KR20050044393A - 지방 조직 유래된 스트로마 세포의 내분비 췌장 분화 및이의 용도 - Google Patents

지방 조직 유래된 스트로마 세포의 내분비 췌장 분화 및이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 지방조직 유래된 스트로마 세포를 췌장 세포의 하나 이상의 유전자형 또는 표현형 특징을 발현하는 세포로 분화시키는 것을 기초로 하는, 세포, 조성물 및 방법을 제공한다. 본 방법에 의해 생성된 세포는 췌장 질환 및 췌장 조직 손상의 치료를 위한 조직 조작된 생성물의 연구, 내이식, 이식 및 개발을 위한 분화된 작용성 세포의 공급원을 제공하는데 유용하다.

Description

지방 조직 유래된 스트로마 세포의 내분비 췌장 분화 및 이의 용도 {ENDOCRINE PANCREAS DIFFERENTIATION OF ADIPOSE TISSUE-DERIVED STROMAL CELLS AND USES THEREOF}
본 발명은 췌장 세포의 하나 이상의 특징을 발현하도록 유도된, 분리된 지방 조직 유래된 스트로마 세포를 제공한다. 췌장의 내분비 질환을 치료하는 방법 또한 제공된다.
췌장의 랑게르한스섬의 내분비 세포 군은 주요 조절 분비 생성물을 기준으로 분류되는 4개의 세포 유형으로 이루어진다. 이들은 글루카곤 생성 α-세포, 인슐린 생성 β-세포, 췌장 폴리펩티드 생성 γ-세포 및 소마토스타틴 생성 δ-세포를 포함한다(Henquin, 2000, Diabetes 49, 1751-1760; Slack, 1995, Development 121, 1569-1580). 발생(development) 동안, 이러한 별개의 세포군은 췌장관 상피 세포와 관련된 공통의 줄기 세포 전구체로부터 발생하는 것으로 여겨진다(Rao et al., 1989, Am.J.Pathol. 134, 1069-1086; Rosenberg and Vinik, 1992, Adv.Exp.Med.Biol.321:95-104; Swenne, 1992, Diabetologia 35, 193-201; Hellerstrom, 1984, Diabetologia 26, 393-400; Gu and Sarvetnick, 1993, Development 118, 33-46). 일련의 단계식 분화 경로를 통해 전구체 세포는 다양한 세포군의 특성을 달성한다. 초기 관찰은, 랑게르한스섬의 α-세포가 처음으로 검출가능하며, 그 후, β-세포, δ-세포 및 γ-세포가 검출가능하다는 것을 나타낸다(Slack, 1995, Development 121, 1569-1580). 랑게르한스섬은 α- 또는 γ-세포 및 맞물리는 δ-세포에 의해 둘러쌓여지는 β-세포 군으로서 췌장관 상피세포를 따라 형성된다. 그 후, 미성숙 랑게르한스섬은 둘러싸는 선방 세포로 이동하며, 맥관화된다(Slack, 1995, Development 121, 1569-1580).
랑게르한스섬 세포의 일차 기능은 생리학적 영양 항상성이다. 예를 들어, 일반적으로 작용하는 β-세포가 인슐린을 합성하고 분비하여 혈중 글루코스 수준을 유지시킨다. 이는 인슐린의 조정된 방출용 분비 경로와 연결된 내생성 글루코스-감지 장치를 통해 달성된다. 이러한 자극-분비 커플링 전형에서, 증가된 혈장 글루코스(예를 들어, 식후)는 β-세포 대사를 변형시켜, ATP-민감성 K+ 채널의 폐쇄에 의한 막 전위를 변형시킨다. 이러한 탈분극성 형상은 전압-민감성 Ca2+ 채널을 개방하고, Ca2+의 유입은 인슐린의 조정된 방출을 촉발시킨다(Henquin, 2000, Diabetes 49, 1751-1760). 그 후, 혈장 인슐린은 골격근 및 지방 조직으로의 글루코스 흡수를 자극하고, 간장의 글루코스 생성을 억제하여, 혈장 글루코스를 전반적으로 저하시킨다(Cheatham and Kahn, 1995, Endocr.Rev. 16, 117-142).
Ⅰ. 인슐린
타입 1(인슐린-의존성) 당뇨는 내분비 췌장 기능의 손실과 관련된 주요 질환이다. 대부분의 경우, 이는 랑게르한스섬의 자가면역 공격에 의해 발생한다. 타입 1 당뇨의 현재 치료법에는 인슐린의 1일당 1회 내지 다수회 주사가 요구된다. 이중 대부분의 경우, 이러한 방법은 혈중 글루코스 수준의 적합한 조정을 유지하는데 불충분하여, 많은 당뇨병성 만기 합병증을 초래하며, 이는 병에 걸린 개체들의 질병률 및 사망율 속도를 크게 증가시킨다. 매일 인슐린을 주사하는 방법에 대한 대안적인 치료법은 췌장 또는 랑게르한스섬 이식을 통한 당뇨의 치유이다(Serup et al., 2001, BMJ 322, 29-32; Soria et al., 2001, Diabetologia 44, 407-415). 여러 연구들은, 손상되지 않은 췌장 조직의 이식이 효과적인 치료법임에도 불구하고, 이러한 방법은 하기 3가지 주요 단점을 갖는다는 것을 보여준다: 1) 공급 물질의 부족; 2) 위험한 수술 과정의 필요 및 3) 단기간 이점을 갖는 장기간의 면역억제 치료 요망. 유사하게는, 랑게르한스섬 이식은 단지 약간만 효과적이다. 이러한 방법은 기증자 췌장으로부터 랑게르한스섬을 분리하여, 문맥으로 주입시키는 것을 포함한다. 게다가, 이러한 방법은 많은 주사가 요구되어, 수일의 입원 치료가 요망된다(Serup et al., 2001, BMJ 322, 29-32; Soria et al., 2001, Diabetologia 44, 407-415). 또한, 이들 환자는 집중적인 면역억제 치료를 받아야 한다. 게다가, 췌장 조직 이식에서와 같이, 랑게르한스섬 분리 공정은 기증자가 매우 제한되어 있다는 단점을 갖는다. 그러나, 이종이식된 돼지 랑게르한스섬을 이용하여 연구를 수행한 결과, 이들 방법에 있어서 면역-거부 반응이 여전히 큰 문제점이었다(Serup et al., 2001, BMJ 322, 29-32; Soria et al., 2001, Diabetologia 44, 407-415).
종합적으로, 상기 데이타는 대안적인 세포 치료법이 필요하다는 것을 암시한다. 이와 함께, 뮤린 및 사람 유래된 체장관 줄기 세포 및 배아간 세포 둘 모두가 내분비 췌장 경로로의 조절된 분화를 통해 랑게르한스섬 유사 세포주를 생성하는데 사용되었다(Assady et al., 2001, Diabetes 50, 1691-1697-; Serup et al., 2001, BMJ 322, 29-32; Lumelsky et al., 2001, Science 292, 1389-1394; Soria et al., 2001, Diabetologia 44, 407-415). 랑게르한스섬-호르몬 생성 세포로의 분화를 유도하는 뮤린 유래된 줄기 세포가 당뇨병의 마우스-모델을 재구성하는데 성공적으로 사용되었다(Serup et al., 2001, BMJ 322, 29-32; Soria et al., 2001, Diabetologia 44, 407-415). 이들 방법의 단점은 또한, 면역-거부 반응을 포함하며, 사람에서 적용하기 위한 전구체 세포주의 제한된 공급원을 포함한다.
사람 배아간 세포(HES)는 인슐린을 생성하는 세포로 성공적으로 분화되었다(Assady et al., 2001, Diabetes 50, 1691-1697; Diabetes 50:1691-1697). 다능성 미분화된 HES 세포의 용도는 잠재적으로 당뇨병과 같은 질환에 사용되는 분화성 췌장 베타 세포의 공급원을 나타낸다. 그러나, 이들 방법은 많은 단점이 있다. 먼저, HES 세포 자체의 공급 문제이다. HES 세포 분야에서의 연구 및 개발에 대한 중대한 필요성에 대한 최근 주지된 상황에도 불구하고, 정치적 및 도덕적 논쟁점이 남아있다. 그 결과, 적합한 HES 세포의 입수가능성이 보장되지 않는다. 분화된 췌장의 랑게르한스섬 세포의 생성에서 HES 세포의 사용으로 인한 두번째 단점은 배양되어 분화된 세포에서 글루코스 반응성이 예측불가능하다는 점이다. 실제로, 아사드 등(Assady and colleagues)(Diabetes 50, 1691-1697)은, HES 세포로부터 분화된 세포가 글루코스 반응성을 입증하지 못한다는 것을 암시하였다. 미반응성은 배양시 성장하는 이종성 세포군의 차이, 단백질 또는 DNA 성분과 같은 파라미터에 대한 인슐린 반응 표준화에 있어서의 어려움, 또는 배양시 고수준의 글루코스에 대한 장기간의 노출로 인한 것이다. 이와 같이, 분화된 β-세포를 사용하기 위해서는, 분화된 세포가 인슐린에 대한 자극-분비 커플링을 갖는다는 것을 입증해야 한다. 또한, HES 세포 치료법은 기형종이 발생할 잠재적 위험성이 매우 높다.
췌장 자체는 랑게르한스섬 전구 세포의 공급원이다. WO 01/23528(University of Florida Research Foundation)에는 당뇨의 생체내 치료를 위해, 포유동물로 이식하기 위한 실험관내 성장된 랑게르한스섬 전구 세포의 용도가 기재되어 있다.
내분비 췌장계로의 췌장관 유래된 줄기 세포 또는 분리된 배아간 세포의 분화는 특이적 마아커 효소 및 전사 인자의 발현을 특징으로 한다. 흥미롭게는, 배아 발생동안, 랑게르한스섬 및 신경 세포는 신경-특이적 에놀라아제, 시냅토파이신, 카테콜-합성 효소, 티로신 히드록실라아제, 네스틴 및 전사 인자 HNF3β, Isl-1, Brain-4 Pax-6, Pax-4, Beta2/NeuroD, 췌장 및 십이지장 호메오박스 유전자 1(PDX-1), Nkx6.2, Nkx2.2 및 뉴로게닌-3(Ngn-3)을 포함한 많은 공통의 마아커를 공유한다(Ramiya et al., 2000, Nat. Med. 6,278-282; Schwitzgebel et al., 2000, Development 127, 3533-3542; Fernandes et al., 1997, Endocrinology 138, 1750-1762; Zulewski et al., 2001, Diabetes 50, 521-533; Gradwohl et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 97, 1607-1611). 더욱 성숙한 랑게르한스섬 세포에 대한 기능적 마아커는 글루카곤, 소마토스타틴, 인슐린, 글루코스 트랜스포터 2(Glut2) 및 췌장 폴리펩티드의 발현이다.
Ⅱ. 글루카곤
글루카곤은 랑게르한스섬의 알파 세포에서 유리된 29개 아미노산 펩티드 호르몬이다. 글루카곤 생성 알파 세포는 내분비 췌장의 발생시 검출가능한 랑게르한스섬 세포의 초기 군중 하나이다. 프로글루카곤의 조직 특이적 유리는 프로호르몬 전환효소(PC)의 세포 특이적 발현에 의해 조절된다. 랑게르한스섬 프로글루카곤의 프로세싱에서 PC2의 주요 역할은 PC2 넉아웃 마우스의 연구에 의해 밝혀졌다. 이러한 마우스는 완만한 저혈당증, 증가된 프로인슐린을 가지며, 췌장 글루카곤을 성숙시키기 위한 프로글루카곤의 프로세싱시에 주요 결함을 나타내며, 뮤린 랑게르한스섬 α 세포는 비정형 분비 과립자로부터 프로글루카곤을 분비한다(J Biol Chem. 1998 Feb 6;273(6);343-7; J Biol Chem. 2001 Jul 20; 276(29):27197-202).
글루카곤의 주요 생물학적 작용은 간에서 글루코스의 증가된 합성 및 가동(mobilization)을 통한 글루코스 항상성 조절에 집중된다. 또한, 글루카곤 수용체는 사람 랑게르한스섬 β 세포에서 발현되며, 글루코스 자극된 인슐린 분비의 조절에 기여한다(Diabetologia 2000 Aug; 43(8):1012-9).
글루카곤은 일반적으로 인슐린의 작용에 상반되며, 특히 저혈당 환자에서 혈중 글루코스 수준을 유지시키는 길항 호르몬으로서 작용한다. 당뇨병 환자의 경우, 과다 글루카곤 분비는 과혈당과 같은 당뇨와 관련된 대사 교란에서 주된 역할을 한다. 반복되는 과혈당을 갖는 당뇨병 환자의 주요 문제점은, 저혈당에 대해 저하된 또는 부재의 글루카곤 반응을 포함하는 길항 반응의 결함에 있다. 따라서, 자율신경계 및 랑게르한스섬 α 세포가 어떻게 그리고 왜 저혈당 둔감성을 초래하는 글루카곤 분비에서의 결함을 발생시키는지를 이해하는 것이 당뇨병 연구에서의 주요한 과제이다.
글루카곤의 투여는 약물학적으로 혈중 글루코스를 신속하게 증가시키며, 따라서 주입가능한 글루카곤이 심각한 저혈당 문제를 갖고 있는 당뇨병 환자를 위한 약물학적 치료제로서 사용된다. 당뇨는 오랫동안, 과다 글루카곤이 과혈당의 발생에 상당히 기여하는 바이호르몬 질환(bihornomal disorder)으로서 간주되었다. 샤(Shah)와 그의 동료들(Am.J.Physiol 1999 277:E283-E290)은 글루코스 부하 식사 후 사람 피검체에서 글루카곤 매개된 과혈당 발생에 대한 주위 인슐린 농도의 중요도를 실험하였다. 상기 저자들은 상대적으로 인슐린이 결핍된 상태에서 과다 글루카곤은 분명히 글루코스 생성의 억제 저하 및 과혈당에 기여함을 발견하였다. 따라서, 글루카곤 분비 또는 글루카곤 작용의 억제제는 인슐립 결핍 및/또는 글루카곤 과다로 인한 당뇨병 치료에 유용할 수 있다. 타입 2 당뇨에 걸린 환자에 대한 연구는, 글루카곤 억제의 결여는 가속화된 글리코겐분해에 의해 어느정도 식후 과혈당에 기여한다는 것을 암시한다. 경구내당능검사(OGTT) 동안 소마토스타틴 유도된 글루카곤 억제의 존재 또는 부재하의 혈중 글루코스 검출은, 더 높은 수준의 글루카곤을 갖는 시험체에서 글루코스가 현저하게 증가한다는 것을 보여주었다(J Clin Endocrinol Metab. 2000 Nov; 85(11):4053-9).
많은 연구는, 글루카곤이 세포 제조시 및 생체내 둘 모두에서 지방 분해(리포라이시스로 공지됨)를 증진시킨다는 것을 입증하였다. 따라서, 글루카곤은 사람 지방 조직의 지방분해를 증진시킬 수 있다. 그러나, 더 오래된 연구에서는, 글루카곤이 사람 지방세포 지방분해에서 반대의 역할을 하는 것으로 일부 보고되었다. 사람 글루카곤 및 혈관확장작용 폴리펩티드(VIP)는 실험관내에서 사람 지방 조직으로부터 유리 지방산 방출을 자극하는 반면, 다른 실험에서는, 글루카곤이 분리된 사람 지방 세포에서 현저한 지방분해 효과를 갖다는 것을 보여주지 못하였다(Int.J.Obes. 1985;9(1):25-7). 생체내에서 글루카곤 회수 또는 생리학적 과다글루카곤은 정상적 사람 또는 당뇨병에 걸린 사람 피검체에서 팔미테이트 흐름의 지방분해 지수의 현저한 변화를 초래하지 않았다(J Clin Endocrinol Metab. 1991 Feb;72(2):308-15). 유사한 반대의 결과가 최근에 보고되었는데, 여기서 7 마리의 건강한 수컷 시험체의 복벽에 미세투석 카테터를 이식하고, 간질성 글리세롤 및 혈장 글리세롤에 대한 글루카곤 주입의 영향, 및 FFA를 실험하였다. 외생성 글루코스의 존재 또는 부재하에 합성 글루카곤의 주입은 글리세롤 또는 유리 지방산에 어떠한 영향도 끼치지 않는 것으로 검출되었다(J Clin Endocrinol Metab. 2001 May 1;86(5):2085-2089). 유사한 반대의 결과가, 복부 지방 조직으로 이식된 미세투석 카테터를 갖는 정상적인 수컷 시험체에서의 지방분해 연구에서 수득되었다(J Clin Endocrinol Metab. 2001 May;86(5):2085-9). 따라서, 입수가능한 데이타는 지방분해에 대한 글루카곤의 중요한 생리학적 역할을 지지하지 못한다.
글루카곤은 사람 시험체에 약물학적으로 투여될 경우 위장관(식도, 위, 소장 및 대장)에 대한 항-운동성 효과를 갖는다(Dig Dis Sci. 1979 Jul; 24(7):501-8; Gut.1975 Dec; 16(12):973-8; N Engl J Med. 1999 Nov 11;341(20):1496-503). 글루카곤은 또한 쓸개 및 수뇨관에서 평활근을 이완시켜, 쓸개 및 신장의 방사선 연구 동안 예비로 사용될 수 있다.
Ⅲ. 소마토스타틴
소마토스타틴은 신체내에서 많은 중요한 작용을 수행하는 췌장 델타 세포에서 생성되는 내인성 펩티드이다. 소마토스타틴은 매우 짧은 생물학적 반감기를 갖는 매우 다루기 용이한 시클릭 펩티드이다. 시상하부-뇌하수체 시스템의 전형적인 내분비 호르몬으로서 작용하는 것으로 밝혀진 소마토스타틴은 추가로 다양한 종류의 세포 유형에서 파라크린 및 오토크린 시그널 인자로서 작용하는 것으로 밝혀졌다. 소마토스타틴에 의해 영향을 받는 것으로 최근에 인식된 많은 생리학적 과정으로는 최근에 호르몬 및 펩티드 인자 분비, 신경전달, 세포 증식, 평활근 수축, 영양 흡수 및 염증을 포함한다. 소마토스타틴에 의해 조정되는 호르몬 및 펩티드는 성장 호르몬(GH), 티로이드-자극 호르몬(TSH), 프롤락틴(PRL), 인슐린 및 물질 P(SP)를 포함한다.
소마토스타틴은 내분비, 위장관, 맥관 및 면역 시스템과 중추 및 말초 신경계와 같은 많은 중요한 생물학적 시스템의 작용에 영향을 끼친다. 내분비 시스템에서, 소마토스타틴은 성장 호르몬, 인슐린 및 글루카곤 분비의 조절에서 중요한 역할을 한다(Koerker et al., Science 1974, 184, 482-484). 위장관 및 혈관의 생물학적 시스템에 대한 소마토스타틴의 영향은 이들 영역 둘 모두에서 소마토스타틴 치료를 위해 임상적 적용을 유발시킨다. 중추 신경계(CNS)에서, 소마토스타틴은 인지 작용의 중요한 조절제이며(Schettini, Pharmacological Research 1991, 23, 203-215), 뇌의 특정 영역에서는 아세틸콜린과 같은 신경전달제의 방출을 조절하는 신경매개체 또는 신경전달제(Gray et al., J. of Neuroscience 1990, 10, 2687-2698), 및 도파민(Thal et al., Brain Research 1986, 372, 205-209)으로서 작용한다. 말초신경계(PNS)에서, 소마토스타틴은 물질 P와 함께 카테콜아민 함유 섬유 및 감각섬유 말단에 존재하며(Green et al., Neuroscience 1992, 50, 745-749), 이들의 방출 및 매개된 효과를 억제하는 작용을 한다.
자체의 소마토스타틴과 같은 소마토스타틴 수용체는 내분비선, 위장관, 혈관, 면역, CNS 및 PNS 시스템에 포함되는 것을 포함한 매우 다양한 조직 및 세포 유형에 존재한다. 소마토스타틴 수용체의 높은 발생 범위는 또한, 다양한 사람 종양에서 입증되었다. 신경내분비 종양은 작용적으로 활성인 높은 밀도의 소마토스타틴 수용체를 나타내는 종양의 한 부류이다. 작용적으로 활성인 신경내분비 종양은 종양 세포로부터의 과다 호르몬 방출로 인한 가스트리노마 및 글루카고마 신드롬과 같은 임상적 증상을 갖는다. 이러한 증상은 소마토스타틴 수용체 활성을 통해 치료될 수 있다.
Ⅳ. 췌장 폴리펩티드
췌장 감마 세포는 단백질의 뉴로펩티드 Y 패밀리에 한 구성원인 췌장 폴리펩티드를 분비하는 것으로 공지되어 있다. 이러한 펩티드의 정확한 생리학적 메카니즘에 대해서는 알려진바 없다. PP는 미주신경 자극에 대한 억제를 통해 췌장 소화 효소의 분비를 억제하므로써 췌장에 직접적으로 영향을 끼치는 것으로서 공지되어 있다. PP의 이러한 효과는 척추 미주신경 컴플렉스 및 아치형 핵에서 중추신경계 매개된 효과 및 미주신경에 대한 직접적인 효과를 통해 발생하는 것으로 여겨진다(Deng et al Brain Res 2001;902:18-29). 이러한 미주 신경 작용을 통해, PP 또한 인슐린 방출을 억제하는 것으로 여겨진다. PP는 또한 비인슐린 의존성 당뇨병에서 관찰되는 랑게르한스섬 세포 비대를 억제하는 것으로 여겨진다. PP의 순환 수준은 또한 간에 영향을 끼치며, 간장 글루코스 생성을 감소시킨다. 이와 같이, PP의 투여는 비인슐인 의존성 당뇨병을 치료하는 역할을 가질 수 있다.
Ⅴ. 줄기 세포의 비-배아 공급원
성인 세포는 분화 능력을 나타내었다. 예를 들어, 최근의 연구는, 실험관내에서 골수 유래된 스트로마 세포의 신경세포 분화가 수행될 수 있다는 것을 입증하였다(Woodbury et al. (2000) J Neuroscience Research 61:364;Sanchez-Ramos et al. (2000) Exp Neurology 164:247). 이들 연구에서, 골수 스트로마 세포를 항산화제, 상피 성장 인자(EGF), 또는 뇌유래 신경영양인자(BDNF)로 처리하므로써 세포가 신경 분화에 상응하는 형태 변화가 수행되었으며, 즉 긴 세포의 신장부는 성장 원추 및 사상족에서 말단화된다(Woodbury et al. (2000) J Neuroscience Research 61:364; Sanchez-Ramos et al. (2000) Exp Neurology 164:247). 또한, 이러한 제제는 네스틴, 신경세포-수용체 에놀라아제(NSE), 신경세사 M(NF-M), 및 신경 성장 인자 수용체 trkA를 포함하는 신경세포 특이적 단백질의 발현을 유도한다(Woodbury et al. (2000) J Neuroscience Research 61:364; Sanchez-Ramos et al. (2000) Exp Neurology 164:247).
분화 능력을 갖는 성인 세포의 기타 예는 하기 특허 문헌에 기술되어 있다:
오시리스(Osiris)의 미국 특허 제 5,486,359호에는 하나의 결체조직 유형 이외의 세로포 분화될 수 있는 사람 간엽모세포의 분리된 동종 군에 관한 것이다. 본 특허에는 이러한 세포를 배양하여 즉, 실험관내에서 분리시키고, 정제하고, 크게 복제하는 공정이 기술되어 있다.
케이스 웨스턴(Case Western) 및 오시리스의 미국 특허 제 5,942,225호에는 분리된 사람 간엽모세포를 단일의 특정 간엽성 계통으로 계통-유도 분화시키는 조성물이 기술되어 있으며, 이는 사람 간엽모세포, 및 간엽모세포를 단일의 특정 계통으로 분화시키기 위한 하나 이상의 생활성 인자를 포함한다.
케이스 웨스턴의 미국 특허 제 5,736,396호에는 분리된 사람 간엽모세포를 생체외에서 계통-유도 분화시키는 방법으로서, 간엽모세포를 생활성 인자와 접촉시켜 단일의 특정 간엽성 계통으로 생체외 분화시키는 것을 포함하는 방법에 대해 기술되어 있다. 본 문헌에는 또한, 특정 간엽성 계통의 간엽성 세포가 필요한 개체를 치료하는 방법으로서, 생활성 인자와 접촉시키므로써 생체외 분화되는 분리된 사람 간엽모 세포를 포함하는 조성물을 상기 개체에 투여하여, 간엽모세포를 단일의 특정 간엽성 계통으로 생체화 분화시키는 것을 포함하는 방법이 기술되어 있다.
케이스 웨스턴의 미국 특허 제 5,908,784호에는 사람 간염전구세포의 실험관내 연골세포분화 및 이들로부터의 사람 연골세포의 실험관내 형성을 위한 조성물로서, 패킹된 세포 펠렛에 매우 근접하게 농축된 분리된 사람 간엽모세포 및 이들과 접촉되는 하나 이상의 연골유도 제제를 포함하는 조성물이 기술되어 있다. 본 문헌에는 또한, 간엽모세포를 연골유도 제제와 실험관내 접촉시켜 간엽모세포에서 연골세포 분화를 유도하는 방법이 기술되어 있으며, 상기 간엽모세포는 패킹된 세포 펠렛에 매우 근접하게 농축된다.
어드밴스드 티슈 사이언스, 인크.(Advanced Tissue Sciences, Inc.)의 미국 특허 제 5,902,741호에는 스트로마 세포에 의해 브릿지 연결되어 사이 공간을 갖는 3차원 구조로 형성된 생체적합한 무생물로 구성된 3차원 프레임워크에 부착되고, 사실상 이를 둘러싸는 스트로마 세포에 의해 자연적으로 분비되는 연골 생성 스트로마 세포 및 결체 조직 단백질을 포함하는, 실험관내에서 제조된 살아있는 연골조직이 기술되어 있다. 본 특허는 또한, 세포가 연골로 증식되고 분화되기에 적합한 중합성 담체중의 간엽모세포를 포함하는, 신규한 연골을 성장시키기 위한 조성물이 기술되어 있다.
어드밴스드 티슈 사이언스, 인크.의 미국 특허 제 5,863,531호에는 스트로마 세포에 의해 브릿지 연결되어 사이 공간을 갖는 생체적합한 무생물로 구성된 3차원 관형 프레임워크에 부착되고, 사실상 이를 둘러싸는 스트로마 세포에 의해 자연적으로 분비되는 체결 조직 단백질 및 스트로마 세포를 포함하는, 실험관내에서 제조된 관형의 살아있는 스트로마 조직에 대해 기술되어 있다.
어드밴스드 티슈 사이언스, 인크.의 미국 특허 제 6,022,743호에는 살아있는 스트로마 조직 프레임워크상의 췌장 실질 세포 배양물로부터 유래된 스트로마 세포 기재 3차원 배양 시스템에 대해 기술되어 있다. 스트로마 세포는 췌장 실질세포, 태반 세포, 간엽모세포 또는 태아 세포를 포함할 수 있다. 이와 같이, 배양 시스템은 작용성 췌장 조직 및 유기 물질을 제공하는데 사용된다.
오시리스의 미국 특허 제 5,811,094호에는 사람 골수로부터 회수되고, 사실상 혈액 세포를 함유하지 않는 사람 간엽모세포를 함유하는 세포 제조물을 체결 조직이 요구되는 개체에 투여하므로써 개체의 체결 조직을 생성시키는 것을 포함하여, 체결 조직을 생성시키는 방법이 기술되어 있다.
티에드(Thiede) 등의 미국 특허 제 6,030,836호에는 사람 간엽모세포를 조혈모세포와 공동배양하여 조혈모세포의 적어도 일부가 이들의 줄기 세포 표현형을 유지할 수 있도록 하는 것을 포함하여, 실험관내에서 사람 조혈모 세포를 유지시키는 방법이 기술되어 있다.
토로크-스트로브(Torok-Storb) 등의 미국 특허 제 6,103,522호에는 혈구생성을 유지하는 사람 골수 스트로마 세포주에 대해 기술되어 있다.
토로크-스트로브 등의 WO 0602662A1 및 미국 특허 제 5,879,940호에는 혈구생성을 유지시키는 사람 골수 스트로마 세포주가 기술되어 있다.
몰포겐(Morphogen)의 미국 특허 제 5,827,735호에는 사실상 다핵화된 근원성 분화 결정된 세포를 함유하지 않으며, 주로 방사형인 정제된 다능성 간엽모세포에 대해 기술되어 있으며, 여기서 간엽모세포는 10% 소태 혈청을 함유하는 조직 배양 배지에서 근육형성 단백질과 접촉시킬 경우 주로 섬유아구성 세포를 형성하며, 10% 소태 혈청을 함유하는 배지로의 조직 배양시 근육형성 단백질 및 상처 저지 인자(scar inhibitory factor)와 접촉시킬 경우 자연스럽게 접촉하는 분지되고, 다핵화된 구조를 구조 형성한다.
하네만 유니버시티(Hahnemann University)의 WO 99/43286에는 중추신경계를 치료하기 위한 간엽모세포의 용도 및 골수 스트로마 세포의 분화를 유도하는 방법이 기술되어 있다.
오시리스의 WO 98/20731에는 간엽성 거핵세포 전구체 조성물 및 거핵세포를 분리하므로써 분리된 거핵세포와 결합된 MSC를 분리시키는 방법이 기술되어 있다.
오시리스의 WO 99/61587에는 사람 CD45 및/또는 섬유아세포 및 간엽모세포에 대해 기술되어 있다.
익시온 테크놀로지(Ixion Technology)의 WO 01/079457에는 실험관내에서 배양되고 췌장형 세포로 분화되는 골수 및 혈액 유래된 세포의 용도에 대해 기술되어 있다. 더 유니버시티 오브 텍사스(The University of Texas)의 WO 01/78752에는 췌장 질환을 치료하기 위해 췌장으로 이식된 신경 줄기 세포의 용도가 기술되어 있다.
그러나, 상기 단락에 기재된 기술들은 수득하기도 어렵고, 기증자에게 고통을 주는 골수와 같은 전구체 세포의 공급원에 의존하고 있다. 따라서, 본 발명은 췌장의 내분비 질환을 치료하는데 있어서 도움이 되는 세포, 물질 및 방법을 제공하는 것이다.
발명의 요약
본 발명은 췌장 세포 및 바람직하게는, 내분비선 췌장 세포의 하나 이상의 유전자형 또는 표현형 특징을 발현하도록 유도된 사람 또는 기타 포유동물로부터 분리된, 분리된 지방-조직 유래된 스트로마 세포를 제공한다. 이러한 세포는 글루카곤-생성 α-세포, 인슐린-생성 β-세포, 췌장 폴리펩티드-생성 γ-세포 또는 소마토스타틴-생성 δ-세포의 특성을 나타낼 수 있다. 바람직한 구체예에서, 인슐린-생성 β-세포가 생성된다. 본 발명의 세포는 실험관내에서 또는 환자로의 이식 후에 분화될 수 있다.
본 발명의 세포는 2차원 또는 3차원 구조로 혼입되어 하기 더욱 상세히 기술된 바와 같은 이식가능한 또는 이식된 매트릭스를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 포유동물, 바람직하게는 사람으로의 이식물과 양립가능한 생물질중의 분화된 지방-유래된 성인 줄기 세포 또는 분화된 세포를 캡슐화시키는 방법을 제공한다. 캡슐화 물질은 지방-유래된 성인 줄기 세포 또는 분화된 세포로부터 분비되는 단백질 또는 호르몬의 방출을 방해하지 않는다. 사용되는 물질로는 콜라겐 유도체, 히드로겔, 칼슘 알기네이트, 아가로스, 히알루론산, 폴리-락트산/폴리-글리콜산 유도체 및 피브린을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 세포는 또한, 외생성 유전자 물질을 포함하도록 유전학적으로 조작될 수 있다. 한 구체예에서, 원하는 유전자 서열을 숙조 세포 염색체로 삽입시킬 수 있는 벡터가 사용된다. 바람직한 구체예에서, 유입된 핵산 분자는 수용체 숙주 세포에서 자율 복제가 가능한 플라스미드 또는 바이러스 벡터로 혼입된다. 다양한 벡터가 본 목적에 사용될 수 있다. 바람직한 진핵세포 벡터로는 예를 들어, 백시니아 바이러스(vaccinia virus), SV40, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 및 당해분야의 이러한 실험에 잘 이용되는 다양한 구입가능한, 플라스미드-기재 포유동물 발현 벡터를 포함한다. 발현을 위한 벡터 또는 핵산 분자가 제조되면, DNA 구조물(들)이 다양한 적합한 방법 즉, 형질전환, 트랜스펙션, 바이러스 감염, 컨주게이션, 원형질 융합, 일렉트로포레이션, 입자총 기법, 인산칼슘-침전, 직접 미세주입 등에 의해 적합한 숙주 세포로 유입될 수 있다. 벡터 유입 후, 수용체 세포는 벡터-함유 세포의 성장을 위해 선택된 선택적인 배지에서 성장한다. 클로닝된 유전자 분자(들)가 발현하여 이종 단백질을 생성시킨다.
또한, 본 발명은 췌장 세포 예를 들어, 글루카곤 생성 α-세포, 인슐린 생성 β-세포, 췌장 폴리펩티드 생성 γ-세포 또는 소마토스타틴 생성 δ-세포중 하나 이상의 유전자형 또는 표현형 특징을 발현시키기 위한 분리된 지방조직 유래된 스트로마 세포를 분화시키는 방법으로서, 분리된 지방조직-유래된 스트로마 세포를 췌장 유도 물질, 바람직하게는 내분비선 췌장 유도 물질과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 이러한 유도 물질은 하기에 더욱 상세히 설명된 바와 같이, 성장 인자, 사이토카인, 화학 제제, 및/또는 호르몬을, 분리된 지방조직-유래된 스트로마 세포가 하나 이상의 내분비선 췌장 세포 마이커를 발현하기에 충분한 농도로 포함하는 화학적으로 규정된 세포 배양 배지중에 존재한다.
추가로, 본 발명은 숙주에서 글루카곤 생성 α-세포, 인슐린 생성 β-세포, 췌장 폴리펩티드 생성 γ-세포 또는 소마토스타틴 생성 δ-세포의 췌장 작용에 의해 매개된 질환을 치료하는 방법으로서, 분리된 지방 조직-유래된 스트로마 세포가 숙주에 치료학적으로 유익한 췌장 세포의 하나 이상의 유전자형 또는 표현형 특징을 발현하도록 유도한 후, 유도된 세포를 숙주에 이식하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명의 이점은, 지방 조직-유래된 스트로마 세포가 숙주로부터 직접적으로 분리되고, 분화되고, 그 후 자가 재이식될 수 있다는 점이다. 대안적으로, 상기 치료법은 이종적으로 달성될 수 있다.
본 발명이 치료하는데 사용될 수 있는 췌장 내분비선 질환 또는 퇴행성 질환의 비제한적 예로는 타입 I 당뇨병, 타입 II 당뇨병, 지방이영양증 관련 질환, 화학적으로 유도된 질환, 췌장 관련 질환, 또는 외상 관련 질환을 포함한다.
본 발명의 세포는 동종의 또는 사실상 동종의 세포군, 또는 기타 세포가 내분비선 췌장 유형 세포의 성장 또는 분화를 지지하는 물질을 분비하거나, 기타 원하는 치료학적 인자를 분비하거나 나타내는 기타 세포와 함께 세포군의 일부로서 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 처리된 지방-유래된 스트로마 세포를 통해 호르몬을 생성시키는 방법을 포함한다. 또한, 세포 배양 배지를 본 발명의 세포에 노출시키므로써 배양 배지를 조절하는 방법을 포함한다. 그 후,배지를 사용하여 다른 지방-유래된 세포를 배양시킬 수 있다.
본 발명은 또한, 췌장 세포의 하나 이상의 유전자형 또는 표현형 특징을 발현하도록 유도된 지방 유래된-스트로마 세포를 생성시키기 위한 키트에 관한 것이며, 이는 나머지 지방 조직으로부터 스트로마 또는 줄기 세포를 분리시키기 위한 설명서를 포함할 수 있으며, 줄기 세포를 분화시키기 위한 배지를 포함하며, 여기서 배지는 세포가 췌장 세포의 하나 이상의 유전자형 또는 표현형 특징을 발현하도록 유도하거나, 일반적으로 췌장유전자를 갖는다. 키트는 또한, 본 발명의 조직을 생성시키는데 필요한 모든 성분을 포함한다. 이러한 키트는 본 발명의 세포 또는 세포군, 생물학적으로 양립가능한 래티스(lattice), 및 수화제, 세포 배양 기판, 세포 배양 배지, 기타 세포, 항체 화합물 및 호르몬으로 구성된 성분을 포함한다.
본 발명의 기타 목적 및 특징은 하기 설명으로부터 더욱 자명해질 것이다.
본 발명은 췌장 세포, 바람직하게는 내분비선 췌장 세포의 하나 이상의 유전자형 또는 표현형 특징을 발현하도록 유도된 사람 또는 기타 포유동물로부터의 분리된 지방 조직-유래된 스트로마 세포를 제공한다. 이러한 세포는 글루카곤-생성 α-세포, 인슐린-생성 β-세포, 췌장 폴리펩티드-생성 γ-세포 또는 소마토스타틴-생성 δ-세포의 특성을 나타낼 수 있다. 바람직한 구체예에서, 인슐린-생성 β-세포가 생성된다. 본 발명의 세포는 실험관내에서 또는 환자로 이식된 후에 분화될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 동물 질환, 바람직하게는 사람 질환의 치료, 조직 회복 또는 개선, 및 삶을 변경시키거나 삶을 위협하는 대사 질환의 교정을 위한 치료학적 생성물의 연구, 이식 및 개발에 있어서 성숙 췌장 세포의 특징을 갖는 부분적으로 또는 완전히 분화된 기능성 세포의 공급원을 제공할 수 있다. 이러한 세포를 생성시키는 방법이 또한 포함된다.
Ⅰ. 정의
"발생적 표현형(developmental phenotype)"은 분화 공정을 통해 특정 물리적 표현형을 수득하기 위한 잠재적 세포이다.
"유전형"은 분화 경로와 관련된 유전자의 하나 이상의 메신저 RNA 전사의 발현을 의미한다.
"췌장 베타 도세포(Pancreatic beta islet cell)"는 바람직하게는 조정된 방식으로, 더욱 바람직하게는 글루코스 농도 의존적 방식으로 인슐린, 인슐린 유사체, 인슐린 전구체 또는 인슐인 유사 인자를 분비할 수 있는 세포를 의미한다.
"췌장 알파 세포"는 바람직하게는 조정된 방식으로 글루카곤, 글루카곤 유사체, 글루카곤 전구체 또는 글루카곤 유사 인자를 분비할 수 있는 세포를 의미한다.
"췌장 델타 세포"는 바람직하게는 조정된 방식으로 소마토스타틴, 소마토스타틴 전구체 또는 소마토스타틴 유사 인자를 분비할 수 있는 세포를 의미한다.
"췌장 PP 세포" 또는 "감마 세포"는 바람직하게는 조정된 방식으로 췌장 펩티드, 유사체, 전구체 또는 유사 인자를 분비할 수 있는 세포를 의미한다.
"인슐린"은 공지된 다양한 인슐린, 인슐린 유사체 또는 인슐린 유사 인자를 의미한다. 이는 프로호르몬 또는 인슐린 전구체 단백질, 완전하게 프로세싱된 단백질, 또는 이들 전체중 임의의 대사물을 포함한다.
"당뇨병"은 췌장 베타 랑게르한스섬 세포가 기능 장애를 일으켜서 글루코스 수준 순환에 대한 반응성이 손실된 질환을 의미한다. 이러한 질환 상태는 선척적 대사 오류, 외상 손상, 화학적 손상, 전염성 질환, 만성 알코올 섭취, 내분비병증, 유전자 질환 예컨대, 다운증후군으로 인해 초래될 수 있거나, 기타 내분비 췌장에 직접적으로 또는 간접적으로 손상을 초래하는 기타 병인으로 초래될 수 있다.
"비성인의 성인발증형 당뇨병(Mature onset diabetes of the young)"은 타입 1 또는 타입 2 당뇨 표현형에 분명하게 해당되지 않은 낮은 비율의 당뇨병 환자를 포함하는 것을 뜻한다. 이는 일반적으로 25세 이전에 초기에 발병되는 베타-세포 기능의 유전적 결점을 특징으로 한다.
"자가면역 질환"은 숙주의 내분비선 췌장의 거부 및 파괴를 초래하는, 체액성 또는 세포성 면역 매개된 과정을 포함하는 것을 뜻한다. 이러한 과정의 병인으로는 항원 예컨대, 콕사키 바이러스, 또는 미코플라즈마 뉴모니애의 감염에 대한 면역 반응, 자가면역 장애에 대한 선천성 대사 경향, 또는 화학적 노출이 있으며, 여기에 제한되는 것은 아니다.
폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE). 크기에 따라 폴리펩티드를 분류하기 위한 가장 일반적으로 사용되는 기법(이 방법만 있는 것은 아님)은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동이다. 이러한 방법의 원리는 겔을 통해 폴리펩티드 분자를 이동시키는 것이며, 겔은 체로서 작용하여 가장 큰 분자의 이동을 가장 많이 저지하며, 가장 작은 분자의 이동을 가장 적게 저지한다. 폴리펩티드 단편이 더 작을 수록, 폴리아크릴아미드 겔에서의 전기영동에 따른 이동성이 더욱 크다. 전기영동 전 또는 동안에, 폴리펩티드는 전형적으로 연속적으로 나트륨 도데실 술페이트(SDA) 세정제에 노출되며, 이러한 조건하에서 폴리펩티드는 변성을 일으킨다. 천연 겔은 SDS의 부재하에 흐른다. 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분류된 폴리펩티드는 염색 과정에 의해 직접적으로 가시화될 수 있다.
웨스턴 트랜스퍼 과정. 웨스턴 트랜스퍼(또한 면역블롯팅으로도 불림) 과정의 목적은 분류 과정으로 생성된 폴리펩티드의 상대적 위치를 유지시키면서, 니트로셀룰로오스 필터 또는 기타 적합한 표면상으로 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분류된 폴리펩티드를 물리적으로 이동시키는 것이다. 그 후, 블롯은 관심있는 폴리펩티드(들)에 특이적으로 결합하는 항체로 프로빙된다.
"정제된" 단백질 또는 호르몬은 세포 성분으로부터 분리된 단백질 또는 호르몬이다. "정제된" 단백질 또는 호르몬은 자연적으로는 발견되지 않는 순도로 정제된다. "사실상 순수한" 단백질 또는 호르몬은 호르몬 또는 단백질의 특성에 실질적으로 영향을 끼치지 않는 기타 성분만을 함유하는 제조물이다.
"내분비선 췌장 유전자"는 내분비선 췌장의 분화되거나 분화된 알파, 베타, 델타 또는 PP 세포의 표현형과 관련된 유전자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다는 것을 의미한다. 이러한 유전자는 pdx1, pax4, pax6, 뉴로게닌 1, 뉴로게닌 2, 뉴로 D, GLUT2, 인슐린, Isl1, Hlxb9, Nkx2.2를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
Ⅱ. 지방-유래된 줄기 또는 스트로마 세포
지방 줄기 세포 또는 "지방 스트로마 세포"는 지방 조직으로부터 유래된 세포이다. "지방"은 지방 조직을 의미한다. 지방 조직은 피하, 대망/내장, 유방, 성선, 또는 기타 지방 조직 부위로부터 유래된 갈색 또는 백색 지방 조직일 수 있다. 바람직하게는, 지방은 피하의 백색 지방 조직이다. 이러한 세포는 일차 세포 배양물 또는 불멸화된 세포주를 포함할 수 있다. 지방 조직은 지방 조직을 갖는 유기로부터 수득될 수 있다. 바람직하게는, 지방 조직은 포유동물로부터의 지방 조직이며, 가장 바람직하게는 사람으로부터의 지방 조직이다. 지방 조직의 편리한 공급법은 지방 흡입술이나, 지방 조직의 공급원 또는 지방 조직의 분리 방법은 본 발명에 있어서 중요한 것은 아니다. 지방흡입은 미용 효과를 갖는 비교적 비침해적인 과정이며, 이는 많은 환자에 적용가능하다. 지방세포가 보충가능한 세포군이라는 것은 널리 증명되어 있다. 지방흡입술 또는 기타 과정에 의한 수술적 제거 후에도, 시간에 따라 개체의 동일한 부위에서 지방세포가 재생성되는 것은 일반적으로 확인된다. 이는, 지방 조직이 지방세포로 자가-재생성될 수 있는 스트로마 줄기 세포를 함유한다는 것을 시사한다.
병리학적 증거는 지방-유래된 스트로마 세포가 다중 계통 경로를 따라 분화될 수 있음을 암시한다. 가장 공통적인 연조직 종양인 지방육종은 지방세포 유사 세포로부터 발생한다. 혼합된 기원의 연조직 종양은 비교적 공통적이다. 이는 지방 조직, 근육(평활근 또는 골격근), 연골, 및/또는 뼈의 요소를 포함할 수 있다. 진행성 골 이형성으로서 공지된 희귀병을 앓고 있는 환자에서, 피하 지방세포는 알려지지 않은 이유로 뼈를 형성한다.
사람 지방 조직-유래된 성인 스트로마 세포는 생체외에서 확장되고, 독특한 계통 경로를 따라 분화되고, 유전학적으로 조작되고, 자가 또는 동종 이식물로서 개체로 재유입될 수 있다.
더 유니버시티 오브 피츠버그(The University of Pittsburgh) 및 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아(The Regents of the University of California)의 WO 00/53795 및 더 유니버시티 오브 피츠버그로 양도된 미국특허출원 2002/0076400에는 사실상 지방세포 및 적혈구를 함유하지 않는 지방-유래된 줄기 세포 및 래티스, 및 체결 조직 줄기 세포의 클로날 군에 대해 기술되어 있다. 이러한 세포가 단독으로 또는 생물학적으로 양립가능한 조성물내에서 사용되어 생체내 및 실험관내에서 분화된 조직 및 구조를 생성시킬 수 있다. 또한, 이러한 세포가 확장되고 배양되어, 호르몬을 생성시키고, 기타 세포군의 성장 및 확장을 지지하기 위한 조정된 배양 배지를 제공할 수 있다. 또 다른 양태에서, 이들 문헌에는 사실상 세포가 결여된 리포-유래된 래티스가 기술되어 있으며, 이는 지방 조직으로부터의 세포외 매트릭스 물질을 포함한다. 이러한 래티스는 생체내 또는 실험관내에서 세포의 성장 및 안라겐(anlagen) 또는 성숙 조직 또는 구조로의 분화를 촉진하는 기재로서 사용될 수 있다. 상기 문헌 어디에도 내분비선 췌장 세포의 하나 이상의 표현형 또는 유전자형 특징을 발현하도록 유도된 지방조직 유래된 스트로마 세포가 기술되어 있지 않다.
아르테셀 사이언스에 양도된 미국 특허 제 6,391,297호에는 생체내에서 뼈를 회복시키고, 뼈 질환을 치료하는데 사용될 수 있는 뼈모세포의 하나 이상의 특징을 나타내도록 분화될 수 있는 분리된 사람 지방조직-유래된 스트로마 세포의 조성물이 기술되어 있다. 이러한 지방-유래된 뼈모세포 유사 세포는 선택적으로 유전학적으로 변형되거나 매트릭스와 혼합될 수 있다.
바이오홀딩스 인터내셔널(BioHoldings International)에는 미국 특허 제 6,426,222호에는 글루코코르티코이드를 함유해야 하는 액체 영양 배지중에 지방 조직 세포를 배양하므로써 사람 수회 지방 조직으로부터 뼈모세포 분화를 유도하는 방법이 기술되어 있다.
발명자로서 할보르센(Halvorsen) 등이 기록되어 있는 WO 00/44882 및 미국특허 제 6,153,432호에는 지방조직으로부터 분리된 사람 전구지방세포를, 분리된 일차 지방세포에서 관찰된 것과 유사한 생화학적, 유전학적 및 생리학적 특성을 갖는 지방세포로 분화시키기 위한 방법 및 조성물이 기술되어 있다.
아르테셀 사이언스의 WO 01/62901 및 공개된 유럽특허출원 2001/0033834에는 신경세포, 아스트로글리얼(astroglial)세포, 조혈선구인자세포 또는 간장세포의 하나 이상의 표현형 특징을 발현시키는 분리된 지방조직-유래된 스트로마 세포가 기술되어 있다. 또한, 지방세포 표현형 마아커가 부재하도록 분화되는, 분리된 지방조직-유래된 스트로마 세포가 기술되어 있다.
아르테셀 사이언스의 미국특허 제 6,429,013호에는 하나 이상의 연골세포의 특징이 발현되도록 유도된 분리된 지방조직-유래된 스트로마 세포에 대한 조성물이 기술되어 있다. 또한, 이들 세포의 분화에 대해 기술되어 있다.
피터슨(Peterson) 등의 미국특허 제 6,200,606호에는 뼈 또는 연골을 생성시킬 수 있는 잠재성을 갖는 전구체 세포가 말초혈, 골수 및 지방 조직을 포함하는 다양한 조혈모세포 및 비조혈모세포 조직으로부터 분리될 수 있다는 것이 기술되어 있다.
더 유니버시티 오브 피츠버그 등의 WO 00/53795, 및 젠-바이오, 인크.의 WO 00/44882 및 미국특허 제 6,153,432호에 기술된 바와 같은 당해분야의 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 본 발명의 방법에 유용한 지방조직 유래된 스트로마 세포가 분리된다. 바람직한 방법에서, 지방조직은 포유동물 시험체, 바람직하게는 사람 피검자로부터 분리된다. 지방조직의 바람직한 공급원은 피하 지방조직이다. 사람에서, 지방조직은 지방흡입에 의해 통상적으로 분리된다. 본 발명의 세포가 사람 피검자로 이식되는 경우, 동일한 피검자로부터 지방조직을 분리시켜 자가 이식을 위해 제공하는 것이 바람직하다. 대안적으로, 이식된 조직은 동종일 수 있다.
비제한적인 예로서, 지방조직 유래된 스트로마 세포를 분리시키는 한 방법에서, 지방 조직을 0.01 내지 0.5%, 바람직하게는 0.04 내지 0.2%, 가장 바람직하게는 0.1% 농도의 콜라게나아제, 및 0.01 내지 0.5%, 바람직하게는 0.04 내지 0.04%, 가장 바람직하게는 0.2%의 트립신으로 25 내지 50℃, 바람직하게는 33 내지 40℃, 가장 바람직하게는 37℃에서 10분 내지 3시간, 바람직하게는 30분 내지 1시간, 가장 바람직하게는 45분 동안 처리한다. 세포를 20 내지 800 마이크론, 더욱 바람직하게는 40 내지 400 마이크론, 가장 바람직하게는 70 마이크론의 나일론 또는 치즈클로스 메쉬 필터를 통해 통과시킨다. 그 후, 세포를 배지에서, 또는 피콜(Ficoll) 또는 페르콜(Percoll)로 또는 기타 미립자 구배로 직접적으로 상이한 원심분리 처리한다. 세포를 100 내지 3000Xg, 더욱 바람직하게는 200 내지 1500Xg, 가장 바람직하게는 500Xg의 속도로 1분 내지 1시간, 더욱 바람직하게는 2 내지 15분, 가장 바람직하게는 5분 동안 4 내지 50℃, 바람직하게는 20 내지 40℃, 가장 바람직하게는 25℃의 온도에서 원심분리한다.
지방-유래된 스트로마 세포를 분리하는 또 다른 방법에서, 카츠(Katz) 등의 미국특허 제 5,786,207호에 기술된 바와 같은 기계적 시스템이 사용된다. 지방조직 샘플을 자동화된 장치로 유입시키고, 이를 세척하고, 분리하기 위한 시스템이 사용되며, 분리 단계에서 조직이 진탕되고 회전되므로써 생성된 세포 현탁액이 원심분리-준비 리셉터클에 모아진다. 이러한 방식으로, 지방 유래된 세포는 조직 샘플로부터 분리되며, 원하는 세포의 세포 보전성이 유지된다.
Ⅲ. 췌장 세포의 하나 이상의 특징이 나타내게 하기 위한 지방-유래된 스트로마 세포의 유도
본 발명은 췌장 세포의 하나 이상의 유전형 또는 표현형 특징을 발현시키는 세포를 형성시키기 위한 지방-유래된 스트로마 세포의 처리를 포함한다. 지방-유래된 스트로마 세포의 분화를 유도하는 방법의 비제한적인 예로는 1) 세포 배지의 용도; 2) 지지 세포의 용도; 3) 환자 조직으로부터 미분화된 세포의 직접 이식; 및 4) 세포 조작 기법을 포함한다.
A) 세포 배지 유도
이론에 의해 제한되지 않으면서, 2-차원 또는 3-차원 미세환경에서 혈청, 배아 추출물, 정제된 또는 재조합 성장 인자, 사이토카인, 호르몬 및/또는 화학 시제의 혼합물을 함유하는 배지로 지방-유래된 스트로마 세포를 처리하므로써 분화가 유도될 것으로 여겨진다.
더욱 상세하게는, 본 발명은 지방-유래된 세포를 췌장 세포의 유전형 또는 표현형 특성을 갖는 세포로 분화시키는 방법으로서, 약 1,000 내지 약 500,000 세포/cm2를 포함하나, 이에 제한되지 않는 원하는 밀도로 분리된 지방-유래된 성인 줄기 세포를 플레이팅시키고; 성장 인자, 호르몬, 사이토카인, 혈청 인자, 핵 호르몬 수용체 액체, 또는 기타 규정된 화학 시제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 혼합물을 포함하는 화학적으로 규정된 배양 배지중에서 세포를 배양시키는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 유용한 염기성 배지로는 배지 199, CMRL 1415, CMRL 1969, CMRL 1066, NCTC 135, MB 75261, MAB8713, DM145, 윌리암스 지(William's G), 뉴맨 앤 티텔(Neuman & Tytell), 히구치(Higuchi), MCDB301, MCDB202, MCDB501, MCDB401, MCDB411, MDBC153을 포함하는 다양한 배지중에서 뉴로바살(NeurobasalTM)(소태 혈청 또는 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)의 존재 또는 부재하에), N2, B27, 미니멈 이센셜 미디엄 이글(Minimum Essential Medium Eagle), ACD-1, LPM(혈청 알부민 비함유), F10(HAM), DCCM1, DCCM2, RPMI 1640, BGJ 미디엄(피튼-잭슨 변형물(Fitton-Jackson Modification)의 존재 또는 부재하에), 베이슬 미디엄 이글(Basal Medium Eagle)(얼스 염 베이스(Earle's salt base)가 첨가된 BME), 둘베코 변형된 이글 미디엄(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(혈청 부재의 DMEM), 야만(Yamane), IMEM-20, 글라스고우 모디피케이션 이글 미디엄(Glasgow Modification Eagle Medium: GMEM), 레이보비츠(Leibovitz) L-15 미디엄, 맥코이스 5A 미디엄(McCoy's 5A Medium), 미디엄 M199(M199E-얼스 세일 베이스(Earle's sale base)), 미디엄 M199(M199H-행크스 염 베이스(Hank's salt base)), 미니멈 이센셜 미디엄 이글(MEM-E-얼스 염 베이스), 미니멈 이센셜 미디엄 이글(MEM-H-행크스 염 베이스), 및 미니멈 이센셜 미디엄 이글(MEM-NAA-비필수적인 아미노산)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 사용하기에 바람직한 배지는 DMEM이다. 이러한 배지 및 기타 유용한 배지는 GIBCO(미국 뉴욕 그랜드 아일랜드) 및 바이오로지칼 인더스트리스(이스라엘 베스 아멕)로부터 구입가능하다. 이러한 많은 배지들은 문헌[Methodd in Enzymology, Volume LVII, "Cell Culture", pp.62-72(ed. Jakoby and Pastan, Academic Press, Inc.]에 요약되어 있다.
지방 유래된 스트로마 세포를 췌장 베타 세포의 하나 이상의 유전자형 또는 표현형 특징을 발현하는 세포로 분화시키기에 유용한 배지는, 온토제니, 인크.(Ontogeny, Inc.) 등의 WO 00/47721에 기술된 바와 같은 선조 세포를 인슐린-분비 베타 세로로 분화시키는데 중요한 역할을 하는 세크레틴 또는 세크레틴 유사체 또는 효능제를 포함한다. 본 발명의 방법에 유용한 배지는 적어도 1 내지 약 30%, 바람직하게는 적어도 약 5 내지 15%, 가장 바람직하게는 적어도 10% 농도로 소태 혈청 또는 기타 종의 기원을 함유할 것이다. 닭의 배아 추출물 또는 기타 종의 기원은 약 1 내지 30%, 바람직하게는 적어도 약 5 내지 15%, 가장 바람직하게는 약 10%의 농도로 존재한다.
성장 호르몬, 에리스로포이에틴, 트롬보포이에틴, 인터루킨 3, 인터루킨 6, 인터루킨 7, 대식세포 콜로니 자극 인자, c-키트 리간드/줄기 세포 인자, 오스테오프로테제린 리간드, 인슐린, 인슐린 유사 성장 인자, 상피세포 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 신경세포 성장 인자, 모양체 신경 추성 인자, 혈소판 유래된 성장 인자, 및 골형성단백질을 포함하나 이에 제한되지 않는 성장 인자, 사이토카인, 호르몬이 피코그램/ml 내지 밀리그램/ml 수준으로 본 발명에 사용된다. 이러한 농도의 예에 있어서, 본 발명의 방법에 유용한 성장 인자, 사이토카인 및 호르몬은 콜로니 형성 단위(CFU) 검정에서 지방 유래된 스트로마 세포로부터 100% 이하의 혈액 세포(림프구, 적혈구, 골수구 또는 혈소판 계통)를 형성시킬 수 있다(Moore et al. (1973) J.Natl.Cancer Inst. 50:603-623; Lee et al. (1989) J.Immunol. 142:3875-3883; Medina et al. (2993), J.Exp.Med.178:1507-1515).
인슐린 생성 세포의 생성을 보조할 수 있는 것으로 입증된 성장 인자는 펩티드, GLP-1, 엑스텐딘-4 및 에간(Egan) 등의 WO 00/09666에 기술된 바와 같은 사실상 동종의 아미노산 서열을 갖는 유사체를 포함한다.
추가적인 성분이 배양 배지에 첨가될 수 있다. 이러한 성분은 항생제, 알부민, 아미노산, 및 세포 배양을 위해 당해분야에 공지된 기타 성분일 수 있다. 또한, 분화 과정을 증가시키는 성분이 첨가될 수 있다. 기타 화학 제제로는 스테로이드, 레티노이드, 및 양성 대조분에 대해 적어도 25-50%까지 지방 유래된 스트로마 세포의 분화를 유도하는 기타 화학 화합물 또는 제제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
상기된 세포 배지 조건은 단일 형태의 췌장 세포, 즉, 췌장 알파, 베타, 또는 PP 세포의 하나 이상의 유전자형 또는 표현형 특성을 발현하는 세포를 생성시키는 것으로 인지되어 있다. 특정의 세포형은 본 기술분야의 전문가에게는 공지된 임의의 수단에 의해서 분리된다. 분화ehls 세포에 의해서 발현된 유전자형 또는 표현형 특성의 이점을 지니는 수단이 특히 유용하다. 하기된 바와 같은 바람직한 세포의 표현형 마아커는 본 기술분야의 전문가에게는 공지되어 있으며, 문헌에 공개되어 있다. 추가의 표현형 마아커는 계속 공개되고 있으며 과도한 실험 없이도 동정할 수 있다. 이들 마아커중 일부는 지방-유래된 성인 줄기세포가 분화 상태로 유도됨을 확인하는데 사용된다.
계통 특이적 표현형 특성은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 세포 표면 단백질, 세포골격 단백질, 세포 형태, 및/또는 분비 생성물을 포함한다. 췌장 알파 세포는 다른 마아커 중에서도 글루카곤을 발현한다. 췌장 베타 도세포(islet cell) 특성은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 네스틴, pdx1(IDX-1, IPF-1 및 STF-1으로도 공지됨), GLUT2, NeuroD, 뉴로게닌, 및 인슐린을 포함한 마아커의 발현을 포함한다. 또한, 췌장 베타 세포는 다량의 아연을 함유한다. 비독성의 아연 민감성 형광 프로브를 사용하면 살아있는 베타 세포내의 불안정한 아연을 선택적으로 표지할 수 있으며, 가시광선 스펙트럼내의 여기 및 방출 파장을 밝혀내어, 본 기술이 표준 장치에 의해서 실시되게 할 것이다[문헌: Lukowiak B et al., J Histochem Cytochem. 2001 Apr; 49(4):519-28]. 해리된 뉴포트 그린-표지된 세포(Newport Green-labeled cell)의 세포 소팅(cell sorting)은 베타-세포를 명확히 분리시키며, 이는 DNA 당 인슐린 함량 및 면역세포화학 분석에 의해서 판단된다. 유세포분류기 또는 유사한 세포 소팅 도구를 사용함으로써, 본 기술 분야의 전문가라면 이러한 기술 또는 유사한 기술을 이용하여 베타세포를 고순도로 정제할 수 있다.
다른 마아커들중에서도 췌장 델타 세포는 소마토스타틴을 발현하며, 췌장 PP 세포는 췌장 폴리펩티드를 발현한다. 이들 세포형의 다른 마아커는 콜리시스토키닌(CCKA)에 대한 수용체 및 KIT 수용체 티로신 키나아제를 포함한다[문헌: Schweiger et al Anat Histol Embryol. 2000 Dec;29(6):357-61; Rachdi et al Diabetes 2001 Sep;50(9):2021-8].
또 다른 방법은 본 기술 분야의 전문가에게는 공지된 많은 문헌화된 기술을 통한 정제를 위해서 다양한 세포형에서 발견된 마아커에 특이적으로 유도된 항체를 이용한다. 이들 기술은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 면역화학적 유세포분류기 및 세포 소팅 및 면역자기 정제법을 포함한다. 비-제한적인 예로서 면역자기 정제법은 특정 항체(즉, 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴 또는 췌장 폴리펩티드)로 코팅된 균일한 상자성 입자인 다이나비드(dynabead)의 사용을 포함한다.
본 기술 분야의 전문가라면 공지된 칼로리메터, 형광, 면역화학, 폴리머라아제 연쇄 반응, 화학 또는 방사성화학 방법이 계통 특이적 마아커의 존재 또는 부재를 용이하게 확인할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 분화를 할 수 있는 배양 배지내에서 췌장 세포의 하나 이상의 유전자형 또는 표현형 특성을 발현하도록 유도될 수 있는 탈분화된, 분리된, 지방-유래된 성인 줄기세포를 제공한다. 탈분화된 지방-유래된 성인 줄기 세포는 성숙한 지방세포 마아커의 부재에 의해서 동정된다.
B) 지방-유래된 스트로마 세포의 분화를 촉진하는 지지 세포의 사용
본 발명의 또 다른 양태에서, 지지 세포는 지방-유래된 스트로마 세포의 분화를 촉진시키는데 사용된다. 지지 세포는 사람 또는 비사람-동물 유도된 세포일 수 있다. 비사람-동물 지지 세포가 사용되면, 생성되는 분화된 세포는 이종간이식을 통해서 이식된다.
본 발명의 지방-유래된 세포는 세포 군체내에서 분리되고 배양되며, 가장 바람직하게는, 군체는 한정된 군체이다. 세포의 군체는 이종성이며, 인자를 본 발명의 세포에 공급하는 지지 세포를 포함한다. 지지 세포는 요구되는 세포의 분화, 성장 및 유지를 촉진할 수 있는 다른 세포형을 포함한다. 비-제한적인 예로서, 췌장 베타 세포의 하나 이상의 제조타입 또는 표현형 특성을 발현하는 지방-유래된 스트로마 세포가 요구되면, 지방-유래된 스트로마 세포를 먼저 상기된 수단중 임의의 수단에 의해서 분리하고 다른 지지 세포의 존재하에 배양물중에서 성장시킨다. 예를 들어, 이들 지지 세포는 바람직하게는 다른 췌장 세포형, 즉, 알파, 델타, 감마, PP의 특성을 지닌다. 또 다른 양태에서, 지지 세포는 배양된 췌장 조직으로부터 취한 이들 세포형의 일차 배양물로부터 유도된다. 또 다른 양태에서, 지지 세포는 불멸화된 세포주로부터 유도된다. 일부 양태에서, 지지 세포는 자기 조직적으로 얻어진다. 또 다른 양태에서, 지지 세포는 동종적으로 얻어진다.
요구되는 세포의 분화를 지지하도록 사용된 세포는 지지 세포가 되도록 유전적으로 조작될 수 있다는 것이 본 발명에서 또한 고려된다. 이러한 세포는 외생성 유전자를 발현하도록 유전적으로 변형되거나 하기된 방법 또는 본 기술분야의 전문가에게는 공지된 방법에 의해서 내생성 유전자의 발현을 억제하도록 유전적으로 변형된다.
C) 이식
또 다른 관점에서, 본 발명은 지질-유래된 스트로마 세포 및 자기 이식 및 동종 이식에 유용한 췌장 세포의 하나 이상의 유전자형 또는 표현형 특성을 발현하는 분화된 세포를 제공한다. 이러한 분화는 환경내에서의 자연적인 인자 또는 유입된 인자 수단에 의해서 생체내에서 수행된다. 한 가지 양태에서, 이식 부위는 질환을 앓고 있는 췌장이다. 다른 양태에서, 이식 부위는 피하 또는 복강내 부위이다. 바람직하게는, 이식 대상은 포유동물이며, 더욱 바람직하게는, 이식 대상은 사람이다. 또 다른 양태에서, 세포는 글루카곤, 췌장 폴리펩티드, 소마토스타틴, 또는 인슐린을 필요로 하는 부위에 추가의 성장 인자와 함께 또는 이러한 성장 인자 없이 이식된다. 본 발명의 세포는 시험관내에서 또는 환자에게로의 이식 후에 분화하도록 유도될 수 있다.
따라서, 또 다른 관점으로, 본 발명은 a) 지방 조직-유래된 스트로마 세포를 분리하고; b) 세포의 분화에 적절한 배지에서 세포를 평판시켜 인큐베이션시키고; c) 분화된 세포를 대상에게 유입시킴을 포함하여, 췌장 세포의 하나 이상의 유전자형 또는 표현형 특성을 발현하는 분화된 세포를 대상에게 제공하는 방법을 개시한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 a) 지방 조직-유래된 스트로마 세포를 분리하고; b) 미분화된 세포를 대상에게 유입시킴을 포함하여, 미분화된 지방-유래된 스트로마 세포를 대상에게 제공하는 방법을 제공한다.
미분화된 지방-분화된 스트로마 세포가 대상에게 도입되는 경우에, 한 가지 특정의 양태로서, 이들 세포가 추가의 성장 또는 분화 인자와 함께 또는 이러한 인자 없이 질환을 앓고 있는 췌장내로 직접 유입되는 것이 본 발명에서 고려된다. 본 발명의 또 다른 관점으로서, 미분화된 지방-유래된 스트로마 세포는 스트로마 세포의 생체내 분화에 적합한 환경을 제공할 수 있는 본원에 기재된 지지 세포 또는 분화 인자와 함께 도입된다. 예를 들어, 이들 지지 세포는 바람직하게는 다른 췌장 세포형, 즉, 알파, 베타, 델타, PP의 특성을 지닌다. 또 다른 양태로서, 지지 세포는 배양된 췌장 조직으로부터 취한 이들 세포형의 일차 배양물로부터 유도된다. 또 다른 양태로서, 지지 세포는 불멸화된 세포주로부터 유도된다. 일부 양태로서, 지지 세포는 자기 조직적으로 얻어진다. 또 다른 양태로서, 지지 세포는 동종적으로 얻어진다.
또 다른 양태로서, 분화된 지방-유래된 세포는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 조직 복구, 재생, 재구성 또는 강화를 포함한 치료학적 적용을 위해서 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 제공된다. 지방-유래된 세포는 미국특허 제6,153,432호(본원에서 참조로 통합)에 개시된 방법에 의해서 배양되어 세포를 탈분화시켜서, 탈분화된 성인 간세포가 지방조직 유도된 세포가 아닌 세포의 유전자형 또는 표현형 특성을 발현하도록 유도될 수 있게 한다. 탈분화된 지방-유래된 세포는 요구되는 단백질 또는 펩티드의 생성을 위해서 비-내생성 유전자 서열을 포함하도록 변화된다. 탈분화된 지방-유래 세포는, 또 다른 양태로서, 요구되는 치료목적으로 2- 또는 3-차원 매트릭스로 숙주에게 투여될 수 있다. 한 가지 양태로서, 탈분화된 세포는 환자 자신의 세포로부터 자기 조직적으로 얻어진다. 또한, 탈분화된 세포는 동종적으로 얻어진다.
본 발명의 또 다른 관점으로, 본 발명의 분화된 세포는 췌장 조직 유래 간세포로부터의 기능성 랑게르한스 섬의 시험관내 성장 방법을 개시하고 있는 유니버시티 오브 플로리다 리서치 파운데이션(University of Florida Research Foundation)의 WO 97/15310호에 개시된 방법과 유사한 현탁된 세포 배양 현탁액으로 분해하고 옮겨서, 도세포 클러스터 형성이 관찰될 때까지 성장시켰다. 클러스터를 함유하는 매질은 췌장 내분비 기능의 지표일 수 있는 인슐린 또는 다른 호르몬의 존재에 대해서 본 기술 분야의 전문가에게는 공지된 표준 생화학분석 기술에 의해서 분석될 수 있다. 클러스터 또는 응집체는 조직 생성 또는 재생성 목적으로 숙주 세포내로 주입되거나 이식될 수 있다.
캡슐화
본 발명은 포유동물, 바람직하게는, 사람에게 이식하기에 적합한 생물질내에 분화된 지방-유래 세포를 캡슐화하는 방법을 제공한다. 캡슐화 물질은 지방-유래 성인 줄기세포에 의해서 분비된 요구되는 단백질의 분비를 방해하지 않도록 선택되어야 한다. 사용된 물질은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 콜라겐 유도체, 히드로겔, 알긴산칼슘, 아가로스, 히알루론산, 폴리락트산/폴리글리콜산 유도체 및 피브린을 포함한다.
D) 본 발명의 지방-유래 세포의 유전자 조작
또 다른 양태에서, 췌장 세포의 하나 이상의 유전자형 또는 표현형 특성을 발현하는 지방-조직 유래 세포는 외생성 유전자를 발현하거나 내생성 유전자의 발현을 억제하도록 유전적으로 변경될 수 있다. 본 발명은 상기 세포 및 세포군을 유전적으로 변형시키는 방법을 제공한다.
프로모터 및 목적하는 서열을 포함하는 핵산 구성물이 선형 분자이거나, 더욱 바람직하게는, 공유결합 폐환 분자일 수 있는 비-복제성 DNA(또는 RNA) 분자로서 수용 원핵 또는 진핵 세포내로 도입될 수 있다. 그러한 분자는 기관의 복제 없이 자가 복제가 불가능하기 때문에, 유전자의 발현이 도입된 서열의 일시적인 발현을 통해서 일어날 수 있다. 또한, 영구적인 발현은 도입된 DNA 서열을 숙주 염색체내로 통합시킴으로써 일어날 수 있다.
한 가지 양태에서, 요구되는 유전자 서열을 숙주 세포 염색체내로 통합시킬 수 있는 벡터가 사용된다. 도입된 DNA가 세포 염색체내로 안전하게 통합되는 세포는 요구되는 핵산서열을 함유하는 숙주 세포의 선택을 가능하게 하는 하나 이상의 마아커를 도입함으로써 선택될 수 있다. 마아커는, 요구되는 경우, 양생형을 위해서 영양요구성 숙주에게 살균 내성, 예를 들어, 항생제, 중금속, 예컨대, 구리 등에 대한 내성을 제공할 수 있다. 선택 가능한 마아커 유전자 서열은 발현되도록 DNA 유전자 서열에 직접 결합되거나, 공동-형질감염에 의해서 동일한 세포내로 도입될 수 있다. 바람직하게는, 마아커의 발현은 정량화되고 선형으로 플롯팅될 수 있다.
바람직한 양태에서, 도입된 핵산 분자는 수용 숙주에서 자가 복제할 수 있는 플라스미드 또는 바이러스 벡터내로 혼입된다. 어떠한 광범위하게 다양한 벡터가 본 목적으로 사용될 수 있다. 특정의 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 선택하는데 있어서의 중요한 인자는: 벡터를 함유하는 수용 세포가 벡터를 함유하지 않는 수용 세포로부터 인지되어 선택될 수 있는 용이성; 특정의 숙주에서 요구되는 벡터의 복제 수; 및 상이한 종의 숙주 세포 사이로 벡터를 "왕복"시킬 수 있는 것이 요구되는 지를 포함한다.
바람직한 진핵 벡터는, 예를 들어, 백신 바이러스, SV40, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련된 바이러스 및 본 기술 분야의 전문가에게는 공지된 다양한 시판중의 플라스미드-기재 포유동물 발현벡터를 포함한다.
구성물(들)을 함유하는 벡터 또는 헥산 분자가 발현을 위해서 제조되면, DNA 구성물(들)은 어떠한 다양하고 적합한 수단, 즉, 형질전환, 트랜스펙션, 바이러스 감염, 컨주게이션, 원형질 융합, 일렉트로포레이션, 입자총 기술, 인산칼슘-침전법, 및 직접적인 미세주입 등에 의해서 적절한 숙주 세포내로 도입될 수 있다. 벡터의 도입 후에, 수용 세포는 벡터-함유 세포의 성장을 선택하는 선택적 배지에서 성장된다. 클로닝된 유전자 분자(들)의 발현은 이종 단백질을 생성시킨다.
세포에 "유지"된 도입된 DNA는 세포가 계속 성장하고 증식하는 한 기본적으로 의문의 모든 세포에 계속 존재하는 것으로 이해되어야 한다. 즉, 도입된 DNA는 다중의 세포 분할 사이클 후에도 세포의 주요 구성물이 희석되지 않는다. 오히려, 도입된 DNA는 세포 증식 동안 복제되어 도입된 DNA의 하나 이상의 복사체가 거의 모든 딸세포(daughter cell)에 유지된다. 도입된 DNA는 두 가지 양상 중 한 양상으로 세포에 유지될 수 있다. 첫번 째로, 도입된 DNA는 세포의 게놈내로 직접적으로 통합된다. 이러한 현상은 빈도가 드물게 발생한다. 두번 째로, 도입된 DNA는 염색체외 요소, 또는 에피솜으로 존재할 수 있다. 에피솜이 세포 증식동안 희석되지 않도록 하기 위해서, 선택 가능한 마아커 유전자가 마아커 유전자의 발현에 요구되는 조건하에 성장한 세포 및 도입된 DNA에 포함될 수 있다. 도입된 DNA가 게놈에 통합되는 경우에도, 선택 가능한 마아커 유전자가 염색체로부터 DNA의 절제를 방지하도록 포함될 수 있다.
유전적으로 변경된 세포는 형질전환유전자가 생체내에서 발현되는 조건하에 다양한 방법에 의해서 유기체에 도입될 수 있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 양태에서, 형질전환유전자는 인슐린을 생성하도록 코드화될 수 있다. 인슐린을 위한 형질전환유전자를 함유하는 세포는 질환을 앓고 있는 사람 또는 다른 동물의 췌장내로 도입될 수 있다. 또한, 형질전환유전자를 함유하는 세포는 복강내 주입되거나 일부 다른 적합한 기관 데포(depot) 부위내로 주입된다.
E) 세포 특성화
생성되는 분화된 세포의 "특성화"는 특정의 말단 분화된 상태에 대한 스트로마 세포의 분화 결정(lineage commitment)을 나타내는 나타내는 표면 및 세포내 단백질, 유전자, 및/또는 다른 마아커의 동정을 의미한다. 이러한 방법은, 이로 한정되는 것은 아니지만, (a) 유세포분석법의 이용을 포함하여, 이차 형광 tag를 사용함으로써 연결된 단백질 특이적 모노클로날 항체를 사용한 면역형광 방법에 의한 세포 표면 단백질의 검출; (b) 유세포분석법의 이용을 포함하여, 이차 형광 tag를 사용함으로써 연결된 단백질 특이적 모노클로날 항체를 사용한 면역형광 방법에 의한 세포내 단백질의 검출; (c) 폴리머라제 연쇄 반응, 동일반응계내 혼성화, 및/또는 노던 블롯 분석에 의한 세포 유전자의 검출을 포함한다. 말단 분화된 세포는 특정의 말단 분화된 상태에 대한 스트로마 세포의 분화 결정을 나타내는 표면 및 세포내 단백질, 유전자, 및/또는 다른 마아커의 동정에 의해서 특성화된다. 상기된 이러한 방법은, 이로 한정되는 것은 아니지만, (a) 지방-유래 스트로마 세포 표면 단백질, 예컨대, 알칼리성 포스파타제, CD44, CD146, 인테그린 베타 1 또는 오스테오폰틴[문헌: Gronthos et al. 1994 Blood 84:4164-4173] 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 췌장 폴리펩티드, 네스틴, PDX1, GLUT2, 뉴로D, 및 뉴로게닌의 유세포분석 또는 동일반응계내 면역염색과 같은 면역 형광 검정에 의한 세포 표면 단백질의 검출; (b) 특이적 모노크로날 항체를 사용한 지방 조직 유래 스트로마 세포의 유세포분석 또는 동일반응계내 면역염색과 같은 면역 형광 방법에 의한 세포내 단백질의 검출; (c) 폴리머라아제 연쇄 반응, 동일반응계내 혼성화, 및/또는 다른 블롯 분석과 같은 방법에 의한 계통 선택적 mRNA, 예컨대, HNF3β, Isl-1, Brain-4, Pax-6, Pax-4, Beta2/NeuroD, PDX-1, Nkx6-2, Ngn-3, 인슐린 및 Glut-2의 발현 검출을 포함한다[참조: Gimble et al. 1989 Blood 74:303-311].
F) 치료제로서 본 발명의 세포의 용도
본 발명의 세포 및 세포군을 치료제로서 사용할 수 있다. 일반적으로, 그러한 방법은 세포를 요구되는 조직 또는 데포(depot)에 전달함을 포함한다. 세포는 조직의 형태에 따라서 다양할 수 있는 어떠한 적절한 방법에 의해서 요구되는 조직에 전달된다. 예를 들어, 세포는 세포를 함유하는 배양 배지로 이식편을 주입하거나 이식편을 침지시킴으로써 이식편에 전달될 수 있다. 또한, 세포는 조직내의 요구되는 부위상에 시딩하여 군체를 형성시킬 수 있다. 세포는 본 기술 분야의 전문가에게는 공지된 장치, 예를 들어, 세포 등으로 시딩된 카테터, 투관침, 캐뉼라, 또는 스텐트를 사용함으로써 생체내 부위에 전달될 수 있다.
본 발명의 세포는 다양한 질환을 치료하는데 사용된다. 특히, 췌장의 내분비 장애와 연관된 질환, 또는 글루카곤, 인슐린, 췌장 폴리펩티드, 또는 소마토스타틴으로 치료될 수 있는 질환이 관심의 대상이다.
i) 인슐린 관련된 질환
형질전환된 세포가 어떠한 인슐린 관련된 질환, 예컨대, 당뇨병, 특히 타입 I 당뇨병, 타입 II 당뇨병 및 비성인의 성인발증형 당뇨병(Maturity-Onset Diabetes of the Young: MODY)을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 세포가 사용되어 치료될 수 있는 당뇨병 증상은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 유전적 원인, 감염, 외상, 또는 화학적 원인을 포함한 어떠한 병인으로 야기될 수 있다. 본 발명의 세포에 의해서 치료되는 다른 질환은 지방이영양증-연관된 질환, 화학적으로-유도된 질환, 췌장염-연관된 질환, 외상-연관된 질환을 포함한다. 질환 상태는 자가면역 장애 또는 바이러스 또는 일부 다른 감염제의 감염의 결과일 수 있다.
ii) 글루카곤-관련된 질환
글루카곤 생성 세포는 글루카곤을 전신 또는 요구되는 부위에 방출하는 이식체로서 만성 하이포글리세믹 환자를 치료하는데 사용되며; 자극성 장 증후군 또는 평활근 이완을 요하는 유사한 증상을 치료하는데 사용되고; 지방 조직 덩어리를 감소시키도록 지방 세포내의 글루카곤에 의한 지방분해의 자극에 의해서 비만을 치료하는데 사용될 수 있다.
iii) 췌장-폴리펩티드-관련된 질환
췌장-폴리펩티드를 분비하는 세포는 이식되어 비-인슐린 의존형 당뇨병, 비만, 또는 췌장 베타 도세포의 비대증, 인슐린 내성, 또는 간에 의한 비정상 글루코스 생성을 유발하는 어떠한 증상을 치료하느데 사용될 수 있다.
iv) 소마토스타틴-관련된 질환
형질전환된 세포는 소마토스타틴 투여가 유용한 어떠한 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 췌장 델타(즉, 소마토스타틴 생성) 세포의 하나 이상의 특성를 발현하는 분화된 세포가 소마토스타틴 자체, 또는 이것이 조절하는 생리학적 과정이 관련되는 질환을 치료 및 예방하는데 사용되는 것으로 예상된다. 이러한 질환은 암 뿐만 아니라 내분비 질환, 위장관 질환, CNS, PNS, 및 혈관 및 면역 시스템의 질환을 포함한다. 따라서, 분화된 소마토스타틴-생성 세포는 1) 포유동물의 다양한 호르몬 분비 및 영양 인자를 억제하는데 사용되고; 2) 예를 들어, 유방암, 뇌암, 전립선암, 및 폐암(소세포 및 비소세포 유표피암종 둘 모두), 뿐만 아니라, 특이성간암, 신경모세포종, 결장 및 췌장 선암종(관형), 연골육종, 및 흑색종을 포함한 영양 인자의 자가분비 또는 측분비와 관련된 질환을 치료하는데 사용된다. 한가지 양태에서, 본 발명의 소마토스타틴 생성 세포는 암을 직접치료하거나 방사선치료법 또는 화학치료법을 포함한 다른 치료법을 사용한 병행치료를 위해서 암세포를 감작시키는데 사용된다.
이들 세포의 그 밖의 사용은 특정의 내분비 분비물, 예컨대, IGF-1과 같은 다양한 영양 인자의 분비를 억제하는 인슐린, 글루카곤, 프로락틴, 및 GH를 억제시킴을 포함한다. 본 발명의 세포는 과다한 GH 및 영양 인자 분비를 포함하거나 이와 연관된 병인에 의한 질환의 치료에 사용되도록 처방된다. 이러한 분비를 억제하는 기능은 말단거대증과 같은 질환을 치료하는데 유용한다. 이러한 활성은 또한 신경내분비종양, 예컨대, 유암종, VIP종, 인슐린종, 및 글루카곤종의 치료에 유용하다. 본 발명의 소마토스타틴 생성 세포는 또한 당뇨병, 및 혈관병, 새벽현상, 신경병증, 신증 및 망막증을 포함한 당뇨병 관련된 병을 치료하는데 유용하다[문헌: Grant et al., Diabetes Care 2000, 23, 504-509].
또 다른 양태에서, 본 발명의 소마토스타틴 생성 세포는 위장계의 출혈 질환, 예컨대, 간경변증과 같은 질환과 연관된 내장 혈류 및 식도정맥류를 포함하는 혈관 질환을 치료하는데 사용된다. 혈관수축을 중재하는 소마토스타틴의 기능은 소마토스타틴 생성 세포가 군집성 두통 및 편두통을 치료하는데 유용하게 한다.
본 발명의 소마토스타틴 생성 세포는 혈관 내피세포의 증식을 억제하는데 사용되며, 그로 인해서, 혈관성형술, 동종 또는 이종이식 혈관병, 이식 혈관 죽상동맥경화증과 같은 혈관 이식후의 재협착 또는 혈관 폐색와 같은 이식편 혈관 질환을 치료하는데 사용되도록 처방되고, 기관(예, 심장, 간, 폐, 신장 또는 췌장 이식체[문헌: Wechbecker et al., Transplantation Proceedings 1997, 29, 2599-2600])의 이식에 사용되도록 처방된다. 본 발명의 소마토스타틴 생성 세포는 또한 혈관신생을 억제하는데 사용될 수 있고, 그로 인해서, 상처를 치료하고, 이로 한정되는 것은 아니지만, 폐, 유방 및 전립선 암을 포함한 전이단계 암을 치료하는데 사용되도록 처방된다.
본 발명의 소마토스타틴 생성 세포는 또한 위산 및 외분비 및 내분비 췌장 분비를 억제하는데 사용될 수 있고 위장관의 다양한 펩티드 방출을 억제하는데 사용될 수 있다. 따라서, 소마토스타틴 생성 세포는 위장 질환, 예를 들어, 소화성궤양, NSAID-유도된 궤양, 궤양성 장염, 급성 췌장염(예, ERCP 후의 환자에서), 장피누공 및 췌장피누공, 위장관 운동장애, 장폐쇄, 만성 위축성 위염, 비궤양성 소화불량, 경피증, 자극성 장 증후군, 크론 질환, 덤핑 증후군, 수양성 설사 증후군 및 AIDS 또는 콜레라와 같은 질환과 연관된 설사의 치료에 유용하다[문헌: O'Dorisio et al., Advances in Endocrinology Metabolism 1990, 1:175-230].
특정의 양태로서, 본원에 개시된 소마토스타틴 생성 세포는 졸중, 다발성 경화증, 알츠하이머 질환 및 그 밖의 형태의 치매, 정신건강 질환(예컨대, 불안증, 우울증, 및 정신분열증) 및 동통 및 발작과 같은 그 밖의 신경 질환을 치료하는데 유용하게 사용되며서 소마토스타틴이 중추신경계내의 신경조절제로서 요구되는 부위에서 작용한다[문헌: A. Vezzani etal., European Journal of Neuroschience 1999, 11, 3767-3776].
소마토스타틴 생성 세포는 또한 다른 치료제와 병행 사용될 수 있다. 예를 들어, 기관 이식을 치료하는 경우에, 그 밖의 치료제의 예는 시클로스포린 및 FK-506을 포함한다. 종양을 치료하는 경우, 그 밖의 치료제의 예는 타목시펜 및 알파-인터페론을 포함한다. 당뇨병을 치료하는 경우, 그 밖의 치료제의 예는 메트포르민 또는 그 밖의 바이구아니드, 아카르보스, 술포닐우레아, 티아졸리딘디온 또는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 퍼옥시좀 증식제-활성화된 수용체 감마(PPAR-감마), 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 I, 글루카곤-유사 펩티드 I(glp-I) 및 포만-촉진제, 예컨대, 덱스펜플루라민 또는 렙틴에 대한 효능제로 작용하는 화합물이 포함된다.
Ⅲ. 조직 조작
본원에 기술된 세포는 조직 조작에 사용될 수 있다. 본 발명은 본 발명의 세포가 목적하는 물질로 확대되고 분화되기에 충분한 조건하에서 유지시키는 것을 포함하여, 동물 물질을 생성시키는 방법을 제공한다. 본 물질은 예를 들어, 전체 췌장의 일부 또는 전체 췌장을 포함할 수 있다. 이렇게 본원에 기술된 세포는 하기 기술된 기법(여기에 제한되는 것은 아님)을 포함하는 조직 조작의 공지된 기법으로 사용된다: 어드밴스드 티슈 사이언스, 인크.(Advanced Tissue Sciences, Inc.)의 미국 특허 제 5,902,741호 및 제 5,863,531호; 베컨티(Vacanti) 등의 미국 특허 제 6,139,574호; 베컨티 등의 미국 특허 제 5,759,830호; 베컨티 등의 미국 특허 제 5,741,685호; 베컨티 등의 미국 특허 제 5,736,372호; 베컨티 등의 미국 특허 제 5,804,178호; 베컨티 등의 미국 특허 제 5,770,417호; 베컨티 등의 미국 특허 제 5,770,193호; 그리프스-시마(Griffith-Ciam) 등의 미국 특허 제 5,709,854호; 아탈라(Atala) 등의 미국 특허 제 5,516,532호; 베컨티 등의 미국 특허 제 5,855,610호; 베컨티 등의 미국 특허 제 5,041,138호; 베컨티 등의 미국 특허 제 6,027,744호; 베컨티 드의 미국 특허 제 6,123,727호; 켐프(Kemp) 등의 미국 특허 제 5,536,656호; 스크작-브렉(Skjak-Braek) 등의 미국 특허 제 5,144,016호; 베컨티 등의 미국 특허 제 5,944,754호; 투보(Tubo) 등의 미국 특허 제 5,723,331호; 시팅거(Sittinger) 등의 미국 특허 제 6,143,501호.
이러한 구조를 생성시키기 위해, 본 발명의 세포 및 세포군은 확장되고 분화되어 기관을 형성하기에 적합한 조건하에 유지된다. 이는 전형적으로 새로운 물질이 요구되는 동물에 본 발명의 세포 및 세포군을 전달하므로써 달성된다. 이와 같이, 본 발명은 상기 세포가 이러한 조직으로 이식된 동물의 췌장 재생을 촉진시킬 수 있다.
또 다른 구체예에서, 세포는 실험관내에서 조직으로 분화되고 확장된다. 이와 같이, 세포는 조직 발생에 도움이 되는 3차원 구조로의 형성을 촉진하는 기판상에서 배양된다. 예를 들어, 이러한 세포는 생체적합한 래티스 에컨대, 세포외 매트릭스 물질, 합성 중합체, 사이토카인, 성장 인자 등을 포함하는 래티스상에 배양되거나 시딩된다. 이러한 래티스는 원하는 형태로 몰딩되어 조직 유형의 발생을 촉진시킬 수 있다.
이와 같이, 본 발명은 세포 및 세포군, 및 생물학적으로 양립가능한 래티스를 포함하는 조성물을 제공한다. 래티스는 전형적으로 100㎛ 내지 약 300㎛의 간격을 갖는 메쉬 또는 스폰지와 같은 섬유를 갖는 중합성 물질로부터 형성된다. 이러한 구조는 세포가 성장하고 증식하는데 충분한 영역을 제공한다. 바람직하게는, 래티스는 시간에 따라 생분해될 수 있어서, 동물 물체로 흡수될 것이다. 적합한 중합체는 단량체 예컨대, 글리콜산, 락트산, 프로필 푸마레이트, 카프로락톤 등으로부터 형성된다. 기타 중합성 물질은 단백질, 폴리사카라이드, 폴리히드록시산, 폴리오르토에스테르, 폴리안하이드라이드, 폴리포스포젠 또는 합성 중합체, 특히 생분해가능한 중합체 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 또한, 래티스는 호르몬 예컨대, 성장 인자, 사이토카인, 몰포겐(예를 들어, 레티노산), 요망되는 세포외 매트릭스 물질(예를 들어, 피브로넥틴, 라미닌, 콜라겐 등) 또는 기타 물질(예를 들어, DNA, 바이러스, 기타 세포 유형 등)을 포함할 수 있다.
조성물을 형성하기 위해서, 세포가 래티스로 유입되어 이들 틈새로 스며든다. 예를 들어, 세포를 함유하는 용액 또는 현탁액에 매트릭스를 침수시키거나, 세포를 매트릭스로 주입시킬 수 있다. 바람직하게는, 중합체를 포함하며, 여기에 분산된 본 발명의 세포를 갖는 현탁액의 가교에 의해 형성된 히드로겔이 사용된다. 이러한 형성 방법은 세포가 래티스에 걸쳐 분산되게 하여, 래티스로의 세포 침투를 촉진시킨다. 물론, 본 조성물은 또한 원하는 표현형의 성숙한 세포 또는 이들의 전구체를 포함하여, 본 발명의 세포의 래티스내로의 유입을 증가시키거나, 래티스내에서의 인슐린 또는 글루카곤과 같은 호르몬의 생성을 증진시킬 수 있다.
당업자는 조성물로의 세포 함유에 적합한 래티스는 임의의 적합한 공급원 예컨대, 마트리겔로부터 유래될 수 있으며, 물론 적합한 래트스에 대한 시중의 공급원을 포함할 수 있다. 또 다른 적합한 래티스는 지방 조직의 무세포 부분 예를 들어, 사실상 세포가 결여된 지방 조직 세포외 매트릭스로부터 유래될 수 있다. 전형적으로, 이러한 지방 유래된 래티스는 단백질 에컨대, 프로테오글리칸, 글리코단백질, 히알루로닌, 피브로넥틴, 콜라겐 등을 포함하며, 이들 모두는 세포 성장을 위한 탁월한 기판 역할을 한다. 또한, 이러한 지방 유래된 래티스는 호르몬, 사이토카인, 성장 인자 등을 포함할 수 있다. 당업자는 본원에 참고문헌으로 인용된 더 유니버시티 오브 피츠버그의 WO 00/53795에 기술된 바와 같이, 이러한 지방 유래된 래티스를 분리하는 방법을 인지하고 있을 것이다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 췌장 유사 조직은, 조직의 재생 및 성장을 가능하게 하는 고형물 비함유 형태의 구조물을 사용하여 생성된다. 이러한 기법은 예를 들어, 베컨티 등의 미국 특허 제 6,138,573호에 기술되어 있으며, 이는 사람에 이식하기 위한 부분적 또는 전체 기관을 생성시킬 수 있다. 특히, 이러한 기법으로 이식을 위한 부분적 또는 전체 췌장을 생성시킬 수 있을 것이다. 이러한 부분적 또는 전체 기관의 생성은 자가 방식으로 수득된 본 발명의 세포로 달성될 수 있다. 대안적으로, 이러한 부분적 또는 전체 기관은 동종 방식으로 수득된 본 발명의 세포로부터 생성된다. 당업자에게 공지된 방법이 본 발며의 세포로부터의 조직을 조작하는데 유용한 것으로 여겨진다. 예를 들어, 노튼(Naughton) 등(어드밴스드 티슈 사이언스)의 미국 특허 제 6,022,743호 및 제 5,516,681호에는 췌장 유사 조직의 배양을 위한 3차원 세포 배양 시스템 방법이 기술되어 있다. 이러한 방법은, 세포를 매트릭스상으로 시딩하고 이식하여, 기관 조직 및 구조적 성분을 형성시키고, 이는 추가적으로 생활제의 방출을 조절할 수 있는 것을 포함한다. 매트릭스는, 이식된 세포에 의해 형성된 조직의 자연적으로 발생하는 맥관화와 작용적으로 동등한 루멘의 네트워크, 및 내피세포와의 라이닝을 특징으로 한다. 매트릭스는 이식시 혈관 또는 기타 관에 추가로 연결되어 매트릭스에 걸쳐 맥관 또는 관 네트워크를 형성시킨다. 유리 형태의 구조 기법은, 일련의 2차원 층으로서 복잡한 3차원 물체를 제작하는 당해분야에 공지된 기법을 참조하기 바란다. 이러한 방법은 다양한 중합성, 유기 및 조성 물질로 규정된 조성, 강도 및 밀도를 갖는 구조물을 생성시키도록 적용될 수 있다. 이와 같이, 이러한 방법을 이용하여, 정확한 채널 및 포어가 매트릭스내에 생성되어 규정된 기능을 갖는 하나 이상의 세포 유형의 매트릭스내에서 후속하는 세포 성장 및 증식을 조절할 수 있다. 이러한 방식으로, 다양한 유형의 췌장 세포에 상응하는 본 발명의 분화된 세포(즉, 적어도 췌장 알파, 베타, 감마 또는 델타 세포의 유전자형 또는 표현형 특징을 갖는 세포)는 부분적 또는 전체 기관을 형성하도록 혼합될 수 있다. 이러한 세포는 매트릭스내에서 혼합되어 세포에 걸쳐 산재된 내피 세포로 라이닝된 맥관 네트워크를 제공한다. 기타 구조는 기관내의 림프 도관, 담즙관 및 기타 외분비관 또는 배설관으로서 사용되도록 형성될 수 있다.
본 발명의 세포, 세포군, 래티스 및 조성물은 조직 조작 및 재생에 사용된다. 이와 같이, 본 발명은 기술된 본 발명의 특징을 혼입시킨 이식가능한 구조물에 속한다. 이식물의 정확한 성질은 요구되는 용도에 따라 변할 수 있다. 이식물은 성숙한 조직을 포함할 수 있거나, 미성숙 조직 또는 래티스를 포함할 수 있다. 이와 같이, 예를 들어, 이식물은, 적합한 크기 및 면적의 래티스내로 선택적으로 시딩된, 처리되거나 췌장 분화되는 본 발명의 세포군을 포함할 수 있다. 이러한 이식물은 숙주내로 주입되어 환자내의 성숙한 췌장 조직의 생성 또는 재생성을 조장한다.
지방 유래된 래티스는 편리하게는, 세포 배양 키트의 일부로 사용된다. 따라서, 본 발명은, 본 발명의 지방 유래된 래티스 및 하나 이상의 기타 성분 예컨대, 수화제(예를 들어, 물, 생리학적으로 양립가능한 염수, 제조된 세포 배양 배지, 혈정 또는 이들의 혼합물 또는 유도체), 세포 배양 기판(예를 들어, 디쉬, 플레이트 용기 등), 세포 배양 배지(액체형 또는 분말형), 항체, 호르몬 등을 포함하는 키트를 제공한다. 키트가 이러한 성분을 포함할 수 있지만, 바람직하게는 이는 요망되는 세포의 배양 및 성장을 지지하는데 필요한 모든 성분을 적합하게 혼합하여 포함한다. 요망되는 키트는 또한, 기술된 바와 같은 래티스로 시딩되는 세포를 포함한다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 더욱 완전하게 기술될 것이다. 그러나, 본 발명은 많은 상이한 형태로 구체화될 수 있으며, 본원에 기술된 구체예에 한정되어서는 안되며; 이들 구체예는, 본 발명이 완전히 기술되게 하고, 당업자에게 본 발명의 범위를 충분히 이해시키기 위해 제공되었다.
실시예 1
실험관내 유도 방법
지방 유래된 줄기 세포를 문헌[Sen et al., 2001, J.Cell Biochem. 81,312-319]에 기술된 바와 같은 지방흡입 물질로부터 분리시켰다. 이들 세포를 하기 배지(이들로 제한되는 것은 아님)의 존재하에 연속 배양시켰다: 소태 혈청(FBS), N2, B27(인비트로겐), 또는 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)로 보충되거나 되지 않은 뉴로바살TM(인비트로겐: InVitrogen). 배지내의 글루코스 수준의 조정을 수행하였다. 세포를 다양한 농도로 시딩하고, 매 3 내지 6일의 간격을 두고 영양을 공급하였다. 가장 바람직하게는, 약 1000 내지 약 500,000세포/cm2의 밀도로 시딩하였다.
배양 동안, 내분비선 췌장 호르몬 인슐린(아메리칸 래보러토리 프로덕츠: American Laboratory Products), 글루카곤, 소마토스타틴 및 췌장 폴리펩티드(페닌술라 랩스 인크.: Peninsula Labs Inc.)에 대한 시중에 구입가능한 라디오-면역검정 또는 효소결합 항체법을 이용하여 조절된 배지를 분석하였다.
다양한 내분비선 췌장 세포 계통의 분화와 관련된 표현형 마아커의 발현은 하기 유전자(여기에 제한되는 것은 아님)에 대한 특이적 프라이머를 사용하여 RT-PCR에 의해 mRNA 검정으로 평가하였다: HNF3β, Isl-1, Brain-4, Pax-6, Pax-4, Beta2/NeuroD, PDX-1, Nkx6.2, Nkx2.2, Ngn-3, 인슐린 및 Glut2. 이들 마아커의 존재 및 내분비선 췌장 세포와의 관계는 이미 기술되어 있다[참고 문헌: Ramiya et al., 2000, Nat.Med. 6,278-282; Schwitzgebel et al., 2000, Development 127, 3533-3542; Fernandes et al., 1997, Endocrinology 138, 1750-1762; Zulewski et al., 2001, Diabetes 50, 521-533; Gradwohl et al., 2000, Proc.Natl. Acd.Sci. U.S.A 97, 1607-1611]. 면역사화학(Immunohistochemical: IHC) 검정은 또한 상기 기술된 표현형 마아커에 대한 항체(여기에 제한되는 것은)를 사용하여 수행될 수 있다.
실시예 2
유전자 치료법
본 방법은 췌장 세포의 하나 이상의 유전자형 또는 표현형 특징을 발현하는 세포로 성인 줄기 세포를 분화시키는, 유전자의 삽입 및 발현 방법을 포함한다. 이들 유전자는 전사 인자, HNF3β, Isl-1, Brain-4, Pax-6, Pax-4, Beta2/NeuroD, PDX-1, Nkx6.2, Nkx2.2 및 Ngn-3의 조절된 발현을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 핵산을 세포로 유입시키기 위한 가능한 방법은, 상기 상세히 설명된 바와 같은 일렉트로포레이션, 인산칼슘, 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 지질 매개된 수송을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 및 실시예 1에 상세히 기술된 바와 같이 세포의 분화에 대해 검정하였다.
실시예 3
생체내 이식
본 발명의 세포를 타입 1 당뇨병과 같은 내분비선 췌장 질환의 기능 부전으로 인한 사람 질환의 치료 및 동물에 치료학적으로 사용하기 위해 생체내에서 이식하였다. 이러한 적용을 위해 존재하는 설치류 모델은 인슐린 의존형 미비만 당뇨병(NOD) 마우스, 및 스트렙토조톡신으로 처리하여 랑게르한스섬이 파괴되어 당뇨병에 걸린 마우스 및 래트를 포함한다(Lumelsky et al., 2001, Science 292, 1389-1394; Soria et al., 2001, Diabetologia 44, 407-415). NOD 마우스는 췌장 랑게르한스섬의 이식에 사용되며, 랑게르한스섬은 췌관 줄기 세포로부터 생성된다[참고: Soria et al., 2001, Diabetologia 44, 407-415; Lumelsky et al., 2001, Science 292, 1389-1394; Stegall et al., 2001]. 췌장 세포의 하나 이상의 유전자형 또는 표현형 특징을 발현하는 본 발명의 분화된 세포는, 생존을 위해 매일 인슐린이 일반적으로 주입되어야 하는 NOD 동물로의 이식에 사용된다. 이식을 위한 동물의 준비는, 이전에 기술된 바와 같은 27-게이지 바늘을 사용하여 신장 캡슐의 피막하 영역에 작은 채널을 형성시키는 수술 과정을 포함한다(Ramiya et al., 2000, Nat.Med.6,278-282). 사람 성인 줄기 세포로부터 유래된 103-106 내분비선 췌장 세포를 작은 카테터를 사용하여 이식하고, 채널 구멍을 부식시켰다. 어깨의 피하 부위를 준비하고, 세포를 이식하는 대안적인 방법으로 실험할 수 있다(Ramiya et al., 2000,Nat.Med.6,278-282). 이들 둘 모두의 이식 모델에 있어서, 허위로 조작된 NOD 마우스 및 어떠한 수술도 수행하지 않은 NOD 마우스를 대조군으로서 사용하였다. 수술 후, 2-7일에 걸쳐셔, 동물에 매일 주입되어 인슐린을 주입하지 않았다. 기능적 인슐린 생성 세포의 지수로서, 아쿠첵-EZ(AccuChek-EZ) 글루코스 모니터(로쉐:Roche)를 사용하여 다양한 단계에서 동물의 혈중 글루코스 수준을 모니터링하였다. 사람 인슐린 및 기타 내분비선 췌장 호르몬에 대한 ELISA 검정을 수행하였다. 또한, 인슐린에 대한 사람 특이적 항체 및 이식으로부터 잠재적으로 생성된 기타 단백질을 사용하여 이식 부위의 면역사화학 검정을 수행하였다.
실시예 4
캡슐화
상기 기술된 바와 같이 이식된 세포는 면역 거부반응을 일으킬 수 있다. 이를 제거하기 위한 노력으로, 캡슐화 매트릭스를 사용하는 방법을 고안하였으며, 이는 캡슐화된 조직으로부터 분비된 호르몬은 이동할 수 있게 하나, 숙주 면역 공격에 대한 보호막으로서 작용하도록 한다. 참고문헌[Ramiya et al., 2000, Med. 6:278:282]. 이러한 보호막은 히알루론산-기재 겔 레스탈린TM(Q-Med Sweden, Uppsala, Sweden)을 포함할 수 있다. 이러한 방법에 있어서, 사람 성인 줄기 세포로부터 유래된 103-106 내분비선 췌장 세포를 겔로 캡슐화시켰다. 이식물을 피하내 부위에 위치시키고, 동물의 인슐린 공급을 중단시키고, 실시예 3에 기술된 바와 같이 검정하였다.
실시예 5
동종 이식
동종 이식을 실험하기 위한 동물 모델의 한 예는 문헌[Stegall et al., 2001, Transplantation 71, 1549-1555]에 기술되어 있다. 두 종(스트레인 A 및 스트레인 B; 예를 들어, CBA(H-2k) 및 BALB/c(H2-d)의 마우스를 성인 줄기 세포 도너 및 성인 줄기 세포로부터 유래된 내분비선 췌장 세포의 수용체로서 사용하였다. 기증체 내분비선 췌장 세포를, 사람 지방 유래된 줄기 세포에 대해 상기 기술된 것과 유사한 방식으로 뮤린 성선 지방세포의 도너 군으로부터 분리된 스트레인 A 또는 스트레인 B 성장 줄기 세포로부터 생성시켰다. 스트레인 A 또는 스트레인 B의 수용체는 스트렙토조톡신으로 처리하여 당뇨가 발생하게 하였다(Stegall et al., 2001, Transplantation 71, 1549-1555). 다음과 같이 이식을 수행하였다: 도너/수용체 혼합은 1) 동계, 스트레인 A에서 스트레인 A로, 그리고, 스트레인 B에서 스트레인 B로; 2) 동종, 스트레인 A에서 스트레인 B로, 그리고, 스트레인 B에서 스트레인 A로; 3) 스트레인 A 또는 스트레인 B로부터의 도너 세포에 대한 수용체로서 스트렙토조톡신 유도된 당뇨병 누드(면역결핍) 마우스를 사용한 제 3 모델. 이식물을 이식된 동물을 모니터링하고, 실시예 3에 기술된 바와 같이 분석하였다.
실시예 6
인슐린 검출 검정
본 발명의 세포 배양에서, 인슐린의 생성을 하기와 같이 검출하였다. 간단하게는, 상기 실시예에서 성장된 세포를 5 내지 25mmol/l 글루코스를 하유하는 혈청 비함유 배지로 3회 세척하고, 3ml의 혈청 비함유 배지에서 2시간 이상 동안 인큐베이션시켰다. 그 후, 조절된 배지를 모으고, 미세입자 효소 면역검정법(AXSYTM 시스템 인슐린 키트 코드 B2D010; 아보트 라보라토리스)를 사용하여 인슐린 수준을 측정하였으며, 프로인슐린 또는 C-펩티드에 대한 교차 반응을 갖지 않는 사람 인슐린이 검출되었다.
실시예 7
랑게르한스섬 클러스터 형성
3차원 랑게르한스섬 클러스터를 예를 들어, 루멜스키(Lumelsky) 등의 방법(2001, Science 1389-1394)에 따라 구성하였다. 간단하게는, 세포를 본원에 기술된 실시예 1에 개략된 방법에 따라 배양하였다. 세포를 초기에는 현탁액중에 네스틴-양성 세포군이 고도로 풍부하게 생성되도록 성장시키고, 혈청 비함유 ITSFn 배지로 보충하였다. 이러한 조건은 네스틴-양성 세포의 비를 증가시키는 것으로 확인되었다. 그 후, 세포를 N2 혈청 비함유 배지중에서 bFGF의 존재하에 확장시켰다. 인슐린 분비 랑게르한스섬 클러스터의 분화 및 형태형성을 유도하기 위해, bFGF를 니코틴아미드가 보충된 B27 배지를 함유하는 배지로부터 회수하였다. 그 후, 생성된 집합물 또는 클러스터가 당업자에게 공지된 방법에 의해 인슐린 생성물이라는 것을 확인하고 입증하였다.
실시예 8
지방 유래된 기질 세포로부터 분화된 특이적 췌장 세포 유형의 분리
단일 래트 랑게르한스섬 세포를 초기에 20-60분 동안 베타-세포 표면 특이적 항체(K14D10 마우스 IgG)와 함께 인큐베이션시켰다. 2차 항체(항-마우스 IgG)로 피복된 다이나비드(Dynabead)의 현탁액을 추가로 15분 동안 첨가한 후, 다이나비드 피복된 세포를 튜브와 마그넷(Dynal MPC) 사이로 접촉시켜 즉시 펠렛화시켰다. 다이나비드 피복된 세포가 인슐린을 함유하는지의 여부를 확인하고, 이러한 방법의 효율을 측정하기 위해 면역염색법을 이용하였다. 다이나비드 피복된 세포 및 피복되지 않은 세포를 인슐린 및 글루카곤에 대해 염색하였다.
다이나비드 면역정제는 95%의 순수한 인슐린 함유 베타 세포를 생성시켰으며, 이는 이소부틸메틸크산틴 및 글루카곤 유사 폴리펩티드 1에 대한 반응으로서 인슐린을 방출한다. 다이나비드-피복된 베타 세포의 인슐린 함량은 비피복된 세포에 비해 현저하게 더 높았다. 출발 물질로서 30개의 적은 랑게르한스섬을 사용하여 성공적인 분리를 달성하였다. "코멧(comet)" 검정을 이용하여, 다아나비드 피복된세포가 비피복된 세포와 비교하여 사이토카인-유도된 DNA 손상에 대한 동일한 민감성을 나타낸다는 것을 확인하였다(Hadjivassiliou et al Diabetologia. 2000 Sep;43(9):1170-7).
상기 설명에 제시된 기법의 이점을 갖는 본 발명의 변형 및 기타 구체예는 당업자에게 자명할 것이다. 따라서, 본 발명은 본원에 기술된 특정 구체예에 한정되는 것이 아니며, 기타 구체예가 첨부된 청구범위의 범위내에 포함되는 것으로 여겨진다. 특정 용어가 사용되었지만, 이들은 한정을 위해서가 아니라 일반적이고 기술적으로 사용된 것이다.

Claims (27)

  1. 내분비선 췌장 유래된 세포의 하나 이상의 특징을 발현시킬 수 있는 분리된 지방 조직 유래된 스트로마 세포.
  2. 제 1항에 있어서, 실험관내에서 세포의 분화가 유도됨을 특징으로 하는 세포.
  3. 제 1항에 있어서, 생체내에서 세포의 분화가 유도됨을 특징으로 하는 세포.
  4. 제 1항에 있어서, 외생성 유전자 물질이 세포내로 유입됨을 특징으로 하는 세포.
  5. 제 1항에 있어서, 사람 세포임을 특징으로 하는 세포.
  6. 제 1항에 있어서, 세포가 호르몬을 분비함을 특징으로 하는 세포.
  7. 제 6항에 있어서, 호르몬이 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴 또는 췌장 폴리펩티드로 구성된 호르몬 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 세포.
  8. 제 7항에 있어서, 호르몬이 인슐린임을 특징으로 하는 세포.
  9. 분리된 지방조직 유래된 스트로마 세포를 내분비선 췌장 유도 물질과 접촉시키는 것을 포함하여, 하나 이상의 내분비선 췌장 세포 마아커가 표출되도록 분리된 지방조직 유래된 스트로마 세포를 분화시키는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 내분비선 췌장 유도 물질이 화학적으로 규정된 세포 배양 배지중에 존재함을 특징으로 하는 방법.
  11. 숙주의 췌장 내분비선 장애 또는 퇴행성 질환을 치료하는 방법으로서,
    i) 분리된 지방조직 유래된 스트로마 세포를, 하나 이상의 내분비선 췌장 세포 마이커가 발현되도록 유도하고;
    ii) 유도된 세포를 숙주에 이식하는 것을 포함하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 지방조직 유래된 스트로마 세포를 숙주로부터 분리시킴을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 11항에 있어서, 췌장 내분비선 장애 또는 퇴행성 질환이 타입 I 당뇨병, 타입 II 당뇨병, 지방이영양증 관련 질환, 화학적으로 유도된 질환, 췌장 관련 질환, 또는 외상 관련 질환임을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1항 내지 제 8항중의 어느 한 항에 따른 세포를 포함하는 이식물.
  15. 제 14항에 있어서, 생체적합성 중합체를 추가로 포함함을 특징으로 하는 이식물.
  16. 제 15항에 있어서, 생체적합성 중합체가 히드로겔임을 특징으로 하는 이식물.
  17. 제 15항에 있어서, 생체적합성 중합체가 콜라겐 유래된, 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리글리콜산/폴리락트산, 히아룰로네이트 또는 피브린임을 특징으로 하는 이식물.
  18. (a) 세포가 호르몬을 배지로 분비시키기에 충분한 조건하에 제 1항 내지 제 8항중의 어느 한 항에 따른 세포를 배지중에서 배양시키고, (b) 배지로부터 호르몬을 분리하는 것을 포함하여, 호르몬을 생성시키는 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 생성된 호르몬이 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴 또는 췌장 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 분비됨을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 생성된 호르몬이 인슐린임을 특징으로 하는 방법.
  21. 실험관내에서 분화시킨 후, 내분비선 췌장 세포의 하나 이상의 특징을 발현시키도록 유도된, 분리된 지방조직 유래된 스트로마 세포.
  22. 제 21항에 있어서, 내분비선 췌장 세포의 하나 이상의 특징이 생체내에서 발현되도록 유도됨을 특징으로 하는 분화된 세포.
  23. 배양시 내분비선 췌장 세포의 하나 이상의 특징을 발현하도록 유도된, 분리된 지방조직 유래된 세포로서, 유도된 세포를
    a) 분해하여 현탁된 세포 배양물에 이송시키고;
    b) 도세포(islet cell) 클러스터의 증거가 관찰될 때까지 현탁된 세포 배양물을 성장시키고,
    c) 생성된 도세포 클러스트를 숙주로 주입시킴을 특징으로 하는 세포.
  24. 제 1항에 있어서, 숙주로의 이식에 적합한 생물질로 추가로 캡슐화됨을 특징으로 하는 세포.
  25. 제 24항에 있어서, 캡슐화 물질이 콜라겐 유도체, 히드로겔, 칼슘 알기네이트, 아가로스, 히알루론산, 폴리락트산/폴리글리콜산 유도체 및 피브린으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 세포.
  26. 숙주로 이식된 제 1항 내지 제 8항, 및 제 21항 내지 제 25항중 어느 한 항에 따른 세포의 용도.
  27. 숙주로 주입된 제 14항 내지 제 17항중의 어느 한 항에 따른 이식물의 용도.
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