CN115927195A

CN115927195A - 一种牦牛输卵管上皮细胞永生化细胞系及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN115927195A
Application number: CN202211109601.7A
Authority: CN
Inventors: 余四九; 叶小琳; 潘阳阳; 王立斌; 王萌; 王靖雷; 张瑞; 赵天; 王亚营; 丁天翊
Original assignee: Gansu Agricultural University
Current assignee: Gansu Agricultural University
Priority date: 2022-09-13
Filing date: 2022-09-13
Publication date: 2023-04-07

Abstract

本发明公开了一种牦牛输卵管上皮细胞永生化细胞系及其构建方法和应用，涉及细胞工程技术领域。该构建方法包括以下步骤：(1)采集牦牛输卵管的上皮细胞，培养后，消化分离，纯化，得到原代牦牛输卵管上皮细胞；(2)所述原代牦牛输卵管上皮细胞传代培养后，用含有SV40基因的表达载体元件进行转染，再经筛选，鉴定，得到所述牦牛输卵管上皮细胞永生化细胞系。本发明的构建方法可以快速、高效地构建得到牦牛输卵管上皮细胞永生化细胞系，该牦牛输卵管上皮细胞永生化细胞系可以保持牦牛输卵管上皮细胞的特性，能特征性的表达牦牛输卵管上皮细胞特异性蛋白。

Description

一种牦牛输卵管上皮细胞永生化细胞系及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及细胞工程技术领域，特别是涉及一种牦牛输卵管上皮细胞永生化细胞系及其构建方法和应用。

背景技术

输卵管上皮细胞(oviduct epithelial cell，OEC)包括有纤毛细胞、分泌细胞。纤毛细胞的主要作用是运输卵母细胞和胚胎以及精子的储存和运行。分泌细胞则产生并释放一些特殊分泌物，维持输卵管微环境促进受精和胚胎发育。目前二维培养状态下输卵管上皮细胞形态呈分泌型，较适合研究细胞的分泌功能。

为进一步提高体内和体外胚胎发育质量，需要进一步的研究牦牛OEC的调控机制。然而，分离的原代输卵管上皮细胞在培养几代后迅速脱分化并失去类固醇激素反应，实验细胞样本的准备费时费力。由于缺乏合适的体外细胞模型系统，外源物质在输卵管细胞中的功能作用及其对生育的潜在影响在很大程度上是未知的。永生细胞系操作更方便、生长速度更快、性质更较稳定的实验样本，则可以解决原代细胞的时间成本问题。同时也为体内实验提供了良好的实验基础。所以有必要构建一种可以表达类固醇激素受体和分泌型蛋白的牦牛输卵管上皮细胞永生化细胞系(YIOECL)，应用于牦牛输卵管上皮细胞分泌型蛋白调控机制的研究，为今后的牦牛输卵管上皮细胞以及体内外胚胎发育的机制研究提供物质基础和研究平台。

发明内容

本发明的目的是提供一种牦牛输卵管上皮细胞永生化细胞系及其构建方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明的构建方法可以快速、高效地构建得到牦牛输卵管上皮细胞永生化细胞系，该牦牛输卵管上皮细胞永生化细胞系可以保持牦牛输卵管上皮细胞的特性，能特征性的表达牦牛输卵管上皮细胞特异性蛋白。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种牦牛输卵管上皮细胞永生化细胞系的构建方法，包括以下步骤：

(1)采集牦牛输卵管的上皮细胞，培养后，消化分离，纯化，得到原代牦牛输卵管上皮细胞；

(2)所述原代牦牛输卵管上皮细胞传代培养后，用含有SV40基因的表达载体元件进行转染，再经筛选，鉴定，得到所述牦牛输卵管上皮细胞永生化细胞系。

进一步地，在步骤(2)中，所述传代培养为传代培养4-5代。

进一步地，在步骤(2)中，所述含有SV40基因的表达载体元件为EF1α-SV40-IRES-puromycin。

进一步地，在步骤(2)中，转染后，细胞扩增3-4代后再进行筛选。

进一步地，在步骤(2)中，所述筛选的药剂为嘌呤霉素。

进一步地，所述嘌呤霉素的使用浓度为1μg/mL。

进一步地，利用所述嘌呤霉素筛选的时间为3d。

进一步地，在步骤(2)中，筛选结束后还包括对筛选后得到的细胞进行扩增的步骤，所述扩增的前3代采用的培养基包括角质细胞无血清培养基+10％胎牛血清+1％青链霉素。

本发明还提供根据上述的构建方法构建得到的牦牛输卵管上皮细胞永生化细胞系。

本发明还提供上述的牦牛输卵管上皮细胞永生化细胞系在牦牛输卵管上皮细胞以及体内外胚胎发育的机制研究中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

1、本发明的牦牛输卵管上皮细胞永生化细胞系的构建方法，实验周期短，实验成功率高，缩减了构建牦牛输卵管上皮细胞永生化细胞系的时间成本与经济成本。

2、本发明的牦牛输卵管上皮细胞永生化细胞系，其细胞形态与原代细胞较为相似且均一，培养至30代仍然保持较为稳定的状态，解决了牦牛输卵管上皮细胞采样难成本高和体外培养困难的问题。

3、本发明的牦牛输卵管上皮细胞永生化细胞系，仍然保持了输卵管上皮细胞的特性，能特征性的表达牦牛输卵管上皮细胞特异性蛋白，能够用于输卵管分泌蛋白功能等方面的研究。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为载体元件EF1α-SV40-IRES-puromycin的图谱；

图2为载体元件psPAX2-pCl-neo-hTERT的图谱；

图3为YOEC和YIOECL形态比对；其中，A：培养第2代牦牛输卵管上皮细胞；B：培养第30代牦牛输卵管上皮永生细胞系；

图4为YOEC和YIOECL鉴定；

图5为YOEC和YIOECL生长曲线；

图6为qRT-PCR检测YOEC与YIOECL基因表达的结果，其中，A为ERα，B为OVGP1，C为GRP 78；

图7为WB检测YOEC与YIOECL蛋白表达的结果；

图8为实施例1制备的SV40转染的YOECL第30代核型分析检测结果；

图9为Caco-2(a)、YIOECL(b)和YOEC(c)在软琼脂内培养14天(100x)的结果；

图10为对比例2制备的hTERT转染的YOECL第30代核型分析检测结果；

图11为不同细胞药筛后的形态；其中，a：第三代YOEC，b：药筛后K-SFM+10％FBS+1％SP培养的YIOECL；c：药筛后DMEMF/12+10％FBS+1％SP培养的YIOECL。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明中的英文缩写解释如下：

YOEC：牦牛输卵管上皮细胞；YIOECL：牦牛输卵管上皮细胞永生化细胞系；K-SFM：角质细胞无血清培养基；FBS：胎牛血清；SP：青链霉素；DMEMF/12：营养混合液F-12培养基；OVGP1：输卵管特异性糖蛋白；ERα：雌激素受体α；GRP 78：葡萄糖调节蛋白78。

实施例1

(1)用0.25％胰酶消化牦牛输卵管，提取并培养牦牛输卵管上皮细胞。

采用恒温培养箱(37℃，5％CO₂)，将采集自未妊娠牦牛输卵管的上皮细胞，培养至第7天，利用0.25％胰酶(SIGMA)分离、纯化细胞见图3，通过角蛋白，波形蛋白鉴定(图4)，获得纯度达到95％以上的YOEC。

(2)将载体元件EF1α-SV40-IRES-puromycin(购自Alpha Lifetech)转染到YOEC。其中，载体元件EF1α-SV40-IRES-puromycin的图谱见图1，图1中黄色区域为目的序列区，目的序列如SEQ ID NO.1所示。

将步骤(1)纯化好的YOEC传代至4代(4-5代可达相同效果)，之后接种6孔板，每孔细胞数约为1×10⁵个，第二天，待细胞贴壁后，换液，加入1mL含有10％FBS的DMEM/F12，再加20μL EF1α-SV40-IRES-puromycin，混匀后继续培养，12h后观察细胞状态，并更换为新鲜培养基(即1mL含有10％FBS的DMEM/F12)，当细胞长满板底后，传代至T25培养瓶中。转染后，细胞扩增3代(3-4代可达相同效果)后进行筛选。

(3)嘌呤霉素最佳浓度的筛选。

将步骤(1)纯化后YOEC传代3代，将第3代的YOEC按5×10⁵/个每孔铺到24孔培养板，将含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基加入每孔，每天观察细胞的存活比例，最小的嘌呤霉素使用浓度就是从嘌呤霉素筛选开始3d内杀死所有细胞的最低筛选浓度，最终确定为1μg/mL。

(4)筛选阳性克隆细胞，筛选后对YOEC状态进行调整。

将步骤(1)纯化好的YOEC传代至4代，按1×10⁵个/孔铺入24孔板进行转染，第二天，加入含嘌呤霉素(1μg/mL)的筛选培养基(DMEMF/12+10％FBS+1％SP+1μg/mL)孵育，每2天更换新鲜的筛选培养基，每天观察细胞的存活比例。3d后存活的细胞，即为转染成功的牦牛输卵管上皮细胞，对筛选后的细胞进行扩增，最终获得牦牛输卵管上皮细胞永生化细胞系。扩增选用K-SFM+10％FBS+1％SP培养液代替DMEMF/12+10％FBS+1％SP配方培养细胞。细胞传3代后使用K-SFM+10％FBS+1％SP，DMEMF/12+10％FBS+1％SP两种培养液皆可培养细胞。

实施例2

一、试验材料

第3代YOEC，第30代实施例1构建得到的YIOECL，胰酶，DMEM/F12，胎牛血清，RNA提取试剂盒，反转录试剂盒，荧光定量PCR试剂盒，RIPA裂解液，CCK8试剂盒，秋水仙素，Giemsa染色液，OVGP1，ERα，GRP 78引物，角蛋白、波形蛋白、OVGP1抗体。

二、试验方法与结果

2.1生长曲线

取第3代YOEC和第30代YIOECL接种到96孔板，密度分别为5000个/孔、6000个/孔、7000个/孔、8000个/孔、9000个/孔和10000个/孔(六组)，每个密度4个重复，5h后加CCK-8，1.5h后用酶标仪测，将数据成标准曲线。将细胞接种到96孔板中做生长曲线。每孔密度为5000，每列5个重复，做7行。每24h加CCK-8，1.5h后用酶标仪测数据，并分析。

结果：试验证实，YIOECL生长曲线对比原代细胞生长速度更快，见图5。

2.2细胞鉴定免疫荧光检测

取第3代YOEC和第30代YIOECL，调到统一密度(1×10⁵个/mL)，滴加于赖氨酸包被无菌盖玻片上，培养48h；PBS清洗2遍，1min/遍；4％多聚甲醛固定1h，PBS洗3遍，5min/遍；0.5％TrsionX-100透化1h，PBS洗3遍，5min/遍；1％BSA封闭30min，PBS洗3遍，5min/遍；一抗4℃孵育过夜。PBS洗3遍，5min/遍；AlexaFluor555标记鼠抗兔IgG(1：250)二抗避光孵育30min，PBS洗3遍，10min/遍；1μg/mL4'，6-二脒基-2-苯基吲(4′-6-diamidino 2-phenylindole，DAPI)染色3min，PBS洗3遍，10min/遍；甘油封片，荧光显微镜拍照。

结果：YIOECL单克隆细胞株，细胞形态和原代细胞基本保持一致，见图3。免疫荧光检测角蛋白，波形蛋白，输卵管糖蛋白阳性和且表达位置一致，见图4。

2.3核型分析

将第30代实施例1构建得到的YIOECL和Caco-2分别进行以下操作：接种至6孔板，每孔加入0.1μg/mL的秋水仙素处理6h。之后将细胞收集到离心管，用预热过的0.075mol/L氯化钾吹打重悬，放入37℃静置30min。弃去氯化钾，加入400μL固定液(甲醇和乙酸体积比3:1)，1500r/min离心5min。弃上清液，保留1mL上清液轻轻吹打，缓慢加入固定液边加入边震荡，1500r/min离心5min。弃上清液，保留1mL上清液轻轻吹打，缓慢加入固定液边加入边震荡，静置15min，1500r/min离心5min，弃上清液。加固定液重悬细胞后，将玻片从冰水浴中拿出，吸取重悬液从50cm高处滴下一滴，立刻在酒精灯上过3个来回，风干30min。待玻片晾干后，使用10％的Giemsa染液染20min，然后用蒸馏水冲洗，封片后显微镜下观察。

结果：为了检验SV40的永生化是否会在建立的牦牛输卵管上皮细胞系中诱发染色体畸变，在30代对细胞系进行了核型分析。发现这细胞系在核型上没有变化都是30对，见图8。

2.4非停泊生长实验(软琼脂克隆形成实验)

下层琼脂胶的制备：将1mL 2×DMEMF/12培养液(含有20％的FBS)与1mL除菌的0.8％的低熔点琼脂混合，添加到6孔板待其凝固。上层琼脂胶的制备：将1mL 2×基础培养液(含有10％的FBS)与1mL除菌的0.8％的低熔点琼脂混合，将YIOECL与Caco-2细胞重悬，以1×10⁴个细胞的数量分别加入到刚配置好的上层胶混匀，加入到下层胶上面。待上层胶完全凝固放入培养箱培养2周，观察细胞克隆是否形成。

结果：转染后YIOECL和Caco-2在软琼脂内培养两周后，不能在形成细胞克隆，而Caco-2培养2周后可在上层软琼脂内形成细胞克隆，见图9。

2.5实时荧光定量PCR检测

根据TRIZOL试剂盒提取第3代YOEC和第30代实施例1构建得到的YIOECL的RNA后反转录为mRNA，根据NCBI数据库GenBank中公布的OVGP1、GRP 78、ERα的mRNA序列，利用PrimerPremier 6.0软件设计的引物，由上海生工基因基因科技有限公司合成。合成引物见表1，将第3代YOEC和第30代实施例1构建得到的YIOECL分为8个组，每一组按空白对照孔、待测孔、内参对照孔分为3个复孔，每个样品设置4个重复组，最终可以根据Cq值，通过公式经2^-ΔΔCt法计算OVGP1、GRP78、ERα在原代细胞和永生化上皮细胞基因水平的表达量。

结果：结果表明转染后YIOECL的OVGP1和ERαmRNA表达水平高于YOEC，GRP 78mRNA表达水平显著低于YOEC(图6)。

2.6WB检测

将在超低温冰箱保存备用的第3代YOEC和第30代实施例1构建得到的YIOECL根据试剂盒说明书提取，配置好分离胶用于SDS-PAGE凝胶电泳，然后在固定电压的情况下预电泳，然后加入样品电泳，转膜后用磷酸盐吐温缓冲液清洗3遍，配置5％脱脂奶粉，室温封闭2h，加入一抗(1∶1000)，4℃过夜孵育，用磷酸盐吐温缓冲液清洗3遍，每次5min，然后加入二抗(1∶1000)孵育2h，用磷酸盐吐温缓冲液清洗5遍，每次3min；在膜上加入ECL(增强型化学发光剂)，将条带曝光显影，利用Image J软件扫描得到图像。

结果：转染后的YIOECL和YOEC皆表达OVGP1蛋白，并且YIOECL的蛋白表达显著高于YOEC(图7)。

以上结果表明YOEC和YOECL的分泌型蛋白功能基本保持一致，可作为YOEC的试验模型细胞使用。

综上所述，本发明成功的将人端粒酶逆转录酶基因导入YOEC细胞中，激活了其端粒酶活性，延长了细胞在体外培养的寿命。牦牛输卵管上皮永生化细胞系YIOECL仍保持其原代细胞YOEC正常的生物学特性，且可以应用于机制的研究。

对比例1

同实施例1，区别在于，在步骤(2)中，转染后，细胞未经扩增3代，直接进行筛选。结果显示，未经扩增细胞状态较差，直接药筛成功率较小。

对比例2

同实施例1，区别在于，在步骤(2)中，将EF1α-SV40-IRES-puromycin替换为psPAX2-pCl-neo-hTERT(载体结构图见图2)。

在本对比例中，hTERT片段较大，在转染过程中对细胞状态要求较高，转染成功率低，且转染试剂的选择有限，经核型分析结果显示(图10)，此方法的细胞染色体输卵管和正常牦牛细胞染色体数量不同。

表1

实施例/对比例	转染成功率(％)
		实施例1	90
对比例2	40

对比例3

同实施例1，区别在于，在步骤(4)中，扩增仍旧选用DMEMF/12+10％FBS+1％SP配方培养细胞，药筛(嘌呤霉素)后的细胞折光性较差，细胞增殖率低，细胞形态不稳定，实施例1和本对比例的培养液培养的细胞见图11。

对比例4

同实施例1，区别在于，在步骤(3)和(4)中，用G418(遗传霉素)，替换嘌呤霉素，最低筛选浓度调整为200μg/mL，G418作为药筛耗时，且对YOEC损伤较大敏感，较难将所需细胞挑出。两种筛选药物见表2。

表2

药物名称	时间	YOEC损伤
			G418	10天	较大
嘌呤霉素	3天	正常

SEQ ID NO.1：

atggataaagttttaaacagagaggaatctttgcagctaatggaccttctaggtcttgaaaggagtgcctgggggaatattcctctgatgagaaaggcatatttaaaaaaatgcaaggagtttcatcctgataaaggaggagatgaagaaaaaatgaagaaaatgaatactctgtacaagaaaatggaagatggagtaaaatatgctcatcaacctgactttggaggcttctgggatgcaactgagattccaacctatggaactgatgaatgggagcagtggtggaatgcctttaatgaggaaaacctgttttgctcagaagaaatgccatctagtgatgatgaggctactgctgactctcaacattctactcctccaaaaaagaagagaaaggtagaagaccccaaggactttccttcagaattgctaagttttttgagtcatgctgtgtttagtaatagaactcttgcttgctttgctatttacaccacaaaggaaaaagctgcactgctatacaagaaaattatggaaaaatattctgtaacctttataagtaggcataacagttataatcataacatactgttttttcttactccacacaggcatagagtgtctgctattaataactatgctcaaaaattgtgtacctttagctttttaatttgtaaaggggttaataaggaatatttgatgtatagtgccttgactagagatccattttctgttattgaggaaagtttgccaggtgggttaaaggagcatgattttaatccagaagaagcagaggaaactaaacaagtgtcctggaagcttgtaacagagtatgcaatggaaacaaaatgtgatgatgtgttgttattgcttgggatgtacttggaatttcagtacagttttgaaatgtgtttaaaatgtattaaaaaagaacagcccagccactataagtaccatgaaaagcattatgcaaatgctgctatatttgctgacagcaaaaaccaaaaaaccatatgccaacaggctgttgatactgttttagctaaaaagcgggttgatagcctacaattaactagagaacaaatgttaacaaacagatttaatgatcttttggataggatggatataatgtttggttctacaggctctgctgacatagaagaatggatggctggagttgcttggctacactgtttgttgcccaaaatggattcagtggtgtatgactttttaaaatgcatggtgtacaacattcctaaaaaaagatactggctgtttaaaggaccaattgatagtggtaaaactacattagcagctgctttgcttgaattatgtggggggaaagctttaaatgttaatttgcccttggacaggctgaactttgagctaggagtagctattgaccagtttttagtagtttttgaggatgtaaagggcactggaggggagtccagagatttgccttcaggtcagggaattaataacctggacaatttaagggattatttggatggcagtgttaaggtaaacttagaaaagaaacacctaaataaaagaactcaaatatttccccctggaatagtcaccatgaatgagtacagtgtgcctaaaacactgcaggccagatttgtaaaacaaatagattttaggcccaaagattatttaaagcattgcctggaacgcagtgagtttttgttagaaaagagaataattcaaagtggcattgctttgcttcttatgttaatttggtacagacctgtggctgagtttgctcaaagtattcagagcagaattgtggagtggaaagagagattggacaaagagtttagtttgtcagtgtatcaaaaaatgaagtttaatgtggctatgggaattggagttttagattggctaagaaacagtgatgatgatgatgaagacagccaggaaaatgctgataaaaatgaagatggtggggagaagaacatggaagactcagggcatgaaacaggcattgattcacagtcccaaggctcatttcaggcccctcagtcctcacagtctgttcatgatcataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacagagcaaaagctcatttctgaagaggacttgtaa。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种牦牛输卵管上皮细胞永生化细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述传代培养为传代培养4-5代。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述含有SV40基因的表达载体元件为EF1α-SV40-IRES-puromycin。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在步骤(2)中，转染后，细胞扩增3-4代后再进行筛选。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述筛选的药剂为嘌呤霉素。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述嘌呤霉素的使用浓度为1μg/mL。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，利用所述嘌呤霉素筛选的时间为3d。

8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在步骤(2)中，筛选结束后还包括对筛选后得到的细胞进行扩增的步骤，所述扩增的前3代采用的培养基包括角质细胞无血清培养基+10％胎牛血清+1％青链霉素。

9.根据权利要求1-8任一项所述的构建方法构建得到的牦牛输卵管上皮细胞永生化细胞系。

10.如权利要求9所述的牦牛输卵管上皮细胞永生化细胞系在牦牛输卵管上皮细胞分泌型蛋白调控机制或牦牛输卵管上皮细胞以及体内外胚胎发育的机制研究中的应用。