含有量の下限は、好ましくは０．０１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．０２μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．０５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．２μｍｏＬ／Ｌである。培地におけるＬＤＮ１９３１８９の含有量の上限は、好ましくは１０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．８μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．４ｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．３μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．２μｍｏＬ／Ｌである。
工程（ａ）における培地は、ＦＧＦ受容体シグナル活性化剤を含んでいてもよい。特に好ましくは、ＦＧＦ７を含む。
前記工程（ａ）培地におけるＦＧＦ受容体シグナル活性化剤の添加量の下限は、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは４０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬである。培地におけるＦＧＦ受容体シグナル活性化剤の添加量の上限は、好ましくは５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは４００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは９０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは８０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは７０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは６０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬである。
［３］後前腸細胞（ＰＦＧ）から膵臓前駆細胞（ＰＰ）への分化誘導に用いる分化誘導因子、及びその他の添加物
本発明における工程（ｂ）においては、後前腸細胞（ＰＦＧ）を、膵臓前駆細胞（ＰＰ）への分化誘導に適した培養条件下、レチノイン酸又はそのアナログの存在下において培養することにより膵臓前駆細胞（ＰＰ）を製造する。
膵臓前駆細胞（ＰＰ）への分化誘導に適した培養条件とは、後前腸細胞（ＰＦＧ）を膵臓前駆細胞（ＰＰ）へ好適に分化誘導できる培養条件であれば、特に限定されない。
分化誘導培地としては、後前腸細胞（ＰＦＧ）を膵臓前駆細胞（ＰＰ）へ分化誘導させる培地であれば特に限定されるものではないが、一つの実施態様として、後述する分化誘導培地にて培養することが挙げられる。
前記工程（ｂ）においてしようする培地におけるレチノイン酸又はレチノイン酸のアナログ（ＥＣ２３等）の添加量の下限は、好ましくは０．０１μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０２μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０３μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０５μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．１μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．２μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．３μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．４μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．５μｍｏｌ／Ｌである。培地におけるレチノイン酸のアナログ（ＥＣ２３等）の添加量の上限は、好ましくは５．０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは４．０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは３．０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは２．０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１．０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．９μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．８μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．７μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．６μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．５μｍｏｌ／Ｌである。
工程（ｂ）において使用する培地は、ヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル阻害剤（ＳＡＮＴ１等）を含んでいてもよい。前記培地におけるヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル阻害剤（ＳＡＮＴ１等）の添加量については、上記の［２］に記載したとおりである。
また、工程（ｂ）において使用する培地には、ＮＥＡＡ（例えば、１×ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（ＮＥＡＡ；Ｗａｋｏ社）など）が含まれていてもよい。前記培地におけるＮＥＡＡの添加量については上記の［２］に記載したとおりである。
工程（ｂ）における培地は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤を含んでもよい。前記培地における骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤の添加量については上記の［２］に記載したとおりである。
工程（ｂ）における培地は、ＦＧＦ受容体シグナル活性化剤を含んでいてもよい。特に好ましくは、ＦＧＦ１０である。前記培地におけるＦＧＦ受容体シグナル活性化剤の添加量は上記の［２］に記載したとおりである。
工程（ｂ）における培地は、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化剤を含んでいてもよい。前記培地におけるプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化剤の添加量は上記の［２］に記載したとおりである。
工程（ｂ）における培地は、ＴＧＦ－β受容体シグナル阻害剤（ＲｅｐＳＯＸ等）を含んでいてもよい。
前記培地におけるＴＧＦ－β受容体シグナル阻害剤（ＲｅｐＳＯＸ等）の含有量の下限は、好ましくは０．１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは３μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは６μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは７μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは８μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは９μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１０μｍｏＬ／Ｌである。培地におけるＴＧＦ－β受容体シグナル阻害剤（ＲｅｐＳＯＸ等）の含有量の上限は、好ましくは１００μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは８０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは５０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは４０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは３０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは２０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１２μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１０μｍｏＬ／Ｌである。
工程（ｂ）における培地は、ＺｎＳＯ４を含んでいてもよい。
培地におけるＺｎＳＯ４の含有量の下限は、好ましくは０．１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは３μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは５μｍｏＬ／Ｌである。培地におけるＺｎＳＯ４の含有量の上限は、好ましくは１００μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは８０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは５０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは４０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは３０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは２０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１２μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは５μｍｏＬ／Ｌである。
［４］膵臓前駆細胞（ＰＰ）から膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）への分化誘導に用いる分化誘導因子、及びその他の添加物
本発明における工程（ｃ）においては、膵臓前駆細胞（ＰＰ）を、膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）への分化誘導に適した培養条件下、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤及びＲＯＣＫシグナル阻害剤の存在下において培養することにより膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）を製造する。
後前腸細胞（ＰＰ）を膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）へ好適に分化誘導できる培養条件であれば、特に限定されない。
分化誘導培地としては、後前腸細胞（ＰＰ）を膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）へ分化誘導させる培地であれば特に限定されるものではないが、一つの実施態様として、後述する分化誘導培地にて培養することが挙げられる。
前記工程（ｃ）培地におけるＮｏｔｃｈシグナル阻害剤（ＤＢＺ等）の添加量の下限は、好ましくは０．０１μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０２μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０３μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０５μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．１μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．２μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．３μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．４μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．５μｍｏｌ／Ｌである。培地におけるＮｏｔｃｈシグナル阻害剤（ＤＢＺ等）の添加量の上限は、好ましくは５．０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは４．０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは３．０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは２．０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１．０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．９μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．８μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．７μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．６μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．５μｍｏｌ／Ｌである。
工程（ｃ）において使用する培地は、ヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル阻害剤（ＳＡＮＴ１等）を含んでいてもよい。前記培地におけるヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル阻害剤（ＳＡＮＴ１等）の添加量については上記の［２］に記載したとおりである。
工程（ｃ）において使用する培地は、レチノイン酸のアナログ（ＥＣ２３等）を含んでいてもよい。前記培地におけるレチノイン酸のアナログの添加量については上記の［２］に記載のとおりである。
工程（ｃ）において使用する培地には、Ｌ－グルタミンが含まれていてもよい。
培地におけるＬ－グルタミンの含有量の下限は、好ましくは０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．７ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１．０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１．２ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１．５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは２．０ｍｍｏｌ／Ｌである。培地におけるＬ－グルタミンの含有量の上限は、好ましくは１００ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは５０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは４０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは３０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは２０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは９ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは８ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは７ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは６ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは４ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは３ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは２ｍｍｏｌ／Ｌである。
工程（ｃ）における培地は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤を含んでもよい。前記培地における骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤の添加量については上記の［２］に記載したとおりである。
工程（ｃ）における培地は、ＴＧＦ－β受容体シグナル阻害剤を含んでいてもよい。前記培地におけるＴＧＦ－β受容体シグナル阻害剤の添加量については上記の［２］に記載したとおりである。
工程（ｃ）における培地は、ＺｎＳＯ４を含んでいてもよい。前記培地におけるＺｎＳＯ４の添加量については上記の［３］に記載したとおりである。
工程（ｃ）における培地は、増殖因子安定化剤（ヘパリン等）を含んでいてもよい。
培地における増殖因子安定化剤（ヘパリン等）の添加量の下限は、好ましくは０．２ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは０．５ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは６ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは７ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは８ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは９ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬである。培地における増殖因子安定化剤（ヘパリン等）の添加量の上限は、好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは９０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは８０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは７０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは６０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは４０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬである。
工程（ｃ）における培地は、ニコチンアミドを含んでいてもよい。
培地におけるニコチンアミドの含有量の下限は、好ましくは０．１ｍｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．５ｍｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１ｍｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは３ｍｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは５ｍｍｏＬ／Ｌである。培地におけるニコチンアミドの上限は、好ましくは１００ｍｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは８０ｍｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは５０ｍｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは４０ｍｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは３０ｍｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは２０ｍｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１５ｍｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１２ｍｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１０ｍｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは５ｍｍｏＬ／Ｌである。
工程（ｃ）における培地は、ＥＧＦ受容体シグナル活性化剤（ＥＧＦ等）を含んでいてもよい。
培地におけるＥＧＦ受容体シグナル活性化剤（ＥＧＦ等）の添加量の下限は、好ましくは０．２ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは０．５ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは７ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１２ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１５ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１６ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１７ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１８ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１９ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２０ｎｇ／ｍＬである。培地におけるＥＧＦ受容体シグナル活性化剤（ＥＧＦ等）の添加量の上限は、好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは９０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは８０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは７０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは６０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは４０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２５ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２０ｎｇ／ｍＬである。
工程（ｃ）における培地は、ＲＯＣＫシグナル阻害剤（Ｙ２７６３２等）を含んでいてもよい。
培地におけるＲＯＣＫシグナル阻害剤（Ｙ２７６３２等）の含有量の下限は、好ましくは０．１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは３μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは６μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは７μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは８μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは９μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１０μｍｏＬ／Ｌである。培地におけるＲＯＣＫシグナル阻害剤（Ｙ２７６３２等）の含有量の上限は、好ましくは１００μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは８０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは５０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは４０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは３０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは２０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１２μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１０μｍｏＬ／Ｌである。
［５］膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）から膵臓β細胞への分化誘導に用いる分化誘導因子、及びその他の添加物
本発明における工程（ｄ）においては、膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）を、膵臓β細胞への分化誘導に適した条件下、インスリン受容体シグナル活性化剤、トランスフェリン及び亜セレン酸の存在下において培養することにより膵臓β細胞を製造する。
膵臓β細胞への分化誘導に適した培養条件とは、膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）を膵臓β細胞へ好適に分化誘導できる培養条件であれば、特に限定されない。
分化誘導培地としては、膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）を膵臓β細胞へ分化誘導させる培地であれば特に限定されるものではないが、一つの実施態様として、後述する分化誘導培地にて培養することが挙げられる。
前記培地におけるインスリン受容体シグナル活性化剤、トランスフェリン及び亜セレン酸の添加量については上記の＜培地＞に記載したとおりである。
工程（ｄ）における培地は、ＴＧＦ－β受容体シグナル阻害剤を含んでいてもよい。
前記培地におけるＴＧＦ－β受容体シグナル阻害剤の添加量については上記の［２］に記載したとおりである。
工程（ｄ）における培地は、ＺｎＳＯ４を含んでいてもよい。
前記培地におけるＺｎＳＯ４の添加量については上記の［３］に記載したとおりである。
工程（ｄ）における培地は、ＧＬＰ－１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ－１）受容体シグナル活性化剤（Ｅｘｅｎｄｉｎ４等）を含んでいてもよい。
前記培地におけるＧＬＰ－１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ－１）受容体シグナル活性化剤（Ｅｘｅｎｄｉｎ４等）の添加量の下限は、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは４０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬである。培地におけるＧＬＰ－１受容体シグナル活性化剤（Ｅｘｅｎｄｉｎ４等）の添加量の上限は、好ましくは５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは４００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは９０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは８０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは７０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは６０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬである。
工程（ｄ）における培地は、増殖因子安定化剤（ヘパリン等）を含んでいてもよい。
前記培地における増殖因子安定化剤（ヘパリン等）の添加量については上記の［４］に記載したとおりである。
工程（ｄ）における培地は、ニコチンアミドを含んでいてもよい。前記培地におけるニコチンアミドの添加量については上記の［４］に記載したとおりである。
工程（ｄ）における培地は、ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤（ＢＭＰ４等）を含んでいてもよい。
培地におけるＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤（ＢＭＰ４等）の添加量の下限は、好ましくは０．２ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは０．５ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは６ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは７ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは８ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは９ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬである。培地におけるＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤（ＢＭＰ４等）の添加量の上限は、好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは９０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは８０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは７０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは６０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは４０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬである。
工程（ｄ）における培地は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を含んでいてもよい。
培地における肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の添加量の下限は、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは４０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬである。培地における肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の添加量の上限は、好ましくは５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは４００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは９０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは８０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは７０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは６０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬである。
工程（ｄ）における培地は、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ１等）を含んでいてもよい。
培地におけるインスリン様増殖因子（ＩＧＦ１等）の添加量の下限は、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは４０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬである。培地におけるインスリン様増殖因子（ＩＧＦ１等）の添加量の上限は、好ましくは５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは４００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは９０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは８０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは７０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは６０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬである。
工程（ｄ）における培地は、Ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ活性化剤（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ等）を含んでいてもよい。
培地におけるＡｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ活性化剤（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ等）の含有量の下限は、好ましくは０．１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．３μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．７μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは２μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは３μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは４μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは５μｍｏＬ／Ｌである。培地におけるＡｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ活性化剤（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ等）の含有量の上限は、好ましくは１００μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは８０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは５０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは４０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは３０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは２０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは７μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは５μｍｏＬ／Ｌである。
［６］多能性幹細胞の維持培養
本発明の製造方法においては、多能性幹細胞から分化誘導された原始腸管細胞（ＰＧＴ）を使用する。
好ましくは、原始腸管細胞（ＰＧＴ）は、多能性幹細胞を内胚葉系細胞に分化誘導できる条件下で培養する工程、および前記内胚葉系細胞から原始腸管細胞（ＰＧＴ）に分化誘導できる条件下で培養する工程により得られる細胞である。
内胚葉系細胞への分化誘導を行う前の多能性幹細胞は、未分化維持培地を用いて未分化性を維持したものとすることが好ましい。未分化維持培地を用いて多能性幹細胞の未分化性を維持する培養のことを、多能性幹細胞の維持培養ともいう。
未分化維持培地は、多能性幹細胞の未分化性を維持できる培地であれば特に限定されないが、例えば、マウス胚性幹細胞及びマウス人工多能性幹細胞の未分化性を維持する性質を有していることが知られているｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒを含む培地や、ヒトｉＰＳの未分化性を維持する性質を有していることが知られているｂａｓｉｃ ＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）を含む培地等が挙げられる。例えば、ヒトｉＰＳ細胞培地（２０％Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ；Ｇｉｂｃｏ社）、１×ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（ＮＥＡＡ；Ｗａｋｏ社）、５５μｍｏｌ／Ｌ ２－メルカプトエタノール（２－ＭＥ；Ｇｉｂｃｏ社）、７．５ｎｇ／ｍＬ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ２（ＦＧＦ２；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、０．５ｘＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ａｎｄ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＰＳ；Ｗａｋｏ社）を含むＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２（Ｗａｋｏ社）、又はＥｓｓｅｎｔａｉｌ８培地（Tｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、ＳＴＥＭＰＲＯ（登録商標） ｈＥＳＣ ＳＦＭ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ｍＴｅＳＲ１（Ｖｅｒｉｔａｓ社）、ＴｅＳＲ２（Ｖｅｒｉｔａｓ社）、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）等を使用することができるが、特に限定されない。
多能性幹細胞の維持培養は、好適なフィーダー細胞（例えば、ＳＬ１０フィーダー細胞、ＳＮＬフィーダー細胞等）上において上記の未分化維持培地を用いて行うことができる。また、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン又はマトリゲル等の細胞接着タンパク質や細胞外マトリックスをコートした細胞培養用ディッシュ上においても上記した未分化維持培地を用いて行うことができる。
培養温度は、使用する多能性幹細胞の培養に適した培養温度であれば、特に限定されないが、一般的には３０℃～４０℃であり、好ましくは約３７℃である。
ＣＯ２インキュベーターなどを利用して、約１～１０％、好ましくは５％のＣＯ２濃度雰囲気下で培養を行うことが好ましい。
多能性幹細胞の維持培養は継代しながら所望の期間行うことができ、例えば、維持培養後の継代数１～１００、好ましくは継代数１０～５０、より好ましくは継代数２５～４０の多能性幹細胞を用いて、凝集体の形成や分化誘導を行うことが好ましい。
［７］多能性幹細胞の浮遊培養による凝集体の形成
多能性幹細胞の凝集体を形成するための実施形態の一つとしては、未分化で維持培養している細胞を、ａｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）等によりフィーダー細胞から剥がし、３～４回ヒトｉＰＳ細胞培地でリンスをしてフィーダー細胞を除くことができる。次いで、ピペッティングにより小さな細胞塊又はシングルセルに砕き、それら細胞を培地中に懸濁した後に、懸濁液中の多能性幹細胞が凝集体を形成するまでの期間にわたって攪拌又は旋回させながら浮遊培養する。
浮遊培養は、培地の粘性等や凹凸を有するマイクロウェル等を用いた静置培養であってもよいし、スピナー等を利用して液体培地が流動する条件での培養であってもよいが、好ましくは液体培地が流動する条件での培養である。液体培地が流動する条件での培養としては、細胞の凝集を促進するように液体培地が流動する条件での培養が好ましい。細胞の凝集を促進するように液体培地が流動する条件での培養としては、例えば、旋回流、揺動流等の流れによる応力（遠心力、求心力）により細胞が一点に集まるように液体培地が流動する条件での培養や、直線的な往復運動により液体培地が流動する条件での培養が挙げられ、旋回流及び／又は揺動流を利用した培養が特に好ましい。さらに、予めマイクロキャリア等に接着させて浮遊培養しても良いし、細胞のみで構成された細胞凝集塊の状態で浮遊培養しても良いし、細胞凝集塊の中にコラーゲン等の高分子が混在していても良く、形態は特に限定しない。
浮遊培養に用いる培養容器は、好ましくは容器内面への細胞の接着性が低い容器が好ましい。このような容器内面への細胞の接着性が低い容器としては、例えば生体適合性がある物質で親水性表面処理されているようなプレートが挙げられる。例えば、ＮｕｎｃｌｏｎＴＭＳｐｈｅｒａ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を使用できるが特に限定はされない。また、 培養容器の形状は特に限定されないが、例えば、ディッシュ状、フラスコ状、ウェル状、バッグ状、スピナーフラスコ状等の形状の培養容器が挙げられる。
凝集体を形成させる期間としては、６時間を超える期間であれば特に限定されないが、具体的には、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、または２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間の期間において凝集体を形成させることが好ましい。
浮遊培養培地としては、多能性幹細胞を増殖可能な成分が含まれるのであれば特に限定されないが、１～１００μＭのＹ－２７６３２（Ｃａｙｍａｎ社）を含むｍＴｅＳＲ１（Ｖｅｒｉｔａｓ社）培地、又は１～１００μＭのＹ－２７６３２（Ｃａｙｍａｎ社）、１～１００ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ８ＴＭなどを使用することができる。
浮遊培養における攪拌又は旋回の条件としては、懸濁液中において多能性幹細胞が凝集体を形成し得る範囲であれば特に限定されないが、上限は、好ましくは２００ｒｐｍ、より好ましくは１５０ｒｐｍ、さらに好ましくは１２０ｒｐｍ、より好ましくは１００ｒｐｍ、より好ましくは９０ｒｐｍ、より好ましくは８０ｒｐｍ、もっと好ましくは７０ｒｐｍ、より好ましくは６０ｒｐｍ、特に好ましくは５０ｒｐｍ、最も好ましくは４５ｒｐｍとすることができる。下限は好ましくは１ｒｐｍ、より好ましくは１０ｒｐｍ、さらに好ましくは２０ｒｐｍ、より好ましくは３０ｒｐｍ、より好ましくは４０ｒｐｍ、特に好ましくは４５ｒｐｍとすることができる。旋回培養の際の旋回幅は特に限定されないが、下限は、例えば１ｍｍ、好ましくは１０ｍｍ、より好ましくは２０ｍｍ、最も好ましくは２５ｍｍとすることができる。旋回幅の上限は、例えば２００ｍｍ、好ましくは１００ｍｍ、好ましくは５０ｍｍ、より好ましくは３０ｍｍ、最も好ましくは２５ｍｍとすることができる。旋回培養の際の回転半径もまた特に限定されないが、好ましくは旋回幅が前記の範囲となるように設定される。回転半径の下限は例えば５ｍｍ、好ましくは１０ｍｍであり、上限は例えば１００ｍｍ、好ましくは５０ｍｍとすることができる。旋回培養の条件をこの範囲とすることで、適切な寸法の細胞凝集体を製造することが容易となるため好ましい。
また、浮遊培養は、揺動（ロッキング）撹拌により液体培地を流動させながら行う揺動培養であってもよい。揺動培養は、液体培地と細胞を収容した培養容器を概ね水平面に垂直な平面内で揺動させることにより行う。揺動速度は特に限定されないが、例えば１分間に２～５０回、好ましくは４～２５回（一往復を１回とする）揺動させることができる。揺動角度は特に限定されないが、例えば０．１°～２０°、より好ましくは２°～１０°とすることができる。揺動培養の条件をこの範囲とすることで、適切な寸法の細胞凝集塊を製造することが可能となるため好ましい。
更に、上記のような旋回と揺動とを組み合わせた運動により撹拌しながら培養することもできる。
スピナーフラスコ状の培養容器を用いた浮遊培養は、培養容器の中に攪拌翼を使用して、液体培地を攪拌しながら行う培養である。回転数や培地量は特に限定されない。市販のスピナーフラスコ状の培養容器であれば、メーカー推奨の培養液量を好適に使用することができ、例えばＡＢＬＥ社のスピナーフラスコ等も好適に用いることができる。
本発明において、浮遊培養における細胞の播種密度は、細胞が凝集体を形成する播種密度であれば特に限定されないが、１×１０５～１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬであることが好ましい。細胞の播種密度は、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、又は５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上が好ましく、９×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、７×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、６×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、１．９×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、１．８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、１．７×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、１．６×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、１．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下が好ましい。特に、５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬから１．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの範囲の細胞密度が好適である。
細胞の凝集体は、凝集体当たり数百から数千の細胞を含む。本発明において、細胞凝集体の大きさ（直径）は、特に限定されないが、例えば、５０μｍ以上、５５μｍ以上、６０μｍ以上、６５μｍ以上、７０μｍ以上、８０μｍ以上、９０μｍ以上、１００μｍ以上、１１０μｍ以上、１２０μｍ以上、１３０μｍ以上、１４０μｍ以上、１５０μｍ以上、であり、且つ、１０００μｍ以下、９００μｍ以下、８００μｍ以下、７００μｍ以下、６００μｍ以下、５００μｍ以下、４００μｍ以下が挙げられる。１５０μｍ～４００μｍの範囲の直径を有する細胞凝集体は本発明で好適である。上記範囲以外の直径を有する細胞凝集体が混在していても良い。
浮遊培養の際の培養液量は使用する培養容器によって適宜調整することができるが、例えば１２ウェルプレート（１ウェルあたりの平面視でのウェル底面の面積が３．５ｃｍ２）を使用する場合は０．５ｍｌ／ウェル以上、１．５ｍｌ／ウェル以下とすることができ、より好ましくは１ｍｌ／ウェルとすることができる。例えば６ウェルプレート（１ウェルあたりの平面視でのウェル底面の面積が９．６ｃｍ２）を使用する場合は、１．５ｍＬ／ウェル以上、好ましくは２ｍＬ／ウェル以上、より好ましくは３ｍＬ／ウェル以上とすることができ、６．０ｍＬ／ウェル以下、好ましくは５ｍＬ／ウェル以下、より好ましくは４ｍＬ／ウェル以下とすることができる。例えば１２５ｍＬ三角フラスコ（容量が１２５ｍＬの三角フラスコ）を使用する場合は、１０ｍＬ／容器以上、好ましくは１５ｍＬ／容器以上、より好ましくは２０ｍＬ／容器以上、より好ましくは２５ｍＬ／容器以上、より好ましくは３０ｍＬ／容器以上とすることができ、５０ｍＬ／容器以下、より好ましくは４５ｍＬ／容器以下、より好ましくは４０ｍＬ／容器以下とすることができる。例えば５００ｍＬ三角フラスコ（容量が５００ｍＬの三角フラスコ）を使用する場合は、１００ｍＬ／容器以上、好ましくは１０５ｍＬ／容器以上、より好ましくは１１０ｍＬ／容器以上、より好ましくは１１５ｍＬ／容器以上、より好ましくは１２０ｍＬ／容器以上とすることができ、１５０ｍＬ／容器以下、より好ましくは１４５ｍＬ／容器以下、より好ましくは１４０ｍＬ／容器以下、より好ましくは１３５ｍＬ／容器以下、より好ましくは１３０ｍＬ／容器以下、より好ましくは１２５ｍＬ／容器以下とすることができる。例えば１０００ｍＬ三角フラスコ（容量が１０００ｍＬの三角フラスコ）を使用する場合は、２５０ｍＬ／容器以上、好ましくは２６０ｍＬ／容器以上、より好ましくは２７０ｍＬ／容器以上、より好ましくは２８０ｍＬ／容器以上、より好ましくは２９０ｍＬ／容器以上とすることができ、３５０ｍＬ／容器以下、より好ましくは３４０ｍＬ／容器以下、より好ましくは３３０ｍＬ／容器以下、より好ましくは３２０ｍＬ／容器以下、より好ましくは３１０ｍＬ／容器以下とすることができる。例えば２０００ｍＬ三角フラスコ（容量が２０００ｍＬの三角フラスコ）の場合は、５００ｍＬ／容器以上、より好ましくは５５０ｍＬ／容器以上、より好ましくは６００ｍＬ／容器以上とすることができ、１０００ｍＬ／容器以下、より好ましくは９００ｍＬ／容器以下、より好ましくは８００ｍＬ／容器以下、より好ましくは７００ｍＬ／容器以下とすることができる。例えば３０００ｍＬ三角フラスコ（容量が３０００ｍＬの三角フラスコ）の場合は、１０００ｍＬ／容器以上、好ましくは１１００ｍＬ／容器以上、より好ましくは１２００ｍＬ／容器以上、より好ましくは１３００ｍＬ／容器以上、より好ましくは１４００ｍＬ／容器以上、より好ましくは１５００ｍＬ／容器以上とすることができ、２０００ｍＬ／容器以下、より好ましくは１９００ｍＬ／容器以下、より好ましくは１８００ｍＬ／容器以下、より好ましくは１７００ｍＬ／容器以下、より好ましくは１６００ｍＬ／容器以下とすることができる。例えば２Ｌ培養バッグ（容量が２Ｌのディスポーザブル培養バッグ）の場合は、１００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは２００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは３００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは４００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは５００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは６００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは７００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは８００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは９００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは１０００ｍＬ／バッグ以上とすることができ、２０００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１９００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１８００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１７００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１６００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１５００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１４００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１３００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１２００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１１００ｍＬ／バッグ以下とすることができる。例えば１０Ｌ培養バッグ（容量が１０Ｌのディスポーザブル培養バッグ）の場合は、５００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは１Ｌ／バッグ以上、より好ましくは２Ｌ／バッグ以上、より好ましくは３Ｌ／バッグ以上、より好ましくは４Ｌ／バッグ以上、より好ましくは５Ｌ／バッグ以上とすることができ、１０Ｌ／バッグ以下、より好ましくは９Ｌ／バッグ以下、より好ましくは８Ｌ／バッグ以下、より好ましくは７Ｌ／バッグ以下、より好ましくは６Ｌ／バッグ以下とすることができる。例えば、２０Ｌ培養バッグ（容量が２０Ｌのディスポーザブル培養バッグ）の場合は、１Ｌ／バッグ以上、より好ましくは２Ｌ／バッグ以上、より好ましくは３Ｌ／バッグ以上、より好ましくは４Ｌ／バッグ以上、より好ましくは５Ｌ／バッグ以上、より好ましくは６Ｌ／バッグ以上、より好ましくは７Ｌ／バッグ以上、より好ましくは８Ｌ／バッグ以上、より好ましくは９Ｌ／バッグ以上、より好ましくは１０Ｌ／バッグ以上とすることができ、２０Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１９Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１８Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１７Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１６Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１５Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１４Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１３Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１２Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１１Ｌ／バッグ以下とすることができる。例えば５０Ｌ培養バッグ（容量が５０Ｌのディスポーザブル培養バッグ）の場合は、１Ｌ／バッグ以上、より好ましくは２Ｌ／バッグ以上、より好ましくは５Ｌ／バッグ以上、より好ましくは１０Ｌ／バッグ以上、より好ましくは１５Ｌ／バッグ以上、より好ましくは２０Ｌ／バッグ以上、より好ましくは２５Ｌ／バッグ以上とすることができ、５０Ｌ／バッグ以下、より好ましくは４５Ｌ／バッグ以下、より好ましくは４０Ｌ／バッグ以下、より好ましくは３５Ｌ／バッグ以下、より好ましくは３０Ｌ／バッグ以下とすることができる。培養液量がこの範囲であるとき、適切な大きさの細胞凝集体が形成され易い。
使用する培養容器の容量は適宜選択することができ特に限定されないが、液体培地を収容する部分の底面を平面視したときの面積として、下限が、例えば０．３２ｃｍ２、好ましくは０．６５ｃｍ２、より好ましくは０．９５ｃｍ２、さらに好ましくは１．９ｃｍ２、もっと好ましくは３．０ｃｍ２、３．５ｃｍ２、９．０ｃｍ２、又は９．６ｃｍ２の培養容器を用いることができ、上限としては、例えば１０００ｃｍ２、好ましくは５００ｃｍ２、より好ましくは３００ｃｍ２、より好ましくは１５０ｃｍ２、より好ましくは７５ｃｍ２、もっと好ましくは５５ｃｍ２、さらに好ましくは２５ｃｍ２、さらにより好ましくは２１ｃｍ２、さらにもっと好ましくは９．６ｃｍ２、又は３．５ｃｍ２の培養容器を用いることができる。
培養温度は、使用する多能性幹細胞の培養に適した培養温度であれば、特に限定されないが、一般的には３０℃～４０℃であり、好ましくは約３７℃である。
ＣＯ２インキュベーターなどを利用して、約１～１０％、好ましくは５％のＣＯ２濃度雰囲気下で培養を行うことが好ましい。
［８］多能性幹細胞の前培養
上記多能性幹細胞の凝集体又は多能性幹細胞を内胚葉系細胞に分化誘導する前に、２－メルカプトエタノールを含む培地を用いて浮遊培養し、細胞集団を調製することができる。
前培養に用いる培地は、細胞の種類に応じて、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ－１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、又はＥｓｓｅｎｔｉａｌ ６ＴＭ培地（Tｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等を用いることができる。
多能性幹細胞の前培養は、浮遊培養にて実施する。上述した浮遊培養の条件によって行うことができ、さらに、予めマイクロキャリア等に接着させて浮遊培養しても良いし、細胞のみで構成された細胞凝集塊の状態で浮遊培養しても良いし、細胞凝集塊の中にコラーゲン等の高分子が混在していても良く、形態は特に限定しない。
前培養に用いる培地中における２－メルカプトエタノールの濃度としては、分化誘導の効率が向上する範囲であれば特に限定されないが、例えば、２－メルカプトエタノールの濃度として、１μＭ以上、２μＭ以上、５μＭ以上、１０μＭ以上、２０μＭ以上、３０μＭ以上、４０μＭ以上、又は５０μＭ以上が好ましく、２００μＭ以下、１５０μＭ以下、１２０μＭ以下、１００μＭ以下、９０μＭ以下、８０μＭ以下、７０μＭ以下、又は６０μＭ以下が好ましい。
前培養に用いる培地は、ＦＧＦ２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ２）を添加していない培地であることも好ましい。ＦＧＦ２を添加していない培地を使用することにより、内胚葉系細胞への分化効率をより向上することができる場合がある。
前培養に用いる培地は、ＴＧＦβ１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β１）を添加していない培地であることも好ましい。ＴＧＦβ１を添加していない培地を使用することにより、内胚葉系細胞への分化効率をより向上することができる場合がある。
前培養に用いる培地は、ＷＮＴシグナル活性化剤を添加していない培地であることも好ましい。ＷＮＴシグナル活性化剤を添加していない培地を使用することにより、内胚葉系細胞への分化効率をより向上することができる場合がある。
前培養に用いる培地は、アクチビンＡ（本明細書中において「ＡＣＴＩＶＩＮ Ａ」と言い換える場合がある）を添加していない培地であることも好ましい。アクチビンＡを添加していない培地を使用することにより、内胚葉系細胞への分化効率をより向上することができる場合がある。
前培養用の培地には、アミノ酸、抗生物質、抗酸化剤、その他の添加物を加えてもよい。例えば０．１～２％（体積／体積）のＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）、０．１～２％（体積／体積）のペニシリン／ストレプトマイシン、０．１～２０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ又は１～２５％（体積／体積）（好ましくは１～２０％（体積／体積））のＫｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ （ＫＳＲ）などを添加してもよい。
培養温度は、使用する多能性幹細胞の培養に適した培養温度であれば、特に限定されないが、一般的には３０℃～４０℃であり、好ましくは約３７℃である。
ＣＯ２インキュベーターなどを利用して、約１～１０％、好ましくは５％のＣＯ２濃度雰囲気下で培養を行うことが好ましい。
多能性幹細胞の前培養の培養期間は、多分化能が向上するまで培養する日数であれば特に限定されないが、例えば１週間を超えない期間であれば良い。より具体的には、６日未満、５日未満、４日未満、３日未満、または、６時間～４８時間であり、１２時間～３６時間程度であり、１８時間～２４時間である。
［９］内胚葉系細胞への分化誘導
本発明においては、上記の前培養で得られた細胞集団を、内胚葉系細胞に分化誘導できる条件下で培養することによって、内胚葉系細胞を製造することができる。
内胚葉系細胞は、消化管、肺、甲状腺、膵臓、肝臓などの器官の組織、消化管に開口する分泌腺の細胞、腹膜、胸膜、喉頭、耳管、気管、気管支、尿路（膀胱、尿道の大部分、尿管の一部）などへと分化する能力を有し、一般的に、胚体内胚葉（DE）と言われることがある。多能性幹細胞から内胚葉系細胞への分化は、内胚葉系細胞に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。内胚葉系細胞に特異的な遺伝子としては、例えば、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４、ＡＦＰ、ＧＡＴＡ４、ＥＯＭＥＳ等を挙げることができる。なお、本明細書中において、内胚葉系細胞を胚体内胚葉と言い換えて使用することがある。
多能性幹細胞を内胚葉系細胞に分化誘導する際には、分化誘導化培地を使用して多能性幹細胞の培養を行う。
分化誘導化培地としては、多能性幹細胞を分化誘導させる培地であれば特に限定されるものではないが、例えば、血清含有培地や、血清代替成分を含有した無血清培地等が挙げられる。
用いる細胞の種類に応じて、霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用培地（リプロセル培地）、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの培地から任意に選択した２種以上の培地を混合した培地などが使用できる。なお、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。
分化誘導培地は、血清成分又は血清代替成分を含んでいてもよい。血清成分又は血清代替成分としては、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素（例えば亜鉛、セレン）、Ｂ－２７サプリメント（Tｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、Ｎ２サプリメント、Ｎ２１サプリメント（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、ＮｅｕｒｏＢｒｅｗ－２１サプリメント（Ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ社）、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、２－メルカプトエタノール、３’チオールグリセロール、並びにこれらの均等物が挙げられる。
分化誘導培地には、さらに各種の添加物、抗生物質、抗酸化剤などを加えてもよい。例えば、０．１ｍＭ～５ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．１～２％（体積／体積）の非必須アミノ酸、０．１～２％（体積／体積）のペニシリン、０．１～２％（体積／体積）のストレプトマイシン、０．１～２％（体積／体積）のアンフォテリシンＢ、カタラーゼ、グルタチオン、ガラクトース、レチノイン酸（ビタミンＡ）、スーパーオキシドディスムターゼ、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、Ｄ－α－トコフェロール（ビタミンＥ）などを添加してもよい。
分化誘導培地にはさらに、分化誘導因子を添加する。分化誘導因子の詳細については後記する。
分化誘導時における多能性幹細胞の培養は、浮遊培養であることが好ましい。細胞はマイクロキャリア等に接着させて浮遊培養しても良いし、細胞のみで構成された細胞凝集塊の状態で浮遊培養しても良いし、細胞凝集塊の中にコラーゲン等の高分子が混在していても良く、形態は特に限定しない。
分化誘導のための培養における培養温度は、使用する多能性幹細胞の培養に適した培養温度であれば、特に限定されないが、一般的には３０℃～４０℃であり、好ましくは約３７℃である。
ＣＯ２インキュベーターなどを利用して、約１～１０％、好ましくは５％のＣＯ２濃度雰囲気下で培養を行うことが好ましい。
多能性幹細胞から内胚葉系細胞への分化培養の培養期間は、内胚葉系列の細胞特性が呈する細胞型になっているのであれば特に限定されないが、例えば、２週間以内であればよく、より具体的には２日以上８日以内であり、より好ましくは２日以上７日以内であり、さらに好ましくは３日以上６日以内であり、一例としては４日または５日である。
［１０］内胚葉系細胞への分化誘導に用いる分化誘導因子、及びその他の添加物
好ましくは、内胚葉系細胞は、多能性幹細胞集団を、ＴＧＦβ(Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β)スーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地で培養した後、ＦＧＦ２及びＢＭＰ４（Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ４）を添加していない培地で培養することにより分化誘導された内胚葉系細胞である。
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地においてアクチビンＡを使用する場合、アクチビンＡの添加初期濃度は、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ以上、２ｎｇ／ｍＬ以上、３ｎｇ／ｍＬ以上、５ｎｇ／ｍＬ以上、１０ｎｇ／ｍＬ以上、２０ｎｇ／ｍＬ以上、３０ｎｇ／ｍＬ以上、４０ｎｇ／ｍＬ以上、又は５０ｎｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは１,０００ｎｇ／ｍＬ以下、９００ｎｇ／ｍＬ以下、８００ｎｇ／ｍＬ以下、７００ｎｇ／ｍＬ以下、６００ｎｇ／ｍＬ以下、５００ｎｇ／ｍＬ以下、４００ｎｇ／ｍＬ以下、３００ｎｇ／ｍＬ以下、２００ｎｇ／ｍＬ以下、１５０ｎｇ／ｍＬ以下又は１００ｎｇ／ｍＬ以下である。
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地においてＦＧＦ２を使用する場合、ＦＧＦ２の添加初期濃度は、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ以上、２ｎｇ／ｍＬ以上、３ｎｇ／ｍＬ以上、５ｎｇ／ｍＬ以上、１０ｎｇ／ｍＬ以上、２０ｎｇ／ｍＬ以上、３０ｎｇ／ｍＬ以上、又は４０ｎｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは１,０００ｎｇ／ｍＬ以下、９００ｎｇ／ｍＬ以下、８００ｎｇ／ｍＬ以下、７００ｎｇ／ｍＬ以下、６００ｎｇ／ｍＬ以下、５００ｎｇ／ｍＬ以下、４００ｎｇ／ｍＬ以下、３００ｎｇ／ｍＬ以下、２００ｎｇ／ｍＬ以下、１５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ以下、９０ｎｇ／ｍＬ以下、８０ｎｇ／ｍＬ以下、又は７０ｎｇ／ｍＬ以下である。
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地においてＢＭＰ４を使用する場合、ＢＭＰ４の添加初期濃度は、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ以上、２ｎｇ／ｍＬ以上、３ｎｇ／ｍＬ以上、５ｎｇ／ｍＬ以上、６ｎｇ／ｍＬ以上、７ｎｇ／ｍＬ以上、８ｎｇ／ｍＬ以上、９ｎｇ／ｍＬ以上、１０ｎｇ／ｍＬ以上、１１ｎｇ／ｍＬ以上、１２ｎｇ／ｍＬ以上、１３ｎｇ／ｍＬ以上、１４ｎｇ／ｍＬ以上、又は１５ｎｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは１,０００ｎｇ／ｍＬ以下、９００ｎｇ／ｍＬ以下、８００ｎｇ／ｍＬ以下、７００ｎｇ／ｍＬ以下、６００ｎｇ／ｍＬ以下、５００ｎｇ／ｍＬ以下、４００ｎｇ／ｍＬ以下、３００ｎｇ／ｍＬ以下、２００ｎｇ／ｍＬ以下、１５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ以下、９０ｎｇ／ｍＬ以下、８０ｎｇ／ｍＬ以下、７０ｎｇ／ｍＬ以下、６０ｎｇ／ｍＬ以下、５０ｎｇ／ｍＬ以下、４０ｎｇ／ｍＬ以下、又は３０ｎｇ／ｍＬ以下である。
ＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地は、アクチビンＡを含むことが好ましい。
ＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地がアクチビンＡを含む場合におけるアクチビンＡの添加初期濃度は、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ以上、２ｎｇ／ｍＬ以上、３ｎｇ／ｍＬ以上、５ｎｇ／ｍＬ以上、１０ｎｇ／ｍＬ以上、２０ｎｇ／ｍＬ以上、３０ｎｇ／ｍＬ以上、４０ｎｇ／ｍＬ以上、又は５０ｎｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは１,０００ｎｇ／ｍＬ以下、９００ｎｇ／ｍＬ以下、８００ｎｇ／ｍＬ以下、７００ｎｇ／ｍＬ以下、６００ｎｇ／ｍＬ以下、５００ｎｇ／ｍＬ以下、４００ｎｇ／ｍＬ以下、３００ｎｇ／ｍＬ以下、２００ｎｇ／ｍＬ以下、１５０ｎｇ／ｍＬ以下又は１００ｎｇ／ｍＬ以下である。
ＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地は、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム及びエタノールアミンからなる群から選択される少なくとも１種類以上を含むことが好ましい。
インスリンの添加濃度は、好ましくは０．００１μｇ／ｍＬ以上、０．０１μｇ／ｍＬ以上、０．０５μｇ／ｍＬ以上、０．１μｇ／ｍＬ以上、０．２μｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは１０，０００μｇ／ｍＬ以下、１，０００μｇ／ｍＬ以下、１００μｇ／ｍＬ以下、１０μｇ／ｍＬ以下、９μｇ／ｍＬ以下、８μｇ／ｍＬ以下、７μｇ／ｍＬ以下、６μｇ／ｍＬ以下、５μｇ／ｍＬ以下、４μｇ／ｍＬ以下、３μｇ／ｍＬ以下、２μｇ／ｍＬ以下である。トランスフェリンの添加濃度は、好ましくは０．００１μｇ／ｍＬ以上、０．０１μｇ／ｍＬ以上、０．０５μｇ／ｍＬ以上、０．０６μｇ／ｍＬ以上、０．０７μｇ／ｍＬ以上、０．０８μｇ／ｍＬ以上、０．０９μｇ／ｍＬ以上、０．１μｇ／ｍＬ以上、０．１１μｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは１０，０００μｇ／ｍＬ以下、１，０００μｇ／ｍＬ以下、１００μｇ／ｍＬ以下、１０μｇ／ｍＬ以下、９μｇ／ｍＬ以下、８μｇ／ｍＬ以下、７μｇ／ｍＬ以下、６μｇ／ｍＬ以下、５μｇ／ｍＬ以下、４μｇ／ｍＬ以下、３μｇ／ｍＬ以下、２μｇ／ｍＬ以下、１．９μｇ／ｍＬ以下、１．８μｇ／ｍＬ以下、１．７μｇ／ｍＬ以下、１．６μｇ／ｍＬ以下、１．５μｇ／ｍＬ以下、１．４μｇ／ｍＬ以下、１．３μｇ／ｍＬ以下、１．２μｇ／ｍＬ以下、１．１μｇ／ｍＬ以下である。亜セレン酸ナトリウムの添加濃度は、好ましくは０．００１ｎｇ／ｍＬ以上、０．０１ｎｇ／ｍＬ以上、０．１ｎｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは１０，０００ｎｇ／ｍＬ以下、１，０００ｎｇ／ｍＬ以下、１００ｎｇ／ｍＬ以下、１０ｎｇ／ｍＬ以下、１ｎｇ／ｍＬ以下である。エタノールアミンの添加濃度は、好ましくは０．００１μｇ／ｍＬ以上、０．０１μｇ／ｍＬ以上、０．０２μｇ／ｍＬ以上、０．０３μｇ／ｍＬ以上、０．０４μｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは１０，０００μｇ／ｍＬ以下、１，０００μｇ／ｍＬ以下、１００μｇ／ｍＬ以下、１０μｇ／ｍＬ以下、１μｇ／ｍＬ以下、０．９μｇ／ｍＬ以下、０．８μｇ／ｍＬ以下、０．７μｇ／ｍＬ以下、０．６μｇ／ｍＬ以下、０．５μｇ／ｍＬ以下、０．４μｇ／ｍＬ以下である。
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地、及び／又はＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地は、さらに２－メルカプトエタノールを含むことが好ましい。２－メルカプトエタノールを作用することにより、内胚葉系細胞への分化誘導効率を高めることができる。
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地は、さらにＷＮＴシグナル活性化剤を含むことが好ましい。
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地においてＣＨＩＲ９９０２１を使用する場合、添加初期濃度は、好ましくは０．０１μＭ以上、０．０２μＭ以上、０．０３μＭ以上、０．０４μＭ以上、０．０５μＭ以上、０．１μＭ以上、０．２μＭ以上、０．３μＭ以上、０．４μＭ以上、０．５μＭ以上、０．６μＭ以上、０．７μＭ以上、０．８μＭ以上、０．９μＭ以上、１μＭ以上、又は２μＭ以上であり、好ましくは１００μＭ以下、９０μＭ以下、８０μＭ以下、７０μＭ以下、６０μＭ以下、５０μＭ以下、４５μＭ以下、４０μＭ以下、３５μＭ以下、３０μＭ以下、２５μＭ以下、２０μＭ以下、１５μＭ以下、１０μＭ以下又は５μＭ以下である。より好ましくは３μＭまたは４μＭである。
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地、及び／又はＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地は、少なくともグルコースを含む。前記培地中に含まれるグルコース濃度の下限は、細胞が増殖できる濃度であれば特に限定されないが、０．０１ｇ／Ｌ以上が好ましい。また、前記培地中に含まれるグルコース濃度の上限は、細胞が死滅しない濃度であれば特に限定されないが、例えば１０ｇ／Ｌ以下が好ましい。他の実施態様として、内胚葉系列の体細胞に効率的に分化させる観点においては、グルコースを２．０ｇ／Ｌ未満で含有する培地が好ましい。ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地、及び／又はＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地におけるグルコースの濃度は、１．０ｇ／Ｌ以下でもよく、０．９ｇ／Ｌ以下でもよく、０．８ｇ／Ｌ以下、０．７ｇ／Ｌ以下、０．６ｇ／Ｌ以下でもよい。ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地、及び／又はＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地がグルコースを含む場合における、グルコースの濃度の下限は特に限定されないが、０．０１ｇ／Ｌ以上でもよく、０．０２ｇ／Ｌ以上、０．０５ｇ／Ｌ以上、０．１ｇ／Ｌ以上、０．２ｇ／Ｌ以上、０．３ｇ／Ｌ以上、０．４ｇ／Ｌ以上、０．５ｇ／Ｌ以上でもよい。
［１１］内胚葉系細胞から原始腸管細胞（ＰＧＴ）を製造する工程
本発明においては、多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を、原始腸管細胞（ＰＧＴ）への分化誘導に適した条件下において培養することによって、原始腸管細胞（ＰＧＴ）を誘導することができる。
好ましくは、多能性幹細胞から誘導された内胚葉系細胞を、インスリン受容体シグナル活性化剤を含む培地において培養することができる。
培地におけるインスリン受容体シグナル活性化剤の添加量の下限は、好ましくは０．００１ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．０１ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２ｍｇ／Ｌ、より好ましくは３ｍｇ／Ｌである。培地におけるインスリン受容体シグナル活性化剤の添加量の上限は、好ましくは１０００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは５００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは９０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは８０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは７０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは６０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは５０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは４０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは３０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１０ｍｇ／Ｌである。
好ましくは、多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を、インスリン、トランスフェリン及び亜セレン酸を含む培地において培養することができる。
インスリン、トランスフェリン及び亜セレン酸は、Ｂ２７サプリメントなど市販の混合物の形態で培地に含まれていてもよい。インスリン、トランスフェリン及び亜セレン酸に加えてエタノールアミンが含まれていてもよい。
培地におけるトランスフェリンの添加量の下限は、好ましくは０．００１ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．０１ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１．１ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１．２ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１．３ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１．４ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１．５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１．６ｍｇ／Ｌである。培地におけるトランスフェリンの添加量の上限は、好ましくは１０００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは５００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは９０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは８０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは７０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは６０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは５０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは４０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは３０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは９ｍｇ／Ｌ、より好ましくは８ｍｇ／Ｌ、より好ましくは７ｍｇ／Ｌ、より好ましくは６ｍｇ／Ｌ、より好ましくは５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは４ｍｇ／Ｌ、より好ましくは３ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２ｍｇ／Ｌである。
培地における亜セレン酸の添加量の下限は、好ましくは０．００１μｇ／Ｌ、より好ましくは０．０１μｇ／Ｌ、より好ましくは０．１μｇ／Ｌ、より好ましくは１μｇ／Ｌ、より好ましくは１．１μｇ／Ｌ、より好ましくは１．２μｇ／Ｌ、より好ましくは１．３μｇ／Ｌ、より好ましくは１．４μｇ／Ｌ、より好ましくは１．５μｇ／Ｌ、より好ましくは１．６μｇ／Ｌ、より好ましくは１．７μｇ／Ｌ、より好ましくは１．８μｇ／Ｌ、より好ましくは１．９μｇ／Ｌ、より好ましくは２μｇ／Ｌである。培地における亜セレン酸の添加量の上限は、好ましくは１０００μｇ／Ｌ、より好ましくは５００μｇ／Ｌ、より好ましくは１００μｇ／Ｌ、より好ましくは９０μｇ／Ｌ、より好ましくは８０μｇ／Ｌ、より好ましくは７０μｇ／Ｌ、より好ましくは６０μｇ／Ｌ、より好ましくは５０μｇ／Ｌ、より好ましくは４０μｇ／Ｌ、より好ましくは３０μｇ／Ｌ、より好ましくは２０μｇ／Ｌ、より好ましくは１０μｇ／Ｌ、より好ましくは９μｇ／Ｌ、より好ましくは８μｇ／Ｌ、より好ましくは７μｇ／Ｌである。
好ましくは、多能性幹細胞から誘導された内胚葉系細胞を、ＦＧＦ受容体シグナル活性化剤を含む培地において培養することができる。より効率的な分化誘導の達成という観点からは、ＦＧＦ２非存在下において培養することが好ましい。
培地におけるＦＧＦ受容体シグナル活性化剤の添加量の下限は、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは４０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬである。培地におけるＦＧＦ受容体シグナル活性化剤の添加量の上限は、好ましくは５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは４００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは９０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは８０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは７０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは６０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬである。
好ましくは、多能性幹細胞から誘導された内胚葉系細胞を、Ｂ２７（登録商標）サプリメント及び／またはＦＧＦ７を含む培地において培養することができる。
培地におけるＢ２７（登録商標）サプリメントの添加量の下限は、好ましくは０．０１％、より好ましくは０．１％、より好ましくは０．２％、より好ましくは０．３％、より好ましくは０．４％、より好ましくは０．５％、より好ましくは０．６％、より好ましくは０．７％、より好ましくは０．８％、より好ましくは０．９％である。培地におけるＢ２７（登録商標）サプリメントの添加量の上限は、好ましくは１０％、より好ましくは９％、より好ましくは８％、より好ましくは７％、より好ましくは６％、より好ましくは５％、より好ましくは４％、より好ましくは３％、より好ましくは２％、より好ましくは１％である。
培地におけるＦＧＦ７の添加量の下限は、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは４０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬである。培地におけるＦＧＦ７の添加量の上限は、好ましくは５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは４００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは９０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは８０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは７０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは６０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬである。
効率的な分化誘導の達成及び、優れた治療効果を有する膵臓β細胞の製造とう観点から、多能性幹細胞から誘導された内胚葉系細胞から原始腸管細胞（ＰＧＴ）への分化誘導は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤の非存在下において培養することが好ましい。ＦＧＦ受容体シグナル活性化剤を含む培地において培養することができる。
さらに好ましくは、ヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル阻害剤の非存在下における培養であり、ＴＧＦβシグナル阻害剤の非存在下における培養であり、レチノイン酸及びそのアナログの非存在下における培養である。
培地としては、細胞の種類に応じて、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ－１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、又はＥｓｓｅｎｔｉａｌ ６ＴＭ培地（Tｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等を用いることができる。
培地にはさらに、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）が含まれていてもよい。好ましくはＢＳＡまたはＨＳＡに含まれる脂質が２ｍｇ／ｇ以下、遊離脂肪酸が０．２ｍｇ／ｇ以下である。
培地におけるＢＳＡの添加量の下限は、好ましくは０．０１％（重量％）、より好ましくは０．０５％、より好ましくは０．１０％、より好ましくは０．１５％、より好ましくは０．２０％、より好ましくは０．２５％である。培地におけるＢＳＡの添加量の上限は、好ましくは１．００％、より好ましくは０．９０％、より好ましくは０．８０％、より好ましくは０．７０％、より好ましくは０．６０％、より好ましくは０．５０％、より好ましくは０．４０％、より好ましくは０．３０％、より好ましくは０．２５％である。
培地にはさらに、ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅが含まれていてもよい。
培地におけるｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅの添加量の下限は、好ましくは０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．２ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．６ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．７ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．８ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．９ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１ｍｍｏｌ／Ｌである。培地におけるｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅの添加量の上限は、好ましくは２０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは４ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは３ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは２ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１ｍｍｏｌ／Ｌである。
培地にはさらに、ＮＥＡＡ（例えば、１×ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（ＮＥＡＡ；Ｗａｋｏ社）など）が含まれていてもよい。
培地におけるＮＥＡＡの含有量の下限は、好ましくは０．０５×ＮＥＡＡ、より好ましくは０．１×ＮＥＡＡ、より好ましくは０．５×ＮＥＡＡ、より好ましくは０．６×ＮＥＡＡ、より好ましくは０．７×ＮＥＡＡ、より好ましくは０．８×ＮＥＡＡ、より好ましくは０．９×ＮＥＡＡ、より好ましくは１×ＮＥＡＡである。培地におけるＮＥＡＡの含有量の上限は、好ましくは２０×ＮＥＡＡ、より好ましくは１５×ＮＥＡＡ、より好ましくは１０×ＮＥＡＡ、より好ましくは５×ＮＥＡＡ、より好ましくは４×ＮＥＡＡ、より好ましくは３×ＮＥＡＡ、より好ましくは２×ＮＥＡＡ、より好ましくは１×ＮＥＡＡである。
培地にはさらに、ペニシリンおよびストレプトマイシンなどの抗生物質が含まれていてもよい。
培養温度は、使用する多能性幹細胞の培養に適した培養温度であれば、特に限定されないが、一般的には３０℃～４０℃であり、好ましくは約３７℃である。
ＣＯ２インキュベーターなどを利用して、約１～１０％、好ましくは５％のＣＯ２濃度雰囲気下で培養を行うことが好ましい。
培養は攪拌しながら行ってもよい。撹拌速度は特に限定されないが、上限は、好ましくは２００ｒｐｍ、より好ましくは１５０ｒｐｍ、さらに好ましくは１２０ｒｐｍ、より好より好ましくは１１０ｒｐｍ、より好ましくは１００ｒｐｍ、より好ましくは９０ｒｐｍ、より好ましくは８０ｒｐｍ、より好ましくは７０ｒｐｍ、特に好ましくは６０ｒｐｍ、最も好ましくは５５ｒｐｍとすることができる。下限は好ましくは１ｒｐｍ、より好ましくは１０ｒｐｍ、さらに好ましくは２０ｒｐｍ、より好ましくは３０ｒｐｍ、より好ましくは４０ｒｐｍ、特に好ましくは５０ｒｐｍ、最も好ましくは５５ｒｐｍとすることができる。
内胚葉系細胞（胚体内胚葉）から原始腸管細胞への分化誘導の培養期間は、一般的には２４時間～１２０時間であり、好ましく４８時間～９６時間程度である。例えば、７２時間である。
［１２］膵臓β細胞の利用
本発明の方法により得られる膵臓β細胞は、インスリン分泌能が高く、糖尿病に対して高い治療効果を発揮できる。即ち、本発明の方法を利用して膵臓β細胞（インスリン産生細胞と言い換える場合がある）を得た場合には、これをカテーテルなどであるいは免疫隔離デバイス等に封入して移植することにより、糖尿病の治療へ利用できる。また、膵臓β細胞などの物質代謝が可能な膵臓系の細胞を得ることにより、その膵臓β細胞が産生したインスリンを直接注射することにより、Ｉ型糖尿病の治療に用いることもできる。
以下の実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
［比較例１］
＜多能性幹細胞の維持培養＞
ヒトｉＰＳ細胞株ＴＫＤＮ４－Ｍ(東京大学医科学研究所)はＭＩＴＯＭＹＣＩＮ－Ｃ(ＷＡＫＯ社)で処理をしたＳＮＬ ＦＥＥＤＥＲ細胞上でヒトｉＰＳ細胞培地(２０％ＫＮＯＣＫＯＵＴ ＳＥＲＵＭ ＲＥＰＬＡＣＥＭＥＮＴ（ＫＳＲ；ＧＩＢＣＯ社)、１×ＮＯＮ－ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ（ＮＥＡＡ；ＷＡＫＯ社)、５５μｍｏＬ／Ｌ ２－ＭＥＲＣＡＰＴＥＴＨＡＮＯＬ（２－ＭＥ；ＧＩＢＣＯ社)、７．５ｎｇ／ｍＬ ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ ＨＵＭＡＮ ＦＩＢＲＯＢＬＡＳＴ ＧＲＯＷＴＨ ＦＡＣＴＯＲ（ＦＧＦ２；ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）、０．５×ＰＥＮＩＣＩＬＬＩＮ ＡＮＤ ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＩＮ ＰＳ；ＷＡＫＯ社）を含むＤＭＥＭ／ＨＡＭ’Ｓ Ｆ１２（ＷＡＫＯ社））で未分化維持培養を行った。または、ＶＩＴＲＯＮＥＣＴＩＮ（ＧＩＢＣＯ）でコーティングしたプレート上で、１×ＰＥＮＩＣＩＬＬＩＮ ＡＮＤ ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＩＮ ＡＮＤ ＡＭＰＨＯＴＥＲＩＣＩＮ Ｂ（ＷＡＫＯ社）を含むＥＳＳＥＮＴＩＡＬ８培地（Ｅ８；ＧＩＢＣＯ社）で未分化維持培養した。なお、播種時のみ最終濃度１０μＭとなるように Ｙ２７６３２を添加して培養した。培養は、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で行った。
＜凝集塊の作製＞
ヒトｉＰＳ細胞株ＴｋＤＮ４－Ｍ（東京大学医科学研究所）は、１回ＰＢＳでリンスを行い、ａｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）にて３７℃で５分から１５分インキュベートしてからピペッティングによりシングルセルまで分散して回収した。３×１０７個の細胞を１０μＭのＹ２７６３２を含むｍＴｅＳＲ１の培地３０ｍＬ中に懸濁し、３０ｍＬシングルユースバイオリアクター（ＡＢＬＥ社）へ移し６チャネルマグネチックスターラー（ＡＢＬＥ社）に装着して４５ｐｍの速度で攪拌しながら３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で浮遊培養を１日間行った。
＜多能性幹細胞の前培養＞
維持培養にて得られた凝集体を形成した細胞集団を、２０％（体積／体積）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ；Ｇｉｂｃｏ社）、１×ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（ＮＥＡＡ；Ｗａｋｏ社）、５５μｍｏｌ／Ｌ ２－メルカプトエタノール（２－ｍｅｒｃａｐｔｅｔｈａｎｏｌ；Ｇｉｂｃｏ社）、０．５×Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ａｎｄ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＰＳ；Ｗａｋｏ社）を含むＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２（Ｗａｋｏ社）に懸濁し、３０ｍＬシングルユースバイオリアクター（ＡＢＬＥ社）へ移し、６チャネルマグネチックスターラー（ＡＢＬＥ社）に装着して４５ｒｐｍの速度で攪拌しながら３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で浮遊培養を１日間行った。
＜膵臓β細胞への分化誘導＞
前培養にて得られた細胞集団を、まずは内胚葉系細胞 (胚体内胚葉：Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｅｎｄｏｄｅｒｍ：ＤＥ)へ分化誘導した。具体的には、最初の１～２日目は、０．２５％Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ； ｓｉｇｍａ）、０．４×ＰＳ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｗａｋｏ社）、１ｘＮＥＡＡ、８０ｎｇ／ｍＬ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ アクチビンＡ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、２０ｎｇ／ｍＬ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ４（ＢＭＰ４；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、３μｍｏｌ／Ｌ ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｗａｋｏ社）で浮遊培養した。３日目はこの培地からＣＨＩＲ９９０２１のみ、又はＣＨＩＲ９９０２１、ＢＭＰ４及びＦＧＦ２を除いて浮遊培養を行い、４日目はさらに０．５％ＫＳＲを加えた培地で浮遊培養を１日間行うことで内胚葉系細胞へ分化誘導した。なお、浮遊培養は３０ｍＬシングルユースバイオリアクター（ＡＢＬＥ社）を６チャネルマグネチックスターラー（エイブル社）に装着し、４５ｒｐｍの速度で攪拌しながら３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で浮遊培養を行った。
上記で得られた内胚葉系細胞から原始腸管細胞（Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ Ｇｕｔ Ｔｕｂｅ；ＰＧＴ）へ分化誘導した。具体的には、０．２５％ＢＳＡ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ、１×ＮＥＡＡ、０．４×ＰＳ、５０ｎｇ／ｍＬ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＦＧＦ７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、１％Ｂ２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ社）、０．３％ＩＴＳ－Ｘ、０．５μｍｏｌ／Ｌ ＥＣ２３、０．３μｍｏｌ／Ｌ ＩＬＶ（Ｉｎｄｏｌａｃｔａｍ Ｖ）、０．２μｍｏｌ／Ｌ ＬＤＮ１９３１８９、０．２５μｍｏｌ／Ｌ ＳＡＮＴ１を含むＲＰＭＩ１６４０培地で２から３日間浮遊培養した。浮遊培養は３０ｍＬシングルユースバイオリアクター（ＡＢＬＥ社）を６チャネルマグネチックスターラー（エイブル社）に装着し、５５ｒｐｍの速度で攪拌しながら３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で浮遊培養を行った。
上記で得られた原始腸管細胞（ＰＧＴ）から後前腸細胞（Ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ Ｆｏｒｅ Ｇｕｔ、ＰＦＧ）へ分化誘導した。具体的には、０．１５％ＢＳＡ、０．４×ＰＳ、１×ＮＥＡＡ、１％Ｂ２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ社）、０．３％ＩＴＳ－Ｘ、５０ｎｇ／ｍＬ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＦＧＦ７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、０．５μｍｏｌ／Ｌ ＥＣ２３、１μｍｏｌ／Ｌ ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（Ｗａｋｏ社）、０．２５μｍｏｌ／Ｌ ＳＡＮＴ１を含むＤＭＥＭ（８ｍＭグルコース含有）で４日間浮遊培養した。浮遊培養は３０ｍＬシングルユースバイオリアクター（ＡＢＬＥ社）を６チャネルマグネチックスターラー（エイブル社）に装着し、５５ｒｐｍの速度で攪拌しながら３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で浮遊培養を行った。
上記で得られた後前腸細胞（ＰＦＧ）から膵臓前駆細胞（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ、ＰＰ）へ分化誘導した。具体的には、０．１５％ＢＳＡ、０．４×ＰＳ、１×ＮＥＡＡ、５０ｎｇ／ｍＬ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＦＧＦ１０（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、１％Ｂ２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ社）、０．３％ＩＴＳ－Ｘ、０．０４μｍｏｌ／Ｌ ＥＣ２３、０．３μｍｏｌ／Ｌ ｉｎｄｏｌａｃｔａｍ Ｖ（ＩＬＶ；Ｃａｙｍａｎ社）、０．２μｍｏｌ／Ｌ ＬＤＮ１９３１８９、０．２５μｍｏｌ／Ｌ ＳＡＮＴ１、１０μｍｏｌ／Ｌ Ａｌｋ５ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＩ（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ社；ＲｅｐＳｏｘ）、５μｍｏｌ／Ｌ ＺｎＳＯ４を含むＤＭＥＭ（８ｍＭグルコース含有）で３日間浮遊培養した。浮遊培養は３０ｍＬシングルユースバイオリアクター（ＡＢＬＥ社）を６チャネルマグネチックスターラー（エイブル社）に装着し、５５ｒｐｍの速度で攪拌しながら３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で浮遊培養を行った。
上記で得られた膵臓前駆細胞（ＰＰ）から膵内分泌前駆細胞（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ、ＥＰ）へ分化誘導した。具体的には、０．１５％ＢＳＡ、０．４×ＰＳ、２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１％Ｂ２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ社）、０．３％ＩＴＳ－Ｘ、２０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、５０ｎｇ／ｍＬ Ｅｘｅｎｄｉｎ４、０．０２μｍｏｌ／Ｌ ＥＣ２３、０．２μｍｏｌ／Ｌ ＬＤＮ１９３１８９、０．２５μｍｏｌ／Ｌ ＳＡＮＴ１、１０μｍｏｌ／Ｌ Ａｌｋ５ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＩ（ＲｅｐＳｏｘ）、０．５μｍｏｌ／Ｌ ＤＢＺ、１０μｍｏｌ／Ｌ Ｙ２７６３２、５μｍｏｌ／Ｌ ＺｎＳＯ４、１０ｎｇ／ｍＬ Ｈｅｐａｒｉｎ、５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅを含むＤＭＥＭ（２０ｍＭグルコース含有）で７日間浮遊培養した。浮遊培養は３０ｍＬシングルユースバイオリアクター（ＡＢＬＥ社）を６チャネルマグネチックスターラー（エイブル社）に装着し、５５ｒｐｍの速度で攪拌しながら３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で浮遊培養を行った。
上記で得られた膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）から膵臓β細胞へ分化誘導した。具体的には、０．１５％ＢＳＡ、０．４×ＰＳ、２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１％Ｂ２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ社）、０．３％ＩＴＳ－Ｘ、１０ｎｇ／ｍＬ ＢＭＰ４、５０ｎｇ／ｍＬ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ （ＨＧＦ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、５０ｎｇ／ｍＬ ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ １（ＩＧＦ１；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、１０μｍｏｌ／Ｌ Ａｌｋ５ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＩ（ＲｅｐＳｏｘ）、５０ｎｇ／ｍＬ Ｅｘｅｎｄｉｎ４、５ｍｍｏｌ／Ｌ ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ社）、５μｍｏｌ／Ｌ ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（Ｗａｋｏ社）、５μｍｏｌ／Ｌ ＺｎＳＯ４、１０ｎｇ／ｍＬ Ｈｅｐａｒｉｎを含むＤＭＥＭ（２０ｍＭグルコース含有）で１０日間浮遊培養した。これにより得られた細胞をｉＰＳ－β細胞と称する。浮遊培養は３０ｍＬシングルユースバイオリアクター（ＡＢＬＥ社）を６チャネルマグネチックスターラー（エイブル社）に装着し、５５ｒｐｍの速度で攪拌しながら３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で浮遊培養を行った。
［実施例１］
原始腸管細胞（ＰＧＴ）までは比較例１と同様の方法にて製造し、前記原始腸管細胞（ＰＧＴ）から後前腸細胞（ＰＦＧ）への分化誘導は、０．１５％ＢＳＡ、０．４×ＰＳ、１×ＮＥＡＡ、１％Ｂ２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ社）、０．３％ＩＴＳ－Ｘ、５０ｎｇ／ｍＬ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＦＧＦ７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、０．５μｍｏｌ／Ｌ ＥＣ２３、０．３μｍｏｌ／Ｌ ＩＬＶ（Ｉｎｄｏｌａｃｔａｍ Ｖ）、０．２μｍｏｌ／Ｌ ＬＤＮ１９３１８９、０．２５μｍｏｌ／Ｌ ＳＡＮＴ１を含むＤＭＥＭ（８ｍＭグルコース含有）で４日間浮遊培養した。浮遊培養は３０ｍＬシングルユースバイオリアクター（ＡＢＬＥ社）を６チャネルマグネチックスターラー（エイブル社）に装着し、５５ｒｐｍの速度で攪拌しながら３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で浮遊培養を行った。膵臓前駆細胞（ＰＰ）への分化誘導、膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）への分化誘導、及び膵臓β細胞への分化誘導は比較例１と同様の方法にて培養した。
［実施例２］
内胚葉系細胞までは比較例１と同様の方法にて製造し、前記内胚葉系細胞から原始腸管細胞（ＰＧＴ）への分化誘導は、０．２５％ＢＳＡ、０．４×ＰＳ、１×ＮＥＡＡ、１％Ｂ２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ社）、０．３％ＩＴＳ－Ｘ、５０ｎｇ／ｍＬ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＦＧＦ７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で３日間浮遊培養した。浮遊培養は３０ｍＬシングルユースバイオリアクター（ＡＢＬＥ社）を６チャネルマグネチックスターラー（エイブル社）に装着し、５５ｒｐｍの速度で攪拌しながら３７℃のＣＯ２インキュベーター内で浮遊培養を行った。後前腸細胞（ＰＦＧ）、膵臓前駆細胞（ＰＰ）、膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）及び膵臓β細胞への分化誘導については、実施例１と同様の方法にて培養した。
［参考例１］
＜多能性幹細胞の維持培養＞
ヒトｉＰＳ細胞株ＴＫＤＮ４－Ｍ(東京大学医科学研究所)はＭＩＴＯＭＹＣＩＮ－Ｃ(ＷＡＫＯ社)で処理をしたＳＮＬ ＦＥＥＤＥＲ細胞上でヒトｉＰＳ細胞培地(２０％ ＫＮＯＣＫＯＵＴ ＳＥＲＵＭ ＲＥＰＬＡＣＥＭＥＮＴ（ＫＳＲ；ＧＩＢＣＯ社)、１×ＮＯＮ－ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ（ＮＥＡＡ；ＷＡＫＯ社)、５５μｍｏＬ／Ｌ ２－ＭＥＲＣＡＰＴＥＴＨＡＮＯＬ（２－ＭＥ；ＧＩＢＣＯ社)、７．５ｎｇ／ＭＬ ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ ＨＵＭＡＮ ＦＩＢＲＯＢＬＡＳＴ ＧＲＯＷＴＨ ＦＡＣＴＯＲ（ＦＧＦ２；ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）、０．５×ＰＥＮＩＣＩＬＬＩＮ ＡＮＤ ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＩＮ （ＰＳ；ＷＡＫＯ社）を含むＤＭＥＭ／ＨＡＭ‘Ｓ Ｆ１２（ＷＡＫＯ社））で未分化維持培養を行った。または、ＶＩＴＲＯＮＥＣＴＩＮ（ＧＩＢＣＯ）でコーティングしたプレート上で、１×ＰＥＮＩＣＩＬＬＩＮ ＡＮＤ ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＩＮ ＡＮＤ ＡＭＰＨＯＴＥＲＩＣＩＮ Ｂ（ＷＡＫＯ社）を含むＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ８培地（Ｅ８；ＧＩＢＣＯ社）で未分化維持培養した。なお、播種時のみ最終濃度１０μＭとなるように Ｙ２７６３２を添加して培養した。培養は、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で行った。
＜多能性幹細胞の前培養＞
維持培養にて得られた細胞集団を、ＴｋＤＮ４－Ｍ株は Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ－Ｃで処理をしたＳＮＬｆｅｅｄｅｒ細胞上で、４５４Ｅ２株はＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎでコートしたディッシュ上で、２０％Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、１×ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ、５５μｍｏｌ／Ｌ ２－メルカプトエタノール、７．５ｎｇ／ｍＬ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、０．５×Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ａｎｄ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２にて、フィーダー細胞又はディッシュ上に接着させた状態で培養を１日間行った。培養は、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で行った。
＜膵臓β細胞への分化誘導＞
膵臓β細胞への分化誘導は、Yabe SG, Fukuda S, Takeda F, Nashiro K, Shimoda M, Okochi H. Efficient generation of functional pancreatic β-cells from human induced pluripotent stem cells. J Diabetes. 2017 Feb;9(2):168-179に記載の方法に基づいて実施した。
前培養にて得られた細胞集団を、まずは内胚葉系細胞 (胚体内胚葉：Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｅｎｄｏｄｅｒｍ：ＤＥ)へ分化誘導した。具体的には、最初の２日間は、０．５％Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ 、０．４×ＰＳ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ、１×ＮＥＡＡ、８０ｎｇ／ｍＬ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎアクチビンＡ、５０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ２、２０ｎｇ／ｍＬ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、３μｍｏｌ／Ｌ ＣＨＩＲ９９０２１を含むＲＰＭＩ１６４０でディッシュ上に接着させた状態で培養した。３日目はこの培地からＣＨＩＲ９９０２１を除いてディッシュ上に接着させた状態で培養を行い、４日目はさらに１％（体積／体積） ＫＳＲを加えた培地でディッシュ上に接着させた状態で培養を１日間行った。培養は、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で行った。
上記で得られた内胚葉系細胞を原始腸管細胞（ＰＧＴ）へ分化誘導した。具体的には０．５％ＢＳＡ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ、１×ＮＥＡＡ、０．４×ＰＳ、５０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ２、５０ｎｇ／ｍＬ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＦＧＦ７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、２％Ｂ２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ社）、０．６７μｍｏｌ／Ｌ ＥＣ２３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）、１μｍｏｌ／Ｌ ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（Ｗａｋｏ社）、１０μｍｏｌ／Ｌ ＳＢ４３１５４２（ｗａｋｏ社）、０．２５ｍｏｌ／Ｌ ＳＡＮＴ１（Ｗａｋｏ社）を含むＲＰＭＩ１６４０で２日間培養した。培養は、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で行った。
上記で得られた原始腸管細胞（ＰＧＴ）から後前腸細胞（ＰＦＧ）へ分化誘導した。具体的には０．４×ＰＳ、１×ＮＥＡＡ、５０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ２、２％ Ｂ２７、０．６７μｍｏｌ／Ｌ ＥＣ２３、１μｍｏｌ／Ｌ ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、１０μｍｏｌ／Ｌ ＳＢ４３１５４２、０．２５μｍｏｌ／Ｌ ＳＡＮＴ１を含むＤＭＥＭ－ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｗａｋｏ社）で４日間培養した。培養は、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で行った。
上記で得られた後前腸細胞（ＰＦＧ）から膵臓前駆細胞（ＰＰ）へ分化誘導した。具体的には０．４×ＰＳ、１×ＮＥＡＡ、５０ｎｇ／ｍＬ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＦＧＦ１０（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、２％Ｂ２７、０．５μｍｏｌ／Ｌ ＥＣ２３、１μｍｏｌ／Ｌ ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、０．２５μｍｏｌ／Ｌ ＳＡＮＴ１、５μｍｏｌ／Ｌ Ａｌｋ５ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＩ（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ社）、０．３μｍｏｌ／Ｌ ｉｎｄｏｌａｃｔａｍ Ｖ（ＩＬＶ；Ｃａｙｍａｎ社）を含むＤＭＥＭ－ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅで３日間培養した。培養は、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で行った。
上記で得られた膵臓前駆細胞（ＰＰ）から膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）へ分化誘導した。具体的には、０．４×ＰＳ、２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、２％Ｂ２７、０．２μｍｏｌ／Ｌ ＥＣ２３、１μｍｏｌ／Ｌ ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、０．２５μｍｏｌ／Ｌ ＳＡＮＴ１、５μｍｏｌ／Ｌ Ａｌｋ５ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＩ（ＲｅｐＳｏｘ）、５０ｎｇ／ｍＬ Ｅｘｅｎｄｉｎ４（Ｓｉｇｍａ社）を含むＡｄｖａｎｃｅｄ－ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社）で３日間培養した。培養は、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で行った。
上記で得られた膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）から膵臓β細胞（以下、「ｉＰＳ－β細胞」と記載することもある）へ分化誘導した。具体的には、０．４×ＰＳ、２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、２％Ｂ２７、１０ｎｇ／ｍＬ ＢＭＰ４、１０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ２、５０ｎｇ／ｍＬ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ （ＨＧＦ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、５０ｎｇ／ｍＬ ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ １（ＩＧＦ１；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、５μｍｏｌ／Ｌ Ａｌｋ５ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＩ（ＲｅｐＳｏｘ）、５０ｎｇ／ｍＬ Ｅｘｅｎｄｉｎ４、５ｍｍｏｌ／Ｌ ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ社）、５μｍｏｌ／Ｌ ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（Ｗａｋｏ社）を含むＡｄｖａｎｃｅｄ－ＤＭＥＭで６日間培養した。培養は、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で行った。
＜定量的ＲＴ－ＰＣＲ＞
分化誘導したｉＰＳ－β細胞のｔｏｔａｌＲＮＡをＩＳＯＧＥＮ（Ｗａｋｏ社）により単離・精製し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＩＩ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社）を用いてｃＤＮＡの合成を行った。ここで合成したｃＤＮＡを鋳型とし、ＧｏＴａｑ ｑＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使いＭｙｉＱ ｑＰＣＲ ｍａｃｈｉｎｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）により定量ＰＣＲを実行した。検出はＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎによるインターカレーション法で、遺伝子発現量比較は比較Ｃｔ法による相対定量法で行った。各遺伝子の発現レベルはハウスキーピング遺伝子であるＯＡＺ１またはβ－Ａｃｔｉｎにより標準化した。
定量ＰＣＲに使用したプライマーの塩基配列は次のとおりである。
OAZ1 F：GTC AGA GGG ATC ACA ATC TTT CAG（配列番号１）
OAZ1 R：GTC TTG TCG TTG GAC GTT AGT TC（配列番号２）
INS F：TTG TGA ACC AAC ACC TGT GC（配列番号３）
INS R：GTG TGT AGA AGA AGC CTC GTT CC（配列番号４）
NKX6.1 F：ATC TTC GCC CTG GAG AAG AC（配列番号５）
NKX6.1 R：CGT GCT TCT TCC TCC ACT TG（配列番号６）
β-Actin F：CCT CAT GAA GAT CCT CAC CGA（配列番号７）
β-Actin R：TTG CCA ATG GTG ATG ACC TGG（配列番号８）
GNAS F：ACA TCA TTC AGC GCA TGC AC（配列番号９）
GNAS R：GTA GGC CGC CTT AAG CTT TC （配列番号１０）
GCK F：CAG CTT GAC CAG ACC TAG AC（配列番号１１）
GCK R：CAT CCC AGA ATC ACA AGC CA（配列番号１２）
CD44 F：GAG TCA AGA AGG TGG AGC AA（配列番号１３）
CD44 R：TGG TCT GGA GTT TCT GAC GA（配列番号１４）
LIG1 F：TGT GTT TGT ACG CCT TCG AC（配列番号１５）
LIG1 R：ACT GAC TGC TCC AGG AAC TC（配列番号１６）
ADCY1 F：GGG ACT CGA CAT GAT TGA TAC C（配列番号１７）
ADCY1 R：ACT GTT CCT CTC ATG TCC GTA A（配列番号１８）
ADCY2 F：GAG CAT CTT ATA CGC TGA CAT C（配列番号１９）
ADCY2 R：CAG TTC TTG GCA TGG TTA GG（配列番号２０）
PLCB4 F：TGC AAA GGA ACA CAG TAC CA（配列番号２１）
PLCB4 R：CTC GGA TTT CTT GCT CCT CA（配列番号２２）
SMAD9 F：AGG TCA TGC TTT CAG AAC GA（配列番号２３）
SMAD9 R：CGT ACT CCA TCA CAA AGT ACA G（配列番号２４）
＜測定の結果＞
遺伝子発現量を測定した結果を図１に示す。
実施例１の方法にて得られたｉＰＳ－β細胞を、参考例１及び比較例１の方法にて得られたｉＰＳ－β細胞と比較すると、実施例１の方法にて得られたｉＰＳ－β細胞のＮＫＸ６．１遺伝子の発現が高かいことが明らかとなった（図１）。すなわち、多能性幹細胞から分化誘導された原始腸管細胞を、本発明の方法にて培養し、膵臓β細胞を製造すると、膵臓β細胞への分化誘導効率が向上することが明らかとなった。また、比較例１と実施例１では、原始腸管細胞（ＰＧＴ）から後前腸細胞（ＰＦＧ）への分化誘導時に使用する培養条件のみが異なっており、膵臓前駆細胞（ＰＰ）、膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）及び膵臓β細胞の製造方法は同一の方法であることから、膵臓β細胞への効率的な分化誘導を達成するためには、原始腸管細胞（ＰＧＴ）から後前腸細胞（ＰＰ）への分化誘導工程が重要であることが示唆される。すなわち、原始腸管細胞（ＰＧＴ）を、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化剤の存在下において培養することにより、膵臓β細胞への分化誘導効率を向上させることができるといえる。
［網羅的遺伝子発現解析］
各分化段階（ＰＦＧ、ＰＰ、ＥＰ、ｉＰＳ－β）の細胞について、網羅的遺伝子発現解析を行った。
＜ＲＮＡ抽出＞
実施例１または参考例１に記載の方法で培養して分化誘導したＰＦＧ細胞、ＰＰ細胞、ＥＰ細胞およびｉＰＳ－β細胞のｔｏｔａｌＲＮＡをＩＳＯＧＥＮ（Ｗａｋｏ社）により単離・精製した。
＜ＤＮＡマイクロアレイ解析＞
抽出したｔｏｔａｌＲＮＡを用いて、ＤＮＡマイクロアレイ解析を行った。
（１）ｃＲＮＡ合成
３’ＩＶＴ ＰＬＵＳ ＲｅａｇｅｎｔＫｉｔを用いてｃＲＮＡ合成を行った。方法はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）推奨プロトコールに準ずる。ｔｏｔａｌＲＮＡ（１００ｎｇ）から逆転写反応によりｃＤＮＡを作製した。作製したｃＤＮＡからｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎにより、ｃＲＮＡに転写してビオチン標識を行った。
（２）ハイブリダイゼーション
標識ｃＲＮＡ（１２．５μｇ）をハイブリダイゼーションバッファーに加え、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ２．０Ａｒｒａｙ上で１６時間のハイブリダイゼーションを行った。ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｓｔａｔｉｏｎ ４５０にて洗浄・フィコエリスリン染色後、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｓｃａｎｎｅｒ ３０００ ７Ｇでスキャンを行い、ＡＧＣＣ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｃｏｍｍａｎｄ Ｃｏｎｓｏｌｅ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ）にて画像解析、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＣｏｎｓｏｌｅTMを用いて数値化を行った。
なお、上記（１）、（２）の各工程については、は株式会社理研ジェネシスが提供する、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製ＤＮＡマイクロアレイ「ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）：Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ Ａｒｒａｙ」を使用した受託解析サービスを利用した（https://rikengenesis.jp/contents/ja_JPY/microarray_affymetrix.html）。本受託解析サービスは、サンプル（トータルＲＮＡ等）を提供するだけで、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）を使用した網羅的遺伝子発現プロファイル解析を行ってくれるものである。
＜ＤＮＡマイクロアレイデータを用いたエンリッチメント解析＞
データの統計解析はＲ ｖｅｒｓｉｏｎ３．４．２およびＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ｖｅｒｓｉｏｎ３．６（The R Foundation for Statistical Computing, 2017）を用いて実施した。また、エンリッチメント解析はＴｈｅ Ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ, Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ （ＤＡＶＩＤ） ６．８ (National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), NIH) を利用した (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp) 。
上記ＤＮＡマイクロアレイ解析によって得られたＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ａｒｒａｙデータ（ＣＥＬファイル）並びに参考例１に記載の方法で培養して分化誘導した原始腸管細胞集団由来のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ａｒｒａｙデータ（ＣＥＬファイル）をＲｅａｄＡｆｆｙ（）関数でＲに読み込んだ。その後、ｒｍａ（）関数を用いてマイクロアレイデータの正規化を行った。この ｒｍａ（）関数はＲｏｂｕｓｔ Ｍｕｌｔｉ－ａｒｒａｙ Ａｖｅｒａｇｅ（ＲＭＡ）法を実施する関数である(Irizarry R, Hobbs B, Collin F, Beazer-Barclay Y, Antonellis K, Scherf U, Speed T. Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data. Biostatistics. 2003;4:249.) 。ＲＭＡ法は現在、最も一般的に用いられている正規化方法のひとつであり、Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｃｏｒｒｅｃｔｉｎｇ、Ｎｏｒｍａｌｉｚｉｎｇ、Ｃａｌｃｕｌａｔｉｎｇ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎを一括して行う。なお、ＲＭＡ法はｐｅｒｆｅｃｔ ｍａｔｃｈ（ＰＭ）値に対して底が２の対数変換を施して正規化処理を実施するため、正規化後の結果も底が２の対数変換値で出力される。
次に、正規化後のシグナルについて、実施例１に記載の方法で培養して分化誘導した原始腸管細胞集団由来のシグナル値と参考例１に記載の方法で培養して分化誘導した原始腸管細胞集団由来のシグナル値の差分を計算した。
ＲＭＡ法による正規化後のシグナルは底が２の対数変換が成されている。ゆえに、シグナルの差分は ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅに対する底が２の対数変換値である（ｌｏｇ２（ｘ） －ｌｏｇ２（ｙ）＝ｌｏｇ２（ｘ／ｙ））。よって、差分に対して逆変換を行うことで、ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅを計算した。その後、ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅが２以上の転写産物と、０．５以下の転写産物を抽出して、それぞれ発現変動遺伝子とした。今回の実験では各条件のサンプルの反復はないこと、およびサンプル数が１であることから、ｔ検定やそれに関連する、仮説検定手法に基づく発現変動遺伝子の選択ができない。そのため、一般的に使用されている基準として、ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅが２以上および０．５以下という基準を採用した。Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ が２以上あるいは０．５以下の転写産物をエンリッチメント解析の対象とした。
エンリッチメント解析とは、発現変動遺伝子のうち、機能の多いものを解析する手法であり、アノテーション解析のひとつである。例えば、発現変動遺伝子は確率論的に転写因子が相対的に多いのか、細胞周期が多いのか、等を解析することが可能である。上記の解析で選択された転写産物リストを、発現量などの情報は除いてＤＡＶＩＤに読み込ませ、エンリッチメント解析を実施した。ＤＡＶＩＤでは様々なエンリッチメント解析が可能であるが、多数の解析を実施することによる多重性のリスクを低減するために、今回はＫＥＧＧ ｐａｔｈｗａｙ 解析に限定して解析を実施した。
ＫＥＧＧｐａｔｈｗａｙ解析は、ＤＡＶＩＤがＫｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ（ＫＥＧＧ） データベース (www.genome.jp/kegg/) にアクセスし、転写産物リストと相関が高いｐａｔｈｗａｙを統計的に抽出することで実施される。Ｐａｔｈｗａｙ毎に相関性に対するｐ値が表示されるが、一度に多数のｐａｔｈｗａｙに対して仮説検定を実施するため、ＤＡＶＩＤでは様々な多重性調整ｐ値を算出することが可能である。今回の解析では、その中でも、マイクロアレイ解析で最も一般的に用いられているＢｅｎｊａｍｉｎｉ-Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を用いることとした (Benjamini, Y; Hochberg, Y (1995). "Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing". Journal of the Royal Statistical Society, Series B. 57 (1): 289-300.) 。Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ-Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法で算出された調整ｐ値を用いて、シグナルセットと相関の高いｐａｔｈｗａｙ を選択した。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法でさらに多重性を調整して、調整ｐ値が０．０５／２０＞０．００３３＝３．３－Ｅ３未満であるときに、当該ｐａｔｈｗａｙを統計的に有意な ｐａｔｈｗａｙ であると判断することとした。
エンリッチメント解析の結果、参考例１に記載の方法で培養して分化誘導したＰＦＧ細胞に比べて、実施例１に記載の方法で培養して分化誘導したＰＦＧ細胞では、パスウェイ名「Maturity onset diabetes of the young」に関する遺伝子発現が向上しており、パスウェイ名「Viral myocarditis」および「Proteoglycans in cancer」に関する遺伝子発現が低下していた。これらの遺伝子の発現発現量が変動することにより、ＰＦＧ細胞への分化効率が向上したと考えらえる。各パスウェイにおいて発現が変動していた遺伝子については、表１～３に示す。
また、参考例１に記載の方法で培養して分化誘導した膵臓前駆細胞（ＰＰ）に比べて、実施例１に記載の方法で培養して分化誘導した膵臓前駆細胞（ＰＰ）では、パスウェイ名「Maturity onset diabetes of the young」、パスウェイ名「Morphine addiction」、パスウェイ名「GABAergic synapse」、パスウェイ名「Dopaminergic synapse」、パスウェイ名「Retrograde endocannabinoid signaling」、パスウェイ名「Serotonergic synapse」、パスウェイ名「Insulin secretion」、パスウェイ名「Glutamatergic synapse」、パスウェイ名「Circadian entrainment」、パスウェイ名「Amphetamine addiction」、パスウェイ名「Neuroactive ligand-receptor interaction」、パスウェイ名「cAMP signaling pathway」、およびパスウェイ名「Alcoholism」に関する複数の遺伝子の発現が向上しており、パスウェイ名「p53 signaling pathway」、パスウェイ名「Focal adhesion」、パスウェイ名「PI3K-Akt signaling pathway」、パスウェイ名「ECM-receptor interaction」、およびパスウェイ名「Graft-versus-host disease」に関する複数の遺伝子の発現が低下していた。各パスウェイにおいて発現が変動していた遺伝子については、表４～２１に示す。さらに、上記に含まれる遺伝子について定量的ＲＴ－ＰＣＲによる発現解析を上記の方法で行ったところ、例えば、ＧＮＡＳ遺伝子およびＧＣＫ遺伝子については、参考例１または比較例１と比較して実施例１で発現が向上しており、またＣＤ４４遺伝子については、参考例１または比較例１と比較して実施例１で発現が低下していた（図４および表６５）。したがって、定量的ＲＴ－ＰＣＲによる発現解析の結果から得られたこれらの遺伝子の発現量が変動することにより、膵臓前駆細胞およびｉＰＳ－β細胞への分化効率が向上したと考えらえる。
また、参考例１に記載の方法で培養して分化誘導した膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）に比べて、実施例１に記載の方法で培養して分化誘導した膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）では、パスウェイ名「Insulin secretion」、パスウェイ名「Maturity onset diabetes of the young」、パスウェイ名「GABAergic synapse」、パスウェイ名「Dopaminergic synapse」、パスウェイ名「Synaptic vesicle cycle」、パスウェイ名「Glutamatergic synapse」、パスウェイ名「Retrograde endocannabinoid signaling」、パスウェイ名「cAMP signaling pathway」、パスウェイ名「Circadian entrainment」、パスウェイ名「Serotonergic synapse」、パスウェイ名「Alcoholism」、パスウェイ名「Morphine addiction」に関する複数の遺伝子の発現が向上しており、パスウェイ名「DNA replication」、パスウェイ名「Cell cycle」、パスウェイ名「Pathways in cancer」、パスウェイ名「Mismatch repair」、パスウェイ名「PI3K-Akt signaling pathway」、パスウェイ名「p53 signaling pathway」、パスウェイ名「Fanconi anemia pathway」、パスウェイ名「Homologous recombination」、パスウェイ名「ECM-receptor interaction」、パスウェイ名「Small cell lung cancer」に関する複数の遺伝子の発現が低下していた。各パスウェイにおいて発現が変動していた遺伝子については、表２２～４３に示す。さらに、上記に含まれる遺伝子について定量的ＲＴ－ＰＣＲによる発現解析を上記の方法で行ったところ、例えば、ＬＩＧ１遺伝子については、参考例１または比較例１と比較して実施例１で発現が低下していた（図５および表６６）。したがって、定量的ＲＴ－ＰＣＲによる発現解析の結果から得られたこれらの遺伝子の発現量が変動することにより、膵内分泌前駆細胞およびｉＰＳ－β細胞への分化効率が向上したと考えらえる。
また、参考例１に記載の方法で培養して分化誘導したｉＰＳ－β細胞に比べて、実施例１に記載の方法で培養して分化誘導したｉＰＳ－β細胞では、パスウェイ名「Dopaminergic synapse」、パスウェイ名「Insulin secretion」、パスウェイ名「Synaptic vesicle cycle」、パスウェイ名「GABAergic synapse」、パスウェイ名「Synaptic vesicle cycle」、パスウェイ名「GABAergic synapse」、パスウェイ名「Glutamatergic synapse」、パスウェイ名「Retrograde endocannabinoid signaling」、パスウェイ名「Circadian entrainment」、パスウェイ名「Alcoholism」、パスウェイ名「Serotonergic synapse」、パスウェイ名「Cholinergic synapse」、パスウェイ名「Morphine addiction」、パスウェイ名「Adrenergic signaling in cardiomyocytes」、パスウェイ名「Maturity onset diabetes of the young」に関する複数の遺伝子の発現が向上しており、パスウェイ名「Cell cycle」、パスウェイ名「ECM-receptor interaction」、パスウェイ名「PI3K-Akt signaling pathway」、パスウェイ名「Proteoglycans in cancer」、パスウェイ名「Pathways in cancer」、パスウェイ名「Focal adhesion」、パスウェイ名「DNA replication」、パスウェイ名「TGF-beta signaling pathway」に関する複数の遺伝子の発現が低下していた。パスウェイの詳細についてはKEGG pathway（http://www.genome.jp/kegg/pathway.html）を参照。各パスウェイにおいて発現が変動していた遺伝子については、表４４～６４に示す。これらの遺伝子の発現量が変動することにより、ｉＰＳ－β細胞への分化効率が向上したと考えらえる。さらに、上記に含まれる遺伝子について定量的ＲＴ－ＰＣＲによる発現解析を上記の方法で行ったところ、例えば、ＡＤＣＹ１遺伝子、ＡＤＣＹ２遺伝子およびＰＬＣＢ４遺伝子については、参考例１または比較例１と比較して実施例１で発現が向上しており、またＳＭＡＤ９遺伝子については、参考例１または比較例１と比較して実施例１で発現が低下していた（図６および表６７）。したがって、定量的ＲＴ－ＰＣＲによる発現解析の結果から得られたこれらの遺伝子の発現量が変動することにより、ｉＰＳ－β細胞への分化効率が向上したと考えらえる。
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＜マウスへの移植実験：血中ｃ－Ｐｅｐｔｉｄｅ濃度の分析＞
実施例１及び実施例２で得られたｉＰＳ－β細胞を、ＨＢＳＳで一回リンスした後に、３．３３μｇ／ｍＬのｉＭａｔｒｉｘ－５１１（Ｗａｋｏ社）を含むＨＢＳＳに懸濁し、懸濁した細胞をハミルトンシリンジ（ハミルトン社）により糖尿病モデルマウス（日本クレア社）の左腎被膜下に移植した（６×１０６個の細胞を投与 ）。糖尿病モデルＮＯＤ/ＳＣＩＤマウス作成は正常ＮＯＤ/ＳＣＩＤマウスの尾静脈から130mg/kgのｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ(ＳＴＺ；Ｓｉｇｍａ社)を投与する事により行った。移植後10週間後、12週間後及び14週間後のマウス血液サンプルを尾静脈からＦｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ ヘパリン処理ヘマトクリット管（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に採取し、遠心分離(10分、4℃、800x g)により血清を分離した後、マウス血中におけるヒトｃ－Ｐｅｐｔｉｄｅ濃度をＭｅｒｃｏｄｉａ Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｃ－ｐｅｐｔｉｄｅ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｍｅｒｃｏｄｉａ社）を用いて測定した。なお、比較のため、参考例１に記載の方法で調製したｉＰＳ－β細胞（４×１０６個）を移植したマウスにおける移植後１２週間後のマウス血中におけるヒトｃ－Ｐｅｐｔｉｄｅ濃度をＭｅｒｃｏｄｉａ Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｃ－ｐｅｐｔｉｄｅ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ Ｍｅｒｃｏｄｉａ社）を用いて測定した。
移植後のマウス血中におけるヒトｃ－Ｐｅｐｔｉｄｅ濃度を図２に示す。
参考例１の方法で製造したｉＰＳ－β細胞を移植したマウス個体の血中では、移植後１２週間後に１００万個の移植細胞あたり平均３．５ｐＭのｃ－Ｐｅｐｔｉｄｅが検出された。一方で、実施例１の方法で製造したｉＰＳ－β細胞を移植したマウス個体の血中では、移植後１０週間後に１００万個の移植細胞あたり、平均４８．６ｐＭのｃ－Ｐｅｐｔｉｄｅが検出され、移植後１２週間後には、１００万個の移植細胞あたり、平均６８．２ｐＭのｃ－Ｐｅｐｔｉｄｅが検出された。また、実施例２の方法で製造したｉＰＳ－β細胞を移植したマウス個体の血中では、移植後１０週間後に１００万個の移植細胞あたり、平均７６．８ｐＭのｃ－Ｐｅｐｔｉｄｅが検出され、移植後１４週間後には、１００万個の移植細胞あたり、平均１０８．２ｐＭのｃ－Ｐｅｐｔｉｄｅが検出された。
ｃ－Ｐｅｐｔｉｄｅは、インスリンと１：１のモル比で膵臓β細胞から分泌されるタンパク質であり、ｃ－Ｐｅｐｔｉｄｅの濃度によって、膵臓β細胞から分泌されるインスリン量を推測できる。すなわち、上記結果によれば、実施例１及び２の方法で製造した膵臓β細胞は、参考例１で製造した膵臓β細胞と比較して、極めて多量のインスリンを分泌しており、糖尿病等を対象疾患とした細胞治療製剤として高い治療効果を有する膵臓β細胞であることが推測される。
したがって、本発明の方法によれば、膵臓β細胞への分化効率を向上させることが可能であり、また、本発明の方法により得られた、原始腸管細胞から分化誘導して得られた膵臓β細胞については、糖尿病等の治療において高い治療効果を期待できる。
＜マウスへの移植実験：糖尿病モデル実験＞
実施例２の方法で調製した原始腸管細胞から分化誘導して得られたｉＰＳ－β細胞を移植したマウス個体（図３実施例２）では、移植後４０日程度で血糖値が正常値（２００ｍｇ／ｄＬ以下）まで低下した。また、移植後１０１日目に腎摘出（移植細胞をマウスから除去）したところ、血糖値が再上昇しており、移植したｉＰＳ－β細胞が血糖値を制御していたことをわかる。これらの結果より、本発明の方法により得られた原始腸管細胞から分化誘導して得られた体細胞（膵臓β細胞）は、糖尿病の治療応用などにおいて、効果的であることが期待できる。

Claims (6)

  1. （ａ）多能性幹細胞から分化誘導された原始腸管細胞（ＰＧＴ）を、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化剤の存在下において培養することにより後前腸細胞（ＰＦＧ）を製造する工程：
    （ｂ）前記の後前腸細胞（ＰＦＧ）を、レチノイン酸又はそのアナログの存在下において培養することにより膵臓前駆細胞（ＰＰ）を製造する工程：
    （ｃ）前記の膵臓前駆細胞（ＰＰ）を、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤及びＲＯＣＫシグナル阻害剤の存在下において培養することにより膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）を製造する工程：及び
    （ｄ）前記の膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）をインスリン受容体シグナル活性化剤、トランスフェリン及び亜セレン酸の存在下において培養することにより膵臓β細胞を製造する工程：
    を含み、
    前記膵臓前駆細胞（ＰＰ）を、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤及びＲＯＣＫシグナル阻害剤の存在下において培養する工程が、ニコチンアミドを含む培地において培養する工程である、膵臓β細胞の製造方法。
  2. 多能性幹細胞から分化誘導された原始腸管細胞（ＰＧＴ）を、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化剤の存在下において培養する工程が、ＦＧＦ２の非存在下である、請求項１に記載の膵臓β細胞の製造方法。
  3. 膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）をインスリン受容体シグナル活性化剤、トランスフェリン及び亜セレン酸の存在下において培養する工程が、ＦＧＦ２の非存在下である、請求項１又は２に記載の膵臓β細胞の製造方法。
  4. 多能性幹細胞から分化誘導された原始腸管細胞（ＰＧＴ）が、多能性幹細胞を内胚葉系細胞に分化誘導できる条件下で培養する工程、および前記内胚葉系細胞から原始腸管細胞（ＰＧＴ）に分化誘導できる条件下で培養する工程により得られる細胞である、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
  5. 多能性幹細胞を内胚葉系細胞に分化誘導できる条件下で培養する工程が、多能性幹細胞を、ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地で培養した後、ＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地で培養する工程である、請求項４に記載の方法。
  6. 内胚葉系細胞を原始腸管細胞（ＰＧＴ）に分化誘導できる条件下で培養する工程が、内胚葉系細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤の非存在下において培養する工程である、請求項４又は５に記載の方法。
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