KR20120080676A

KR20120080676A - 백혈병 치료용 조성물 및 몰약 추출물의 제조방법

Info

Publication number: KR20120080676A
Application number: KR1020110002022A
Authority: KR
Inventors: 황성연; 정경채
Original assignee: 주식회사한국전통의학연구소; 정경채; 황성연
Priority date: 2011-01-08
Filing date: 2011-01-08
Publication date: 2012-07-18
Also published as: WO2012093919A2; KR101782962B1; WO2012093919A3

Abstract

본 발명은 건조된 몰약(沒藥, myrrh) 분쇄물로부터 지방족 극성 용매를 이용하여 추출되고 유효성분인 몰약 추출물 및 약리학적으로 허용 가능한 담체들을 포함하는 백혈병 치료용 조성물을 제공한다. 상기 몰약 추출물은 미량만으로도 백혈병 세포의 사멸 및 증식 억제를 유도할 수 있어 다양한 약학적 제형에 폭 넓게 적용될 수 있다.

Description

백혈병 치료용 조성물 및 몰약 추출물의 제조방법{COMPOSITION FOR TREATMENT OF LEUKEMIA AND METHOD OF MANUFACTURING EXTRACT FROM MYRRH}

본 기술은 백혈병 치료제에 관한 기술로서, 미량의 천연 추출물로서 우수한 사멸 효과를 발휘할 수 있는 약리 조성물에 관한 기술이다. 보다 상세하게는, 백혈병 세포 성장 억제제, 백혈병 분화치료제 또는 백혈병의 아폽토시스(apoptosis) 유도제로서 사용하기 위한 조성물에 관한 기술이다. 아울러 본 기술은 백혈병 인자에 대한 현저한 사멸 효과를 발휘할 수 있는 천연 추출물의 추출방법에 관한 기술이다.

몰약(沒藥, myrrh)은 쓴맛이 나며 향기가 좋고 노란색을 띤 적갈색의 함유수지(含油樹脂) 고무이다. 콤미포라속(Commiphora 屬)의 작고 가시가 있는 꽃피는 교목 또는 콤미포라 미르라(Commiphora myrrha)나 콤미포라 아비시니카(Commiphora abyssinica) 같은 감람과(橄欖科, Burseraceae) 식물에서 얻어지며, 언급한 식물(Commiphora myrrha)과는 구별한다.

몰약은 주로 분향료(焚香料), 향수, 향고(香膏) 등의 화장품, 향유의 부향료(賦香料), 약제 등 다양하게 이용되어, 고대 근동(近東) 지방이나 중동 지역 및 중세 유럽에서는 매우 귀하게 여겼다. 일반인들에게는 기독교 경전에서 동방박사들이 아기 예수에게 황금, 유향, 그리고 몰약을 선물한 것으로 유명하다.

약제로의 이용으로서는 주로 구강의 감염과 염증 치료에 사용되어 왔는데, 몰약을 포함하고 있는 구강세척제나 치약은 치은염 치료에 효과적인 것으로 알려져 있다. 더불어 입과 치아, 눈의 감염을 방지, 국소도포제 등으로 사용되었다고 한다. 이집트에서는 미라를 만드는 데 방부제로서 사용된 필수적인 향약이었다. 기원전(BC) 1세기 이전에 몰약은 와인이 발효돼 식초가 되는 것을 막는 데 사용됐으며, 그리스와 로마에서는 뱀에 물렸을 때 효과적인 치료약으로 처방됐다는 기록이 있다. 인디언들은 순환장애, 신경장애, 관절염 등의 치료를 위해 몰약을 쓰는 등 서방에서는 몰약이 강력한 방부효과를 내면서 신체의 고통을 덜어주고 치료과정을 가속화시키는 물질로 인정받아 왔다.

그러나 과학의 발전과 함께 현대로 오면서 몰약의 중요성이 점차 감소하였다. 현재는 주로 치약, 방향제와 자극성 강장제(强壯劑)의 성분 및 제약 산업에서 보호제로 사용된다. 몰약은 약간의 방부효과, 수렴(收斂)효과가 있으며, 의약품으로서는 위 내 가스 제거제로 쓰이고, 몰약 팅크 제제는 잇몸 및 구강 질환의 통증을 완화하는 데 사용된다. 몰약에서 증류시킨 정유(精油)는 몇몇 강한 향수의 구성성분이 되고 있다. 몰약은 나무껍질이 자연히 쪼개지거나 칼자국을 낼 때에 나무껍질 속에 있는 수지관(樹脂管)에서 흘러나온다. 공기에 노출되면 이 유체(流體)는 점점 딱딱해지면서 방울들과 불규칙한 덩어리들을 만드는데 이것을 '눈물'이라 부른다.

한편, 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia; "AML")은 효과적인 치료가 없다면 단 수달 내에 사람을 죽음으로 이르게 하는 병이다. AML의 진단은 골수에서 증가되는 미성숙 백혈병 아세포수의 형태학적 인식을 기본으로 한다. 또한, AML의 아세포는 성숙한 단구/대식세포와 유사한 형태학적 특징으로 포함하여 다양한 형태학적 신호의 분화를 나타낼 수 있다.

종래의 AML 백혈병 치료로는 악성종양에 대해 독성을 갖는 화학물질을 이용한 화학요법이 사용되었지만, 이러한 화학물질은 일반세포도 파괴하는 부작용을 갖고 있다. 이에 더하여 일부의 백혈병 세포들은 화학요법에 저항성을 갖고 있어서, 백혈병 세포들을 모두 제거하기 어렵다.

이러한 문제점을 해결하기 위하여, 최근에는 부작용이 적은 백혈병 분화치료를 이용하고자 하는 연구가 진행되고 있다. 즉, 백혈병은 조혈구(hematopoietic stem cell)가 면역세포 또는 혈구로 분화하는 중간 과정에서 문제가 생김으로써, 과립세포, 단구세포, 백혈구, 호중구 등으로 완전히 분화되지 못하고, 분화되지 않는 세포들인 백혈구 및 그 아구들이 골수에서 비정상적으로 증식하기 때문에 발병한다. 따라서 세포분화 치료제에 의해 완전히 분화된 세포들은 자기증식을 할 수 있는 능력이 없고, 체내에서 세포 수명이 다하면 사멸하게 되므로, 매우 유용하다. 또한, 백혈병 분화치료제는 백혈병 세포의 분화를 유도함으로써, 전구세포들의 증식을 억제할 수 있다. 또한, 분화치료제는 분화가 진행되지 않는 세포에 특이적으로 작용하기 때문에 분화가 완전히 진행된 일반 세포에는 거의 영향을 미치지 않는다.

이러한 분화 치료제로서 레티노인산, 디메틸 설폭사이드, 포르볼 에스테르(phorbol ester) 및 1,25-디하이드록시 비타민 D3 등의 화합물이 공지되어 있다. 이 중에서 레티노인산은 AML 세포들을 과립세포(granulocyte)로 분화시킬 수 있는 반면, 1,25-디하이드록시 비타민 D3는 AML 세포들을 단구세포(monocyte)로 분화할 수 있다.

그러나 이러한 공지의 분화제들도 일종의 화학요법으로, 백혈병 세포들은 분화제에 대한 저항성을 갖는 등의 부작용을 유발하기 때문에 새로운 치료제의 개발이 요구되었다.

본 발명은 천연 추출물에 의한 백혈병 세포의 효과적인 사멸을 유도할 수 있고 상기 백혈병 세포의 성장을 현저하게 억제할 수 있는 신규의 치료제 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 천연 추출물의 추출 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 백혈병 치료용 조성물은 건조된 몰약(沒藥, myrrh) 분쇄물을 지방족 극성 용매에 침잠시켜 추출된 유효성분을 포함하는 몰약 추출물, 및 약리학적으로 허용 가능한 담체들을 포함한다.

상기 몰약 추출물 용액 100μg/ml을 5.0×10⁴개의 HL-60 세포에 48시간 처리한 후, 알라머 블루(Alamar Blue) 분석법에 의하여 분석할 경우 HL-60 세포의 생존률은 6% 이하로 감소할 수 있다. 또한, 상기 몰약 추출물의 EC50 값은 32μg/ml 내지 36μg/ml일 수 있다.

상기 몰약의 건조는 음지에서 이루어질 수 있다. 한편, 상기 지방족 극성 용매는 탄소수 1 내지 4인 알코올일 수 있고 예를 들면, 에탄올 등을 들 수 있다. 추출 과정은 60℃ 미만의 온도 하에서 이루어 질 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 치료용 조성물은 백혈병 치료제로 사용될 수 있고, 상기 백혈병은 급성 전골수성 백혈병을 포함한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 몰약 추출물의 제조 방법은 음지에서 1차 건조된 몰약을 분쇄하여 몰약 분쇄물을 준비하는 단계, 상기 몰약 분쇄물을 탄소수 1 내지 4인 알코올 용매에 60℃ 미만의 온도 하에서 침잠시켜 유효성분을 추출하는 단계, 상기 유효성분을 포함하는 알코올 용매를 2차 건조하여 상기 유효성분의 고형분을 수득하는 단계, 및 상기 유효성분의 고형분을 냉동 보관하는 단계를 포함한다. 상기 2차 건조는 60℃ 미만의 감압 상태에서 이루어질 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 백혈병 치료용 조성물은 백혈병 세포에 대한 사멸 및 성장 억제 효과가 우수하고, 몰약 추출물은 천연물로서 부작용이 거의 없어서 치료용 조성물 외의 식품 분야 등 다양한 이종의 분야에도 널리 활용될 수 있다. 또한, 상기 몰약 추출물은 백혈병 세포 성장 억제제, 백혈병 분화치료제 또는 백혈병의 아폽토시스(apoptosis) 유도제로서 활용 가능할 수 있다.

나아가, 미량으로도 백혈병 세포에 대한 사멸 효과가 우수하여 다양한 제형에도 본 발명에 따른 몰약 추출물이 유연한 함량으로 응용될 수 있을 것으로 판단된다.

도 1은 실시예 2에서 수행된 실험에 대응한 HL-60 세포의 생존율을 도시한 그래프이다. 도면의 가로축은 추출물의 농도를, 세로축은 백혈병 세포의 생존율을 나타낸다.

이하에서는 본 발명에 따른 백혈병 치료용 조성물에 대하여 상세하게 설명하도록 한다.

상기 백혈병 치료용 조성물은 몰약 추출물 및 약리학적으로 허용 가능한 담체들을 포함한다. 몰약 추출물을 제조하기 위해서는 우선 몰약을 건조하는 단계가 필요하다. 몰약의 건조 방법은 특별히 국한되지 않으나, 상기 건조는 외부의 강한 광원에 의하여 몰약에 함유된 고유 화합물들이 변성되지 않도록 음지에서 이루어질 수 있다. 건조된 몰약은 추출 효율의 극대화를 위하여 적당한 형태로 분쇄되어 사용되고, 분쇄 정도 즉, 몰약 분쇄물의 사이즈는 추출물의 화학적 성질 변화와 무관하므로, 물리적인 측면에서 결정되면 충분하다. 또한, 상기 건조는 상온에서 이루어질 수 있고, 건조 기간은 특별히 한정되지는 않으나 대략 수일(數日) 정도 이루지는 것이 바람직하다.

상기 지방족 극성용매로서는 80℃ 미만, 나아가 60℃ 미만의 온도 하에서도 몰약의 추출 효율이 우수한 용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 탄소수 1 내지 4인 지방족 알코올을 사용한다. 추출 용매로서는 예를 들면, 에탄올을 들 수 있다. 열수추출 등의 고온 추출 방식은 몰약 내 함유된 백혈병 사멸 인자인 화합물의 변성이나 파괴를 유발할 수 있어 본 발명의 일 실시예에 따른 백혈병 치료용 조성물에 포함되는 몰약 추출물의 추출방법은 저온 추출 방식이 바람직하다.

상기 몰약 추출물은 백혈병 세포 성장 억제제, 백혈병 분화치료제 또는 백혈병의 아폽토시스(apoptosis) 유도제의 기능을 함유하며, 특히 백혈병으로서 전골수성 급성 백혈병에 유효할 수 있다.

상기 분쇄된 몰약은 전술한 바와 같이 에탄올 등의 유기 용매에 추가적인 조치 없이 침잠됨으로써 추출물이 발생될 수 있다. 발생된 추출물은 60℃ 미만의 온도 하에서 건조될 수 있으며, 건조 효율을 개선을 위하여 감압 하에서 이루어질 수 있다. 건조가 완료되면, 고형인 몰약 추출물이 수득될 수 있다. 수득된 고형의 몰약 추출물은 수분 등 외부 조건에 의한 유효 성분의 변성을 방지하고 추출물 내 유효 화합물의 안정성을 확보하기 위하여 극저온 상태(-15℃ 이하)에서 보관되는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 실시예에 따른 백혈병 치료용 조성물은 상기 몰약 추출물을 단독으로 포함할 수 있으며, 기타 약리학적으로 허용 가능한 담체들을 포함할 수 있다. 상기 약리학적으로 허용 가능한 담체의 예로서는 물, 글리세린, 유단, 전분, 식염수 등을 들 수 있다.

또한, 상기 몰약 추출물은 백혈병 예방 및 치료용 조성물, 약제, 식품 또는 식품 첨가제로 사용할 수 있으며, 약제로 사용하는 경우 경구 또는 비경구로 사용될 수 있다. 상기 조성물의 제형은 사용방법이나 유효성을 고려하여 다양하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물의 제형으로서 경고제, 과립제, 로션제, 산제, 시럽제, 액제, 주사제, 캅셀제, 환원제 등의 예를 들 수 있다.

일반적으로 세포 실험에서 사용한 농도의 약 100배 내지 200배를 동물실험에서 사용하므로, 본 발명의 일 실시예에 따른 백혈병 치료용 조성물의 투여량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도 및 병용되는 약물을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.

이하에서는 구체적인 실시예들을 들어 본 발명의 일 실시예에 따른 몰약 추출물에 대하여 설명하도록 한다. 그러나 이하의 실시예들에 의하여 본 발명의 기술사상이 제한되는 것은 아니다.

[실시예]

[실시예 1]: 몰약 추출물의 제조

입수된 몰약(중국산)을 실온에서 음지인 장소에 보관하며 5일간 건조하였다. 건조된 몰약은 소정의 크기로 분쇄되었다. 분쇄된 몰약은 95% 에탄올 용액에 침잠되어 50℃의 온도 하에서 24시간 동안 추출 과정을 거쳤다. 몰약 추출물 및 에탄올 용액의 혼합물은 45℃의 온도 하에서 감압 건조되었다. 건조된 후 고형분의 몰약 추출물이 수득되었다. 수득된 고형분의 몰약 추출물을 -20℃의 저온 하에서 보관하였다.

[실시예 2]: 몰약 추출물이 백혈병 세포의 성장에 미치는 영향

실시예 1에서 수득된 고형분의 몰약 추출물이 백혈병 세포의 성장에 미치는 영향을 알아보기 위하여 사람 백혈병 세포인 HL-60에 대하여 알라마 블루(Alamar Blue) 분석을 시행하였다. 알라마 분석은 MTT 분석의 변형된 형태인데, 특정 효소에 의해서 분해되는 화합물을 살아있는 세포에 처리한 후 화합물이 분해되면서 나오는 생성물의 형광 세기를 측정함으로써 약물을 처리한 후 살아있는 세포의 상대적인 숫자를 알아내는 실험방법이다.

본 실시예에서 사용된 백혈병 세포인 HL-60 세포는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB)으로부터 분양받아 실험에 이용하였고, 백혈병 세포인 HL-60에 대하여 세포 성장 억제효과를 확인 하였다. HL-60 백혈병 세포를 20% FBS와 25 mM HEPES를 포함하는 RPMI1640 배지에서 배양한 후 96 웰 플레이트에 각 웰 당 5.0×10⁴ 개의 세포를 주입하고 DMSO에 녹인 실시예 1의 몰약 추출물을 0 내지 100 μg/ml 농도로 48 시간 동안 처리하였을 때, 세포 성장을 저해하는 정도를 확인하였다. 각 농도의 추출물을 처리한 후, 96-웰 플레이트에서 각 웰에 채워진 0.2 ml의 세포 배양액에 20 μl의 알라마 블루 시약을 첨가한 후 플레이트를 인큐베이터에서 2시간 동안 배양하였다. 각 웰의 세포를 고르게 반응시키기 위하여 플레이트를 천천히 흔들고, 544 nm의 파장에서 조사광을 조사하면서 590 nm에서 형광의 세기를 형광광도계(Fluorescence Microplate Reader; Molecular Devices Corp.)로 흡광도를 측정하였다. 도 1은 본 실시예에서 수행된 실험에 대응한 HL-60 세포의 생존율을 도시한 그래프이다. 아래 표 1은 본 실시예의 실험결과를 기재한 표이다. 각각의 농도 실험은 5회 반복한 결과이고, 그 평균값의 변화를 도 1에 도시하였다.

	0 μg/ml	3.125 μg/ml	6.25 μg/ml	12.5 μg/ml	25 μg/ml	50 μg/ml	100 μg/ml
평균	1.000	1.048	1.066	0.971	0.684	0.287	0.055
표준편차	0.000	0.025	0.041	0.030	0.013	0.014	0.005

상기 표 1 및 도 1에서 나타난 바와 같이 몰약 추출물의 처리 농도가 높을수록 백혈병 세포의 성장이 감소하였으며, 이로부터 몰약 추출물이 백혈병 치료효과를 가짐을 확인할 수 있었다.

[실시예 3] EC50 값 측정

EC50라 함은 본 발명에 따른 몰약 추출물이 나타낼 수 있는 최대 효과를 100%라 했을 때, 50%의 효과를 나타내는 농도를 의미하여, 50% 유효농도 또는 50% 효능 농도라고 한다. EC50 산출결과 34.0 μg/ml의 값이 구하여 졌다.

[실시예 4] 안정성 평가

본 발명에 따른 몰약은 한약제로 구분되어 있어 안정성에 문제가 없을 것으로 판단하였으나, 경구 투여시 및 복강내 투여시의 독성 실험을 수행하여 이를 확인하고자 하였다.

6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2 마리씩의 동물에 본 발명의 실시예 1의 관동화 추출물을 각각 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 5 g/㎏의 용량으로 단회 경구 투여하였다. 시험물질 투여후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.

시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 관동화 추출물은 모두 랫트에서 5 g/㎏까지 독성변화를 나타내지 않으며 경구 투여 최소치사량 (LD₅₀)은 5 g/㎏이상인 안전한 물질로 판단되었다.

Claims

건조된 몰약(沒藥, myrrh) 분쇄물을 지방족 극성 용매에 침잠시켜 추출된 유효성분을 포함하는 백혈병 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 몰약 추출물 용액은 50℃에서 24시간 추출되는 것을 특징으로 하는 백혈병 예방 또는 치료용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 몰약 추출물은 이를 HL-60 세포에 48시간 처리한 후 알라머블루(Alamar Blue) 분석법에 의해 정해진 EC50 값이 61μg/ml 내지 65μg/ml인 것을 특징으로 하는 백혈병 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 지방족 극성 용매는 탄소수 1 내지 4인 알코올인 것을 특징으로 하는 백혈병 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 추출물은 60℃ 이하의 온도 하에서 추출된 것임을 특징으로 하는 백혈병 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 백혈병은 전골수성 급성 백혈병인 것을 특징으로 하는 백혈병 예방 또는 치료용 조성물.
음지에서 1차 건조된 몰약을 분쇄하여 몰약 분쇄물을 준비하는 단계;
상기 몰약 분쇄물을 탄소수 1 내지 4인 알코올 용매에 60℃의 온도 하에서 침잠시켜 유효성분을 추출하는 단계;
상기 유효성분을 포함하는 알코올 용매를 2차 건조하여 상기 유효성분의 고형분을 수득하는 단계; 및
상기 유효성분의 고형분을 냉동 보관하는 단계를 포함하는 몰약 추출물의 제조 방법.
제7항에 있어서,
상기 2차 건조는 60℃ 미만의 감압 상태에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 몰약 추출물의 제조 방법.