JP2015086161A - 2型5−αリダクターゼ産生阻害剤、HGF産生促進剤およびWnt5a産生促進剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】松樹皮抽出物を有効成分とする2型5−αリダクターゼ産生阻害剤、松樹皮抽出物を有効成分とするHGF産生促進剤、カフェインを有効成分とする2型5−αリダクターゼ産生阻害剤、カフェインを有効成分とするWnt5a産生促進剤であることを特徴とする。
【選択図】図1
Description
これまでに知られている5α−リダクターゼ産生阻害剤としては、例えばビスナフトキノン誘導体を有効成分として含有するもの(特許文献1)、バナナの皮抽出物を有効成分とするもの(特許文献2)、ペルー原産のキク科植物であるヤーコンの抽出物(特許文献3)、東洋カボチャや西洋カボチャを有効成分とするもの(特許文献4)などがある。
これまでに知られているHGF産生促進剤としては、例えばアンジオテンシン変換酵素(Angiotensin-Converting Enzyme)阻害剤及びアンジオテンシンII受容体拮抗薬(特許文献5)があり、また天然物由来のものとして、米抽出物(特許文献6)や蒲公英(ホコウエイ)抽出物(特許文献7)がある。
これまでに知られているWnt5a産生促進剤としては、例えばリナロールオキシド、フェニルエチルアルコール、アンスラニル酸メチルを有効成分とするもの(特許文献8)がある。
これらの中でも、フランス海岸松(学名:Pinus maritima)の樹皮が好ましく、フランス海岸松は南仏の大西洋沿岸などに生育している海洋性松をいう。
1−1.被験物質
松樹皮抽出物(商品名:フラバンジェノール、株式会社東洋新薬製)、カフェインを用いた。
東洋紡株式会社より入手したCELL APPLICATION社製ヒト毛乳頭細胞(HFDPC,カタログNo.602−05a,ロットNo.1710,白人40歳女性由来)を使用した。
(i)毛乳頭細胞増殖培地(以下、PCGMと略す)(東洋紡社製)
(ii)リン酸緩衝生理食塩水(以下、PBSと略す)(Sigma社製)
(iii)トリプシンEDTA(Sigma社製)
(iv)コラーゲンコート溶液(東洋紡社製)
(v)RNeasy Mini Kit(Qiagen社製)
(vi)37℃CO2インキュベーター(ESPEC社製)
(vii)プレートリーダー(VARIOSKAN,Thermo electron社製)
(viii)75cm2培養フラスコ(以下、T75フラスコと称す)(IWAKI社製)
(ix)6ウェル培養プレート(IWAKI社製)
(x)96ウェル培養プレート(IWAKI社製)
(xi)顕微鏡(OLYMPUS社製,IX−70)
PCGMに各被験物質を10mg/mLとなるように懸濁させ、その後、0.2μmフィルターで処理し、PCGMで段階希釈して試験に供した。
1−5−1.細胞の準備
(i)T75フラスコ、6ウェル培養プレート、96ウェル培養プレートにコラーゲンコート溶液をそれぞれ1ml、0.5ml、50μl入れ、2時間静置させた。
(ii)コラーゲンコート溶液を除去し、PBSで2回洗浄し、上記フラスコ及びプレートを密封した後、使用するまで冷蔵庫で保管した。
(iii)コラーゲンコートしたT75フラスコに、HFDPC(P5)を播種し、これを37℃の5%CO2インキュベーター内で4日間培養した。
(iv)上記T75フラスコをPBSで洗浄した後、HFDPCをトリプシン処理により浮遊させ、1.2×105cells/mLの細胞懸濁液を作製し、次いで、コラーゲンコートした6ウェル培養プレート、96ウェル培養プレートに、該細胞懸濁液をそれぞれ1ml、0.1ml入れ、37℃の5%CO2インキュベーター内で一晩培養した。
(i)上記「1−5−1.細胞の準備」に従い、96ウェル培養プレートで培養されたHFDPCの培地を除去し、その後、PBSで2回洗浄した。
(ii)上記「1−4.サンプル調製」に従い調製された松樹皮抽出物の濃度が1.9、5.6、16.7、50、150μg/mlであるサンプルを96ウェル培養プレート中のHFDPCに添加した。同様に、カフェインの濃度が0.1、0.4、1.1、3.3、10μg/mlであるサンプルを96ウェル培養プレート中のHFDPCに添加した。
(iii)24時間の培養後、96ウェル培養プレートをPBSで2回洗浄した。
(iv)無血清ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)(シグマアルドリッチ社製)で30倍の体積に希釈したCell Counting Kit−8溶液(同仁化学研究所社製)を96ウェル培養プレートに100μl/ウェル添加した。
(v)37℃の5%CO2インキュベーター内に静置させ、適度に発色させた後、450nmにおける吸光度を測定した。
(vi)得られたデータを基に、下記式に従い、コントロールに対する割合(%コントロール)を算出した。
%コントロール=[(データサンプル−データブランク)/(データコントロール−データブランク)]×100
1−5−3.細胞賦活作用
後述するマイクロアレイ解析を行う際の松樹皮抽出物およびカフェインの濃度を決定するため、様々な濃度の松樹皮抽出物およびカフェインによる毛乳頭細胞の賦活活性を調べた。各濃度の松樹皮抽出物およびカフェインを含むサンプルを添加した際の毛乳頭細胞の賦活活性を図1および表1に示す。なお、図1は表1に示される%コントロールの結果をグラフ化したものである。
(i)上記「1−5−1.細胞の準備」に従い、6ウェル培養プレートで培養された毛乳頭細胞をPBSで2回洗浄し、上記「1−4.サンプル調製」に従い調製された松樹皮抽出物の濃度が5.6μg/mlであるサンプル、カフェインの濃度が3.3μg/mlであるサンプルを6ウェル培養プレートに添加し、24時間培養した。
(ii)培養後、6ウェル培養プレートを氷冷したPBSで2回洗浄し、その後、RNeasy Mini Kitに付属の細胞溶解バッファーを加えた。次いで、RNeasy Mini Kitの説明書に従い、RNAの抽出を行った。
(iii)抽出後、速やかに液体窒素に浸けて凍結させ、ディープフリーザーにて保管した。
ミルテニーバイオテク社でマイクロアレイ解析を行った。
マイクロアレイ解析の結果から、毛乳頭細胞で発現している遺伝子を抽出し、その遺伝子の発現量の変化を検討した。
2−1.マイクロアレイ解析
マイクロアレイの結果より、松樹皮抽出物およびカフェインにより処理された毛乳頭細胞内における遺伝子の発現量の変化を解析した。
まず、以下のように処理前後のサンプルのデータ値の比を求める。
比=(処理後のサンプルのデータ値)/(処理前のサンプルのデータ値)
次に、比>1の場合はこのまま倍率変化の値とする。一方、比<1の場合は、倍率変化の値=処理前のサンプルのデータ値/処理後のデータ値×(−1)とする。
Claims (4)
- 松樹皮抽出物を有効成分とする2型5−αリダクターゼ産生阻害剤。
- 松樹皮抽出物を有効成分とするHGF産生促進剤。
- カフェインを有効成分とする2型5−αリダクターゼ産生阻害剤。
- カフェインを有効成分とするWnt5a産生促進剤。
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