CN108753702A

CN108753702A - 一种通过细胞表面标记特异性富集的人牙周膜干细胞亚群及其干性检测方法

Info

Publication number: CN108753702A
Application number: CN201810595335.0A
Authority: CN
Inventors: 徐随民
Original assignee: Nanjing Tai Sheng Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Nanjing Tai Sheng Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-06-11
Filing date: 2018-06-11
Publication date: 2018-11-06

Abstract

本发明提供了一种特异的人牙周膜干细胞亚群及其富集方法。本方法包含牙组织样品的采集运输，牙周膜干细胞的分离，及表达CD18干细胞的富集。本发明还提供了一种富集的牙周膜干细胞亚群生物学特性的检测方法。包括与干性相关的集落形成能力检测，增殖能力检测，体外成骨分化能力检测，体内成骨分化能力检测。

Description

一种通过细胞表面标记特异性富集的人牙周膜干细胞亚群及其干性检测方法

技术领域

本发明涉及一种通过细胞表面标记，优选CD18特异性富集的人牙周膜干细胞亚群及其干性检测方法。本发明也涉及将通过本发明富集的细胞用于再生医学的用途。

背景技术

牙周膜是一种特殊的结缔组织，连接牙骨质和牙槽骨，对牙组织起支持营养作用，并维护牙组织的稳态，修复受损牙组织。

牙周膜中包含异质性的细胞群，可以分化为成牙骨质细胞（Cementoblast），或成骨细胞（Osteoblasts）。

申请人在以前的研究中，通过酶消化法从牙周膜中分离获得具有克隆形成和高增殖能力的细胞。这些细胞在体外具有多向分化能力，包括成骨、成软骨、成脂等。当将这些细胞和羟基磷灰石/磷酸三钙（HA/TCP）颗粒混合，移植于裸鼠皮下时，可形成牙骨质/ 牙周膜样组织。

但这些细胞是高度异质性的，是否像骨髓干细胞一样存在严格的层级、谱系目前还不是很清楚。另外，因为缺乏特异的表面标记，不利于细胞的体外分离和鉴定，也影响对其临床功效的研究。

因此，通过特异的表面标记提取特定的细胞亚群，不仅对细化研究这些细胞的生物学特性、了解牙周膜干细胞的全貌至关重要，而且对不同细胞亚群是否有不同的临床效果的研究也是非常关键的，有巨大的基础研究和临床意义。

所述的细胞表面标记选自CD18，STRO-1，CD106/VCAM-1，CD146/MUC-18，HOP-26，CD49A/整合素β1，SB-10/CD166中的一个或多个。

CD18，也称整合素β2亚家族，是细胞粘附分子中的一员，介导细胞与细胞间、细胞与基质间的相互作用。由于CD18在白细胞上显著表达，过去的很多研究都集中于CD18在白细胞粘附、迁移和免疫反应中的作用。

但事实上，CD18也在骨髓基质干细胞上表达，且在骨发生过程中发挥关键作用。缺乏CD18的小鼠表现出骨质疏松症的某些特征，包括骨密度降低，小梁骨数目减少，小梁骨厚度减少，骨小梁空间增加等。而通过病毒转染，过表达CD18可促进骨的形成。

申请人最近的研究证实，牙周膜细胞也表达CD18，而且CD18可作为一个独特的细胞分选标记，用于富集一种人牙周膜干细胞亚群。

发明内容

如上文所述，骨髓基质干细胞也表达CD18。而最近的研究发现，牙周膜细胞和成骨细胞有很多相似的特性，包括在体外形成矿物结节的能力，表达骨相关表面标记物碱性磷酸酶和骨涎蛋白，以及能够响应骨诱导因子如甲状旁腺激素、胰岛素样生长因子1、骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1等。基于这些事实，我们创造性地发明了一种通过CD18特异性富集人牙周膜干细胞亚群的方法，大大提高了体外牙周膜干细胞分离和鉴定的效率。更为重要的是，通过该方法富集的牙周膜干细胞亚群有更强的克隆形成能力，更优的成骨分化能力，具有优越的科研和临床应用前景。

具体地说，本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明提供了一种特异的人牙周膜干细胞亚群的富集方法。本方法包含牙组织样品的采集运输，牙周膜干细胞的分离，及表达CD18细胞的富集。

本方法采用了含有多种抗生素组合的采集液收集牙组织样品，包括但不限于青霉素、链霉素、二性霉素B等。该采集液也可用于其它组织样品的采集，如脂肪、脐带、胎盘等，可大大降低样品污染的可能。

本方法中青霉素的使用浓度可以是50U/mL，100U/mL，150U/mL，200U/mL，250U/mL，300U/mL。链霉素的使用浓度可以是50μg/mL，100μg/mL，150μg/mL，200μg/mL，250μg/mL，300μg/mL。二性霉素B的使用浓度可以是1μg/mL，2μg/mL，2.5μg/mL 3μg/mL，4μg/mL，5μg/mL。

本方法中样品的保存运输温度可以是2℃，4℃，6℃，8℃，10℃，15℃，25℃。

本方法中样品从采集到开始提取的时间间隔可以是4小时，8小时，12小时，24小时，48小时，72小时，96小时。

本方法采用了含有多种消化酶的组合来分离组织样品，获得单个细胞悬液。包括但不限于胶原酶、分散酶、透明质酸酶、胰酶、EDTA等，这些消化酶组合可大大提高细胞的得率。

本方法中胶原酶的使用浓度可以是1 mg/ml，2 mg/ml，3 mg/ml，4 mg/ml，5 mg/ml，6 mg/ml，7 mg/ml，8 mg/ml，9 mg/ml，10 mg/ml。分散酶的使用浓度可以是1 mg/ml，2mg/ml，3 mg/ml，4 mg/ml，5 mg/ml，6 mg/ml，7 mg/ml，8 mg/ml，9 mg/ml，10 mg/ml。

尽管本方法是优选CD18来富集牙周膜干细胞亚群，但本发明不限于使用CD18，还可以使用以下一个或多个标记物的组合来富集牙周膜干细胞亚群，包括STRO-1，CD106/VCAM-1，CD146/MUC-18，HOP-26，CD49A/整合素β1，SB-10/CD166。

CD18可以使用荧光标记，或磁珠标记。相应的，精确的细胞分离技术包括流式细胞仪分选，或免疫磁珠分选。

本发明还提供了一种富集的牙周膜干细胞亚群生物学特性的检测方法。包括与干性相关的集落形成能力检测，增殖能力检测，体外成骨分化能力检测，体内成骨分化能力检测。在证实细胞干性和生物学效力方面，本套检测方法的组合是充分和适宜的。

本方法通过测定富集细胞中CFU-F（Colony Forming Unit-Fibroblast）数目，检测CD18阳性干细胞的克隆形成能力。

本方法通过BrdU掺入法检测CD18阳性干细胞的体外增殖能力。

本方法中CD18阳性干细胞的体外基础培养基可以是α-MEM，DMEM，D/F-12，RPMI-1640等。完全培养基是在基础培养基的基础上，添加胎牛血清、抗坏血酸2-磷酸酯、谷氨酰胺、青霉素、链霉素等。

完全培养基中胎牛血清的浓度可以是5%，10%，15%，20%。抗坏血酸2-磷酸酯的浓度可以是50μM，100μM，150μM，200μM。其它添加物浓度是按照本领域公认的优化方案添加。

本方案中成骨诱导培养基是在基础培养基的基础上，添加地塞米松，维生素 C 和β-甘油磷酸钠等。

成骨诱导培养基中地塞米松的使用浓度可以是5nM，10nM，15nM，20nM，25nM，30nM。维生素 C 的使用浓度可以是50μg/mL，100μg/mL，150μg/mL，200μg/mL，250μg/mL，300μg/mL。β-甘油磷酸钠的使用浓度可以是 1 mM，2 mM，3 mM，4 mM，5 mM，6 mM，7 mM，8 mM，9 mM，10 mM。

本方法通过将富集细胞和羟基磷灰石/磷酸三钙（HA/TCP）载体混合，移植于免疫缺陷动物皮下，优选的免疫缺陷动物是裸鼠，通过组织切片来检测细胞的体内分化能力。这一体内移植系统，也是目前本领域公认的金标准。

本发明富集的CD18阳性干细胞可直接用于再生医学，优选的是牙齿及相关疾病的再生医学。

此外，鉴于CD18在骨发生过程中发挥的关键作用，本发明也涉及通过各种转基因技术，优选方案是通过逆转录病毒介导的方式，将CD18基因转入各种基质干细胞，包括但不限于牙齿、脂肪、骨髓、脐带、胎盘、脐血等组织来源的基质干细胞，用于骨及相关疾病的再生医学和组织工程。

附图说明

图1 CD18阳性干细胞亚群的表型分析

图2 CD18阴性干细胞的表型分析对比

图3 CD18阳性干细胞的集落形成能力分析

图4 CD18阴性干细胞的集落形成能力分析对比

图5 CD18阳性干细胞的增殖能力分析

图6 CD18阳性干细胞的体外成骨分化

图7 CD18阳性干细胞的体内成骨分化。

具体实施方式

实施例1 CD18阳性牙周膜干细胞的富集

材料与方法

1. 收集正常的成人（19-29岁）拔除智齿，立即置于4℃预冷的含50-300U/mL青霉素、50-300μg/mL链霉素、和1-5μg/mL二性霉素B的α-MEM培养基中，2℃-8℃条件下运至洁净实验室。从收集到开始提取牙周膜干细胞的时间间隔不超过72小时；

2. 转移至生物安全柜，取出智齿至培养皿，用4℃预冷的无菌磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer Saline，PBS）清洗其外表面；

3. 从牙根表面轻轻剥离残留的牙周膜组织；

4. 将牙周膜组织置于含1-10 mg/ml I型胶原酶和1-10 mg/ml分散酶的PBS中，37℃消化1小时；

5. 将消化液通过70微米的细胞筛过滤，获得单细胞悬液；

6. 900rpm离心5min，用PBS洗细胞一次；

7. 用适量PBS重悬细胞，加入CD18单抗，混匀，室温避光孵育30分钟；

8. 洗涤后，900rpm离心5min，用PBS重悬细胞；

9. 通过流式细胞分选，分别获取CD18阳性和阴性细胞。

分析结果显示，富集的阳性干细胞CD18表达强阳性（图1），阴性干细胞CD18表达阴性（图2），该分离富集方案是显著有效的。

实施例2 CD18阳性牙周膜干细胞的集落形成能力

材料与方法

1. 取分选的CD18阳性干细胞亚群，计数；

2. 900rpm 离心5min；

3. 用含10％-20% 胎牛血清、50μM-200μM的抗坏血酸2-磷酸酯、2mM谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的α-MEM培养基重悬细胞；

4. 将10⁴个CD18阳性干细胞接种于T25细胞培养瓶中，置于37℃、5％ CO₂的孵箱中培养；

5. 每3-4天换液；

6. 14-16天后，倒掉培养液，PBS清洗贴壁细胞，随后用含有0.1%甲苯胺蓝和2%多聚甲醛的PBS溶液对细胞进行固定、染色。超过50个细胞的细胞群被记为一个集落（ColonyForming Unit-Fibroblast，CFU-F）。

分析结果表明，和CD18阴性干细胞（图4）比，CD18阳性干细胞（图3）有更强的克隆形成能力。

实施例3 CD18阳性牙周膜干细胞的体外增殖能力

材料与方法

1. 取分选的CD18阳性干细胞亚群，计数；

2. 900rpm 离心5min；

4. 将步骤3得到的细胞以10⁴每孔接种于12孔板中，置于37℃、5％ CO₂的孵箱中培养；

5. 培养1-2天后，加入BrdU试剂（1:100），孵育24h；

6. BrdU染色试剂盒对细胞进行染色；

7. 苏木素复染；

8. 镜下计数阳性干细胞数，测定细胞的增殖率。

BrdU作为一种胸腺嘧啶核苷的类似物，可掺入到细胞新合成的DNA中，反映细胞的增殖能力。CD18阳性干细胞培养1-2天后，加入BrdU，经BrdU染色，结果可见（图5），80%以上细胞呈阳性，表明富集的CD18阳性干细胞有较强的增殖能力。

实施例4 CD18阳性牙周膜干细胞的体外成骨分化能力

材料与方法

1. 取分选的CD18阳性干细胞亚群，计数；

2. 900rpm 离心5min；

4. 接种 4×10⁵个CD18阳性干细胞于6孔板中，置于37℃、5％ CO₂的孵箱中培养；

5. 待细胞扩增到 80% 融合度时，更换成成骨诱导培养基（含有 5-30nM 地塞米松，50-300μg/mL 维生素 C 和 1-10 mM β-甘油磷酸钠的 α-MEM 培养基）；

6. 每3-4天换液；

7. 3-4周诱导后，镜下观察细胞，见暗黄色钙结节形成；

8. 弃去培养液，PBS 清洗 2 遍后，弃去 PBS；

9. 换成 60%的异丙醇进行固定，室温 1min之后，弃去异丙醇，使用双蒸水清洗 2遍，用 1%的茜素红染色，室温 3min。PBS 清洗 2 遍后，吸尽液体后拍照。

在体外经3-4周成骨诱导培养后，通过茜素红染色（图6），可见细胞间有矿物沉积，表明CD18阳性干细胞可向成骨细胞分化。

实施例5 CD18阳性牙周膜干细胞的体内成骨分化能力

材料与方法

1. 将 2×10⁶个CD18阳性干细胞与 15mg 的羟基磷灰石/磷酸三钙（HA/TCP）颗粒混合，并移植到 6-8周龄的裸鼠背部皮下；

2. 移植术后 8 周取材；

3. 安乐死处死小鼠后，小心分离皮下细胞团块和皮肤，用4%的多聚甲醛固定，4℃过夜；

4. 弃去固定液，PBS 清洗干净后，换成 10%的 EDTA 进行脱钙，每3天换一次脱钙液，脱钙 21 天后，脱水包埋；

5. 切片后，进行苏木素/伊红（H&E）染色和 Masson’s 三色染色；

6. 镜检。

将CD18阳性干细胞和羟基磷灰石/磷酸三钙（HA/TCP）颗粒混合，并移植到 6-8周龄的裸鼠背部皮下。8周后组织切片显示（图7），CD18阳性牙周膜干细胞分化为成牙骨质细胞样细胞，在HA/TCP表面形成牙骨质样结构（C）。还生成牙骨质细胞样细胞和牙周膜样组织(PDL)。结果表明，CD18阳性干细胞在体内可分化为牙骨质/牙周膜样结构。

Claims

1.一种通过细胞表面标记特异性富集的人牙周膜干细胞亚群，其特征在于，所述干细胞为人牙周膜干细胞，所述细胞表面标记选自CD18，STRO-1，CD106/VCAM-1，CD146/MUC-18，HOP-26，CD49A/整合素β1，SB-10/CD166中的一个或多个。

2.权利要求1所述的人牙周膜干细胞亚群，其特征在于，以CD18作为细胞表面标记，所述CD18使用荧光标记或磁珠标记。

3.一种权利要求1或2所述人牙周膜干细胞亚群的富集方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：

步骤1，收集正常的成人拔除智齿，立即置于4℃预冷的含50-300U/mL青霉素、50-300μg/mL链霉素、和1-5μg/mL二性霉素B的α-MEM培养基中，2℃-8℃条件下运至洁净实验室，所述成人年龄为19到29岁，从收集到开始提取牙周膜干细胞的时间间隔不超过72小时；

步骤2，转移至生物安全柜，取出智齿至培养皿，用4℃预冷的无菌磷酸盐缓冲液清洗，即PBS清洗其外表面；

步骤3，从牙根表面轻轻剥离残留的牙周膜组织；

步骤4，将牙周膜组织置于含1-10 mg/ml I型胶原酶和1-10 mg/ml分散酶的PBS中，37℃消化1小时；

步骤5，将消化液通过70微米的细胞筛过滤，获得含有人牙周膜干细胞的单细胞悬液，900rpm离心5min，用PBS洗细胞一次；

步骤6，用PBS重悬细胞，加入CD18单抗，混匀，室温避光孵育30分钟；

步骤7，洗涤后，900rpm离心5min，用PBS重悬细胞；

步骤8，通过流式细胞仪分选或免疫磁珠分选，获得CD18阳性干细胞亚群。

4.一种权利要求1或2所述人牙周膜干细胞亚群的干性检测方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：

步骤1，取富集的CD18阳性干细胞亚群，计数；

步骤2，900rpm 离心5min；

步骤3，用含10％-20% 胎牛血清、50μM-200μM的抗坏血酸2-磷酸酯、2mM谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的α-MEM培养基重悬细胞；

步骤4，将10⁴个CD18阳性干细胞接种于T25细胞培养瓶中，置于37℃、5％ CO₂的孵箱中培养；

步骤5，每3-4天换液，14-16天后，倒掉培养液，PBS清洗贴壁细胞，随后用含有0.1%甲苯胺蓝和2%多聚甲醛的PBS溶液进行固定、染色。

5.一种权利要求1或2所述人牙周膜干细胞亚群的干性检测方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：

步骤1，取富集的CD18阳性干细胞亚群，计数；

步骤2，900rpm 离心5min；

步骤3，用含10％-20% 胎牛血清、50μM-200μM的抗坏血酸2-磷酸酯、2mM谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的α-MEM培养基重悬细胞；

步骤4，将步骤3得到的细胞以10⁴每孔接种于12孔板中，置于37℃、5％ CO₂的孵箱中培养；

步骤5，培养1-2天后，加入Brdu试剂，所述Brdu试剂，孵育24h；

步骤6，Brdu染色试剂盒对细胞进行染色；苏木素复染；镜下计数阳性干细胞数，测定所述干细胞的增殖率。

6.一种权利要求1或2所述人牙周膜干细胞亚群的干性检测方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：

步骤1，取富集的CD18阳性干细胞亚群，计数；

步骤2，900rpm 离心5min；

步骤4，接种 4×10⁵个CD18阳性干细胞于6孔板中，置于37℃、5％ CO₂的孵箱中培养；

步骤5，待所述干细胞扩增到 80% 融合度时，更换成成骨诱导培养基，所述培养基为含有 5-30nM 地塞米松，50-300μg/mL 维生素 C 和 1-10 mM β-甘油磷酸钠的 α-MEM 培养基；

步骤6，每3-4天换液；3-4周诱导后，镜下观察所述干细胞，见暗黄色钙结节形成；

步骤7，弃去培养液，PBS 清洗 2 遍后，弃去 PBS；

步骤8，换成 60%的异丙醇进行固定，室温 1min之后，弃去异丙醇，使用双蒸水清洗 2遍，用 1%的茜素红染色，室温 3min；PBS 清洗 2 遍后，吸尽液体后拍照。

7.一种权利要求1或2所述的人牙周膜干细胞亚群的干性检测方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：

步骤1，将 2×10⁶个CD18阳性干细胞与 15mg 的羟基磷灰石/磷酸三钙，即HA/TCP颗粒混合，并移植到 6-8周龄的免疫缺陷动物背部皮下；

步骤2，移植术后 8 周取材；

步骤3，安乐死处死所述免疫缺陷动物后，小心分离皮下细胞团块和皮肤，用4%的多聚甲醛固定，4℃过夜；

步骤4，弃去固定液，PBS 清洗干净后，换成 10%的 EDTA 进行脱钙，每3天换一次脱钙液，脱钙 21 天后，脱水包埋；

步骤5，切片后，进行苏木素/伊红染色和 Masson’s 三色染色；

步骤6，镜检。

8.权利要求7所述人牙周膜干细胞亚群的干性检测方法，所述免疫缺陷动物为裸鼠。

9.一种权利要求1或2所述人牙周膜干细胞亚群的用途，其特征在于，用于骨疾病的再生医学和组织工程材料的制备。

10.一种权利要求1或2所述人牙周膜干细胞亚群的用途，其特征在于，通过转基因技术将CD18基因转入基质干细胞，用于骨疾病的再生医学和组织工程材料的制备。

11.权利要求10所述人牙周膜干细胞亚群的用途，其特征在于，所述的基质干细胞来源选自牙齿、脂肪、骨髓、脐带、胎盘或脐血。

12.权利要求10所述人牙周膜干细胞亚群的用途，其特征在于，所述转基因技术是通过逆转录病毒介导的方式。