CN110172444A - 一种人软骨干细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种人软骨干细胞的制备方法，制备方法包括培养瓶包被、软骨组织采集、组织酶消、接种初筛、单克隆扩增、细胞鉴定等步骤。本发明的优点在于：本发明能够利用小量的软骨组织获得大量均一、稳定的干细胞种子，且生长周期短，操作方法简单易行、可重复性强。

Description

一种人软骨干细胞的制备方法
技术领域
本发明属于细胞培养领域，特别涉及一种人软骨干细胞的制备方法。
背景技术
关节软骨是一种富含细胞外基质、无血管和神经的黏弹性组织，在体内主要作用为负荷、润滑、力的吸收等方面。关节软骨在关节活动中起非常关键的作用，一旦发生损伤或病变就会引起软骨的剥脱，关节面缺损，给患者造成关节肿胀、疼痛及活动障碍，严重可永久影响关节功能，造成生活不便。目前关节软骨损伤的治疗方法主要有关节腔灌洗术、骨髓刺激技术(磨削关节成形术、软骨下骨钻孔术、微骨折术)、自体或异体软骨膜和骨膜移植、自体或异体骨软骨块(Mosaicplasty,又称骨软骨镶嵌移植)、关节软骨移植等。由于关节软骨的复杂性和高度特异性决定了其损伤后修复的效果不佳。故临床医生和研究者们一直在致力于寻找一种全新的治疗方式，能够有效的改善和治疗关节损伤。近年来，研究者们从软骨中发现除了软骨细胞，还存在一种软骨前体/祖细胞，这类细胞能够在特定诱导条件下分化成脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞，这为软骨损伤的原位修复带来了新的希望。
现有技术，从软骨中分离干细胞都是用了胰酶和II型胶原酶（CN106309493A），且消化时间长达十几个小时，消化时间长，产率一般，不利于规模化生产。或获得的细胞来源于试验动物，而非人类（CN105787154A），使细胞的应用受到限制。本发明目的在于提供一种人软骨干细胞的分离方法，解决现有技术问题中的一个或多个。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种细胞来源于人类，使细胞的应用更为广泛且利于规模生产的人软骨干细胞的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：一种人软骨干细胞的制备方法，其创新点在于：所述制备方法包括如下步骤：
步骤1：培养皿包被：将层粘连蛋白用PH 7.6-8.2的无菌DPBS梯度稀释至100 ug/ml，分装成若干支分装液；然后，取一支分装液用无菌DPBS梯度稀释至10-20 ug/ml包被35mm培养皿，每个培养皿2 ml，4度过夜或37度预包被1 h；
步骤2：组织采集：软骨组织取自人关节软骨处的筋膜和软骨膜，放入含有生理盐水的5ml离心管内，4度保存，12 h内分离；
步骤3：组织酶消：将离心管内的软骨组织放入90 cm的培养皿内，用生理盐水洗涤2-3次，将软骨组织用齿镊固定住两侧，用无菌手术刀将软骨组织切成约1 mm2厚的薄片，将薄片组织转入50 ml离心管内，剪碎呈0.5-1 mm3大小的组织块，加入2 mlP型胶原酶和2mldispase酶，消化1-2 h，形成细胞悬液；再将细胞悬液用培养基2倍稀释后过100 目筛网，过滤后的液体再用生理盐水稀释2倍，1000-1500 rpm，离心10 min，收集底部沉淀，用生理盐水重悬后再离心2次；
步骤4：接种初筛：将步骤3最终离心的细胞沉淀用无血清培养基重悬后，计数，以0.5-0.8×103/ml密度接种至预先包被层粘连蛋白的培养皿内，再放入到37℃，5%的CO2培养箱内培养，并在30-40 min内换液去掉未贴壁的细胞，加入新的培养基培养，每3天全量换液一次；
步骤5：单克隆扩增：镜下观察经步骤4接种初筛后的细胞，待单细胞形成克隆团≥30个细胞时，用marker笔做好标识，待单克隆长至90%汇合度时，将单个克隆细胞团用克隆环挑取后，按1-2×103/ml密度接接种到新的培养瓶内进行培养，每三天换液一次，待细胞长至80%汇合度时，对细胞进行传代；
步骤6：细胞鉴定：取P3-P5代干细胞，消化离心后，取100-200万用于流式细胞仪检测CD44、CD90、CD166、CD34、CD45的表达情况。
进一步地，所述步骤3中的P型胶原酶选用质量百分浓度为0.2-0.5%的P型胶原酶。
进一步地，所述步骤3中的dispase酶选用质量百分浓度为0.1-0.3%的dispase酶。
进一步地，所述步骤5中细胞进行传代的具体步骤：倒掉培养瓶内的培养基，用质量分数为0.9%的生理盐水洗涤细胞表面两次，加入2 ml浓度为0.125%温和消化酶，37℃消化1-2 min，加入2倍体积盐水稀释，用移液管吹打细胞，使细胞完全脱落，将脱落的细胞转移到离心管内，1000-1500rpm，离心6-10min，将离心所得的沉淀用的无血清培养基重悬，按1-2×105/ml密度接种于培养瓶进行传代培养，每瓶加入15 ml培养基，2-3天细胞即达到85%汇合度，此时可对细胞进行冻存或继续传代扩增。
进一步地，所述步骤6抗体染色的具体步骤为：将细胞沉淀用DPBS洗涤2次，取0.8-1×106，100 ul细胞悬液放于EP管中，加入一抗15 ul，空白管不加一抗，4℃避光孵育30min，加入400ul DPBS，1500 rpm离心6 min，弃去上清，加入10 ul的二抗，4℃避光孵育30min后，加入400 ul DPBS，1500 rpm离心6 min，弃去上清，加入500 ul DPBS混匀后转移到流式上机管中，上机检测。
本发明的优点在于：本发明人软骨干细胞的制备方法，通过P型胶原酶和dispase酶联合消化软骨组织替代传统胰酶和胶原酶混合消化，将消化时间由10 h以上缩短在2 h以内，显著提高生产效率；分离后的细胞经过层粘连蛋白接种初筛和单克隆扩增后，细胞纯度高，活性好，周期稳定；经流式细胞仪检测，干细胞表面标志CD44\CD90\CD166表达率大于95%，而不表达CD34\CD45；且本发明的制备方法简单，高效，有利于规模化生产。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为三种浓度酶作用下分离细胞培养形成的克隆团的照片。
图2为三种浓度酶作用下克隆团传代扩增第3天的照片。
图3为三种浓度酶作用下P1达到80%汇合度照片。
图4-6为不同酶浓度作用下获得细胞的流式图。
具体实施方式
下面的实施例可以使本专业的技术人员更全面地理解本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1
本实施例人软骨干细胞的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
步骤1：培养瓶包被：将层粘连蛋白用PH 7.6-8.2的无菌DPBS梯度稀释至100 ug/ml，分装成若干支分装液；然后，取一支分装液用无菌DPBS梯度稀释至10-20 ug/ml包被35mm培养皿，每个培养皿2 ml，4度过夜。
步骤2：组织采集：组织样本均由经三甲医院检测HBV抗原、抗HCV抗体，抗HIV抗体、抗梅毒螺旋体抗体、ALT、支原体等检测项目均为阴性的试验人员提供；由专业临床经提供者同意剥离包裹软骨组织的筋膜和软骨膜，放入含有生理盐水的5 ml离心管内，4度保存，12 h内分离。
步骤3：组织酶消：将离心管内的软骨组织放入90 cm的培养皿内，用生理盐水洗涤2-3次，将软骨组织用齿镊固定住两侧，用无菌手术刀将软骨组织切成约1 mm2厚的薄片，将薄片组织转入50 ml离心管内，将软骨组织用顿头手术剪刀剪碎呈0.5-1 mm3大小的组织块，加入2 ml 0.2% P型胶原酶和2 ml 0.1%dispase酶消化2 h。不同酶浓度作用下获得的细胞种子数和细胞活力见表1。将细胞悬液用培养基2倍稀释后过100 目筛网，过滤后的液体再用生理盐水稀释2倍，1000-1500 rpm，离心10 min，收集底部沉淀，用生理盐水重悬后再离心2次。
步骤4：接种初筛：将离心的细胞沉淀用无血清培养基重悬后，计数，以0.5-0.8×103/ml密度接种至预先包被层粘连蛋白的培养皿内，放入到37℃，5%的CO2培养箱内培养。35 min内换液去掉未贴壁的细胞，加入新的培养基培养。每3天全量换液一次。
步骤5：单克隆扩增：镜下观察细胞，在显微镜下可明显看到单细胞形成克隆团（≥30个细胞）时，如图1A,此时用marker笔做好标识，并记录克隆团数目，见表1，单个克隆团细胞长至90%汇合度时，将单个克隆细胞团用克隆环挑取后，按1-2×103/ml密度接接种到新的培养瓶内进行培养，每三天换液一次；第一次换液时细胞呈典型的梭形或纺锤体型，细胞汇合度达20%左右，如图2A,待细胞长至80%汇合度时，如图3A所示，对细胞进行传代。
实施例2
加入2 ml0.35% P型胶原酶和2 ml 0.2%dispase酶，消化时间为1.5 h，步骤5中，镜下观察细胞，在显微镜下可明显看到单细胞形成克隆团（≥30个细胞）时，如图1B,此时用marker笔做好标识，并记录克隆团数目，见表1，单个克隆团细胞长至90%汇合度时，将单个克隆细胞团用克隆环挑取后，按1-2×103/ml密度接接种到新的培养瓶内进行培养，每三天换液一次；第一次换液时细胞呈典型的梭形或纺锤体型，细胞汇合度达30%左右，如图2B,待细胞长至80%汇合度时，如图3B所示，对细胞进行传代，其他步骤同实施例1。
实施例3
加入2 ml0.5% P型胶原酶和2 ml 0.3%dispase酶，消化时间为1 h，步骤5中，镜下观察细胞，在显微镜下可明显看到单细胞形成克隆团（≥30个细胞）时，如图1C,此时用marker笔做好标识，并记录克隆团数目，见表1，单个克隆团细胞长至90%汇合度时，将单个克隆细胞团用克隆环挑取后，按1-2×103/ml密度接接种到新的培养瓶内进行培养，每三天换液一次，第一次换液时细胞呈典型的梭形或纺锤体型，细胞汇合度达15%左右，如图2C，待细胞长至80%汇合度时，如图3C所示，对细胞进行传代，其他步骤同实施例1。
不同浓度消化方法得到的细胞，结果如表1：
表1 不同消化液浓度作用下获得的种子细胞数、活力，单克隆数的比较
从上述试验中可以看出，本发明使用的混合胶原酶能够高效快速的从软骨组织中分离出干细胞，细胞活性好，贴壁快，克隆形成率高，P0代细胞的生长周期为12-16天，另混合胶原酶最佳浓度为0.75%，消化时间为1.5 h，获得的种子细胞为1.1～1.2×103个，细胞活力达95%，30-40 min第一次换液后，有13%左右的细胞贴壁，细胞呈典型的梭形或纺锤体型，培养8天左右，可以观察到85～100个克隆，再继续培养3-4天，单个克隆团细胞汇合度达到90%以上。
结果分析
干细胞体外培养和表面标志物鉴定
将上述3个实施例获得的P1代细胞继续进行扩增传代，传代的具体步骤为：倒掉培养瓶内的培养基，加入10 ml质量分数为0.9%的生理盐水洗涤细胞表面两次，加入2 ml浓度为0.125%温和消化酶，37℃消化1-2 min，加入2倍体积盐水稀释，用移液管吹打细胞，使细胞完全脱落，将脱落的细胞转移到离心管内，1000-1500rpm，离心6-10min，将离心所得的沉淀用无血清培养基重悬，按1-2×105/ml密度接种于培养瓶进行传代培养，每瓶加入15 ml培养基，2-3天细胞即达到85%以上汇合度，此时可对细胞进行冻存或继续传代扩增，同时抽取100-200万细胞用于流式细胞仪表型检测。
流式细胞仪表型检测：取P2-3代细胞，消化离心后，将细胞沉淀用DPBS洗涤2次，取0.8-1×106，100ul细胞悬液放于EP管中，加入一抗15ul（空白管不加一抗），4℃避光孵育30min，加入400ul DPBS，1500rpm离心6min，弃去上清，加入10ul的二抗，4℃避光孵育30min后，加入400ul DPBS，1500rpm离心6min，弃去上清，加入500ul DPBS混匀后转移到流式上机管中，上机检测。检测结果显示实施例1获得的种子细胞经扩增后干细胞特异性标志物CD44，CD166，CD90阳性率分别为99.31%，99.18%，99.39%，而细胞不表达CD34，HLA-DR，如图4A-E;实施例2获得的种子细胞经扩增后干细胞特异性标志物CD44，CD166，CD90阳性率分别为99.58%，99.51%，99.60%%，而细胞不表达CD34，HLA-DR，如图5A-E；实施例3获得的种子细胞经扩增后干细胞特异性标志物CD44，CD166，CD90阳性率分别为97.09%，97.76%，96.87%，而细胞不表达CD34，HLA-DR，如图6A-E；表明我们能够从软骨组织分离获得具有干细胞特性的种子细胞，且干细胞特异性蛋白CD44，CD166，CD90阳性率达95%以上。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (5)

1.一种人软骨干细胞的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括如下步骤：
步骤1：培养皿包被：将层粘连蛋白用PH 7.6-8.2的无菌DPBS梯度稀释至100 ug/ml，分装成若干支分装液；然后，取一支分装液用无菌DPBS梯度稀释至10-20 ug/ml包被35mm培养皿，每个培养皿2 ml，4度过夜或37度预包被1 h；
步骤2：组织采集：软骨组织取自人关节软骨处的筋膜和软骨膜，放入含有生理盐水的5ml离心管内，4度保存，12 h内分离；
步骤3：组织酶消：将离心管内的软骨组织放入90 cm的培养皿内，用生理盐水洗涤2-3次，将软骨组织用齿镊固定住两侧，用无菌手术刀将软骨组织切成约1 mm2厚的薄片，将薄片组织转入50 ml离心管内，剪碎呈0.5-1 mm3大小的组织块，加入2 mlP型胶原酶和2mldispase酶，消化1-2 h，形成细胞悬液；再将细胞悬液用培养基2倍稀释后过100 目筛网，过滤后的液体再用生理盐水稀释2倍，1000-1500 rpm，离心10 min，收集底部沉淀，用生理盐水重悬后再离心2次；
步骤4：接种初筛：将步骤3最终离心的细胞沉淀用无血清培养基重悬后，计数，以0.5-0.8×103/ml密度接种至预先包被层粘连蛋白的培养皿内，再放入到37℃，5%的CO2培养箱内培养，并在30-40 min内换液去掉未贴壁的细胞，加入新的培养基培养，每3天全量换液一次；
步骤5：单克隆扩增：镜下观察经步骤4接种初筛后的细胞，待单细胞形成克隆团≥30个细胞时，用marker笔做好标识，待单克隆长至90%汇合度时，将单个克隆细胞团用克隆环挑取后，按1-2×103/ml密度接接种到新的培养瓶内进行培养，每三天换液一次，待细胞长至80%汇合度时，对细胞进行传代；
步骤6：细胞鉴定：取P3-P5代干细胞，消化离心后，用抗体染色后，转移到流式细胞仪检测CD44、CD90、CD166、CD34、CD45的表达情况。
2.根据权利要求1所述的人软骨干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤3中的P型胶原酶选用质量百分浓度为0.2-0.5%的P型胶原酶。
3.根据权利要求1或2所述的人软骨干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤3中的dispase酶选用质量百分浓度为0.1-0.3%的dispase酶。
4.根据权利要求1所述的人软骨干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤5中细胞进行传代的具体步骤：倒掉培养瓶内的培养基，用质量分数为0.9%的生理盐水洗涤细胞表面两次，加入2 ml浓度为0.125%温和消化酶，37℃消化1-2 min，加入2倍体积盐水稀释，用移液管吹打细胞，使细胞完全脱落，将脱落的细胞转移到离心管内，1000-1500rpm，离心6-10min，将离心所得的沉淀用的无血清培养基重悬，按1-2×105/ml密度接种于培养瓶进行传代培养，每瓶加入15 ml培养基，2-3天细胞即达到85%汇合度，此时可对细胞进行冻存或继续传代扩增。
5.根据权利要求1所述的人软骨干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤6抗体染色的具体步骤为：将细胞沉淀用DPBS洗涤2次，取0.8-1×106，100 ul细胞悬液放于EP管中，加入一抗15 ul，空白管不加一抗，4℃避光孵育30 min，加入400ul DPBS，1500 rpm离心6min，弃去上清，加入10 ul的二抗，4℃避光孵育30 min后，加入400 ul DPBS，1500 rpm离心6 min，弃去上清，加入500 ul DPBS混匀后转移到流式上机管中，上机检测。
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