JP3621412B2 - フィブリン・コート・ポリマー表面 - Google Patents

Description

発明の背景
閉塞性動脈疾患は、一般的に閉塞した血管をバイパスすることにより治療される。最も首尾よい治療は、自原性（autogenous）静脈移植物の使用を通して達成される。しかしながら、静脈が利用できないとき、延伸ポリテトラフルオロエチレン又はポリエチレンテレフタレートのような材料から作られた合成移植物に置換される。
中程度の又は小さな血管バイパスのための小内径の合成血管移植物の外科用塗は、最近入手可能な移植材料の血栓形成性質のために頻繁な移植物閉塞により制限されている。小さな血管移植においては、血流は減少し、そして移植物表面上に血液タンパク質の速い吸着及び蓄積が存在する。患者内への移植の直後、補てつ血管移植物の管腔態様（luminal aspect）が、擬脈管内膜（pseudointima）といわれるフィブリン表面の形成により治癒される。トロンビンは、このフィブリン擬脈管内膜に結合し、ここで、それは血小板活性化及び血小板豊富血栓の形成に寄与することができる。結合されたトロンビンは、今度は遠位の塞栓を導くさらなるフィブリン固化（accretion）に寄与することもできる。
内皮細胞による血管移植物の接種（seeding）が、（Mosquera and Goldman,Br.J.Surg.78:656−660,1991によりレビューされるような）血栓形成の問題に対する解決策として提案されている。移植物の内皮細胞接種が実験的な環境において有益な結果を示したけれども、その技術は、定常的な用途に好適な接種移植物が作られることができるという点には進展していない。
生物学的に適合性の、減少された血栓形成性をもつ合成材料について、本分野において明確な必要性が存在する。このような材料は、血液タンパク質の堆積に、そして血小板接着性に対し抵抗性でなければならない。これらの材料は、血管移植物、合成心弁、人工臓器として、そしてその材料が血液に晒されるであろう、そして血栓形成の可能性が存在するいずれかの補てつ用途において、有用であろう。本発明は、このような材料及びその材料の製造方法を提供する。本発明の方法に従って製造される材料は、血栓形成（rhrombogenic）及び血栓溶解（fibrinolytic）の過程の研究における実験モデルとしても有用である。
発明の開示
本発明は、フィブリノーゲン及びフィブリンによりポリマー材料の表面をコーティングする方法を提供する。１つの態様においては、ポリマー材料は、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート又は延伸ポリテトラフルオロエチレンであり、そして血管移植物の形態であることができる。
本発明の１つの態様に従えば、ポリマー材料を、フィブリノーゲン・コート材料を作るために、少なくとも56℃であるが100℃未満の、好ましくは約70℃の温度においてフィブリノーゲンの溶液中でインキュベートする。１つの態様においては、溶液は、0.5と3.0mg/mLフィブリノーゲン、好ましくは約1mg/mLフィブリノーゲンを含む。他の態様においては、フィブリノーゲンは、ヒトのフィブリノーゲンである。
本発明の関連態様に従えば、先に開示されたように調製されたフィブリノーゲン・コート・ポリマー材料は、トロンビンにより処理され、フィブリン・モノマーを作り出す。１つの態様においては、この処理は、フィブリノーゲン−コート表面を約１μg/mLトロンビンを含む溶液に晒すことにより行われる。他の態様においては。トロンビン−処理表面は、因子XIII及び追加のフィブリノーゲンを含んで成る第二溶液に晒され、これにより、その追加のフィブリノーゲンがフィブリンに変換され、そしてフィブリン−コート表面に架橋される。第二溶液中の因子XIIIの濃度は、好ましくは0.25−5.0μg/mLである。関連態様においては、第二溶液は、塩基性繊維芽細胞成長因子、内皮細胞成長因子、α_２マクログロブリン、ビトロネクチン（vitronectin）、フィブロネクチン（fibronectin）、又はフィブロネクチンの細胞結合断片をさらに含んで成る。他の態様においては、第二溶液は、内皮細胞を含んで成る。関連態様においては、架橋したフィブリン・コート表面は、内皮細胞により接種される。
本発明は、さらに、先に開示された方法に従って製造されたポリマー材料を提供する。
本発明の上記の及び他の態様は、以下の詳細な説明及び添付図面を参照して明確になるであろう。
【図面の簡単な説明】
図１は、熱分解を介しての表面上に析出したフィブリノーゲンの濃度と出発溶液中のフィブリノーゲンの濃度との関係について説明している。
図２は、非コート・ポリエチレン及び熱変性フィブリノーゲン又は吸着フィブリノーゲンによりコートされたポリエチレンへの血小板の付着について説明している。
図３は、因子XIIIの増加量を使用して調製したフィブリン・コーティングへの血小板の付着について説明している。
図４は、10分間検定における様々な抗血液凝固剤によるフィブリン固化の阻害について説明している。
図５は、30分間検定における様々な抗血液凝固剤によるフィブリン固化の阻害について説明している。
図６は、フィブリン−コート・ポリエチレン上のフィブリン固化に対する合成ヒルジン誘導体の効果について説明している。
図７は、フィブリン−コート・ポリエチレンを使用したトロンビン排除（displacement）の結果について説明している。
発明の詳細な説明
本発明は、ポリマー材料、例えば、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート（例えば、Dacron^▲Ｒ▼）又は延伸ポリテトラフルオロエチレン（例えば、Gore−Tex^▲Ｒ▼,W.L.Gore,Flagstaff,Arizona）の表面をフィブリノーゲンによりコーティングする方法を提供する。コートされた表面は、さらにトロンビンにより処理され、その後、因子XIIIの存在中追加のフィブリノーゲンと共にインキュベートされることができる。本発明に従って調製されたフィブリン−コート表面は、内皮細胞の成長のための支持体、減少された血栓形成性をもつ（血管移植物を含む）補てつ装置、及び血栓形成及び血栓溶解の研究のためのテスト系を提供する。
本発明に従えば、ポリマー材料の表面は、熱変性の工程を通してフィブリノーゲンによりコートされる。フィブリノーゲンのポリマー表面への付着がフィブリノーゲンのＤ−ドメインを変性させるがそのＥ−ドメインを変性させないのに十分な温度におけるフィブリノーゲンの熱変性により非常に強化されることができることが発見された。このように、熱変性は少なくとも56℃であるが100℃未満の温度において行われる。一般的に、約70℃の温度を使用することが好ましい。但し、当業者は、実際の温度が使用する特定のポリマーに合わせて、先に述べたレンジ内で変化されることができることを理解するであろう。温度は、そのポリマーを溶融させず又は他の損傷を与えることなく、ポリマー全体を少なくとも56℃まで加熱するのに十分に高いものであろう。このような温度の決定は、本分野における通常の知識レベルの内にある。典型的なコーティング手順においては、ポリエチレン・チュービングを、メタノールにより濯ぎ、いずれかの脂質汚染物を除去し、その後TBS（0.05M Tris pH7.4,0.1M NaCl）中で濯ぐ。濯いだチュービングを、次にTBS中に保存することができる。次にチュービングを、乾かし、そしてNaClの生理学的濃度を含むpH6.0−8.0のバッファー（例えば、TBS）中のフィブリノーゲン溶液（0.5−3.0mg/mL）により満たし、次に70℃において10〜30分間オーブン内に置く。次にチュービングをTBSの40チューブ容量により濯ぐ。
先に記載したように調製したフィブリノーゲン−コート表面を、トロンビン、因子XIII及び追加のフィブリノーゲンにより安定化することができる。発明者は、因子XIIIが析出したフィブリンを安定化し、血管移植物が受ける高液体剪断速度に対してそれを抵抗性にすることを、発見した。このように、本発明は、血管移植物上の新脈管内膜の再生産可能なモデルとして役立つことができる重合したフィブリンの薄く均一なコートをもつポリマー・チューブを提供する。
フィブリノーゲン・コーティングを安定化するために、先に開示されたように調製したフィブリン−コート表面を、α−トロンビンにより処理する。典型的な手順においては、低張性の（0.04−0.065M NaCl）pH6.0−8.0の溶液（例えば、0.025M Tris,0.05M NaCl,pH7.4）中のヒトα−トロンビンの溶液（0.5−10μg/mL）を、約18℃〜約37℃の温度において約５−10分間、変性フィブリノーゲン−コート表面に適用する。トロンビンは、析出したフィブリノーゲンからフィブリノペプチドＡを解裂させ、そしてフィブリノーゲンをフィブリン・モノマーに変換する。得られたフィブリンをフィブリノーゲン及び因子XIIIを含む溶液に晒すことは、析出したフィブリン層に吸着されたトロンビンによる追加のフィブリノーゲンのフィブリンへの変換を導く。次に因子XIIIは、フィブリンの架橋を触媒し、重合したフィブリンの薄い均一なコートの形成をもたらす。一般的には、２〜10mM CaCl₂、好ましくは約2mM CaCl₂を含む生理学的バッファー（pH6.0−8.0）中の約0.5−5.0mg/mLのフィブリノーゲン濃度が使用されるであろう。因子XIIIは、約0.25〜20μg/mL以上、より好ましくは約0.25−1.0μg/mLの好ましい濃度において含まれる。この方法で調製された表面は、血管移植物上に新脈管内膜の再生産可能なモデルを提供する。表面は、バッファー溶液、細胞懸濁液及び血漿による高い壁剪断速度の条件下で還流されるとき安定である。本発明に従って調製される表面は、血管移植物上の血栓形成及び血栓溶解の研究において有用である。
架橋フィブリン・コーティングの厚さは、チュービングをフィブリノーゲン−因子XIII溶液に晒す時間に比例する。いずれかの特定表面のための時間とコーティング厚さとの間の関係及び反応条件の設定は、経験的に容易に確立されることができる。典型的な手順においては、フィブリノーゲン−コート・ポリマー・チュービングのセグメントを、0.5 x TBS中のヒトα−トロンビンの１μg/mL溶液により満たし、そして約５分間約23℃において放置する。次にチュービングを20チューブ容量の0.5 x TBSにより濯ぐ。次に濯いだチュービングを2mM CaCl₂及び0.5μg/mL因子XIIIを含むTBS中の1mg/mLフィブリノーゲンの溶液により満たす。混合物を、架橋フィブリンの所望の厚さが得られるまでチュービング内に残す。次にチュービングをTBSにより広く濯ぐ。追加の架橋を、濯いだチュービングのさらなるインキュベーション（例えば、37℃において30分間−24時間）により得ることができる。フィブリンの架橋は、コーティング内で結合した因子XIIIにより触媒される。フィブリン−コート・ポリマー表面の血栓形成性は、架橋の程度を増加させることによりかなり減少される。なぜなら、血小板接着性が減少するからである。これらのテスト方法は、様々な厚さのフィブリン・コーティング及び様々な程度の架橋を作るための反応条件（例えば、時間、温度及びタンパク質濃度）を決定するために使用されることができる。いくつかの場合においては、先に開示された条件の好ましいレンジから外れることが望ましいであろう。
本発明に従って調製されたフィブリン−コート・ポリマー表面を内皮細胞により接種することができる。血液に晒される血管移植物及び他の表面の内皮細胞接種は、活性に抗血栓であり且つ閉塞に対する増加した抵抗性を示す補てつ材料を提供する。フィブリン・コーティングの安定性は、それを内皮細胞接種のための優れた支持体にする。
内皮細胞は、臍帯静脈（umbilical vein）、伏在静脈（saphenous vein）又は他の源から、標準的な手順により得られる。例えば、Balconi et al.,Med.Biol.64:231−245,1986;Ryan et al.,Tissue Cell 17:171−176,1985;Budd et al.,Br.J.Surg.76:1259−1261,1989を参照のこと。細胞は、機械的な又は好ましくは酵素的な方法により収穫されることができる。簡単に言えば、静脈を、血液を除去するためにフラッシュし、そしてコラゲナーゼ溶液により満たし、内皮細胞を分離させる。細胞を採取し、そして慣用の培地中で培養する。接種のために、細胞を、一般的には約37℃において５％のCO₂雰囲気中で培養基の存在中フィブリン・コート表面上で培養する。満足できる付着は、一般的には、１〜２時間以内で得られる。あるいは、培養内皮細胞を因子XIII/フィブリノーゲン溶液に添加し、このように、そのコーティング内でそれらを捕獲する。次にコートされた材料をインキュベートし、細胞を再生させる。
本発明の１つの態様においては、追加のタンパク質をフィブリン・コーティングに添加し、内皮細胞付着及び／又は化学走性を強化する。これに関して好適なタンパク質は、成長因子、例えば、塩基性繊維芽細胞成長因子（塩基性FGF）及び内皮細胞成長因子（血管内皮細胞増殖因子）、α_２マクログロブリン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、及び内皮細胞のための結合決定基を含むフィブロネクチン断片を含む。これらのタンパク質及びタンパク質断片の調製は、本分野における通常の技術レベル内に在る。例えば、Gospodarowicz et al.,FEBS Lett.213:261−264,1987;Dufour et al.,EMBO J.7:2661−2671,1988;Tischer et al.,WO 91/02058;Boel et al.,Biochmistry 29:4081−4087,1990;Ruoslahti et al.,米国特許第4,614,517号;Pierschbacher et al.,EMBO J.4:2519−2524,1985（これらを、引用により本明細書中に取り込む。）を参照のこと。これらのタンパク質は、一般的に、約0.5と10μg/mLとの間の濃度においてフィブリノーゲン／因子XIII溶液中に含まれる。
フィブリノーゲンを、公知の手順、例えば、逐次的β−アラニン沈降を使用するStraughn et al.,Thromb.Dia th.Haemorrhag.16:198,1966のものに従って調製する。さらなる精製を、DEAE−セルロース・クロマトグラフィー（Lawrie et al.,Biochem.Soc.Trans.7:693−694,1979）を使用して得る。自己のフィブリノーゲンであってさらに因子XIII及びフィブロネクチンを含むことができるものを、米国特許第4,298,598号及び第4,627,879号中に開示されたように調製することができる。
本発明における使用のための因子XIIIは、公知の方法、例えば、Cooke and Holbrook（Biochem.J.141:79−84,1974）及びCurtis and Lorand（Methods Enzymol.4 5:177−191,1976）（引用により本明細書中に取り込む。）により開示されているようなものに従って、血漿から調製されることができる。因子XIIIのa₂ダイマー形態は、米国特許第3,904,751号；第3,931,399号；第4,597,899号及び第4,285,933号（引用により本明細書中に取り込む。）中に開示されているように胎盤から調製されることができる。しかしながら、疾患の伝達の危険を担持する血液−又は組織−誘導生成物の使用を回避し、そして他のタンパク質による汚染を回避するように、組換え因子XIIIを使用することが好ましい。
組換え因子XIIIの製造方法は、本分野において公知である。例えば、Davie et al.,EP268,722及びGrundmann et al.,AU−Ａ−69896/87（これらを、全体として引用により本明細書中に取り込む。）を参照のこと。好ましい態様においては、因子XIII a₂ダイマーは、同時係属中の米国特許出願逐次番号第07/741,263号（全体として、引用により本明細書中に取り込む。）中に開示されたような酵母、サッカロトミセス・セレビシエ（Saccha romyces cerevisiae）中で細胞原形質として生産される。細胞を収獲し、そして溶解させ、そして清澄な溶解物を調製する。溶解物を、誘導体化アガロースのカラム、例えば、DEAE Fast−Flow Sepharose^TM（Pharmacia）等を使用して中性〜僅かにアルカリ性のpHにおけるアニオン交換クロマトグラフィーにより分画する。次に因子XIIIを、溶出物を濃縮し、そしてそのpHを5.2−5.5に調整することにより、例えば、琥珀酸アンモニウム・バッファーに対するダイアフィルトレーションにより、そのカラム溶出液から沈降させる。次に沈降物を溶解させ、そして慣用のクロマトグラフィー技術、例えば、ゲル濾過及び疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用してさらに精製する。
本発明においては因子XIII a₂ダイマーを使用することが好ましいが、因子XIIIの他の酵素前駆体形態（例えば、a₂b₂テトラマー）を使用することができる。酵素前駆体因子XIIIは、フィブリン表面上に存在するトロンビンにより活性化される。しかしながら、活性化された因子XIII（因子XIIIa）をも使用することができる。
（トロンビン、フィブリノーゲン及び因子XIIIを含む）本発明における使用のためのタンパク質は、様々な哺乳類源、例えば、ヒト、ウシ、ブタ及びヒツジから得られることができる。当業者には理解されるであろうが、補てつ用途においては、免疫応答を誘導する危険を減少させるために患者と同遺伝子のタンパク質を使用することが好ましい。非ヒト・タンパク質は、獣医学用塗のための又は実験モデルにおける使用のための材料の調製において特に有用である。
本発明の方法は、血管移植物、人工心弁、心臓補助装置及び他の補てつ装置であって血流に晒されるものの製造に有用である。このような装置の表面は、本明細書中に開示するように調製され、そして装置は、標準的な外科技術に従って移植される。さらに、本発明のフィブリノーゲン−コート・ポリマー表面は、フィブリン固化、血小板付着及び血管移植失敗関連の他の現象を研究するための、並びに可能性のある抗−血液凝固剤をテストするための、有用なインビトロにおけるモデルを提供する。
以下の例は、限定ではなく説明のために提供される。
実施例１
ポリエチレン・チュービング（Intramedic PE240,内径0.17cm及びIntramedic PE320,内径0.27cm,Clay Adams,Parsippany,NJ）をメタノールにより洗浄し、そして蒸留脱イオン水により濯いだ。チューブをTBS（0.05M Tris pH7.4,0.1MNaCl）中で一夜インキュベートした。チューブを24−cmの長さに切断した。
次にチューブをヒト・フィブリノーゲン（Grade L,Kabi Vitrum,Stockholm,Sweden）によりコートした。フィブリノーゲンをTBSに対し透析し、そして本質的にLawrie et al.（Biochem.Soc.Trans.7:693−694,1979）により記載されるようにDEAE−セルロース・クロマトグラフィーによりさらに精製した。精製材料は、＞96％トロンビン−血液凝固性であった。チューブをTBS中の様々な濃度のフィブリノーゲンにより満たした。溶液は、（供給者の指示に従って、Enzymobead試薬,Bio−Rad Ltd.,Mississauga,Ontarioを使用した固相ラクトペルオキシダーゼ−グルコース・オキシダーゼ手順により標識された）¹²⁵I−標識タンパク質として１％のフィブリノーゲンを含んでいた。チューブを、70℃において10分間オーブン内に置き、次に未結合のフィブリノーゲンを除去するために蒸留水により広範囲に洗浄した。結合したフィブリノーゲンの量を、次にチューブ内の放射能をカウントすることにより測定した。図１中に示すように、フィブリノーゲンの表面濃度は、フィブリノーゲン溶液の濃度に直接的に依存する。
変性フィブリノーゲンによりコートされたチューブ上のタンパク質吸着と非コート・チューブ上のものとを比較するために、チュービングの片を、¹²⁵I−標識フィブリノーゲン及びヒト・トロンビン（Sigma）、並びに¹³⁵I−標識ウシ・アルブミン（Boehringer Mannheim Canada）（すべてがEnzymobead試薬（Bio−Rad Ltd.を使用して標識された。）の変化濃度を含む溶液に晒した。チューブを、23℃において３時間フィブリノーゲン又はアルブミンと共に、又は23℃において15分間トロンビンと共に、インキュベートした。次にチューブを、TBSにより３回濯いだ。それぞれの洗浄は、そのチューブを通してのゆっくりとした20チューブ容量の吸引から成っていた。次にッチューブと会合した放射能を測定した。フィブリノーゲンとアルブミンの両方の熱変性したフィブリノーゲンへの吸着は、非コート・ポリエチレンへの吸着よりもかなり少なかった。
次に熱変性フィブリノーゲン（TDF）への血小板接着性を評価した。洗浄したウサギ血小板の懸濁液をArdlie et al.（Br.J.Haemat.19:7−17,1970;Proc.Soc.Exp.Bi ol.Med.136:1021−1023,1971）の方法に従って調製し、そしてNa₂ ⁵¹CrO₄（Du Pont−New England Nuclear,Boston,Ma.,200−500mCi/mgクロム）により第一洗浄液中で30分間標識した。次に血小板を、４％アルブミンを含むカルシウム不含Tyrode溶液（136mM NaCl,0.1％グルコース,1mM MgCl₂,2mM CaCl₂,NaHCO₃及びNaH₂PO₄によりpH7.35にバッファー化したもの）中で１回洗浄し、そして４％アルブミン、アピラーゼ（apyrade）及び5mM HEPESバッファー（pH7.35）を含むEagle's培地中で500,000/μＬにおいて再懸濁した。血小板付着の測定の直前に、洗浄した赤血球細胞を遠心分離によりパックし、そして血小板懸濁液に添加し、40％ヘマトクリットを得た（Cazenave et al.,J.Lab.Clin.Med.93:60−70,1979）。血小板：赤血球細胞懸濁液を、非コートされた、熱変性フィブリノーゲン（TBS中1mg/mL）によりコートされた、又は吸着非変性フィブリノーゲン（TBS中1mg/mL,3時間,22℃）によりコートされたポリエチレン・チュービング（PE240）のいずれかを通して37℃において10分間循環させた。流れを可変速蠕動ポンプを使用して2.5mL/分又は15mL/分のいずれかの速度において維持した。これらの流速は、完全に発達した層流の条件下でそれぞれ90秒^-1と550秒^-1の壁剪断速度に一致する。0.01M EDTA及び0.1％グルコースを含むTyrode溶液（カルシウム省略）によりチューブを洗浄した後、それらを、２−cmセグメントに切断し、そして放射能についてカウントした。
低い（90秒^-1）及び高い（550秒^-1）壁剪断速度下の血小板接着性（platelet adhesion）を、図２中に説明する。吸着されたフィブリノーゲンに比べて、熱変性フィブリノーゲンへの血小板接着性における両剪断速度における有意な減少が在った（ｐ＜0.01）。非コート・ポリエチレンに対する血小板接着性は、検出不能であった。
溶出に対する熱変性フィブリノーゲンの安定性を評価するために、PE320チュービングを、放射標識フィブリノーゲン・トレーサーが添加された1mg/mLフィブリノーゲン溶液を使用して熱変性フィブリノーゲンによりコートした。次にチュービングをTBSにより37℃及び流速20mL/分において24時間灌流した。４−cmセグメントを１時間毎に取り出し、これらの流れ条件下でのフィブリノーゲン層の安定性について評価した。幾つかの実験において、プールしたヒト血漿を灌流物として、低い及び高い流速（20及び100mL/分）において37℃で２時間使用した。４−cmセグメントを、５、10、15、60及び120分目に取り出し、血漿の存在中でのフィブリノーゲン層の安定性について評価した。
４時間の期間にわたる20mL/分における流れTBSにそれを晒すときTDF表面と会合した放射能における有意な減少は無かった。同様に、灌流を24時間続けたとき、層内のフィブリノーゲン量における減少も無かった（データを示さず。）低及び高両方の壁剪断速度におけるクエン酸化ヒト血漿に熱変性フィブリノーゲン−コート・ポリエチレンを晒すことは、２時間の期間にわたる表面放射能を減少させなかった（データを示さず。）。これは、表面コーティングが安定であり、そして流れの条件下でさえも脱着に抵抗することを示している。
実施例２
ポリエチレン・チュービング（Intramedic PE240,Clay Adams）を、メタノールによりその後TBSにより濯ぎ、そしてTBS中で室温において一夜インキュベートする。次にチュービングを乾燥させ、そしてTBS中の精製フィブリノーゲン溶液（1mg/mL）により満たす。チュービングを70℃オーブン内に10分間置き、フィブリノーゲンを変性させた。チュービングをオーブンから取り出し、40チューブ容量のTBSにより濯ぐ。
次にコートされたチュービングをトロンビンにより処理する。チュービングを0.5 x TBS（低張性TBS）中のヒトα−トロンビン（Sigma Chamical Co.,St.Louis,MO）の１μg/mL溶液により満たす。チューブを室温において５分間インキュベートし、次に20チューブ容量の低張性TBSにより濯ぐ。
次にフィブリンの追加の層をコーティングに架橋させる。トロンビン−処理チュービングを1mg/mlフィブリノーゲン及び2mM CaCl₂を含むTBS中の様々な濃度（０−５μg/ml）の組換え因子XIIIの溶液中で37℃において５分間インキュベートする。次にチュービングをTBSにより濯ぐ。
この方法で調製したチュービングへの血小板接着性を評価した。⁵¹Cr−標識血小板:RBC懸濁液を実施例１中に記載したようなチュービングを通して循環させた。図３中に示すように、血小板付着性は、因子XIIIの量の増加により減少した。
実施例３
フィブリン−コート・ポリエチレンを、フィブリン−トロンビン表面上へのビタミンＫ−依存性血液凝固因子を欠いた血漿からのフィブリン固化の阻害において、ヘパリンと、アンチトロンビンIII−非依存性トロンビン阻害剤、ヒルジン、Hirulog−１及びＤ−フェニルアラニル−Ｌ−プロールイル−Ｌ−アルギニル・クロロメチル・ケトン（PPACK）との効果を比較するために使用した。すべての溶液を特記を除きTBS中で調製した。ブタ腸粘膜からの標準へパリン（グレードII）をSigma Chemical Co.,St.Louis,MO.から得て、そしてPPACKをCalbiochem Corp.,San Diego,Californiaから得た。PPACKを10^-3M HCl中で調製した。組換えヒルジンは、Dr.H.Grossenbacher,Ciba−Geigy Ltd.,Biotechnology Department,Basel,Switzerland（Lot rHH5−7033/♯A19）の寄贈品であった。この分子は、３つのジスルフィド架橋をもつ65アミノ酸の一本鎖ポリペプチドである。それは、生来のヒルジン、変異体HV−１と同じアミノ酸配列及び構造をもつ。Hirulog−１、合成ヒルジン誘導体は、Dr.John Maraganore,Biogen Inc.,Cambridge,Massachusettsの寄贈品であった。組換えヒルジン及びHirulog−１は、壁効果を避けるために6mg/mLポリエチレン・グリコール8000（PEG8000）を含むTBS中で調製した（Degryse et al.,Thromb.Res.61:87,1991）。
15人の健康なドナーから酸−シトレート・デキストロース中に採取した全血を、カナダ赤十字（Canadian Red Cross）から得た。細胞成分を遠心分離により除去し、そしてビタミンＫ−依存性血液凝固因子を血漿１リッター当たり1M BaCl₂の100mLの添加により除去した。４℃において１時間穏やかに攪拌した後、不溶性クエン酸バリウムを遠心分離により除去し、そして上澄血漿を0.15M NaClに対し一夜透析した。HEPESバッファーを50mMの最終濃度まで添加し、そしてpHを7.4に調整した。血漿を−70℃において保存した。血塊性タンパク質の測定法（Ratnoff et al.,J.Lab.Clin.Med.37:316,1951）により測定されるようなフィブリノーゲン濃度は、2.2mg/mLであった。AT III及びヘパリン補因子II（HC II）レベルは、供給者（Diagnostica Stago,Asnieres,France）からの指示に従ってAutomated Coagulation Laboratory（ACL300,Instrumentation Laboratory,Milan,Italy）上で測定され、そしてそれぞれ、0.98U/mL及び0.68U/mLであることが分かった。ウサギ脳トロンボプラスチン及び因子II−欠損血漿を使用して測定された血漿プロトロンビン（Owren,J.Clin.Lab.Invest.1:81,1949）は、0.01U/mL未満であった。この血漿へのCaCl₂の添加（最終濃度、2mM）は、それを37℃において一夜放置したとき、血塊形成をもたらさなかった。
ポリエチレン・チュービング（Intramedic PE240,Clay Adams）を、（Straughn and Wagner,Thromb.Diath.Ha emorrhag.16:198,1966により開示されたような逐次的β−アラニン沈降を使用してクエン酸化ヒト血漿から精製された）フィブリノーゲンによりコートした。チュービングを、メタノール及びTBSにより最初に洗浄し、次に1mg/mLフィブリノーゲンを含むTBSにより満たし、そして10分間で70℃まで加熱した。次にチュービングを50チューブ容量のTBSにより洗浄した。チューブを乾燥させ、そして低張性TBS中の（Dr.J.Fenton II,New York State Department of Health,Albany,NYから得た）１μg/mLヒトα−トロンビンを含む溶液により満たした。室温において５分間のインキュベーションの後、チューブを10チューブ容量の低張性TBSにより、次に10チューブ容量の、1mg/mLヒト・フィブリノーゲン及び2mM CaCl₂を含むTBSにより洗浄した。チューブを37℃において10分間インキュベートし、次に100チューブ容量の0.05M Na₂HPO₄,pH6.5により洗浄した。
得られたフィブリン−トロンビン表面の量及び均一性をその表面を調製するために使用した溶液の両方の中で放射標識したトレーサー・タンパク質（¹²⁵I−トロンビン、¹³¹I−フィブリノーゲン）を使用することにより評価した。表面に結合したフィブリン及びトロンビンの量を、ガンマ・カウンター（Minaxi gamma,Auto−gamma 5000 Series,Canberra−Pacard Canada,Ltd.,Mississauga,Ont.）内でチュービングから切断された等サイズ・セグメンントの放射能を測定することにより測定した。表面上のフィブリン及びトロンビンの量における変化は、テストされたセグメント間で10％未満であった。
フィブリン−コート表面の均一性及び形態学的特徴をさらに評価するために、セグメントを、４％パラホルムアルデヒドその後0.1Mナトリウム・カコディレート（sodium cacodylate）バッファー中の１％オスミウム・テトラオキシド（osmium tetraoxide）中で固定し、等級エタノールを通して脱水し、そしてCO₂臨界点乾燥機（Bomer SPC−900）内で乾燥させた。次にチューブをアルミニウム試料スタブ（stubs）上に載せ、金によりスパッター−コート（sputter−coated）し、低（40倍）及び高（2500倍）の倍率においてPhilips 501−Ｂ走査電子顕微鏡内で検査した。チュービングの管腔態様の長さに沿って付着された重合フィブリンの均一で薄い層が在った。表面上のフィブリンの表面積対重量の比は、67cm²/mgフィブリンであると計算された。
フィブリン−コート・チューブのセグメントを一定の長さに分割し、そして8M尿素、２％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、100mMβ−メルカプトエタノールを含む溶液中で100℃において１時間煮沸した。SDS−PAGEを使用する消火表面材料の分析（Laemmli,Nature 227:680,1970）は、この材料が架橋重合フィブリンの存在を伴うガンマ−ガンマ・ダイマー構成成分を含んでいることを示した。
研究抗血液凝固剤と等抗−トロンビン濃度を、Hattonの方法（Biochem.J.131::799,1973）の修正法を使用して測定した。12 x 85mmボロシリケート・ガラス・チューブ内で、200μｌのRingers Lactate及び100μｌのテスト血漿を37℃において３分間インキュベートし、次にヒトα−トロンビンを含む100μｌの冷凍TBSを添加した。血塊化時間（clotting time）を、傾斜チューブ（tilt−tube）法を使用して測定した。添加したトロンビンの量を計算し、20秒間のベースライン・トロンビン血塊化時間を得た。次にテスト抗血液凝固剤を様々な濃度において血漿に添加し、そして血塊化時間テストを同一量の添加トロンビンにより繰り返した。血塊化時間の対数に対して抗−血液凝固剤の濃度をプロットすることにより、血塊傾斜テストを２倍のベースライン（40秒）に延長する等抗−トロンビン濃度への外挿が、それぞれの医薬について作られることができた。
また、Hirulog−１によるトロンビンの阻害は、6mg/mL PEG8000を含むTBS（37℃）中でHirulog−１（42nM,0.12μg/mL及び420nM,1.2μg/mL）と共にヒトα−トロンビン（42nM,1.5μg/mL）をインキュベートすることにより評価した。インキュベートのアリイコット（100μＬ）を様々な時間間隔において取り出し、そして血漿に添加し、先に記載したように血塊化時間を測定した。
テスト血漿の血塊化時間を20秒間のベースラインから40秒間に延長する研究抗血液凝固剤の等抗−トロンビン濃度は：組換えヒルジン、25nM（0.17μg/mL）;Hirulog−１、42nM（0.12μg/mL）;PPACK、65nM;へパリン、0.23U/mLであった。
フィブリン−トロンビンによりコートされたPEチューブ（6cm）を、先に記載したように調製した1mLの血漿により洗浄した。血漿は、様々な濃度におけるテスト抗血液凝固剤、トレーサー・タンパク質としての（固相ラクトペルオキシダーゼ−グルコース・オキシダーゼ手順により標識された）¹²⁵I−標識フィブリノーゲン、及び2mM CaCl₂を含んでいた。チューブを、様々な時間間隔にわたり37℃においてインキュベートし、そして次に10mL/分において10分間（剪断速度365秒^-1）37℃においてローラー・ポンプ（Harvard Apparatus Variable Speed Paristaltic Pump,Harvard Apparatus Inc.,South Natick,Mass）上でTBSにより灌流した。末端の１−cmセグメントを廃棄し、そして残ったチュービングの放射能を固化フィブリンの量を測定するために測定した。
Hirulog−１（42nm）の存在中及び非存在中テスト血漿からPEチューブ上に固化した表面¹²⁵I−標識フィブリン（30分間、インキュベーション、37℃）を、1mL8M尿素、２％SDS、100mMβ−メルカプトエタノール中で１時間、100℃において消化した。等容量の消化材料を、SDS−ポリアクリルアミド上のゲル電気泳動により評価した。ゲルを乾燥した後、それをKodak X−AR5フィルムに晒し、そして形成したバンドをLKB Ultrascaan XL Laser Densitometer（Pharmacia LKB Biotechnology,Uppsala,Sweden）を使用して濃度計により評価した。
図４中に説明するように、フィブリン−コートPEチュービングとのテスト血漿の10分間のインキュベーションの後、抗血液凝固剤のすべてが、Hirulog−１を除き、対照血漿に比べてフィブリン固化を阻害することができた。組換えヒルジン及びPPACKの両方が、フィブリン固化の阻害において、対照（ｐ＜0.001,Student's t−テスト）、Hirulog−１（ｐ＜0.001）又はヘパリン（ｐ＜0.001）のいずれよりも有意により有効であった。抗血液凝固剤の組換えヒルジン及びPPACKによるフィブリン固化の阻害間に有意な差異は無かった。
インキュベーションの30分目において（図５）、抗血液凝固によるフィブリン−コート・チューブのフィブリン固化の阻害の程度は、10分目よりも少なかった。組換えヒルジン及びPPACKの両方が対照（ｐ＜0.001）と比べて固化を減少させたが、ヘパリンはそうではなかった（ｐ＜0.02）。さらに、対照血漿（ｐ＜0.02）と比べたとき、抗血液凝固剤Hirulog−１の存在中でフィブリン−トロンビン表面上に固化するフィブリンの量における増加が在った。
フィブリン−トロンビン・コートPEチューブ上にフィブリン固化がHirulog−１の存在及び非存在中で評価されるような別々の実験ぬいおいて（図６）、対照と比較したとき、低濃度のHirulog−１（42nM）が４分間フィブリン固化を阻害し、そして高濃度（420nM）が８分間フィブリン固化を阻害した。これらの濃度は、フィブリン−コート表面に結合したα−トロンビンの量（3.2ngトロンビン/cm²、15nM/cm²）に比べて３−及び30−倍過剰モルのHirulog−１を示した。しかしながら、これらの時間点の後、対照血漿と比較したとき、血漿中のHirulog−１の両濃度において固化したフィブリン量における漸進的な増加が在った（30分間、インキュベーションHirulog−1;18.4±3.5μｇフィブリン/cm²、対照;11.7±2.0μｇフィブリン/cm²、ｐ＜0.001）。放射標識され固化したフィブリンであって消化されているものの濃度計による分析によるSDS−PAGE及びオートラジオグラフィー（8M尿素、２％SDS、100mMβ−メルカプトエタノール、１時間、100℃）は、Hirulog−１の存在中に固化した量が増加し、そしてフィブリンがガンマ−ガンマ・ダイマー構成成分を含み、そして固化重合架橋フィブリンをもち、そしてフィブリノーゲンを吸着しない（ガンマ−ガンマ・ピークHirulog−1:対照の比;1.3）ことを確信させた。
フィブリン・コートPEチュービングを、（固相ラクトペルオキシダーゼ−グルコース・オキシダーゼ手順により標識された）¹²⁵I−トロンビンを使用して先に記載したように調製した。次にチュービングを、血塊傾斜テストを２倍のベースラインに延長するのに必要な５倍の濃度においてAT III−非依存性トロンビン阻害剤を含むTBSにより濯いだ。10分間のインキュベーション時間の後（23℃）、チューブをローラー・ポンプ上の低張性TBAにより濯いだ（10mL/分、10分間）。それぞれのチューブに会合した放射能を、残った表面トロンビン量を測定するために測定した。図７は、AT III−非依存性トロンビン阻害剤の、フィブリン表面からのトロンビンの置換に対する効果を示している。PPACKは、いずれの置換をも生じさせなかったけれども、組換えヒルジン及びHirulog−１は、対照バッファー（ｐ＜0.001）に比べて、重合フィブリンに結合したトロンビンの表面濃度を有意に減少させた。
本発明の特定の態様を説明の目的のために詳細に記載したが、本明細書中に記載した方法及び組成物が本発明の本質及び範囲から外れることなく修正されることができることが、当業者に容易に理解されよう。したがって、本発明は、添付のクレームによる以外によって限定されるべきではない。

Claims (22)

1. フィブリノーゲンによるポリマー材料の表面コーティング方法であって、少なくとも56℃、かつ、100℃未満の温度においてフィブリノーゲンの溶液中で当該材料をインキュベートして、フィブリノーゲンによりコートされた表面を形成することを含み、ここで、当 該フィブリノーゲンの溶液が、インキュベーションが終 了した後にさらなる加熱処理を受けない、前記方法。
2. 前記温度が約70℃である、請求項１に記載の方法。
3. 前記溶液が、0.5mg/mL〜3.0mg/mL間のフィブリノーゲンを含有する、請求項１に記載の方法。
4. 前記溶液が、約1mg/mLのフィブリノーゲンを含有する、請求項１に記載の方法。
5. 前記フィブリンが、ヒトのフィブリノーゲンである、請求項１に記載の方法。
6. 前記材料が、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート又は延伸ポリテトラフルオロエチレンである、請求項１に記載の方法。
7. 前記材料が、血管移植物の形態にある、請求項１に記載の方法。
8. フィブリノーゲンによりポリマー材料の表面をコーティングする方法であって：
   少なくとも56℃、かつ、100℃未満の温度においてフィブリノーゲンの溶液中で当該材料をインキュベートして、フィブリノーゲンによりコートされた表面を形成し；そして
   上記のフィブリノーゲンによりコートされた表面をトロンビンの溶液中でインキュベートして、フィブリン・モノマーを形成する、
   ことを含み、ここで、上記フィブリノーゲンの溶液が、 インキュベーションが終了した後に、さらなる加熱処理 を受けない、前記方法。
9. 前記トロンビンの溶液が、約１μg/mLのトロンビンを含む、請求項８に記載の方法。
10. 前記温度が約70℃である、請求項８に記載の方法。
11. 前記溶液が、0.5mg/mL〜3.0mg/mL間のフィブリノーゲンを含む、請求項８に記載の方法。
12. 前記溶液が、約1mg/mLのフィブリノーゲンを含む、請求項８に記載の方法。
13. 前記フィブリノーゲンが、ヒトのフィブリノーゲンである、請求項８に記載の方法。
14. 前記材料が、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート又は延伸ポリテトラフルオロエチレンである、請求項８に記載の方法。
15. 前記材料が、血管移植物の形態にある、請求項８に記載の方法。
16. 前記のトロンビンにより処理された表面を、因子XIII及び追加のフィブリノーゲンを含む第二溶液に晒し、それにより、当該追加のフィブリノーゲンがフィブリンに変換され、そして前記のフィブリンによりコートされた表面に架橋されるステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
17. 前記第二溶液中の因子XIIIの濃度が、0.25〜20μg/mLである、請求項16に記載の方法。
18. 前記第二溶液中の因子XIIIの濃度が、0.25〜5.0μg/mLである、請求項16に記載の方法。
19. 前記第二溶液中のフィブリノーゲンの濃度が、0.5〜5.0mg/mLである、請求項16に記載の方法。
20. 前記第二溶液が、塩基性繊維芽細胞成長因子、内皮細胞成長因子、α_２マクログロブリン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、又はフィブロネクチンの細胞−結合性断片をさらに含む、請求項16に記載の方法。
21. 前記第二溶液が、内皮細胞を含む、請求項16に記載の方法。
22. 前記の架橋されたフィブリンを内皮細胞で接種（seeding）するステップをさらに含む、請求項16に記載の方法。

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