DE3637260A1

DE3637260A1 - Verfahren zur besiedlung von oberflaechen mit endothelzellen

Info

Publication number: DE3637260A1
Application number: DE19863637260
Authority: DE
Inventors: Klaus T Dr Preissner; Elisabeth Anders; Gert Prof Dr Mueller-Berghaus
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1986-11-03
Filing date: 1986-11-03
Publication date: 1988-05-11
Also published as: EP0331672A1; JPH02500482A; WO1988003560A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Besiedlung von Oberflächen mit Endothelzellen, welches insbesondere die Anhaftung, Ausbreitung, Migration, Motilität, Pro liferation und Differenzierung von humanen sowohl mikrovaskulären als auch makrovaskulären Endothelzellen auf Fremdoberflächen ermöglicht bzw. verbessert.

Die Auskleidung der Blutgefäße mit einer monozellulären Schicht von Endothelzellen, die im Normalfall nicht thrombogene Eigenschaften aufweisen, garantiert ungehin derten Blutfluß und eine Unterdrückung der Blutgerin nungsaktivierung. Erst nach Schädigung dieser Zell schicht wird durch eine Aktivierung der Blutplättchen und des Blutgerinnungssystems die Gefäßwand thrombogen: Es kommt zum Anhaften von Blutzellen und zur Bildung eines Blutgerinnsels. Durch Einwanderung von Endothel zellen kann eine verletzte Gefäßwand repariert werden. Dabei ist die Anhaftung und Ausbreitung der Endothel zellen an die subendotheliale Matrix eine wichtige Voraussetzung für deren Migration, Motilität, Prolife ration und Differenzierung. Versuche mit Zellen in Kultur zeigen, daß eine natürliche Matrix die beste Grundlage für Anhaftung und Ausbreitung von Endothel zellen bildet (Madri, J.A. & Williams, S.T. (1983) J. Cell. Biol. 97, 153-165).

Die subendotheliale Matrix setzt sich komplex zusammen und besteht unter anderem aus Kollagen, Laminin, von Willebrand Faktor, Fibronektin, Elastin, Thrombospondin und weiteren nicht näher charakterisierten Komponenten. Es ist deshalb von größtem Interesse, die Komposition der extrazellulären Matrix weiter aufzuklären. Die Zu sammensetzung der extrazellulären Matrix ist auch für das Anhaften von Endothelzellen an nicht-körpereigene Oberflächen, an sogenannte Biomaterialien, von Bedeutung, da gezeigt wurde, daß implantierte Biomaterialien in vivo nicht mit Endothelzellen bewachsen werden. Bisher gibt es keine zuverlässige Methode, Endothelzellen zum Anhaften und Ausbreiten an Biomaterialien zu stimulie ren. Auch ist bisher keine Methode bekannt, wie Biomate rialien beschichtet sein müssen, damit in vivo Endothel zellen an einer Matrix haften bleiben, um eine neue Endothelzellbeschichtung entstehen zu lassen.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, Verfahren und Materialien zu entwickeln, um das Anhaften von Endothelzellen durch entsprechende Matrices zu erreichen.

Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Besiedlung von Oberflächen mit Endothel zellen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Oberflächen mit S-Protein beschichtet und danach mit Endothelzellen besiedelt.

Es war bekannt, daß S-Protein, das identisch dem Vitro nectin ist (Jenne, D & Stanley, K.K. (1985) EMBO J. 4, 3153-3157; Preissner, K.T., Heimburger, N., Anders, E. & Müller-Berghaus, G (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun. 134, 951-956), die Anhaftung und Ausbreitung von Fibroblasten fördert. Es war jedoch nicht bekannt, welche Wirkungen S-Protein auf Endothelzellen ausübt.

Es wurde überraschenderweise gefunden, daß S-Protein in konzentrationsabhängiger und zeitabhängiger Weise die Anhaftung von mikrovaskulären und makrovaskulären Endo thelzellen humanen Ursprungs stimuliert. Hierbei fördert S-Protein die Anhaftung, die Ausbreitung, Migration und Motilität sowie die Proliferation und Differenzierung der Zellen. Dabei ist die Funktion von S-Protein durch die Gegenwart von Antikörpern gegen andere Adhäsivpro teine wie Fibronektin, von Willebrand Faktor oder Fibrinogen nicht hemmbar, wird aber durch Antikörper gegen S-Protein völlig unterdrückt. Die beschriebenen Eigenschaften von S-Protein lassen sich auch durch ein synthetisches Peptid mit der charakteristischen Sequenz Gly-Arg-Gly-Asp-Ser, das der Sequenz der Zellbindungs stelle des S-Proteins entspricht, in konzentrationsab hängiger Weise hemmen.

S-Protein, das für die Erfindung geeignete Eigenschaf ten aufweist, wird z. B. durch Reinigung aus Blutplasma nach vorbekannten Verfahren erhalten. Ein geeignetes Verfahren ist z. B. beschrieben in Biochem. J. 231, 349-355 (1985). S-Protein ist ein Einketten-Glykopro tein mit einem Molekulargewicht von 78 000 und kommt im Plasma in einer Konzentration von 0,4 mg/ml vor.

Die Beschichtung der Oberfläche mit dem S-Protein er folgt zweckmäßigerweise durch Inkubation mit einer wäßrigen Lösung von S-Protein, vorzugsweise einer Lösung ein geeigneten wäßrigen Pufferlösungen, die so ausgewählt sind, daß ihr pH-Wert nahe dem physiologi schen pH-Wert liegt. Geeignet sind insbesondere die üblicherweise bei Zellkulturen verwendeten Pufferlösun gen. Die Konzentration des S-Proteins im wäßrigen Medium liegt zweckmäßig zwischen 0,3 und 30 µg/ml.

Größere Konzentrationen sind anwendbar, bringen aber keinen Vorteil. Bei geringeren Konzentrationen ist eine Verbesserung der Anhaftung zwar feststellbar, aber ungenügend. Im angegebenen Bereich nimmt die Anhaftung von etwa 50 bis auf 100% der eingesetzten Zellen zu, wobei bereits mit 3 µg/ml eine Anhaftung von etwa 75% erzielt wird.

Die Anhaftung ist auch zeit- und temperaturabhängig. Gute Ergebnisse werden bei Temperaturen zwischen etwa 25 und 40°C erhalten, bevorzugt wird ein Bereich um 37°C. Unter diesen bevorzugten Bedingungen sind nach etwa 1 bis 2 Stunden mehr als 90% der Endothelzellen angehaftet. Die nachstehenden Tabellen 1 und 2 zeigen die Zeitabhängigkeit und die Konzentrationsabhängig keit der Haftung unter den angegebenen bevorzugten Be dingungen.
Zeit (Stunden)% Anhaftung

0,25 13,5 0,5 30,0 1,0 91,0 2,0 98,0 3,0100,0

S-Protein (µg/ml)% Anhaftung

0,352,0 1,065,5 3,075,0 6,077,4 20,095,0 30,099,0

Die Endothelzellen werden zweckmäßig in einer Menge von etwa 0,2 bis 10×10⁴-Zellen pro m² zu beschichtender Oberfläche eingesetzt.

Als Oberflächen eignen sich für die Erfindung im Prin zip alle chemisch inerten Oberflächen, wie sie insbe sondere für Gewebs- oder Zellkulturen, Prothesen oder Implantate verwendbar sind. Beispiele für geeignete Oberflächen sind Petrischalen, beispielsweise aus Poly styrol, Glas, Keramikkörper wie z. B. Porzellan oder die für Implantate verwendeten Keramiksorten, Kunst stoffe wie Polyvinylchlorid oder Polytetrafluorethylen und Metalle wie Edelstahl, also Materialien, die ins besondere für Prothesen und Implantate angewendet werden können. Erfindungsgemäß wird es so möglich, Endothelzellen nicht nur auf Kulturschalen, wie z. B. aus Polystyrol nach Vorbeschichtung mit S-Protein zur schnelleren Anhaftung und Ausbreitung zu bewegen, sondern alle Arten von insbesondere synthetischen supportiven Materialien, die als Prothesen und Implan tate in Betracht kommen, als Träger für S-Protein zu verwenden und mit Endothelzellen zu besiedeln.

Generell ist es dabei vorteilhaft, vor der Beschichtung mit S-Protein eine Beschichtung mit Komponenten der subendothelialen Matrix vorzunehmen, wobei insbesondere ein oder mehrere der Bestandteile Fibronektin, Kollagen, Laminin, Elastin und Thrombospondin verwendet werden.

Als besonders vorteilhaft erwies sich eine Vorbeschich tung der Oberflächen mit Kollagen (Typ III) oder Kolla gen-Fibronektingemischen. Wird eine mit Kollagen (Typ III) oder Kollagen-Fibronektin vorbeschichtete Petrischale (Polystyrol) zusätzlich mit S-Protein vor inkubiert, so findet eine noch schnellere Anhaftung der Zellen aus der Suspension statt, verglichen mit einer Beschichtung aus nur S-Protein oder nur Kollagen-Fibro nektin. Bei Verwendung der Kombination von Kollagen- Fibronektin kann S-Protein auch in viel geringeren Konzentrationen eingesetzt werden (1-2 µg/ml). Diese synergistische Kombinationsbeschichtung der Oberfläche fördert nicht nur in hohem Maße die Anhaftung, Ausbrei tung, Migration und Motilität, sondern auch die Prolife ration und Differenzierung der Endothelzellen.

Diese Kombinationsbeschichtung kann auch einstufig durchgeführt werden, derart, daß die zu beschichtende Oberfläche mit einer wäßrigen Lösung inkubiert wird, in der S-Protein, Kollagen und Fibronektin bzw. Kollagen (Typ III) enthalten sind.

Die Erfindung ermöglicht es, auf Zellkulturgefäß-Ober flächen, Prothesenoberflächen oder Implantatoberflächen und dergleichen eine Besiedlung mit Endothelzellen durchzuführen und eine verbesserte Anhaftung, Ausbrei tung, Migration, Motilität, Proliferation und Differen zierung derselben zu erzielen. Hierdurch lassen sich nicht nur verbesserte Zellkulturen erreichen, sondern auch die bei Implantaten und Prothesen auftretenden, auf das Anhaften von Blutzellen zurückzuführenden Gefahren beseitigen.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Beispiel 1

S-Protein wird nach dem Verfahren von Preissner et al. Biochem. J. 231, 951-956 (1985) aus Blutplasma isoliert und gereinigt. Die Reinheit des S-Protein wird durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese verifiziert.

S-Protein (20 µg/ml) wird zwei Stunden lang auf der mit Endothelzellen zu beschichtenden Oberfläche einer Petrischale aus Polystyrol bei 37°C in Phosphat-Puffer inkubiert. Anschließend werden die Endothelzellen, entweder aus Gewebekulturen entnommene oder aus Venen abgelöste Zellen, in einer Endkonzentration von 1×10⁵- 5×10⁵ Zellen/ml auf die vorbeschichtete Oberfläche gegeben (ca. 1,5×10⁴ Zellen/cm²). Die Anhaftung und Ausbreitung der Zellen bei 37°C wird unter dem Mikros kop verfolgt. Dabei sind nach 1 bis 2 Stunden mehr als 90% Zellen angehaftet, während in einem Kontrollver such, in dem Albumin als Beschichtungssubstanz verwen det wird, weniger als 5% der Zellen anhaften. Die Quantifizierung des Grades der Anhaftung gelingt durch Auszählen der im Überstand befindlichen sowie durch Zählen der angehafteten Zellen nach Ablösung mit Trypsin/EDTA (Tabelle 1). Eine zunehmende Anhaftung (50 bis 100%) der Zellen, vermittelt durch S-Protein, ist im Konzentrationsbereich von 0,3 bis 30 µg/ml S-Protein in einem ähnlichen Versuch zu beobachten (Tabelle 2).

Beispiel 2

Präpariert man die zu beschichtende Oberfläche mit 20 µg/ml S-Protein, wie unter Beispiel 1 beschrieben, gibt aber kurz vor dem Hinzufügen der Zellsuspension das der Zellbindungsstelle im S-Protein entsprechende Pentapeptid Gly-Arg-Gly-Asp-Ser (Pierschbacher & Ruoslahti, 1984) hinzu, so inhibiert dieses Peptid in konzentrationsabhängiger Weise die durch S-Protein vermittelte Anhaftung der Zellen. Bei einer Konzentra tion des Peptides von 30 µg/ml haften nur weniger als 10% der Zellen an. Ebenso übt ein für S-Protein spezi fischer Antikörper einen Hemmeffekt auf die Zellanhaf tung aus. Dagegen beeinflussen Antikörper gegen andere Adhäsivproteine wie Fibronektin, von Willebrand Faktor oder Fibrinogen die Wirkung des S-Proteins nicht.

Beispiel 3

S-Protein (20 µg/ml) wird wie in Beispiel 1 nicht auf den Boden einer Petrischale (Polystyrol), sondern auf eine Kunststoffprothese (z. B. aus Polyvinylchlorid oder Polytetrafluorethylen) oder auf Glas aufgetragen. Wie im Beispiel 1 beschrieben, finden sich auch in diesen Fällen nach 1 bis 2 Stunden mehr als 90% der Endothelzellen angehaftet.

Claims

1. Verfahren zur Besiedlung von Oberflächen mit Endothelzellen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Oberflächen mit S-Protein beschichtet und danach mit Endothelzellen besiedelt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Oberfläche zuerst mit Kollagen (Typ III) oder Kollagen und Fibronektin vorbeschichtet und dann die Vorbeschichtung mit S-Protein durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als zu beschichtende Oberfläche eine extrazelluläre Matrix verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man eine extrazelluläre Matrix verwendet, die im wesent lichen aus Fibronektin, Kollagen, Laminin, Elastin oder/und Thrombospondin besteht.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Ober flächen aus Kunststoff, Glas, Keramik oder synthe tischen supportiven Materialien, die als Prothesen und Implantate dienen, verwendet.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Beschichtung mit S-Protein durch Inku bation der zu beschichtenden Oberfläche mit einer wäßrigen Lösung von S-Protein durchführt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung von S-Protein in Pufferlösung verwendet.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung, welche 1 bis 200 µg S-Pro tein pro ml enthält, verwendet.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man 0,2 bis 10×10⁴ Endothelzellen pro cm² zu beschichtender Oberfläche aufbringt.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Aufbringung der Endothelzellen und/ oder des S-Proteins auf der zu beschichtenden Oberfläche bei einer Temperatur zwischen 25 und 40°C vornimmt.

11. Prothese, Implantat oder Zellkulturgefäß, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Oberflächenbeschichtung aus S-Protein aufweist.