KR100869685B1 - 초고정수압 인가에 의한 이식용 생체 조직의 처리방법 - Google Patents

Abstract

이식용 생체 조직의 처리방법으로서, 이식 가능한 동물 유래 조직에 매체 중에서 초고정수압을 인가함을 포함한다. 이 처리 때문에, 결합 조직은 구조 및 생체 역학적 특성을 그대로 유지한 상태로 세포를 포함하는 다른 성분으로부터 분리 가능하다.

초고정수압, 인가, 생체 조직

Description

초고정수압 인가에 의한 이식용 생체 조직의 처리방법{METHOD OF TREATING BIOLOGICAL TISSUE FOR TRANSPLANTATION BY APPLYING ULTRAHIGH HYDROSTATIC PRESSURE}

본 발명은 이식용의 생물 유래 조직으로부터 도너(donor) 세포의 파괴, 세포의 사멸 및 바이러스 불활화를 달성하는 기술에 관한 것이다.

생체 조직을 글루탈알데히드와 같은 고정제에 의해 화학 처리함으로써, 또는 생체 조직에서 세포 성분을 제거함으로써 이식용 조직편이 만들어져 널리 임상 응용되고 있다. 예를 들어, 심장 판막 치환술에서 이종 생체 판막은 돼지 심장 판막 또는 소 심막을 면역원성의 저하를 위해 글루탈알데히드로 고정화한 것이다. 상기 이종 생체 판막은 항응고성이 우수하기는 하지만 젊은 사람에게는 5∼10 년 정도의 내구성밖에 없어, 통상은 60 세 이상의 고령자에 적용된다. 서양에서는 1985년 무렵부터, 일본에서도 최근 동결 보존에 의한 조직 뱅크가 정비되어, 사체에서 제공된 동결 보존 동종 판막이 임상에서 사용되고 있다. 이 동종 판막은 기계 판막에 비하여 항혈전성이고, 이종 생체 판막에 비하여 내구성이며, 양자에 비하여 항감염성이라 우수하다고 여겨진다. 그러나, 제공수가 절대적으로 부족한 것이 큰 문제이다. 또한 젊은 사람에게서는 비교적 조기에 기능 부전을 초 래하는 증례도 보고되어 있어, 면역 반응의 관여가 강하게 시사되고 있다. 젊은 사람에게 유효한 Ross 수술에서는, 자기 폐동맥 판막을 대동맥 판막 위치로 치환 이식하여, 결손된 폐동맥 판막을 동결 보존 동종 판막에 의해 재건하는데, 대동맥 판막 위치로 이식된 자기 폐동맥 판막은 환자의 성장과 함께 증대된다는 특징이 있다. 이에 반하여, 기계 판막이나 이종 생체 판막은 물론이고 동결 보존 동종 판막이라도 성장성을 갖지 않기 때문에, 소아 환자의 경우에는 재이식되는 경우가 적지 않다. 최근 이러한 문제를 해결하기 위해, 동종 판막에서 도너 유래 세포를 제거함으로써 항원성의 감약(減弱)에 의해 면역 반응의 관여를 저하시켜 내구성 및 자기화를 향상시키는 연구가 보고되고 있다. 미국 CryoLife 사는 SynerGraft 라 불리는 약액 처리에 의한 세포 제거 방법을 발표하였으며, 이식 후 수개월 동안에 자기세포가 조직 내에 침윤하여 자기조직화된다고 보고하고 있다. 또한 독일 하노버 의과대학의 Haverich 등의 그룹은, 계면활성제인 TritonX-100 이나 단백 분해 효소인 트립신 용액을 세포 제거에 사용하고 있다. 그러나, 조직편 내부의 세포 성분 및 세균이나 바이러스의 제거는 표면으로부터의 약액의 확산 및 침투에 따라 다르기 때문에, 종래의 계면활성제 또는 약액에 의한 세정 공정만으로는 충분하지 않다. 또한 이러한 제약 때문에 대형 조직편의 처리에 대해서는 완전한 세포 제거나 세균 및 바이러스의 제거가 곤란하였다. 또한 화학 처리에 의한 경우에 충분한 효과를 얻기 위해서는 처리 정도를 높일 필요가 있고, 그로 인해 매입(埋入) 후의 석회화나 처리 시약의 제거 등의 문제가 생긴다. 그리고 경막 이식에서의 BSE 및 CJD 의 감염으로 분명해진 바와 같이 이식 조직의 안 전성 확보는 매우 중요하지만, 현재의 화학 약액 처리는 조직 내 바이러스를 완전히 불활화할 수 있다는 보증이 없다. 또한 처리 과정에서의 오염에 의해 이식용 조직으로부터의 감염 사고도 종종 발생하고 있다.

본 발명의 목적은 상기에 기술된 바와 같은 종래 기술의 문제점을 개선하는 것에 있다. 즉, 먼저 첫번째로 약액 처리로는 달성할 수 없는 대형 조직 내부의 세포 성분 및 세포나 바이러스의 제거를 달성하는 것, 두번째로 생체 역학 특성을 손상시키지 않고 처리하는 것, 세번째로 간편하게, 또한 단시간에 조직을 멸균하는 것이다.

본 발명에서는, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구한 결과, 고압 하에서는 세포막의 파괴, 세균의 사멸 및 바이러스의 불활화가 일어나는 것을 이용하여, 이식용 생물 유래 조직의 처리법으로서 이용하는 것을 고안하였다.

본 발명은 이식 가능한 동물 유래 조직에 매체 중에서 초고정수압을 인가함으로써, 구조 및 생체 역학적 특성을 그대로 유지한 상태로 결합 조직을 세포를 포함하는 다른 성분으로부터 분리 가능하게 하는 것을 특징으로 하는 이식용 생체 조직의 처리방법을 제공한다.

도 1 은 돼지 심장 판막 조직의 조직 단면 사진이다. 왼쪽은 24 시간 동안 계면활성제를 처리하였고, 오른쪽은 10 분 동안 10000 기압의 고압 처리하였다. 계면활성제 처리에서는 조직 심부 (왼쪽 아래) 내에서 세포핵의 잔존이 확인된다.

도 2 는 돼지 심장 판막 조직의 조직 단면 사진이다. 왼쪽은 24 시간 동안 계면활성제를 처리하였고, 오른쪽은 10 분 동안 10000 기압의 고압 처리하였다. 모두 조직에서 해리 등이 보이지 않으며 콜라겐 조직이 양호하게 보존되어 있다.

도 3 은 돼지 심장 판막엽의 파단 강도의 처리 시간 의존성을 나타낸다. 왼쪽은 계면활성제를 처리하였고, 오른쪽은 10000 기압의 고압 처리하였다. 계면활성제 처리에서는 파단 강도가 처리 시간에 따라 증가하는 경향이 있지만, 고압 처리에서는 변화가 확인되지 않는다.

도 4 는 돼지 심장 판막엽의 탄성률의 처리 시간 의존성을 나타낸다. 왼쪽은 계면활성제를 처리하였고, 오른쪽은 10000 기압의 고압 처리하였다. 계면활성제 처리에서는 탄성률이 처리 시간에 따라 증가하는 경향이 있지만, 고압 처리에서는 변화가 확인되지 않는다.

도 5 는 미리 상재균을 감염시킨 혈관 조직을 고압 처리한 후 1 일간 배양한 결과를 나타낸다. 1000 기압 처리에서는 세포의 증식에 의한 배지의 혼탁이 보이지만, 5000 기압 이상에서는 확인되지 않는다.

(발명을 실시하기 위한 최선의 형태)

여기에서 사용하는 고압이란 5000 기압 내지 15000 기압 정도의 범위이며, 식품 분야의 연구에서 멸균이 가능한 것이 이미 공지되어 있다. 또, 세포 파괴 및 바이러스 불활화가 일어나는 것도 보고되어 있다. 그러나, 이들을 종합적으로 감안하여 이식용 처리법으로서 제안한 사례는 없다. 이들 요인을 전부 감안하고 또한 각각의 요인에 대한 조건 범위 및 새로운 처리 온도 범위를 설정함으로써 신규 이식용 생물 유래 조직의 처리법을 개발하였다. 초고정수압 인가에는, 예를 들어 고베제강소 제조의 닥터셰프 등의 장치를 사용할 수 있다. 또는 광공학사 제조의 초고압 실험 장치도 사용할 수 있다. 모두 소형 챔버 내에 처리 조직을 설치하고, 액체를 매체로 하여 15000 기압 정도까지 정수압을 인가할 수 있다. 상기 매체는 물, 고장액, 저장액, 계면활성제 용액, 효소액, 또는 유기 용매를 포함하는 이들의 매체이다. 또한 동시에, 챔버 외투의 온도를 조절함으로써 챔버 내의 온도를 제어할 수 있다. 식품 분야와 달리 이식용 생체 조직의 경우는, 생체 역학 특성을 변화시키지 않기 위해 구성 매트릭스의 변성을 방지할 필요가 있어, 고압 인가시에 온도가 어는 점 이하나 40 ℃ 이상이 되는 것을 피해야 한다. 약액 처리의 경우, 세포핵의 제거는 표면에서의 계면활성제의 확산 및 침투에 따라 다르기 때문에, 조직 심부의 세포 제거에는 장시간의 처리가 필요하였다. 초고압 처리에서는 30 분이라는 단시간에 조직 내의 세포를 완전히 파괴하여 제거하는 것이 가능하다. 그리고 세포편의 내부까지 균등하게 처리할 수 있다. 이용 분야 또는 용도는,

1) 이식용 동물 유래 연조직

예 : 뇌사 또는 심장사 도너로부터의 이식용 연조직 처리, 또는 돼지 및 소 등의 이종 동물로부터의 이식용 연조직 처리가 언급될 수 있다. 세포 성분을 제거하는 세정 처리 공정의 효율을 비약적으로 높일 수 있다. 또한 항원성 원인 물질의 대폭적인 감소를 달성할 수 있다.

2) 이식용 동물 유래 경조직

예 : 상기 기술된 바와 같이 뼈, 연골 및 치아 등의 경조직의 처리를 할 수 있다.

3) 의료용 생물 조직의 처리

예 : 동물 및 식물 유래 조직 중 세포를 포함한 것에 대한 세포 파괴 처리에 사용할 수 있다.

1. 식용 돼지 번식장에서 돼지 심장을 구입하여 4 ℃ 로 반송하였다. 심장을 적출할 때 온허혈시간(warm ischemic time)은 20 분 이내로 하였다. 폐동맥 판막 및 혈관을 적출하여 행크스액(Hank's solution)으로 세정하였다. 도너 세포를 고베제강소 제조의 닥터셰프를 이용해 37 ℃에서 10∼30 분동안 1000∼10000 기압의 정수압을 인가하였다. 처리 후, PBS 용액으로 세정하여 세포 잔류물을 제거하였다. 처리 표본의 조직 단면을 HE 염색 및 EVG 염색에 의해 광현 관찰함으로써 조직학적으로 평가하였다. 생체 역학적 특성은, 고압 처리한 심장 판막엽을 폭 3 ㎜ 및 길이 약 15 ㎜ 로 길게 잘라 역학 시험기 (텐실론) 로 인장 시험하여 파단까지의 장력을 측정하였다. 측정 후 절단편의 중량과 비중으로부터 판막엽의 막두께를 구하고, 응력 변형 특성으로부터 탄성률을 계산하였다. 조직의 감염성은 미리 상재균으로 감염시킨 혈관 조직을 고압 처리한 후, 배양함으로써 세균 증식능을 평가하여 실시하였다. 그 결과, 도 1 에 나타낸 바와 같이, 초고압 처리에 의해 탈세포화한 돼지 폐동맥 판막엽 조직에서는 조직 심부까지 완전히 세포를 제거할 수 있었다. 이에 반하여, 계면활성제로 처리한 폐동맥 판막엽 단면에서는 두께 수백 ㎛의 판박엽 내에서는 침지 처리 6 시간 후에 는 세포핵은 염색되지 않았지만, 판막엽 기부의 심근 조직 내 세포의 핵은 처리 24 시간 후 표면에서 1 ㎜ 이상에서는 염색되었다. 또한, 도 2 에 나타낸 바와 같이, 초고압 처리 후에도 판막엽 내의 콜라겐 섬유나 엘라스틴 섬유가 보존되어 있는 것이 확인되었다. 생체 역학 특성에서, 정상 돼지 폐동맥 판막엽의 비중은 약 1.05 로 혈관벽과 거의 같은 값이었다. 판막엽의 혈관벽 접선 방향을 기준 0°로 하여 역학 특성의 이방성에 관해 검토시, 90°방향은 부드럽고 약하고, 0°방향은 단단하고 강한 특성을 가지고 있었다. 도 3 및 4 에 나타낸 바와 같이, 초고압에 의한 탈세포화 처리에서는 역학 특성에 대한 영향이 전혀 보이지 않았다. 이에 반하여, 계면활성제 처리에서는 처리 시간에 따라 강도, 탄성률 모두 증가하는 경향을 나타내었다. 그리고, 미리 상재균에 의해 감염시킨 혈관 조직을 고압 처리하였더니, 도 4 에 나타낸 바와 같이 5000 기압 이상 인가한 경우, 세균 감염이 확인되지 않았다.

Claims (8)

1. 이식 가능한 동물 유래 조직에 매체 중에서 5000∼15000 기압의 초고정수압을 인가함으로써, 구조 및 생체 역학적 특성을 그대로 유지한 상태로, 결합 조직을 세포를 포함하는 다른 성분으로부터 분리 가능하게 하는 것을 특징으로 하는 이식용 생체 조직의 처리방법.
2. 제 1 항에 있어서, 처리되는 조직은 혈관, 심장 판막, 각막, 양막 및 경막을 포함하는 연조직인 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 처리되는 조직은 뼈, 연골 및 치아를 포함하는 경조직인 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 처리되는 조직은 심장, 신장, 간장, 췌장, 뼈 및 뇌를 포함하는 장기 또는 그 일부인 방법.
5. 삭제
6. 제 1 항에 있어서, 초고정수압의 인가는 0 ℃∼40 ℃ 의 온도에서 실시되는 방법.
7. 제 1 항에 있어서, 상기 매체는 물, 고장액, 저장액, 계면활성제 용액, 효소액, 또는 유기 용매를 포함하는 이들의 매체인 방법.
8. 제 1 항, 제 2 항, 제 3 항, 제 4 항, 제 6 항, 또는 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 처리 후 세정에 의해 파괴된 세포를 조직으로부터 제거하는 공정을 포함하는 방법.

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