KR101773538B1 - 인간 배아 줄기 세포의 분화 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인슐린 생성 세포로의 만능 줄기 세포의 분화를 촉진하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 NKX6.1 및 인슐린, 및 최소량의 글루카곤을 공동-발현하는 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 생성 방법을 제공한다.

Description

인간 배아 줄기 세포의 분화{DIFFERENTIATION OF HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS}
본 출원은 전문이 본 명세서에 참고로 포함된, 2009년 12월 23자로 출원된 미국 가출원 제61/289,671호의 이익을 주장한다.
본 발명은 인슐린 생성 세포로의 만능 줄기 세포의 분화를 촉진하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 NKX6.1 및 인슐린, 및 최소량의 글루카곤을 공동-발현하는 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 생성 방법을 제공한다.
제I형 당뇨병 및 이식가능한 랑게르한스섬의 부족에 대한 세포-대체 치료법에서의 진전에서는 생착 (engraftment)에 적절한 인슐린-생산 세포, 또는 β 세포의 공급원을 개발하는 데 관심이 집중되었다. 한 가지 접근법은 예를 들어 배아 줄기 세포와 같은 만능 줄기 세포로부터의 기능성 β 세포의 생성이다.
척추동물 배아 발생에서, 만능성 세포는 낭배형성 (gastrulation)으로 알려진 과정에서 삼배엽층 (외배엽, 중배엽, 및 내배엽)을 포함하는 세포군을 생성한다. 예를 들어, 갑상선, 흉선, 췌장, 소화관, 및 간과 같은 조직은 중간 단계를 통해 내배엽으로부터 발생할 것이다. 이 과정에서 중간 단계는 완성 내배엽 (definitive endoderm)의 형성이다. 완성 내배엽 세포는 HNF3 베타, GATA4, MIXL1, CXCR4 및 SOX17과 같은 많은 마커를 발현한다.
췌장의 형성은 완성 내배엽의 췌장 내배엽으로의 분화로부터 생긴다. 췌장 내배엽의 세포는 췌장-십이지장 호메오박스 (homeobox) 유전자, Pdx1을 발현한다. Pdx1의 부재 하에서는, 췌장은 복측 원기 (ventral bud) 및 배측 원기 (dorsal bud)의 형성 이상으로는 발달하지 못한다. 따라서, Pdx1 발현이 췌장 기관형성에서 중요한 단계를 특징짓는다. 성숙한 췌장은 다른 세포형 중에서도 외분비 조직 및 내분비 조직을 포함한다. 외분비 및 내분비 조직은 췌장 내배엽의 분화로부터 생긴다.
췌도 세포의 특징을 지닌 세포가 마우스의 배아 세포로부터 유도된 것으로 보고되었다. 예를 들어, 루멜스키 (Lumelsky) 등 (문헌[Science 292:1389, 2001])은 마우스 배아 줄기 세포가 췌도와 유사한 인슐린 분비 구조로 분화한 것을 보고하였다. 소리아 (Soria) 등 (문헌[Diabetes 49:157, 2000])은 마우스 배아 줄기 세포로부터 유도된 인슐린 분비 세포가 스트렙토조토신 유도된 당뇨 마우스에서 혈당을 정상화시킴을 보고하였다.
일 예에서, 호리 (Hori) 등 (문헌[PNAS 99: 16105, 2002])은 마우스 배아 줄기 세포를 포스포이노시티드 3-키나아제의 억제제 (LY294002)로 처리하여 β 세포와 닮은 세포를 생성하였음을 기술하였다.
다른 예에서는, 블리츠주크 (Blyszczuk) 등 (문헌[PNAS 100:998, 2003])은 구성적으로 Pax4를 발현하는 마우스 배아 줄기 세포로부터 인슐린 생산 세포를 생성하는 것을 보고하였다.
미칼레프(Micallef) 등은 PDX1 양성 췌장 내배엽이 형성되게 하는 배아 줄기 세포의 책무 (commitment)를 레티노산이 조절할 수 있음을 보고하였다. 레티노산은 배아에서 낭배형성의 마지막에 해당하는 기간 동안 배아 줄기 세포 분화의 4일째에 배양물에 첨가될 때 Pdx1 발현을 유도하는 데 가장 효과적이다 (문헌[Diabetes 54:301, 2005]).
미야자키 (Miyazaki) 등은 Pdx1을 과다 발현하는 마우스 배아 줄기 세포주를 보고한다. 그들의 결과는 외인성 Pdx1 발현이 생성된 분화된 세포에서 인슐린, 소마토스태틴, 글루코키나아제, 뉴로제닌3, p48, Pax6 및 Hnf6 유전자의 발현을 명백히 향상시켰음을 보여준다 (문헌[Diabetes 53: 1030, 2004]).
스쿠디 (Skoudy) 등은 액티빈 (activin) A (TGF-β 슈퍼패밀리의 구성원)가 마우스 배아 줄기 세포에서 외분비 췌장 유전자 (p48 및 아밀라아제) 및 내분비 유전자 (Pdx1, 인슐린, 및 글루카곤)의 발현을 상향조절함을 보고하였다. 최대 효과는 1 nM 액티빈 A를 이용할 때 관찰되었다. 또한, 이들은 인슐린 및 Pdx1 mRNA의 발현 수준이 레티노산에 의해 영향을 받지 않았으나; 3nM FGF7 처리가 Pdx1에 대한 전사체의 증가된 수준을 야기하였음을 관찰하였다 (문헌[Biochem. J. 379: 749, 2004]).
쉬라키 (Shiraki) 등은 배아 줄기 세포의 PDX1 양성 세포로의 분화를 특이적으로 향상시키는 성장 인자들의 영향을 연구하였다. 이들은 TGF-β2가 재현가능하게 더 높은 비율의 PDX1 양성 세포를 생성함을 관찰하였다 (문헌[Genes Cells. 2005 Jun; 10(6): 503-16]).
고든(Gordon) 등은 Wnt 신호전달 억제제와 함께 액티빈의 존재 하에 그리고 혈청의 부재 하에, 마우스 배아 줄기 세포로부터 브라키어리(brachyury) [양성]/HNF3 베타 [양성] 내배엽 세포의 유도를 보여주었다 (미국 특허 공개 제2006/0003446A1호).
고든(Gordon) 등 (문헌[PNAS, Vol 103, page 16806, 2006])은 "Wnt 및 TGF-베타/ 노달 (nodal)/ 액티빈 신호전달은 전방 원시선 (anterior primitive streak)의 생성에 동시에 필요하였다"라고 진술한다.
그러나, 배아 줄기 세포 발생의 마우스 모델은 예를 들어, 인간과 같은 고등 포유류에서의 발생 프로그램을 정확하게 모방하지 않을 수 있다.
톰슨 (Thomson) 등은 인간 배반포로부터 배아 줄기 세포를 단리하였다 (문헌[Science 282:114, 1998]). 동시에, 기어하트 (Gearhart)와 동료들은 태아 생식선 조직으로부터 인간 배아 배 (human embryonic germ, hEG) 세포주를 유도하였다 (문헌[Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998]). 백혈병 억제 인자 (LIF)와 함께 배양함으로써 간단하게 분화를 방지할 수 있는 마우스 배아 줄기 세포와는 달리, 인간 배아 줄기 세포는 매우 특별한 조건 하에서 유지되어야 한다 (미국 특허 제6,200,806호; 국제특허출원공개 WO 99/20741호; 국제특허출원공개 WO 01/51616호).
드'아무르(D'Amour) 등은 고농도의 액티빈과 저 혈청의 존재 하에서 인간 배아 줄기 세포-유래 완성 내배엽의 농축 배양물의 생성을 개시한다 (문헌[Nature Biotechnology 2005]). 마우스의 신장 피막하에 이들 세포를 이식하면 일부 내배엽 기관의 특징을 가진 보다 성숙한 세포로의 분화가 야기되었다. 인간 배아 줄기 세포-유래 완성 내배엽 세포는 FGF-10의 첨가 후에 Pdx1 양성 세포로 추가로 분화될 수 있다 (미국 특허 출원 공개 제2005/0266554A1호).
드'아무르 등 (문헌[Nature Biotechnology - 24, 1392 - 1401 (2006)])은 "우리는 인간 배아 줄기 (hES) 세포를 췌장 호르몬 인슐린, 글루카곤, 소마토스태틴, 췌장 폴리펩티드 및 그렐린을 합성할 수 있는 내분비 세포로 전환시키는 분화 방법을 개발하였다"고 밝혔다. 이 과정은 도중에 완성 내배엽, 창자관 내배엽, 췌장 내배엽, 및 내분비 전구체를 닮은 단계들을 통해 세포를 내분비 호르몬 발현 세포가 되도록 함으로써 생체내 (in vivo) 췌장 기관형성을 모방한다고"밝혔다.
다른 예에서, 피스크 (Fisk) 등은 인간 배아 줄기 세포로부터 췌도 세포를 생성하는 시스템을 보고하였다 (미국 특허 출원 공개 제2006/0040387A1호). 이 경우에, 분화 경로를 세 단계로 나누었다. 인간 배아 줄기 세포를 먼저 소듐 부티레이트와 액티빈 A의 조합을 이용하여 내배엽으로 분화시켰다. 이어서, EGF 또는 베타셀룰린과 조합된 노긴 (Noggin)과 같은 TGF-β 길항제를 이용하여 세포를 배양하여 PDX1 양성 세포를 생성하였다. 마지막 분화는 니코틴아미드에 의해 유도되었다.
일 예에서, 벤베니스트리 (Benvenistry) 등은 "우리는 PDX1의 과발현이 췌장의 풍부한 유전자의 발현을 향상시켰고, 인슐린 발현의 유도는 단지 생체 내에서만 존재하는 추가의 신호를 필요로 할 수 있는 것으로 결론짓는다"고 명시하였다 (문헌[Benvenistry et al, Stem Cells 2006; 24:1923-1930]).
다른 예에서, 그래핀-보튼 (Grapin-Botton) 등은 "Ngn3의 조기 활성화는 췌장 조상세포의 풀을 고갈시키면서 글루카곤+ 세포를 거의 배타적으로 유도하였다. E11.5에서와 같이, PDX-1 조상세포는 인슐린 [양성] 및 PP [양성] 세포로의 분화에 대하여 적격성으로 되었다"라고 명시하였다(문헌[Johansson KA et al, Developmental Cell 12, 457-465, March 2007]).
예를 들어, 디에즈 (Diez) 등은 "9 및 10주에, 글루카곤 양성 세포의 대부분은 인슐린을 공동-발현하였지만, 별개의 오직 인슐린 양성 세포가 이들 단계에서 명백하게 검출가능하였다. 인슐린 및 글루카곤을 공동-발현하는 세포가 전체 연구 기간(9 내지 21주) 동안 관찰되었으나, 이들은 단지 적은 분획의 전체 인슐린 및 글루카곤 발현 세포만을 나타내었다"고 명시하였다 (문헌[J Histochem Cytochem. 2009 Sep;57(9):811-24. 2009 Apr 13]).
일 예에서, 첸 (Chen) 등은 "(-)-인돌락탐 V [(ILV)]가 단백질 키나아제 C 신호전달을 활성화시키며, 이미 내분비 계통으로 수임된 hESC의 췌장 지정을 지시하며...ILV 및 레티노산은 관련 메커니즘을 통해 기능하고...ILV는 레티노산이 그러한 것보다 더 강한 PDX-1 발현의 유도를 보였다."고 명시하였다 (문헌[Nature Chemical Biology 5, 195-196 (April 2009) doi:10.1038/nchembio0409-195]).
라이틀 (Lyttle) 등은 "NKX6-1은 오직 인슐린 세포와 공동-국소화되며, 이는 NKX6-1이 배타적으로 인간 베타 세포 발생에 수반되는 것을 나타낸다."고 명시하였다 (문헌[Diabetologia 2008 Jul: 51(7):1169-80, 2008]).
따라서, β 세포와 더욱 밀접하게 유사한 작용성 인슐린 발현 세포를 생성하기 위한 시험관 내 방법을 개발하는 것이 여전하게 상당히 필요하다. 본 발명은 NKX6.1 및 인슐린, 및 최소량의 글루카곤을 공동-발현하는 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포 집단을 생성함으로써 인슐린 발현 세포를 향한 인간 배아 줄기 세포의 분화 효율을 향상시키는 대안적인 접근법을 취한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 NKX6.1 및 인슐린, 및 최소량의 글루카곤을 공동-발현하는 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 제공한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 만능 줄기 세포의 집단을, NKX6.1 및 인슐린, 및 최소량의 글루카곤을 공동-발현하는 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화시키는 방법을 제공하며, 이는
a. 만능 줄기 세포를 배양하는 단계,
b. 만능 줄기 세포를 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계,
c. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계, 및
d. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 단백질 키나아제 C 활성화제가 보충된 배지로의 처리에 의하여, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 NKX6.1 및 인슐린, 및 최소량의 글루카곤을 공동-발현하는 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계를 포함한다.
<도 1>
도 1은 본 발명의 세포에서 인슐린 및 글루카곤의 발현에서의 TPB 처리의 영향을 나타낸다. 패널 a 및 b는 각각 TPB로 처리한 세포에서의 인슐린 및 글루카곤의 발현을 보여준다. 세포의 대조군 집단을 패널 c 및 d에 나타내었다.
<도 2>
도 2는 본 발명의 방법에 따라 처리한 세포에서 인슐린 및 글루카곤의 발현에서의 다양한 농도의 TPB의 영향을 보여준다. 패널 a 내지 d는 지정된 용량으로 TPB로 처리한 세포의 집단에서의 인슐린 및 글루카곤의 발현을 보여준다.
<도 3>
도 3은 본 발명의 방법에 따라 처리한 세포에서 인슐린 및 글루카곤의 발현에서의 단백질 키나아제 C 억제제의 영향을 보여준다. 패널 a는 TPB로 처리한 세포에서의 인슐린 및 글루카곤의 발현을 도시하며, 패널 c는 해당하는 DAPI 염색을 도시한다. 패널 b는 TPB 및 Gㅦ 6976으로 처리한 세포에서의 인슐린 및 글루카곤의 발현을 도시하며, 패널 d는 해당하는 DAPI 염색을 도시한다.
<도 4>
도 4는 본 발명의 방법에 따라 처리한 세포에서 인슐린의 발현에서의 단백질 키나아제 C 활성화제의 영향을 보여준다. 패널 a는 TPB로 처리한 세포 내의 인슐린의 발현을 보여준다. 패널 b는 ILV로 처리한 세포 내의 인슐린의 발현을 보여준다. 패널 c는 PMA로 처리한 세포 내의 인슐린의 발현을 보여준다.
<도 5>
도 5는 본 발명의 방법에 따라 처리한 세포 내의 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커의 발현을 보여준다. 패널은 인슐린 및 NKX6.1 (패널 a), 인슐린 및 PDX1 (패널 b), 인슐린 및 NEUROD1 (패널 c), 인슐린 및 소마토스태틴 (패널 d) 및 인슐린 및 그렐린 (패널 e)의 발현을 도시한 것이다.
<도 6>
도 6은 본 발명의 방법에 따라 처리한 세포 내의 인슐린 및 글루카곤의 발현을 보여준다. 패널 a 내지 c는 DMEM-고 글루코스 + 1% B27 + 50ng/㎖ FGF7 + 0.25μM 사이클로파민- KAAD + 2 μM 레티노산 (RA) + 100ng/㎖의 노긴 + 20ng/㎖ 액티빈 A + p38 키나아제 억제제 (미국 특허 제US6,214,830호에 개시, 2.5μM)로 4일 동안 처리한 세포에서의 인슐린 발현 (패널 a), 글루카곤 발현 (패널 b) 및 DAPI 염색 (패널 c)을 보여준다 (단계 3, 처리 8, 실시예 2). 패널 d 내지 f는 DMEM-고 글루코스 + 1% B27 + 0.25μM 사이클로파민- KAAD + 2μM 레티노산 (RA) + 100 ng/㎖의 노긴으로 4일 동안 처리한 세포에서의 인슐린 발현 (패널 d), 글루카곤 발현 (패널 e) 및 DAPI 염색 (패널 f)를 보여준다 (단계 3, 처리 9, 실시예 2).
<도 7>
도 7은 인간 C-펩티드가 본 발명의 세포를 제공하고 4, 8 및 12주 후에 글루코스 챌린지 (challenge) 후의 (SCID) - 베이지 (Bg) 마우스에서 검출되었음을 보여준다.
<도 8>
도 8은 지정된 농도에서 다양한 단백질 키나아제 C 억제제의 처리 후에 수득한 PDX1 및 NKX6.1을 공동-발현하는 세포의 백분율을 보여준다.
<도 8>
도 9는 실시예 6에 기재된 방법에 따라 처리한 세포 내의 NGN3, PDX1, NKX6.1 및 PTF1 알파의 발현을 보여준다.
개시내용을 분명하게 하고 제한되지 않기 위해, 본 발명의 상세한 설명은 본 발명의 특정 특징, 실시형태 또는 출원을 기술 또는 예시하는 하기 부문으로 구분된다.
정의
줄기 세포는 단일 세포 레벨에서 자가 재생하고 분화하여 자가 재생 조상세포, 비재생 조상세포, 및 최종 분화 세포를 비롯한 자손 세포 (progeny cell)를 생성하는 그의 능력에 의해 규정되는 미분화 세포이다. 줄기 세포는 또한 다수의 배엽층 (내배엽, 중배엽 및 외배엽)으로부터 다양한 세포 계통의 기능성 세포로 시험관 내에서 (in vitro) 분화하는 그의 능력, 및 이식 후 다수의 배엽층의 조직을 발생시키며, 배반포 내로의 주입 후, 전부는 아니더라도 대부분의 조직에 실질적으로 기여하는 그의 능력을 특징으로 한다.
줄기 세포는 그들의 발생 잠재력에 의해 분류된다: (1) 모든 배아 및 배아외 세포 유형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 전능성; (2) 모든 배아 세포 유형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 만능성; (3) 세포 계통의 하위세트이지만 모두 특정 조직, 기관 또는 생리학적 시스템 내에 있는 하위세트가 생기게 할 수 있음을 의미하는 다능성 (예를 들어, 조혈 줄기 세포 (hematopoietic stem cell, HSC)는 HSC (자가-재생), 혈구 세포 제한된 소기능성 (oligopotent) 조상세포 및 혈액의 정상 성분인 모든 세포 유형 및 요소 (예를 들어, 혈소판)를 포함하는 자손을 생성할 수 있음); (4) 다능성 줄기 세포보다 더 제한된 하위세트의 세포 계통이 될 수 있음을 의미하는 소기능성; 및 (5) 단일 세포 계통 (예를 들어, 정자발생 줄기 세포)이 생기게 할 수 있음을 의미하는 단일기능성.
분화는 특화되지 않은 ("미결된") 또는 덜 특화된 세포가 예를 들어, 신경 세포 또는 근육 세포와 같은 특화된 세포의 특징을 획득하는 과정이다. 분화된 또는 분화-유도된 세포는 세포의 계통 내에서 보다 특화된 ("결정된 (committed)") 위치를 차지한 것이다. 분화 과정에 적용될 때, 용어 "결정된"은 분화 경로에서, 통상적인 환경하에서 특정 세포형 또는 세포형의 서브세트로 계속 분화할 것이며, 통상적인 환경하에서 다른 세포형으로 분화할 수 없거나 덜 분화된 세포형으로 돌아갈 수 없는 시점까지 진행한 세포를 말한다. 탈분화 (De-differentiation)는 세포가 세포의 계통 내의 덜 특화된 (또는 결정된) 위치로 되돌아가는 과정을 말한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 세포의 계통은 세포의 유전, 즉 어느 세포로부터 왔는지 그리고 어떤 세포가 생성되게 할 수 있는지를 규정한다. 세포의 계통은 세포를 발생과 분화의 유전적 체계 내에 둔다. 계통 특이적 마커는 관심있는 계통의 세포의 표현형과 특이적으로 관련되며 미결정 세포가 관심있는 계통으로 분화하는지를 평가하기 위해 사용될 수 있는 특징을 말한다.
본 명세서에 사용되는 "완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포", 또는 "단계 1 세포", 또는 "단계 1"은 하기의 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: SOX17, GATA4, HNF3 베타, GSC, CER1, 노달, FGF8, 브라키어리, 믹스-유사 (Mix-like) 호메오박스 단백질, FGF4 CD48, 에오메소더민 (eomesodermin, EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 또는 OTX2. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포, 원시선 세포, 중내배엽 세포 및 완성 내배엽 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 "췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: PDX1, NKX6.1, HNF1 베타, PTF1 알파, HNF6, HNF4 알파, SOX9, HB9 또는 PROX1. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포, 원시 창자관 (primitive gut tube) 세포, 및 후방 전장 (posterior foregut) 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "완성 내배엽"은 낭배 동안 외피 (epiblast)로 인한 세포의 특징을 갖고 위장관로 및 그의 유도체를 형성하는 세포를 말한다. 완성 내배엽 세포는 하기 마커를 발현한다: HNF3 베타, GATA4, SOX17, 세르베루스 (Cerberus), OTX2, 구스코이드 (goosecoid), C-Kit, CD99 및 MIXL1.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "마커"는 관심있는 세포에서 차등적으로 발현되는 핵산 또는 폴리펩티드 분자이다. 이와 관련하여, 차등 발현은 양성 마커의 수준 증가 및 음성 마커의 수준 감소를 의미한다. 마커 핵산 또는 폴리펩티드의 검출가능한 레벨은 다른 세포에 비하여 대상 세포에서 충분히 더 높거나 더 낮아, 대상 세포가 당업계에 알려진 다양한 방법 중 임의의 것을 이용하여 다른 세포로부터 확인되어 구별될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "췌장 내분비 세포", 또는 "췌장 호르몬 발현 세포", 또는 "췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기의 호르몬 중 적어도 하나를 발현할 수 있는 세포를 말한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스태틴, 및 췌장 폴리펩티드.
만능 줄기 세포의 단리, 증식 및 배양
만능 줄기 세포의 특성화
만능 줄기 세포는 단계-특이적 배아 항원 (stage-specific embryonic antigen, SSEA) 3 및 4, 및 Tra-1-60 및 Tra-1-81로 표기되는 항체를 이용하여 검출가능한 마커 중 하나 이상을 발현할 수 있다 (문헌[Thomson et al., Science 282:1145, 1998]). 시험관 내에서 만능 줄기 세포의 분화는 SSEA-4, Tra 1-60, 및 Tra 1-81 발현(존재하는 경우)의 손실 및 SSEA-1의 발현 증가로 이어진다. 미분화된 만능 줄기 세포는 전형적으로 알칼리성 포스파타아제 활성을 가지며, 이 활성은 상기 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 이어서 제조사 (미국 캘리포니아주 벌링게임 소재의 벡터 래보러토리즈 (Vector Laboratories))가 설명한 바와 같이, 기질로서 벡터 레드 (Vector Red)를 이용하여 발색시킴으로써 검출될 수 있다. 미분화된 만능 줄기 세포는 또한 전형적으로 RT-PCR에 의해 검출할 때, OCT4 및 TERT를 발현한다.
증식된 만능 줄기 세포의 다른 바람직한 표현형은 모든 삼배엽층의 세포, 즉 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 조직으로 분화하는 능력이다. 만능 줄기 세포의 만능성은 예를 들어, 세포를 중증 복합형 면역결핍증 (severe combined immunodeficient, SCID) 마우스내로 주사하고, 형성되는 기형종을 4% 파라포름알데히드를 이용하여 고정하고, 이어서 삼배엽층으로부터의 세포 유형의 증거에 대해 그들을 조직학적으로 조사함으로써 확인할 수 있다. 대안적으로, 다능성은 배양체 (embryoid body)를 형성하고, 삼배엽층과 관련된 마커들의 존재에 대해 배양체를 평가함으로써 결정될 수 있다.
증식된 만능 줄기 세포주는 표준 G-밴딩 기술을 이용하여 핵형을 결정하고 상응하는 영장류 종의 공개된 핵형과 비교할 수 있다. "정상 핵형"을 가진 세포를 얻는 것이 필요하며, 이는 세포가 모든 인간 염색체가 존재하며 눈에 띄게 변경되지 않은 정배수체임을 의미한다.
만능 줄기 세포의 공급원
사용될 수 있는 만능 줄기 세포의 유형은 임신 후 형성된 조직으로부터 유도되는 구축된 만능 세포주를 포함하고, 이러한 조직에는 전-배아 조직 (예를 들어, 배반포), 배아 조직, 또는 전형적으로 본질적으로는 대략 10 내지 12주의 임신 전이 아닌 임신 동안의 임의의 때에 취해진 태아 조직이 포함된다. 비제한적인 예로는 수립된 인간 배아 줄기 세포주 또는 인간 배아 생식 세포주, 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포주 H1, H7, 및 H9 (WiCell)가 있다. 이러한 세포의 초기 수립 또는 안정화 시에 본 명세서의 조성물의 사용도 고려되며, 이 경우에는 공급원 세포는 공급원 조직으로부터 직접 취한 일차 다능성 세포일 것이다. 영양 세포의 부재 하에서 이미 배양된 만능 줄기 세포 집단으로부터 취한 세포가 또한 적합하다. 돌연변이 인간 배아 줄기 세포주, 예를 들어, BG01v (BresaGen (Athens, GA))가 또한 적합하다.
일 실시형태에서, 인간 배아 줄기 세포는 톰슨 (Thomson) 등에 의해 기재된 바와 같이 제조된다(미국 특허 제5,843,780호; 문헌 [Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998]; 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995])에 개시된 바와 같이 제조된다.
만능 줄기 세포의 배양
일 실시형태에서, 만능 줄기 세포는 전형적으로 다양한 방식으로 만능 줄기 세포를 지지하는 영양 세포층 상에서 배양된다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 본질적으로 영양 세포가 없지만, 그럼에도 불구하고 실질적인 분화를 거치지 않고 만능 줄기 세포의 증식을 지지하는 배양 시스템에서 배양된다. 영양세포가 없는 배양에서 분화 없는 만능 줄기 세포의 성장은 이전에 다른 세포 유형을 이용하여 배양함으로써 조절된 배지를 이용하여 지지된다. 대안적으로, 영양세포가 없는 배양에서 분화 없는 만능 줄기 세포의 성장은 화학적 규명 배지를 이용하여 지지된다.
예를 들어, 레우비노프 (Reubinoff) 등 (문헌 [Nature Biotechnology 18: 399 - 404 (2000)]) 및 톰슨 등 (문헌 [Science 6 November 1998: Vol. 282. no. 5391, pp. 1145 - 1147])은 마우스 배아 섬유아세포 영양 세포층을 사용하여 인간 배반포로부터 만능 줄기 세포주를 배양하는 것을 개시하고 있다.
리차즈 (Richards) 등 (문헌 [Stem Cells 21: 546-556, 2003])은 인간 만능 줄기 세포 배양을 지지하는 능력에 대해 11가지 상이한 인간 성인, 태아 및 신생아 영양 세포층의 패널을 평가하였다. 리차즈 등은 "성인 피부 섬유아세포 영양세포 상에서 배양된 인간 배아 줄기 세포주는 인간 배아 줄기 세포 형태를 유지하며 만능으로 남아 있다"고 진술한다.
미국 특허 출원 공개 제20020072117호는 영양세포가 없는 배양에서 영장류 만능 줄기 세포의 성장을 지지하는 배지를 생성하는 세포주를 개시하고 있다. 이용된 세포주는 배아 조직으로부터 얻어지거나 배아 줄기 세포로부터 분화된 중간엽 및 섬유아세포-유사 세포주이다. 미국 특허 출원 공개 제20020072117호는 또한 일차 영양 세포층으로서의 당해 세포주의 사용을 개시하고 있다.
다른 예에서는, 왕 (Wang) 등 (문헌 [Stem Cells 23: 1221-1227, 2005])은 인간 배아 줄기 세포로부터 유래된 영양 세포층 상에서 인간 만능 줄기 세포의 장기 성장을 위한 방법을 개시하고 있다.
다른 예에서는, 스토코빅 (Stojkovic) 등 (문헌 [Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005])은 인간 배아 줄기 세포의 자발적 분화로부터 유래된 영양 세포 시스템을 개시하고 있다.
추가의 예에서, 미야모토 (Miyamoto) 등 (문헌 [Stem Cells 22: 433-440, 2004])은 인간 태반으로부터 수득한 영양 세포의 공급원을 개시하고 있다.
아미트 (Amit) 등 (문헌[Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003])은 인간 포피로부터 유래된 영양 세포층을 개시하고 있다.
다른 예에서, 인준자 (Inzunza) 등 (문헌 [Stem Cells 23: 544-549, 2005])은 인간 신생아 포피 섬유아세포로부터의 영양 세포층을 개시하고 있다.
미국 특허 제6642048호는 영양세포가 없는 배양에서 영장류 만능 줄기 (primate pluripotent stem, pPS) 세포의 성장을 지지하는 배지 및 그러한 배지의 생성에 유용한 세포주를 개시한다. 미국 특허 제6642048호는 "본 발명은 배아 조직으로부터 얻어지거나 배아 줄기 세포로부터 분화된 중간엽 및 섬유아세포-유사 세포주를 포함한다. 그러한 세포주를 유도하고, 배지를 가공하고, 조절된 배지를 이용하여 줄기 세포를 성장시키는 방법이 이 개시 내용에 기재되고 예시된다. "라고 진술한다.
다른 예에서, 국제특허 공개 WO2005014799호는 포유류 세포의 유지, 증식 및 분화를 위한 조절된 배지를 개시한다. 국제 특허 제WO2005014799호는 "본 발명에 따라 생성된 배양 배지는 뮤린 세포, 특히 MMH (Met 뮤린 간세포 (Met Murine Hepatocyte))로 불리는, 분화되고 무한증식화된 트랜스제닉 (transgenic) 간세포의 세포 분비 활성에 의해 조절된다"고 진술한다.
다른 예에서, 수(Xu) 등 (문헌[Stem Cells 22: 972-980, 2004])은 인간 텔로머라아제 역전사효소를 과다 발현하도록 유전적으로 변형된 인간 배아 줄기 세포 유도체로부터 얻은 조절된 배지를 개시한다.
다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20070010011호는 만능 줄기 세포의 유지를 위한 화학적으로 규명된 배양 배지를 개시한다.
대안적인 배양 시스템은 배아 줄기 세포의 증식을 촉진할 수 있는 성장 인자로 보충된 무-혈청 배지를 이용한다. 예를 들어, 천 (Cheon) 등 (문헌[BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, October 19, 2005])은 배아 줄기 세포 자가-재생을 일으킬 수 있는 상이한 성장 인자로 보충된 비조절된 혈청 대체(serum replacement, SR) 배지에서 배아 줄기 세포가 유지되는 영양세포가 없는 무-혈청 배양 시스템을 개시한다.
다른 예에서, 레벤스타인 (Levenstein) 등 (문헌[Stem Cells 24: 568-574, 2006])은 bFGF가 보충된 배지를 이용하여, 섬유아세포 또는 조절된 배지의 부재 하에서 인간 배아 줄기 세포의 장기 배양을 위한 방법을 개시하였다.
다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20050148070호는 혈청 없이 그리고 섬유아세포 영양 세포 없이 규명된 배지에서 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 방법을 개시하였으며, 이 방법은 알부민, 아미노산, 비타민, 미네랄, 적어도 하나의 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체물, 적어도 하나의 인슐린 또는 인슐린 대체물을 함유한 배양 배지에서 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 상기 배양 배지는 본질적으로 포유류 태아 혈청이 없으며, 섬유아세포 성장 인자 신호전달 수용체를 활성화시킬 수 있는 섬유아세포 성장 인자를 적어도 약 100 ng/㎖ 함유하며, 여기서 성장 인자는 단지 섬유아세포 영양세포층 이외의 공급원으로부터 공급되며, 배지는 영양 세포 또는 조절된 배지 없이 미분화된 상태로 줄기 세포의 증식을 지지한다.
다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20050233446호는 미분화 영장류 원시 줄기 세포를 비롯한 줄기 세포를 배양하는 데 유용한 규명된 배지를 개시한다. 용액에서, 배지는 배양되는 줄기 세포와 비교할 때 사실상 등장성이다. 주어진 배양물에서, 특정 배지는 기본 배지 및 원시 줄기 세포의 사실상 미분화된 성장을 지지하는 데 필요한 양의 bFGF, 인슐린 및 아스코르브산 각각을 포함한다.
다른 예에서, 미국 특허 제6800480호는 "일 실시형태에서, 사실상 미분화된 상태의 영장류-유래 원시 줄기 세포를 성장시키기 위한 세포 배양 배지가 제공되며 이 배지는 영장류-유래 원시 줄기 세포의 성장을 지지하기에 효과적인 저 삼투압, 저 내독소 기본 배지를 포함한다. 기본 배지는 영장류-유래 원시 줄기 세포의 성장을 지지하기에 효과적인 영양 혈청과, 영양 세포 및 영양 세포로부터 유래된 세포외 매트릭스 성분으로 이루어진 군으로부터 선택된 기질과 조합된다. 배지는 추가로 비필수 아미노산, 산화방지제, 및 뉴클레오시드와 피루베이트염으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 성장 인자를 포함한다."고 진술한다.
다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20050244962호는 "일 태양에서 본 발명은 영장류 배아 줄기 세포를 배양하는 방법을 제공한다. 본질적으로 포유류 태아 혈청이 없는(바람직하게는 또한 본질적으로 임의의 동물 혈청이 없는) 배지에서 그리고 단지 섬유아세포 영양 세포층 이외의 공급원으로부터 공급된 섬유아세포 성장 인자의 존재 하에서 줄기 세포를 배양한다. 바람직한 형태에서, 이전에는 줄기 세포 배양을 지속하기 위해 필요했던 섬유아세포 영양세포층이 충분한 섬유아세포 성장 인자의 첨가에 의해 불필요해지게 된다."고 진술한다.
추가의 예에서, 국제특허 공개 WO2005065354호는 본질적으로 영양세포가 없는 그리고 무혈청인 규명된 등장성 배양 배지를 개시하며, 이 배지는 a. 기본 배지; b. 사실상 미분화된 포유류 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 bFGF; c. 사실상 미분화된 포유류 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 인슐린; 및 d. 사실상 미분화된 포유류 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 아스코르브산을 포함한다.
다른 예에서, 국제특허 공개 WO2005086845호에는 미분화 줄기 세포의 유지 방법이 개시되어 있는데, 상기 방법은 줄기 세포를 원하는 결과를 성취하기에 충분한 양의 시간 동안 미분화 상태로 유지하기에 충분한 양의 형질전환 성장 인자-베타 (transforming growth factor-beta, TGF-β) 패밀리의 단백질류의 구성원, 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 패밀리의 단백질류의 구성원 또는 니코틴아미드 (NIC)에 줄기 세포를 노출시키는 것을 포함한다.
만능 줄기 세포는 적합한 배양 기재 상에 도말될 수 있다. 일 실시형태에서, 적합한 배양 기재는 세포외 매트릭스 성분, 예를 들어, 기저막으로부터 유래된 것들, 또는 부착 분자 수용체-리간드 커플링의 일부를 형성할 수 있는 것들이다. 일 실시형태에서, 적절한 배양 기재는 매트리겔 (Matrigel) (등록상표) (벡턴 디킨슨 (Becton Dickenson))이다. 매트리겔 (등록상표)은 실온에서 젤화하여 재구성된 기저막을 형성하는 엔젤브레스-홈-스왐 (Engelbreth-Holm Swarm) 종양 세포 유래의 용해성 제제이다.
다른 세포외 매트릭스 성분 및 성분 혼합물이 대안으로서 적합하다. 증식되는 세포 유형에 따라, 이것은 라미닌, 피브로넥틴, 프로테오글리칸, 엔탁틴, 헤파란 설페이트 등을 단독으로 또는 다양한 조합으로 포함할 수 있다.
만능 줄기 세포는 적합한 분포로 그리고 세포 생존, 증식, 및 바람직한 특징의 보유를 촉진하는 배지의 존재 하에서 기재상에 도말될 수 있다. 모든 이들 특성은 씨딩(seeding) 분포에 세심한 주의를 기울여 이익을 얻으며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
적합한 배양 배지는 하기 성분들, 예를 들어, 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)(DMEM), 깁코(Gibco) # 11965-092; 넉아웃(Knockout) 둘베코 변형 이글 배지 (KO DMEM), 깁코 #10829-018; 햄(Ham's) F12/50% DMEM 기본 배지; 200 mM L-글루타민, 깁코 # 15039-027; 비-필수 아미노산 용액, 깁코 11140-050; β-메르캅토에탄올, 시그마(Sigma) # M7522; 인간 재조합 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 깁코 # 13256-029로부터 제조될 수 있다.
만능 줄기 세포로부터의 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성
일 실시형태에서, 본 발명은 만능 줄기 세포로부터 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 생성하는 방법을 제공하며, 이는
a. 만능 줄기 세포를 배양하는 단계,
b. 만능 줄기 세포를 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계,
c. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계, 및
d. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 태양에서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 NKX6.1 및 인슐린, 및 최소량의 글루카곤을 공동-발현한다.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로의 만능 줄기 세포의 분화
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성은 특정 프로토콜을 이행하기 전후에 마커의 존재에 대해 시험함으로써 결정될 수 있다. 만능 줄기 세포는 전형적으로 최소량의 이러한 마커를 발현한다. 따라서, 만능 세포의 분화는 세포가 그들을 발현하기 시작할 때 검출된다.
만능 줄기 세포는 당업계의 임의의 방법에 의해 또는 본 발명에서 제안된 임의의 방법에 의해 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 23, 1534 - 1541 (2005)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[Shinozaki et al, Development 131, 1651 - 1662(2004)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[McLean et al, Stem Cells 25 , 29 - 38 (2007)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 혈청 부재 하에서 액티빈 A를 함유하는 배지에서 만능 줄기 세포를 배양하고, 이어서 액티빈 A와 혈청을 이용하여 세포를 배양하고, 이어서 상이한 농도의 액티빈 A와 혈청을 이용하여 세포를 배양함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다. 이러한 방법의 예는 문헌[Nature Biotechnology 23, 1534 - 1541 (2005)]에 개시된다.
예를 들어 만능 줄기 세포는 혈청 부재 하에서 액티빈 A를 함유하는 배지에서 만능 줄기 세포를 배양하고, 이어서 다른 농도의 혈청 및 액티빈 A를 이용하여 세포를 배양함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다. 이 방법의 예는 문헌[D' Amour et al, Nature Biotechnology, 2005]에 개시된다.
예를 들어 만능 줄기 세포는 혈청 부재 하에서 액티빈 A와 Wnt 리간드를 함유하는 배지에서 만능 줄기 세포를 배양하고, 이어서 Wnt 리간드를 제거하고 혈청 및 액티빈 A를 이용하여 세포를 배양함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다. 이 방법의 예는 문헌[Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 라이프스캔 인코포레이티드(LifeScan, Inc.)에 허여된, 미국 특허 출원 제11/736,908호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 라이프스캔 인코포레이티드에 허여된, 미국 특허 출원 제11/779,311호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 라이프스캔 인코포레이티드에 허여된, 미국 특허 출원 제60/990,529호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 라이프스캔 인코포레이티드에 허여된, 미국 특허 출원 제61/076,889호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 라이프스캔 인코포레이티드에 허여된, 미국 특허 출원 제61/076,900호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 라이프스캔 인코포레이티드에 허여된, 미국 특허 출원 제61/076,908호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 라이프스캔 인코포레이티드에 허여된, 미국 특허 출원 제61/076,915호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로의 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 분화
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 당업계의 임의의 방법에 의해 또는 본 발명에서 제안된 임의의 방법에 의해 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 문헌 [DAmour et al, Nature Biotechnol. 24:1392-1401, 2006]에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
일 실시형태에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 PDX1, NKX6.1을 공동-발현하나, 최소량의 CDX2 및 NGN3도 공동-발현한다.
일 실시형태에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 FGF7로 보충된 제1 배지에서 배양하고, 이어서 상기 세포를 FGF7, BMP를 억제할 수 있는 인자, TGFβ 수용체 작용제, 레티노산 및 헤지호그 신호전달 경로 억제제로 보충된 제2 배지에서 배양함으로써, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 PDX1, NKX6.1을 공동-발현하나, 최소량의 CDX2 및 NGN3도 공동-발현하는 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화된다.
일 실시형태에서, FGF7은 약 50 pg/㎖ 내지 약 50 ㎍/㎖의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, FGF7은 50 ng/㎖의 농도로 사용된다.
일 실시형태에서, BMP를 억제할 수 있는 인자는 노긴이다. 노긴은 약 500 ng/㎖ 내지 약 500 ㎍/㎖의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 노긴은 100 ng/㎖의 농도로 사용된다.
일 실시형태에서, TGFβ 수용체 작용제는 액티빈 A, 액티빈 B, TGFβ-I, TGFβ-II, GDF-8, 및 GDF-11로 이루어진 군으로부터 선택된다.
액티빈 A는 약 2 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 액티빈 A는 20 ng/㎖의 농도로 사용된다. 대안적인 실시형태에서, 액티빈 A는 50 ng/㎖의 농도로 사용된다.
액티빈 B는 약 2 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 액티빈 B는 20 ng/㎖의 농도로 사용된다. 대안적인 실시형태에서, 액티빈 B는 50 ng/㎖의 농도로 사용된다.
TGFβ-I은 약 2 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, TGFβ-I은 20 ng/㎖의 농도로 사용된다. 대안적인 실시형태에서, TGFβ-I은 50 ng/㎖의 농도로 사용된다.
TGFβ-II는 약 2 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, TGFβ-II는 20 ng/㎖의 농도로 사용된다. 대안적인 실시형태에서, TGFβ-II는 50 ng/㎖의 농도로 사용된다.
GDF-8은 약 2 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, GDF-8은 20 ng/㎖의 농도로 사용된다. 대안적인 실시형태에서, GDF-8은 50ng/㎖의 농도로 사용된다.
GDF-11은 약 2 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, GDF-11은 20 ng/㎖의 농도로 사용된다. 대안적인 실시형태에서, GDF-11은 50 ng/㎖의 농도로 사용된다.
레티노산은 약 1 nM 내지 약 1 mM의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 레티노산은 1 μM의 농도로 사용된다.
일 실시형태에서, 헤지호그 신호전달 경로 억제제는 사이클로파민-KAAD이다. 사이클로파민-KAAD는 약 0.025μM 내지 약 2.5 μM의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 사이클로파민-KAAD는 0.25 μM의 농도로 사용된다.
분화 효율은 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 의해 발현되는 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제 (예를 들어, 항체)에 처리된 세포 집단을 노출시킴으로써 결정될 수 있다.
배양되거나 단리된 세포에서 단백질 및 핵산 마커의 발현을 평가하는 방법은 당업계에서의 표준이다. 이들은 정량적 역전사효소 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR), 노던 블롯, 동소 (in situ) 혼성화 (예를 들어, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001 supplement)] 참고), 및 면역분석, 예를 들어, 단면 재료의 면역조직화학 분석, 웨스턴 블롯팅 및 온전한 세포에서 접근가능한 마커의 경우 유세포분석(FACS) (예를 들어 문헌[Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)] 참고)을 포함한다.
만능 줄기 세포의 특징은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 만능 줄기 세포의 추가의 특징은 계속 확인되고 있다. 만능 줄기 세포 마커는 예를 들어, ABCG2, 크립토 (cripto), FOXD3, 커넥신 (CONNEXIN)43, 커넥신45, OCT4, SOX2, 나노그, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, Tra 1-81.
만능 줄기 세포를 본 발명의 방법으로 처리한 후, 분화된 세포는 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 의해 발현된 CXCR4와 같은 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제 (예를 들어, 항체)에 처리된 세포 집단을 노출시켜 정제될 수 있다.
본 발명에 사용하기에 적합한 만능 줄기 세포는 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포주 H9 (NIH 코드: WA09), 인간 배아 줄기 세포주 H1 (NIH 코드: WA01), 인간 배아 줄기 세포주 H7 (NIH 코드: WA07), 및 인간 배아 줄기 세포주 SA002 (스웨덴 소재의 셀라르티스(Cellartis))를 포함한다. 만능 세포의 특징적인 하기 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 또한 본 발명에 사용하기에 적합하다: ABCG2, 크립토, CD9, FOXD3, 커넥신43, 커넥신45, OCT4, SOX2, 나노그, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60 및 Tra 1-81.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커는 SOX17, GATA4, HNF3 베타, GSC, CER1, 노달, FGF8, 브라키어리, 믹스-유사 호메오박스 단백질, FGF4, CD48, 에오메소더민 (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-키트, CD99 및 OTX2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포이다. 대안적인 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 중내배엽 세포이다. 대안적인 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 완성 내배엽 세포이다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커들은 PDX1, NKX6.1, HNF1 베타, PTF1 알파, HNF6, HNF4 알파, SOX9, HB9 및 PROX1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포이다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로의 분화
일 실시형태에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.
일 실시형태에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 PDX1, NKX6.1을 공동-발현하나, 최소량의 CDX2 및 NGN3도 공동-발현한다.
일 실시형태에서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 NKX6.1 및 인슐린, 및 최소량의 글루카곤을 공동-발현한다.
일 실시형태에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 BMP를 억제할 수 있는 인자, TGFβ 수용체 신호전달 억제제 및 단백질 키나아제 C 활성화제가 보충된 배지에서 배양함으로써, NKX6.1 및 인슐린, 및 최소량의 글루카곤을 공동-발현하는 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화된다.
일 실시형태에서, BMP를 억제할 수 있는 인자는 노긴이다. 노긴은 약 500 ng/㎖ 내지 약 500 ㎍/㎖의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 노긴은 100 ng/㎖의 농도로 사용된다.
일 실시형태에서, TGFβ 수용체 신호전달 억제제는 ALK5의 억제제이다. 일 실시형태에서, ALK5의 억제제는 ALK5 억제제 II이다. ALK5 억제제 II는 약 0.1 μM 내지 약 10 μM 농도로 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, ALK5 억제제 II는 1 μM의 농도로 사용된다.
일 실시형태에서, 단백질 키나아제 C 활성화제는 (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(트라이플루오로메틸)페닐)-2,4-펜타다이에노일아미노) 벤졸락탐, 인돌락탐 V 및 포르볼 (phorbol)-12-미리스테이트-13-아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 단백질 키나아제 C 활성화제는 (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(트라이플루오로메틸)페닐)-2,4-펜타다이에노일아미노) 벤졸락탐이다. (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(트라이플루오로메틸)페닐)-2,4-펜타다이에노일아미노) 벤졸락탐은 약 20nM 내지 약 500nM의 농도로 사용될 수 있다. (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(트라이플루오로메틸)페닐)-2,4-펜타다이에노일아미노) 벤졸락탐, 인돌락탐 V 및 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트는 본 명세서에서 "TPB"로 지칭된다.
췌장 내분비 계통의 특징적인 마커는 NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, NKX2.2, PAX4 및 PAX6으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 NKX6.1 및 인슐린, 및 최소량의 글루카곤을 공동-발현한다.
치료법
일 태양에서, 본 발명은 제1형 당뇨병을 앓고 있거나 제1형 당뇨병이 발병될 위험이 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 이 방법은 만능 줄기 세포를 배양하고, 만능 줄기 세포를 시험관 내에서 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키고, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 환자에게 이식하는 것을 수반한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 제2형 당뇨병을 앓고 있거나, 제2형 당뇨병이 발병될 위험이 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 이 방법은 만능 줄기 세포를 배양하고, 만능 줄기 세포를 시험관 내에서 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키고, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 환자에게 이식하는 것을 수반한다.
적절하다면, 환자는 이식된 세포의 생존과 기능을 촉진하는 약제 또는 생물활성제로 추가로 치료될 수 있다. 이러한 제제는 다른 것들 중에서, 예를 들어, 인슐린, TGF-β 패밀리의 구성원 (TGF-β1, 2, 및 3 포함), 골 형성 단백질 (BMP-2, -3, -4, -5, -6, -7, -11, -12, 및 -13), 섬유아세포 성장 인자-1 및 -2, 혈소판-유도 성장 인자-AA, 및 -BB, 혈소판 풍부한 혈장, 인슐린 성장 인자 (IGF-I, II) 성장 분화 인자 (GDF-5, -6, -7, -8, -10, -15), 혈관 내피 세포-유도 성장 인자 (VEGF), 플레이오트로핀 (pleiotrophin), 엔도텔린(endothelin)을 포함할 수 있다. 다른 약제학적 화합물은 예를 들어, 니코틴아미드, 글루카곤 유사 펩티드-I (GLP-1) 및 II, GLP-1 및 2 미메티바디, 엑센딘-4, 레티노산, 부갑상선 호르몬, MAPK 억제제, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2004/0209901호 및 제2004/0132729호에 개시된 화합물을 포함할 수 있다.
만능 줄기 세포는 수령체 내로 이식하기 전에 인슐린-생성 세포로 분화될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 만능 줄기 세포는 수여자에게 이식되기 전에, β-세포로 완전히 분화된다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 미분화 또는 부분 분화 상태로 수령체 내로 이식될 수 있다. 추가 분화는 수령체 내에서 일어날 수 있다.
완성 내배엽 세포 또는, 대안적으로, 췌장 내배엽 세포, 또는, 대안적으로, β 세포는 분산된 세포로서 이식되거나, 또는 간문맥으로 융합될 수 있는 클러스터로 형성될 수 있다. 대안적으로, 세포는 생체적합성 분해성 중합체성 지지체, 다공성 비분해성 장치로 제공되거나 또는 캡슐화되어 숙주 면역 반응으로부터 보호될 수 있다. 세포는 수령체에서 적절한 부위 내로 이식될 수 있다. 이식 부위는 예를 들어, 간, 천연 췌장, 신장 피막하 공간, 장막, 복막, 장막하 공간, 장, 위, 또는 피하 주머니를 포함한다.
추가 분화, 이식된 세포의 생존 또는 활성을 향상시키기 위하여, 성장 인자, 산화방지제 또는 항염증제와 같은 추가 인자를 세포의 투여 전에, 세포의 투여와 동시에, 또는 세포의 투여 후에 투여할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 성장 인자는 생체 내에서 투여된 세포를 분화시키기 위해 사용된다. 이들 인자는 내인성 세포에 의해 분비되어 원위치에서 투여된 세포에 노출될 수 있다. 이식된 세포는 내부 및 외부 투여된 당업계에 알려진 성장 인자의 임의의 조합에 의해 분화되도록 유도될 수 있다.
이식에 사용되는 세포의 양은 환자의 상태 및 치료법에 대한 반응을 비롯한 다양한 많은 인자에 의존하며, 당업자에 의해 결정될 수 있다.
일 태양에서 본 발명은 당뇨병을 앓고 있거나 상기 당뇨병이 발병될 위험이 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 만능 줄기 세포를 배양하는 단계, 배양된 세포를 시험관 내에서 β-세포 계통으로 분화시키는 단계, 및 세포를 3차원 지지체 내로 혼입하는 단계를 포함한다. 세포는 환자 내로 이식되기 전에 이 지지체 상에서 시험관 내에서 유지될 수 있다. 대안적으로, 세포를 함유한 지지체는 추가의 시험관 내 배양 없이 환자에서 직접 이식될 수 있다. 지지체에는 이식된 세포의 생존과 기능을 촉진하는 적어도 하나의 약제가 선택적으로 혼입될 수 있다.
본 발명의 목적을 위해 사용하기에 적합한 지지체 물질은 조직 복구에 유용한 조직 주형, 도관, 장벽, 및 저장부를 포함한다. 구체적으로, 생물학적 조직을 재구성하거나 재생시키기 위해서뿐만 아니라 조직 성장을 유도하기 위한 주화성 제제를 전달하기 위해 시험관 내 및 생체 내에서 사용된 폼, 스펀지, 젤, 하이드로젤, 직물, 및 부직 구조체 형태의 합성 및 천연 물질이 본 발명의 방법의 실시에서 사용하기에 적합하다. 예를 들어, 미국 특허 제5,770,417호, 미국 특허 제6,022,743호, 미국 특허 제5,567,612호, 미국 특허 제5,759,830호, 미국 특허 제6,626,950호, 미국 특허 제6,534,084호, 미국 특허 제6,306,424호, 미국 특허 제6,365,149호, 미국 특허 제6,599,323호, 미국 특허 제6,656,488호, 미국 특허 출원 공개 제2004/0062753 A1호, 미국 특허 제4,557,264호 및 미국 특허 제6,333,029호에 개시된 물질을 참고한다.
약제가 혼입된 지지체를 형성하기 위하여, 약제는 지지체를 형성하기 전에 중합체 용액과 혼합될 수 있다. 대안적으로, 약제는 바람직하게는 약제학적 담체의 존재하에서, 제작된 지지체 상에 코팅될 수 있다. 약제는 액체, 미분 고체, 또는 임의의 다른 적절한 물리적 형태로 존재할 수 있다. 대안적으로, 부형제는 약제의 방출 속도를 변경하기 위하여 지지체에 첨가될 수 있다. 대안의 실시예에서, 지지체에는 항-염증성 화합물인 적어도 하나의 약제학적 화합물, 예컨대, 예를 들어 미국 특허 제 6,509,369 호에 개시된 화합물이 혼입된다.
지지체에는 예를 들어, 미국 특허 제6,793,945호에 개시된 화합물과 같은 항-아폽토시스(anti-apoptotic) 화합물인 적어도 하나의 약제학적 화합물이 혼입될 수 있다.
지지체에는 예를 들어, 미국 특허 제6,331,298호에 개시된 화합물과 같은 섬유증 억제제인 적어도 하나의 약제학적 화합물이 또한 혼입될 수 있다.
지지체에는 또한 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2004/0220393호 및 미국 특허 출원 공개 제2004/0209901호에 개시된 화합물과 같은 혈관신생을 향상시킬 수 있는 적어도 하나의 약제학적 화합물이 혼입될 수 있다.
지지체에는 또한 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2004/0171623호에 개시된 화합물과 같은 면역억제 화합물인 적어도 하나의 약제학적 화합물이 혼입될 수 있다.
지지체에는 또한, 성장 인자, 예컨대, 다른 것들 중에서도, 예를 들어, TGF-β 패밀리의 구성원 (TGF-β1, 2, 및 3 포함), 골 형성 단백질(BMP-2, -3,-4, -5, -6, -7, -11, -12, 및 -13), 섬유아세포 성장 인자-1 및 -2, 혈소판-유도 성장 인자-AA, 및 -BB, 혈소판 풍부한 혈장, 인슐린 성장 인자 (IGF-I, II) 성장 분화 인자 (GDF-5, -6, -8, -10, -15), 혈관 내피 세포-유도 성장 인자 (VEGF), 플레이오트로핀, 엔도텔린인 적어도 하나의 약제학적 화합물이 혼입된다. 다른 약제학적 화합물은 예를 들어, 니코틴아미드, 저산소증 유도성 인자 1-알파, 글루카곤 유사 펩티드-I (GLP-1), GLP-1 및 GLP-2 미메티바디, 및 II, 엑센딘-4, 노달, 노긴, NGF, 레티노산, 부갑상선 호르몬, 테나신-C, 트로포엘라스틴, 트롬빈-유래 펩티드, 카텔리시딘, 데펜신, 라미닌, 피브로넥틴 및 비트로넥틴과 같은 부착성 세포외 매트릭스 단백질의 세포- 및 헤파린-결합 도메인을 함유한 생물학적 펩티드, MAPK 억제제, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2004/0209901호 및 미국 특허 출원 공개 제2004/0132729호에 개시된 화합물을 포함할 수 있다.
스캐폴드 (scaffold) 내로 본 발명의 세포를 혼입시키는 것은 스캐폴드 상에 세포를 간단히 침적시키는 것에 의해 성취될 수 있다. 세포는 간단한 확산에 의해 스캐폴드 내로 들어갈 수 있다 (문헌[J. Pediatr. Surg. 23 (1 Pt 2): 3-9 (1988)]). 세포 접종의 효율을 향상시키기 위하여 몇몇 다른 접근법이 개발되었다. 예를 들어, 스피너 플라스크 (spinner flasks)가 폴리글리콜산 스캐폴드 상에 연골세포를 접종하는 데 사용되었다 (문헌[Biotechnol. Prog. 14(2): 193-202 (1998)]). 세포를 접종하기 위한 다른 접근법은 원심분리를 사용하는 것이며, 이것은 접종된 세포에 대해 최소의 스트레스를 생성하며 접종 효율을 향상시킨다. 예를 들어, 양 (Yang) 등은 원심분리 세포 고정화 (Centrifugational Cell Immobilization, CCI)로 지칭되는 세포 접종 방법을 개발하였다(문헌[J. Biomed. Mater. Res. 55(3): 379-86 (2001)]).
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되지만, 이에 의해 제한되지는 않는다.
실시예
실시예 1
인슐린 및 NKX6 .1, 및 최소량의 글루카곤을 공동-발현하는 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단의 형성
인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 매트리겔® (1:30 희석) (BD 바이오사이언스즈; 카달로그 번호 356231)-코팅된 접시에서 RPMI 배지 (인비트로겐 (Invitrogen); 카달로그 번호 22400) + 0.2% FBS + 100 ng/㎖ 액티빈 A (페프로테크 (PeproTech); 카달로그 번호 120-14) + 20 ng/㎖ WNT-3a (알앤디 시스템즈 (R&D Systems); 카달로그 번호 1324-WN/CF)로 1일 동안 배양하고, 이어서, RPMI 배지 + 0.5% FBS + 100 ng/㎖ 액티빈 A로 추가 2일 동안 처리한 다음 (단계 1),
a. 3일 동안 DMEM/F12 (인비트로겐; 카달로그 번호 11330-032) + 2% FBS + 50 ng/㎖ FGF7 (페프로테크; 카달로그 번호 100-19)로 처리한 다음 (단계 2),
b. 4일 동안 DMEM-고 글루코스 (인비트로겐; 카달로그 번호 10569) + 1% B27 + 50 ng/㎖ FGF7 + 0.25 μM 사이클로파민- KAAD (칼바이오켐 (Calbiochem); 카달로그 번호 239804) +100 ng/㎖ 노긴 (알앤디 시스템즈; 카달로그 번호 3344-NG)로 처리한 다음 (단계 3),
c. 6일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27 (인비트로겐; 카달로그 번호 0791) + 100 ng/㎖ 노긴 + 1 μM ALK5 억제제 II (악소라 (Axxora);카달로그 번호 ALX-270-445) + 500 nM TBP ((2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(트라이플루오로메틸)페닐)-2,4-펜타다이에노일아미노) 벤졸락탐) (칼바이오켐; 카달로그 번호 565740)로 처리하였다 (단계 4).
대조군으로서, 별개의 세포 집단을 6일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27 + 100 ng/㎖ 노긴 + 1 μM ALK5 억제제 II로 처리하였다 (단계 4, 대조군).
도 1에 나타낸 바와 같이, 단계 4에서의 TBP 처리는 인슐린-발현 세포의 증가를 야기하였다 (도 1, 패널 a). 이들 인슐린 발현 세포의 약 60%가 단일 내분비 호르몬 발현 세포임을 주목하여야 하며, 여기서, 세포는 인슐린을 발현하였고, 글루카곤 소마토스태틴 및 그렐린을 발현하지 않았다 (도 1 패널 a 및 b, 도 5 패널 d 및 e). 글루카곤-발현 세포는 또한 TBP 처리를 제공한 배양에서 나타났다. 또한, 글루카곤-발현 세포의 대부분은 인슐린을 공동-발현하였다 (도 1 패널 a 및 b). 대조군에 대하여, 세포의 대부분은 인슐린과 글루카곤을 공동-발현하였다 (도 1 패널 c 및 d).
별개의 실험에서, 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 매트리겔(등록상표) (1:30의 희석) 코팅된 접시에서 1일 동안 RPMI 배지 + 0.2% FBS + 100 ng/㎖의 액티빈 A + 20 ng/㎖의 WNT-3a로 배양하고, 이어서 RPMI 배지 + 0.5% FBS + 100 ng/㎖의 액티빈 A로 추가 2일간 처리한 다음 (단계 1),
a. 3일 동안 DMEM/F12+ 2% FBS + 50 ng/㎖ FGF7로 처리한 다음 (단계 2),
b. 4일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27 + 0.25 μM 사이클로파민- KAAD + 2 μM 레티노산 (RA) + 100 ng/㎖의 노긴으로 처리한 다음 (단계 3),
c. 처리 1: 6일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27 + 100 ng/㎖ 노긴 + 1 μM ALK5 억제제 II + 500 nM TBP (단계 4, 처리 1), 또는
d. 처리 2: 6일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27 + 100 ng/㎖ 노긴 + 1 μM ALK5 억제제 II + 100 nM TBP (단계 4, 처리 2), 또는
e. 처리 3: 6일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27 + 100 ng/㎖ 노긴 + 1 μM ALK5 억제제 II + 20 nM TBP (단계 4, 처리 3), 또는
f. 처리 4: 6일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27 + 100 ng/㎖ 노긴 + 1 μM ALK5 억제제 II (단계 4, 처리 4)로 처리하였다.
면역세포화학 분석을 사용하여 본 발명의 세포의 형성에서의 상이한 농도의 TPB의 영향을 평가하였다. 단일의 인슐린-발현 세포의 수의 유의미한 증가가 500nM 및 100nM TPB 처리군 둘 모두에서 관찰되었다 (도 2 패널 a 및 b). FACS 분석에 의해, 두 처리 모두가 시험관 내에서 12%의 단일 인슐린 발현 세포를 야기하였으며, 또한 그 집단의 15%가 NKX6.1을 발현한 것이 확인되었다 (표 1 - NKX6.1/INS 발현 세포는 전체 집단의 2.4%였다). 20nM TPB에서, 대조군과 유사하게, 대부분의 세포는 인슐린과 글루카곤을 공동-발현하였다 (도 2 패널 c 및 d).
Figure 112012057481899-pct00001
내분비 호르몬 발현 세포 형성에서의 효과가 단백질 키나아제 C의 활성화에 의해 매개됨을 추가로 확인하기 위하여, 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포의 별개의 집단을 매트리겔(등록상표) (1:30 희석) 코팅된 접시에서 RPMI 배지+ 0.2% FBS + 100 ng/㎖ 액티빈 A + 20 ng/㎖ WNT-3a로 1일 동안 배양하고, 이어서, RPMI 배지 + 0.5% FBS + 100 ng/㎖ 액티빈 A로 추가 2일 동안 처리한 다음 (단계 1),
a. 3일 동안 DMEM/F12+ 2% FBS + 50 ng/㎖ FGF7로 처리한 다음 (단계 2),
b. 4일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27 + 0.25 μM 사이클로파민- KAAD + 2 μM 레티노산 (RA) + 100 ng/㎖의 노긴으로 처리한 다음 (단계 3),
c. 처리 5: 6일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27 + 100 ng/㎖ 노긴 + 1 μM ALK5 억제제 II + 500 nM TBP (단계 4, 처리 5), 또는
d. 처리 6: 6일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27 + 100 ng/㎖ 노긴 + 1 μM ALK5 억제제 II + 500 nM TPB + 5μM Gㅦ 6976 (단계 4, 처리 6), 또는
e. 처리 7: DMEM-고 글루코스 + 1% B27 + 100 ng/㎖ 노긴 + 1 μM ALK5 억제제 II로 처리한 다음 (단계 4, 처리 7),
f. 4일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27로 처리하였다 (단계 5).
G
Figure 112012057481899-pct00002
6976은 Ca2 +-의존적 단백질 키나아제 C 아이소형을 선택적으로 억제하는 것으로 알려져 있다. 단독의 TPB (도 3, 패널 a) 및 TPB, 및 G
Figure 112012057481899-pct00003
6976 (도 3, 패널 b)을 제공한 배양에서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 수의 유의미한 감소가 관찰되었다. FACS 분석에 의해, TPB 처리 (처리 6)가 30.6% 시냅토피신, 12% 단일 인슐린 및 4.6% 글루카곤 발현 세포를 야기하였음이 확인되었다. 반면, TBP 및 G
Figure 112012057481899-pct00004
6976 처리 (처리 7)는 10.6% 시냅토피신과 검출가능하지 않은 수준의 단일 인슐린 발현 세포를 야기하였다 (표 2). 처리 6과 처리 7간에 관찰되는 총 세포 개수의 차이가 없었다. (처리 6 및 처리 7에서 총 세포 개수를 반영하는 DAPI 염색을 보여주는 도 3, 패널 c 및 d 참조). 이들 결과는 단백질 키나아제 C 신호전달이 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성에 중요할 수 있음을 시사한다.
또한, 다른 단백질 키나아제 C 활성화제를 시험하였다. 이들은 인돌락탐 V (ILV) (악소라; 카달로그 번호 ALX-420-011-C300) 및 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트 (PMA) (칼바이오켐; 카달로그 번호 524400)였다. 그러나, 오직 TPB만이 단일의 인슐린 발현 세포의 형성을 나타내었다 (도 4, 패널 a). 500 nM에서 ILV (도 4, 패널 b) 및 PMA (도 4, 패널 c)는 6일 후에 인슐린 및 글루카곤을 공동-발현하는 세포를 야기하였다. FACS 분석에 의해, TPB 처리가 12%의 단일 인슐린 발현 및 4.6%의 글루카곤 발현 세포 및 7.1%의 인슐린 및 글루카곤 공동-발현 세포를 야기하였음을 확인하였다. 반면, ILV 처리는 3%의 단일 인슐린 발현 및 12%의 글루카곤 세포 및 12%의 인슐린 및 글루카곤 공동-발현 세포를 야기하였다 (표 2). 면역세포화학 분석에 의해, TPB로 처리한 배양에서, 인슐린 발현 세포의 20%가 NKX6.1 (도 5 패널 a) 및 PDX1 (도 5 패널 b)을 공동-발현하였음이 나타났다. 인슐린 발현 세포의 대부분은 내분비 마커인 NEUROD를 공동-발현하였다 (도 5 패널 c). 인슐린 발현 세포의 극소수가 소마토스태틴 또는 그렐린 (GHRL)을 공동-발현하였다 (도 5 패널 d 및 e).
Figure 112012057481899-pct00005
실시예 2
인슐린 및 NKX6 .1, 및 최소량의 글루카곤을 공동-발현하는 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단의 형성을 위한 대안적인 방법
별개의 실험에서, 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 매트리겔(등록상표) (1:30의 희석)코팅된 접시 에서 1일 동안 RPMI 배지 + 0.2% FBS + 100 ng/㎖의 액티빈 A + 20 ng/㎖의 WNT-3a로 배양하고, 이어서 RPMI 배지 + 0.5% FBS + 100 ng/㎖의 액티빈 A로 추가 2일간 처리한 다음 (단계 1),
a. 3일 동안 DMEM/F12+ 2% FBS + 50 ng/㎖ FGF7로 처리한 다음 (단계 2),
b. 처리 8: 4일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27 + 50ng/㎖ FGF7 + 0.25μM 사이클로파민- KAAD + 2 μM 레티노산 (RA) + 100ng/㎖의 노긴 + 20ng/㎖ 액티빈 A + p38 키나아제 억제제 (미국 특허 제US6,214,830호에 개시, 2.5μM) (단계 3, 처리 8), 또는
c. 처리 9: 4일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27 + 0.25 μM 사이클로파민- KAAD + 2 μM 레티노산 (RA) + 100 ng/㎖의 노긴으로 처리한 다음 (단계 3, 처리 9),
d. 6일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27 + 100 ng/㎖ 노긴 + 1 μM ALK5 억제제 II + 500 nM TPB로 처리하였다 (단계 4).
단계 3, 처리 8에 의해, PDX1 및 NKX6.1을 공동-발현하지만, CDX2 및 NGN3을 발현하지 않았던 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단의 형성이 야기되었다. 반면, 단계 3, 처리 9에 의해, PDX1, NKX6.1 및 NGN3을 공동-발현하는 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단의 형성이 야기되었다. 이들 세포 집단에서 단백질 키나아제 C 활성화제 처리로의 처리의 영향을 시험하였다 (상기 단계 4).
FACS 분석을 수행하여, 인슐린 단일 양성 세포, 글루카곤 단일 양성 세포, 인슐린/글루카곤 이중 양성 세포, NKX6.1 양성 세포를 발현하는 세포, 인슐린/NKX6.1 양성 세포 및 시냅토피신 양성 세포(췌장 내분비 마커)의 백분율을 확인하였다.
표 3에 나타낸 바와 같이, 처리 8로 형성된 세포 집단은 시냅토피신 발현으로 나타난 바와 같이, 더 큰 백분율의 내분비 세포로 이어졌다: 전체 세포 집단의 49.7%가 시냅토피신을 발현하였다. 전체 집단의 27.8%가 인슐린 단일 양성 세포였다.
반면, 처리 9로 형성된 세포 집단은 오직 25.7%의 시냅토피신 발현 세포로 이어졌다. 전체 집단의 7.6%는 단일 인슐린-발현 세포였다. 단일 글루카곤 발현 세포의 유의미한 차이가 둘 모두의 처리에서 관찰되지 않았으며, 글루카곤 발현 세포의 백분율은 인슐린 발현 세포보다 유의미하게 더 낮았다.
또한, 유의미한 양의 인슐린-발현 세포가 NKX6.1을 공동-발현하였다. 처리 8을 제공한 세포의 집단에서, 전체 집단의 11%가 인슐린 및 NKX6.1을 발현하였다. 처리 9를 제공한 세포의 집단에서, 전체 집단의 2%가 인슐린 및 NKX6.1을 발현하였다.
면역형광 분석에 의해 상기의 것을 확인하였다 (도 6). 처리 8은 처리 9에 비해 인슐린 발현 세포의 증가를 야기하였다 (도 6 패널 a 및 d). 대부분의 글루카곤 발현 세포는 폴리-호르몬 세포였다 (도 6, 패널 a, b, d 및 e). 이들 결과는 처리 8에 의해 생성된 세포 의 집단(PDX1 및 NKX6.1을 공동-발현하지만 CDX2 및 NGN3을 발현하지 않았던 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포) 가 본 발명의 방법에 의해 성숙 및 작용성 인슐린 발현 세포가 되게 더욱 효과적으로 유도될 수 있음을 시사한다.
Figure 112012057481899-pct00006
실시예 3
인슐린 및 NKX6 .1, 및 최소량의 글루카곤을 공동-발현하는 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단의 형성을 위한 대안적인 방법
다른 실험에서, 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 매트리겔(등록상표) (1:30의 희석) 코팅된 접시에서 1일 동안 RPMI 배지 + 0.2% FBS + 100 ng/㎖의 액티빈 A + 20 ng/㎖의 WNT-3a로 배양하고, 이어서 RPMI 배지 + 0.5% FBS + 100 ng/㎖의 액티빈 A로 추가 2일간 처리한 다음 (단계 1),
a. 3일 동안 DMEM/F12+ 2% FBS + 50 ng/㎖ FGF7로 처리한 다음 (단계 2),
b. 4일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27 + 50ng/㎖ FGF7 + 0.25μM 사이클로파민- KAAD + 2 μM 레티노산 (RA) + 100ng/㎖의 노긴 + 20ng/㎖ 액티빈 A + p38 키나아제 억제제 (JNJ3026582, 2.5μM)로 처리한 다음 (단계 3),
c. 처리 10: 6일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27 + 100 ng/㎖ 노긴 + 1 μM ALK5 억제제 II + 500 nM TPB (단계 4, 처리 10), 또는
d. 처리 11: 9일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27 + 100 ng/㎖ 노긴 + 1 μM ALK5 억제제 II + 500 nM TPB(단계 4, 처리 11), 또는
e. 처리 12: 12일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27 + 100 ng/㎖ 노긴 + 1 μM ALK5 억제제 II + 500 nM TPB로 처리하였다 (단계 4, 처리 12).
표 4에 나타낸 바와 같이, 단백질 키나아제 C 활성화제 처리의 기간이 9일 (처리 11) 또는 12일 (처리 12) 중 어느 하나까지 연장되는 경우, 추가의 혜택이 관찰되지 않았다. 단일 인슐린-발현 세포는 처리 10을 사용한 6일 처리 후에 전체 집단의 27.8%였다. 역으로, 인슐린-발현 세포는 9일 처리 (처리 11) 후에 10%로 감소하였으며, 12일 처리 (처리 12) 후에 추가로 4% 감소하였다. 동시에, 인슐린 및 NKX6.1 공동-발현 세포 집단의 전체 백분율은 또한 처리를 연장한 후에 유의미하게 낮아졌다. 이들 결과는 노긴, Alk5 억제제 II 및 단백질 키나아제 C 활성화제로의 6일의 처리가 본 발명의 세포를 형성하기에 충분함을 시사한다.
Figure 112012057481899-pct00007
실시예 4
본 발명의 세포의 중증 복합형 면역결핍증( SCID ) - 베이지 ( Bg ) 마우스 내로의 이식
인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 매트리겔(등록상표) (1:30의 희석) 코팅된 접시에서 1일 동안 RPMI -배지 + 0.2% FBS + 100 ng/㎖의 액티빈 A + 20 ng/㎖의 WNT-3a로 배양하고, 이어서 RPMI 배지 + 0.5% FBS + 100 ng/㎖의 액티빈 A로 추가 2일간 처리한 다음 (단계 1),
a. 3일 동안 DMEM/F12+ 2% FBS + 50 ng/㎖ FGF7로 처리한 다음 (단계 2),
b. 4일 동안 DMEM-고 글루코스+ 1% B27 + 50 ng/㎖ FGF7 + 0.25 μM 사이클로파민- KAAD +100 ng/㎖ 노긴으로 처리한 다음 (단계 3),
c. 6일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27 + 100 ng/㎖ 노긴 + 1 μM ALK5 억제제 II + 500 nM TBP로 처리하였다 (단계 4).
단계 4의 마지막의 세포를 1 ㎖ 유리 피펫을 사용하여 기계적으로 스코어링하고, 후속적으로 하룻밤 배양을 위하여 비-부착성 플레이트로 옮겼다. 생성된 세포 응집체를 수집하고, 500만개 세포를 포함하는 응집체를 면역-손상된 마우스 (SCID/Bg, 동물 번호 47, 48, 49, 50 및 51)의 신장 피막 내로 이식하였다. 도 7을 참고한다.
4주 후에, 동물에 글루코스를 주사하여, 인슐린 분비를 유도함으로써, 이들 이식물에서 인슐린-생성 세포의 작용성을 시험하였다. 동물을 약 15 내지 20시간 동안 절식시키고 그 후 혈액 샘플 (글루코스 전)을 후안와에서 채혈하였다. 이어서 각각의 동물은 30% 덱스트로스 용액 중 약 3g/kg의 글루코스의 복강내 주사 용량을 받았으며, 글루코스 주입 후 약 60분에 혈액을 채혈하였다. 초민감성 인간 특이적 C-펩티드 ELISA 플레이트 (카탈로그 번호 80-CPTHU-E01, 알프코 다이아그노스틱스, 미국 뉴햄프셔주)를 사용하여 순환하는 인간 C-펩티드를 검출하였다. 인간 C-펩티드의 검출은 인슐린 분비가 이식된 세포로부터 유래됨을 나타낸다.
인간 C-펩티드는 이식 후 4주만큼 이른 시점에 동물 혈청에서 검출되었으며, 이는 시간이 지남에 따라 증가하였다. 이식 데이터는 도 7에 요약되어 있다. 1개월의 마지막에, 본 발명자들은 연구 그룹의 동물의 60%에서 글루코스 투여에 반응하는 인간 C-펩티드 (0.2 ng/㎖ 미만)를 검출할 수 있었다. 인간 C-펩티드의 글루코스 자극된 혈청 수준은 4주 후에 4마리의 마우스 중 3마리에서 5 내지 10배 증가하였다. 이식 12주 후에, 이식된 마우스에서 인간 c-펩티드의 평균 글루코스-자극된 혈청 수준은 1mg/㎖ 초과였다 (n=4).
실시예 5
PDX1 및 NKX6 .1을 공동-발현하는 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단의 형성을 위한 대안적인 방법
간단하게, 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 매트리겔(등록상표) (1:30의 희석) 코팅된 접시에서 1일 동안 0.2% FBS, 100 ng/㎖의 액티빈 A 및 20 ng/㎖의 WNT-3a가 보충된 RPMI 배지로 배양하고, 이어서 0.5% FBS 및 100 ng/㎖의 액티빈 A가 보충된 RPMI 배지로 추가 2일간 처리한 다음 (단계 1),
a. 3일 동안 DMEM/F12+ 2% FBS + 50 ng/㎖ FGF7로 처리한 다음 (단계 2),
b. 4일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27 + 0.25 μM 사이클로파민- KAAD + 2 μM 레티노산 (RA) + 100 ng/㎖의 노긴으로 처리한 다음 (단계 3),
c. 6일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27 + 100 ng/㎖ 노긴 + 1 μM ALK5 억제제 II + 20nM PMA, 또는 100nM TPB, 또는 20nM 포르볼-12,13-다이부티레이트 (PDBu) (칼바이오켐, 카달로그 번호 524390)로 처리하였다 (단계 4).
대조군으로서, 별개의 세포 집단을 1% B27, 100 ng/㎖의 노긴 및 1μM ALK5 억제제 II가 보충된 DMEM 고 글루코스로 6일 동안 처리하였다 (단계 4).
배양을 단계 4, 6일에서, 이중으로 샘플링하고, IN 셀 어널라이저 (Cell Analyzer) 1000 (지이 헬스케어 (GE Healthcare))을 사용하여 영상화를 수행하였다. 웰 당 100개 필드의 이미지를 수득하여, 생물검정 및 후속한 염색 과정 동안의 임의의 세포 상실에 대해 보상하였다. 총 세포 개수, 총 PDX1 발현 세포 및 총 NKX6.1 발현 세포에 대한 측정치를 IN 셀 디벨로퍼 (Cell Developer) 툴박스 (Toolbox) 1.7 (지이 헬스케어) 소프트웨어를 사용하여 각 웰로부터 수득하였다. 각각의 복제 데이터 세트에 대하여 평균 및 표준 편차를 계산하였다. 전체 PDX1 및 NKX6.1 단백질 발현 세포를 전체 세포 집단의 백분율로 기록하였다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 대조군 처리로부터 수득한 샘플에 비하여, 더 낮은 유효한 농도 (대략 20nM)에서 단백질 키나아제 C 활성화제 처리군에는 NKX6.1/PDX1 발현 세포 집단의 급격한 증가가 있었다. 단백질 키나아제 C 활성화제 또는 대조군 처리 중 어느 하나를 제공한 세포의 집단에서 단계 4의 6일까지, 집단의 92% ± 4%가 PDX1을 발현하였다. 단백질 키나아제 C 활성화제 처리군에서, PDX1-발현 세포의 75% ± 5%가 NKX6.1을 발현하였다. 그러나, 노긴 및 TGF 베타 수용체 억제제 (대조군) 만으로 처리한 집단에서, PDX1-발현 세포의 오직 58% ± 5% 만이 NKX6.1을 발현하였다. 단백질 키나아제 C 활성화제의 존재 하에, 20%의 NKX6.1-발현 세포가 증식 마커인 EdU (클릭-아이티 (Click-iT) (등록상표) EdU 이미징 키트 (Imaging Kit), 인비트로겐, 카달로그 번호 C10337)와 공동-양성이었다.
이러한 실시예는 단백질 키나아제 C 활성화제를 상대적으로 낮은 유효 농도 (약 20nM)로 노긴 및 TGF 베타 수용체 억제제와 병용하여 사용하여, Nkx6.1 발현의 상향 조절을 용이하게 하고, PDX1 및 NKX6.1을 발현하는 세포의 백분율을 증가시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 6
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 단백질 키나아제 C 활성화제로의 처리
간단하게, 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 매트리겔(등록상표) (1:30의 희석) 코팅된 접시에서 1일 동안 0.2% FBS, 100 ng/㎖의 액티빈 A 및 20 ng/㎖의 WNT-3a가 보충된 RPMI 배지로 배양하고, 이어서 0.5% FBS 및 100 ng/㎖의 액티빈 A가 보충된 RPMI 배지로 추가 2일간 처리한 다음 (단계 1),
a. 3일 동안 DMEM/F12+ 2% FBS + 50 ng/㎖ FGF7로 처리한 다음 (단계 2),
b. T1: 4일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27+ 0.25 μM 사이클로파민- KAAD + 2 μM 레티노산 (RA) + 100 ng/㎖의 노긴 + FGF10 50ng/㎖ (단계 3, T1), 또는
T2: 4일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27+ 0.25 μM 사이클로파민- KAAD + 2 μM 레티노산 (RA) + 100 ng/㎖의 노긴 + FGF10 50ng/㎖+ 100 nM TPB로 처리한 다음 (단계 3, T2),
c. 6일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27 + 100 ng/㎖ 노긴 + 1 μM ALK5 억제제 II로 처리하였다 (단계 4).
도 9에 나타낸 바와 같이, 췌장 내배엽 마커 PDX1, NKX6.1 및 PTF1 알파의 유의미한 하향-조절이 대조군 (T1)에 비해 TPB (T2)로 처리한 세포에서 관찰되었다. NKX6.1은 면역조직화학에 의해 검출할 수 없었다. 이들 데이터는 단계 3에서의 단백질 키나아제 활성화제 처리가 PDX1/ NKX6.1 공동-발현 세포의 생성을 용이하게 하지 않았음을 시사한다.
본 명세서 전체에 걸쳐 인용된 간행물은 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 본 발명의 다양한 측면은 실시예 및 바람직한 실시 양태를 참조로 하여 상기 예시되었음에도, 본 발명의 범주는 전술한 상세한 설명에 의해서가 아니라 본 특허 법칙의 원칙 하에 적절하게 의도되는 하기 청구항에 의해 정의되는 것으로 생각될 것이다.

Claims (12)

  1. 췌장 내배엽 세포(pancreatic endoderm cells)를 (ⅰ) 노긴(noggin), (ⅱ) ALK5 억제제 II, 및 (ⅲ) (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(트라이플루오로메틸)페닐)-2,4-펜타다이에노일아미노) 벤졸락탐, 인돌락탐 V, 포르볼-12,13-다이부티레이트 및 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 단백질 키나아제 C 활성화제가 보충된 배지에서 배양함으로써 수득되는, NKX6.1 및 인슐린을 공동-발현하고 세포 집단 내 10% 미만의 세포가 글루카곤을 발현하는 정제되지 않은(unpurified) 췌장 내분비 세포(pancreatic endocrine cells)의 집단; 및
    배양 배지를 포함하는 세포 배양물.
  2. 제1항에 있어서, 적어도 30%의 세포가 NKX6.1을 발현하는 세포 배양물.
  3. 제1항에 있어서, 적어도 40%의 세포가 NKX.6.1을 발현하는 세포 배양물.
  4. 제1항에 있어서, 적어도 50%의 세포가 NKX6.1을 발현하는 세포 배양물.
  5. 제1항에 있어서, 적어도 60%의 세포가 NKX6.1을 발현하는 세포 배양물.
  6. 제1항에 있어서, 적어도 5%의 세포가 인슐린을 발현하는 세포 배양물.
  7. a) 인간 배아줄기세포를 완성 내배엽 세포(definitive endoderm cells)로 분화시키는 단계;
    b) 상기 완성 내배엽 세포를 췌장 내배엽 세포(pancreatic endoderm cells)로 분화시키는 단계; 및
    c) 상기 췌장 내배엽 세포를 (ⅰ) 노긴, (ⅱ) ALK5 억제제 II, 및 (ⅲ) (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(트라이플루오로메틸)페닐)-2,4-펜타다이에노일아미노) 벤졸락탐, 인돌락탐 V, 포르볼-12,13-다이부티레이트 및 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 단백질 키나아제 C 활성화제가 보충된 배지에서 배양함으로써, 상기 췌장 내배엽 세포를 NKX6.1 및 인슐린을 공동-발현하고 최소량의 글루카곤을 발현하는 췌장 내분비 세포(pancreatic endocrine cells)로 분화시키는 단계를 포함하는,
    NKX6.1 및 인슐린을 공동-발현하고 세포 집단 내 10% 미만의 세포가 글루카곤을 발현하는 췌장 내분비 세포의 집단을 생성하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 단백질 키나아제 C 활성화제가 (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(트라이플루오로메틸)페닐)-2,4-펜타다이에노일아미노) 벤졸락탐인 방법.
  9. 제7항에 있어서, 단백질 키나아제 C 활성화제가 인돌락탐 V인 방법.
  10. 제7항에 있어서, 단백질 키나아제 C 활성화제가 포르볼-12,13-다이부티레이트인 방법.
  11. 제7항에 있어서, 단백질 키나아제 C 활성화제가 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트인 방법.
  12. 인간 배아줄기세포를 분화시킴으로써 수득되는 췌장 내배엽 세포를 (ⅰ) 노긴, (ⅱ) ALK5 억제제 II, 및 (ⅲ) (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(트라이플루오로메틸)페닐)-2,4-펜타다이에노일아미노) 벤졸락탐, 인돌락탐 V, 포르볼-12,13-다이부티레이트 및 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 단백질 키나아제 C 활성화제가 보충된 배지에서 배양하는 것을 포함하는, 췌장 내배엽 세포를 췌장 내분비 세포로 분화시키는 방법.
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